Name: laser capture microdissection of glioma subregions for spatial and molecular characterization of intratumoral heterogeneity, oncostreams, and invasion
Uploaded: 2020-04-12T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Laser Capture Microdissection of Glioma Subregions for Spatial and Molecular Characterization of Intratumoral Heterogeneity, Oncostreams, and Invasion at JoVE

Arbeidet ble støttet av National Institutes of Health, (NIH/NINDS) Grants: R37-NS094804, R01-NS105556, R21-NS107894 til M.G.C.; (NIH/NINDS) Gir R01-NS076991, R01-NS096756, R01-NS082311 til P.R.L.; (NIH/NIBI): R01-EB022563; (NIH/NCI) U01CA224160; Institutt for nevrokirurgi, Rogel Cancer Center ved University of Michigan, ChadTough Foundation og Leah's Happy Hearts Foundation til M.G.C. og P.R.L. RNA Biomedicine Grant F046166 til M.G.C. National Institutes of Health, UL1 TR002240 for Michigan Institute for Clinical and Health Research (MICHR), Postdoktor Translational Scholars Program (PTSP) stipend, Prosjekt F049768 til A.C. University of Michigan Forbes Cancer Research Institute, en Lege-Forsker Award fra forskning for å forhindre blindhet, Inc. (RPB), gi R01 EY022633 fra NEI av NIH (AK), og en ubegrenset tilskudd fra RPB til Institutt for oftalmologi og visuelle vitenskaper. Denne forskningen benyttet Vision Research Core (P30 EY007003), og Cancer Center Research Core (P30 CA046592). AK støttes av Mrs. William Davidson Emerging Scholar Award fra A. Alfred Taubman Medical Research Institute.

Alle metoder beskrevet her som bruker eksperimentelle dyr har blitt godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved University of Michigan.
MERK: Glioma-nevrosfærer generert fra en GEMM eller stabile linjer kan brukes til intrakraniell tumorengraftment hos mus10 og behandlet for LMD- og RNA-sekvensering. Disse cellene uttrykker samtidig firefly luciferase og GFP-proteiner, som vil bli ytterligere utnyttet til tumorvekstanalyse og lokalisering.
<...

<ol>
	<li>Reifenberger, G., Wirsching, H. G., Knobbe-Thomsen, C. B., Weller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+the+molecular+genetics+of+gliomas+-+implications+for+classification+and+therapy.">Advances in the molecular genetics of gliomas - implications for classification and therapy.</a> Nature Reviews Clinical Oncology. 14 (7), 434-452 (2017).</li><li>Espina, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser-capture+microdissection.">Laser-capture microdissection.</a> Nature Protocols. 1 (2), 586-603 (2006).</li><li>Rabien, A., Kristiansen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+Microdissection.">Tissue Microdissection.</a> Methods in Molecular Biology. 1381, 39-52 (2016).</li><li>Lovatt, D., Bell, T., Eberwine, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-neuron+isolation+for+RNA+analysis+using+pipette+capture+and+laser+capture+microdissection.">Single-neuron isolation for RNA analysis using pipette capture and laser capture microdissection.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (1), (2015).</li><li>Erickson, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+RT-PCR+gene+expression+analysis+of+laser+microdissected+tissue+samples.">Quantitative RT-PCR gene expression analysis of laser microdissected tissue samples.</a> Nature Protocols. 4 (6), 902-922 (2009).</li><li>Cheng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser-assisted+microdissection+in+translational+research:+theory,+technical+considerations,+and+future+applications.">Laser-assisted microdissection in translational research: theory, technical considerations, and future applications.</a> Applied Immunohistochemistry &amp; Molecular Morphology. 21 (1), 31-47 (2013).</li><li>Butler, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recovery+of+high-quality+RNA+from+laser+capture+microdissected+human+and+rodent+pancreas.">Recovery of high-quality RNA from laser capture microdissected human and rodent pancreas.</a> Journal of Histotechnology. 39 (2), 59-65 (2016).</li><li>Clement-Ziza, M., Munnich, A., Lyonnet, S., Jaubert, F., Besmond, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stabilization+of+RNA+during+laser+capture+microdissection+by+performing+experiments+under+argon+atmosphere+or+using+ethanol+as+a+solvent+in+staining+solutions.">Stabilization of RNA during laser capture microdissection by performing experiments under argon atmosphere or using ethanol as a solvent in staining solutions.</a> RNA. 14 (12), 2698-2704 (2008).</li><li>van Dijk, M. C., Rombout, P. D., Dijkman, H. B., Ruiter, D. J., Bernsen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+resolution+by+mounting+of+tissue+sections+for+laser+microdissection.">Improved resolution by mounting of tissue sections for laser microdissection.</a> Molecular Pathology. 56 (4), 240-243 (2003).</li><li>N&#250;&#241;ez, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IDH1-R132H+acts+as+a+tumor+suppressor+in+glioma+via+epigenetic+up-regulation+of+the+DNA+damage+response.">IDH1-R132H acts as a tumor suppressor in glioma via epigenetic up-regulation of the DNA damage response.</a> Science Translational Medicine. 11 (479), (2019).</li><li>Calinescu, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposon+mediated+integration+of+plasmid+DNA+into+the+subventricular+zone+of+neonatal+mice+to+generate+novel+models+of+glioblastoma.">Transposon mediated integration of plasmid DNA into the subventricular zone of neonatal mice to generate novel models of glioblastoma.</a> Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).</li><li>Koschmann, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATRX+loss+promotes+tumor+growth+and+impairs+nonhomologous+end+joining+DNA+repair+in+glioma.">ATRX loss promotes tumor growth and impairs nonhomologous end joining DNA repair in glioma.</a> Science Translational Medicine. 8 (328), (2016).</li><li>Brat, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive,+Integrative+Genomic+Analysis+of+Diffuse+Lower-Grade+Gliomas.">Comprehensive, Integrative Genomic Analysis of Diffuse Lower-Grade Gliomas.</a> The New England Journal of Medicine. 372 (26), 2481-2498 (2015).</li><li>Datta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection:+Big+data+from+small+samples.">Laser capture microdissection: Big data from small samples.</a> Histology and Histopathology. 30 (11), 1255-1269 (2015).</li><li>Lein, E., Borm, L. E., Linnarsson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+promise+of+spatial+transcriptomics+for+neuroscience+in+the+era+of+molecular+cell+typing.">The promise of spatial transcriptomics for neuroscience in the era of molecular cell typing.</a> Science. 358 (6359), 64-69 (2017).</li><li>Gagner, J. P., Zagzag, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+Glioblastoma+Tissue+Heterogeneity+with+Laser+Capture+Microdissection.">Probing Glioblastoma Tissue Heterogeneity with Laser Capture Microdissection.</a> Methods in Molecular Biology. 1741, 209-220 (2018).</li></ol>

Forstå molekylære mekanismer underliggende glioma heterogenitet og invasjon er av avgjørende betydning for å avdekke nye terapeutiske mål13. I dette manuskriptet beskriver vi en detaljert og optimalisert metode for å analysere det molekylære landskapet av glioma heterogenitet og invasjon ved hjelp av laserfangst mikrodisseksjon (LMD) etterfulgt av transkripsjonomisk analyse.
Laser fangst mikrodisseksjon (LMD) kan brukes til å identifisere ulike områder eller en...

Gliomas er de mest aggressive primære svulstene i sentralnervesystemet. De er svært invasive og heterogene1. Analyse av cellulære og molekylære komponenter i svulsten vil avsløre nye terapeutiske mål.
Blant ulike metoder som er tilgjengelige, laser fangst mikrodisseksjon (LMD) av frosne hjernen tumor vev er en kostnadseffektiv, pålitelig teknikk som gjør det mulig å isolere diskrete anatomiske områder eller spesifikke cellepopulasjoner fra tumorvev for å studere deres molekylære profil2,3. LMD tillater analyse av mRNA genuttrykkprofiler av utvalgte enkeltceller eller flercellulære strukturer4,5. LMD kan brukes til å få inngående mekanistisk kunnskap om molekylære hendelser som finner sted under tumorprogresjon. Forbedring i behandling av tumorvev er nødvendig for å oppnå optimal optisk oppløsning av vevmorfologi og RNA-kvalitet6. Selv om paraformaldehydfiksering er det beste alternativet for morfologisk analyse, påvirkes RNA-kvaliteten og forringes under disse forholdene, noe som resulterer i dårlig RNA-kvalitet for RNA-seqanalyse. Bruken av frosne vevseksjoner unngår iskrystalldannelse, som kan bryte cellemembraner og produsere hull i celler, og er fortsatt det beste alternativet for RNA-Seq analyse7.
Her beskriver vi en optimalisert seksjonsfikserings- og fargingsmetode for å behandle frosne mushjernetumorvev for LMD. For å forhindre at iskrystaller dannes i vevet, gjennomsyret vi mus med en løsning på 30% sukrose. Denne løsningen forstyrrer interaksjoner mellom polare vannmolekyler og forhindrer dannelse av iskrystaller, og bevarer vevmorfologien. Vevfarging er nødvendig for å skille og oppnå spesifikk populasjon av celler eller anatomisk forskjellige områder i svulsten. Det er viktig å fikse og flekke vevet med uskyldige fargestoffer for å opprettholde RNA integritet. Det har tidligere vist seg at farging vev med hematoksylin/eosin (H&E) forverrer RNA integritet8. Vi fikset og farget vevet av interesse med etanol, Cresyl fiolett 4% og eosin Y 0,5% løsninger. Cresyl violet er en surfargestoff farge som flekker cellekjernen med en mørk blå farge. Eosin Y er en basofile farge som flekker grunnleggende komponenter i cellene, noe som gir et skille mellom cytoplasma og andre cellulære strukturer8. Begge fargestoffer er løselig i etanol og forverres ikke RNA-kvalitet. For å unngå vevsskader og opprettholde høy optisk oppløsning av cellulære strukturer, monterte vi vevsseksjonene før LMD9.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Accutase Cell Detachment Solution</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>423201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal-Free Recombinant Human EGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50X), serum free</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer RLT</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning PCR Tubes</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>CLS6530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cresyl Violet Acetate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C5042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 - Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11330057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Y</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E4009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiSeq 4000</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Microdissection (LMD) System</td>
			<td>Leica</td>
			<td>LMD7000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 Supplement (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normocin - Antimicrobial Reagent</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>ant-nr-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peel Away Disposable Embedding Molds</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>70182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEN Membrane Glass Slide (2 &#181;m)</td>
			<td>Lieca</td>
			<td>1150518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pinpoint Solution</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D3001-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human FGF-basic</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-18B-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Research Cryostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM3050s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZap RNase Decontamination Solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Plus Micro Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v2 - Pico Input Mammalian</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>634411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Plus O.C.T. Compound</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-730-571</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

laser capture microdissection of glioma subregions for spatial and molecular characterization of intratumoral heterogeneity, oncostreams, and invasion

Gliomer er primære hjernesvulster preget av deres invasivitet og heterogenitet. Spesifikke histologiske mønstre som pseudopalisader, mikrovaskulær spredning, mesenchymal transformasjon og nekrose karakteriserer histologisk heterogenitet av høyverdige gliomer. Vårt laboratorium har vist at tilstedeværelsen av høye tettheter av mesenchymale celler, kalt oncostreams, korrelerer med tumor malignitet. Vi har utviklet en unik tilnærming for å forstå mekanismene som ligger til grunn for gliomas vekst og invasjon. Her beskriver vi en omfattende protokoll som benytter laserfangstmikrodisseksjon (LMD) og RNA-sekvensering for å analysere differensial mRNA-uttrykk for intra-tumoral heterogene multicellulære multicellulære strukturer (dvs. mesenchymal områder eller områder av tumorinvasjon). Denne metoden opprettholder god vevshistologi og RNA-integritet. Perfusjon, frysing, innebygging, snitting og farging ble optimalisert for å bevare morfologi og få høykvalitets lasermikrodisseksjonsprøver. Resultatene indikerer at perfusjon av gliomabærende mus som bruker 30% sukrose gir god morfologi og RNA-kvalitet. I tillegg resulterer flekker av tumorseksjoner med 4% Cresyl fiolett og 0,5% eosin i god kjernefysisk og cellulær farging, samtidig som RNA-integritet bevares. Metoden som er beskrevet er følsom og svært reproduserbar, og den kan brukes til å studere tumormorfologi i ulike tumormodeller. Oppsummert beskriver vi en komplett metode for å utføre LMD som bevarer morfologi og RNA-kvalitet for sekvensering for å studere de molekylære egenskapene til heterogene flercellede strukturer i faste svulster.

Vårt laboratorium har generert en genmodifisert mus modeller (GEMMs) ved hjelp av sove skjønnhet transposase system (Figur 1A). Dette systemet inkorporerer spesifikke genetiske endringer i genomet til nevrale stamceller i nyfødte mus. Disse endrede stamceller danner endogene gliomasvulster. Plasmid sekvenser som brukes til å generere svulster var: (1) pT2C-LucPGK-SB100X for Sleeping Beauty transposon & luciferase uttrykk, (2) pT2-NRASSV12...

Watch this Scientific Journal Video about Laser Capture Microdissection of Glioma Subregions for Spatial and Molecular Characterization of Intratumoral Heterogeneity, Oncostreams, and Invasion at JoVE

Laser Capture Microdissection of Glioma Subregions for Spatial and Molecular Characterization of Intratumoral Heterogeneity, Oncostreams, and Invasion

Lasermikrodisseksjon (LMD) er en følsom og svært reproduserbar teknikk som kan brukes til å avdekke veier som medierer glioma heterogenitet og invasjon. Her beskriver vi en optimalisert protokoll for å isolere diskrete områder fra gliomavev ved hjelp av laser LMD etterfulgt av transkripsjonsanalyse.

Laser Capture Microdissection av Glioma Subregions for romlig og molekylær karakterisering av intratumoral heterogenitet, oncostreams, og invasjon

Gliomas are primary brain tumors characterized by their invasiveness and heterogeneity. Specific histological patterns such as pseudopalisades, ...

Denne protokollen bruker lasermikrodisseksjon og RNA-sekvensering for å analysere differensialmRNA-uttrykket av intratumor heterogenitet, for eksempel områder for akkumulering av mesenchymale celler eller områder av tumorinvasjon. Denne metoden er optimalisert for å bevare god kvalitet vev histologi og RNA integritet for å lette oppkjøpet av høy kvalitet laser mikrodisseksjon prøver. Denne metoden er følsom og svært reproduserbar.Det kan benyttes til å studere tumormorfologi og heterogenitet i ulike tumormodeller. Lasermikrodisseksjon av frosset hjernesvulstvev er en kostnadseffektiv, pålitelig teknikk for isolering av diskrete anatomiske områder av cellepopulasjoner fra tumorvev for å studere deres molekylære profiler. LMD kan brukes til å få inngående mekanistisk kunnskap om molekylære hendelser som finner sted under tumorprogresjon, og kan avsløre nye terapeutiske mål.En in vivo bioluminescens av musen tumor byrden når et signal mellom en ganger 10 til seks og en ganger 10 til 7th fotoner. Skyll oksygenert tyrodoppløsning gjennom sirkulasjonssystemet til den eutaniserte tumorbærende musen til leveren og lungene er fullstendig ryddet av blod. Fortsett å perfusere dyret med 30% sukroseoppløsning oppløst i tyrodoppløsning i ytterligere 15 minutter.For å evaluere suksessen til perfusjonen, bekreft at nakke, hale og ben er stive på slutten av sirkulasjonen. Deretter høster hjernen i henhold til standardprotokoller og lagrer hjernen over natten i fersk 30% sukroseløsning. For å forberede deg på kryopreservation, fyll en krukke med kald isopentan-2-metylbutan og legg krukken i en beholder fylt med flytende nitrogen.Mens løsningsmidlet er chilling, blot hjernen tørke på et stykke filterpapir og plassere hjernen i en merket Cryomold. Forsiktig på ca fem milliliter optimal temperatur kutte medium til midten av Cryomold og plassere hjernen i formen i ønsket orientering. Bruk rene tang, plasser raskt Cryomold i det avkjølte isopentanet-2-metylbutan i 30 til 40 sekunder.Når skjæremediet har størknet, overfør Cryomold til tørris og pakk Cryomold og snap frosset hjernevev i aluminiumsfolie for minus 80 grader Celsius lagring. For å skaffe frosne hjernesvulstvevsseksjoner, sett først temperaturen på en kryostat mellom minus 20 og minus 24 grader Celsius, og plasser prøveblokken i kryostatkammeret i 30 til 60 minutter. Mens prøven er likevekt, rengjør kammeret og knivholderen med 100% etanol og spray seksjonsbørstene med RNase rengjøringsløsning.Når prøven er klar, fjern formen og bruk ferskt skjæremedium for å feste den frosne vevsblokken til kryostatprøven. Plasser blokken i diskholderen og juster blokken etter knivbladet. Få 10 mikrometer deler av hjernen ved hjelp av en av de Rnase-frie børster for å forsiktig flate og løsne vevsbitene på skjæreflaten.Hvis du vil montere hjernevevsseksjonene på lysbildene, trykker du jevnt på den positivt ladede siden av et merket RNase-fritt PEN-glasssklie på delen og plasserer lysbildet i en oppbevaringsboks inne i kammeret. Når alle lysbildene er samlet inn, plasserer du oppbevaringsboksen på minus 80 grader Celsius. For å oppløse skjæremediet før lasermikro disseksjon, senk lysbildene i 30-sekunders sekvensielle synkende etanol nedsenking etterfulgt av krystallfiolett løsning farging i 20 sekunder og fem sekunder i 0,5% eosin Y løsning.På slutten av eosin Y-inkubasjonen, bruk filterpapir for å blokkere lysbildene tørre og dehydrere lysbildene i sekvensielle stigende etanolsenkinger. Etter 60-sekunders etanol nedsenking, skyll lysbildene i en beholder med xylen i tre minutter. Tørk deretter lysbildene på RNase-fri overflate ved romtemperatur i 10 sekunder før prøvene monteres i monteringsmedium tilberedt med RNase-fritt vann.Etter 10 til 20 sekunder, overføre lysbildene til mikroskopet mikroskop mikroskop plattform. For laserfangst mikrodisseksjon, slå på strømmen før du slår på laseren. Deretter slår du på mikroskopkontrolleren i datamaskinen og starter laserfangstmikrodisseksjonsprogramvaren.Velg 10 ganger forstørrelse i mikroskopkontrollpanelet. Under Laserkontroll, angi laser parametere for vev disseksjon og velge en laserfrekvens på 120 hertz og en laserstrøm på 100%For nøyaktig laser mikrodisseksjon, sette hastigheten til 10 og sette blenderåpningen til 10 mikrometer. Sett deretter strømmen til 53.Last vevsoppsamleren som fanger vevet etter delen og klikker på den andre Unload-knappen. Bytt ut den tomme samleren med DNase og Rnase-frie 0,5 milliliter PCR flathead rør som inneholder 30 mikroliter lysisbuffer per rør. Sett samleren tilbake til maskinen, og klikk fortsett.Legg den behandlede prøven på mikroskopet og klikk Loss i lasermikrodisseksjonsprogramvaren. Opp prøven på glideholderen og plasser glideholderen på scenen. Klikk Fortsett for å fortsette, og velg Trekk klipp ut i vinduet Klipp ut figurer.Bruk mikroskopkontrollene til å finne interesseområdet og tegne en oversikt rundt interesseområdet. Velg deretter et målsamlerrør og klikk Start Cut for å fortsette vevsmikrodisseksjonen. Når alle interesseområdene er dissekert, overfører du samlerrørene fra holderen til tørris til de er nedstrøms behandling.For å skaffe vev med en overlegen morfologi og RNA integritet, ulike perfusjon tilnærminger ble evaluert. For å dissekere interesseområdene, er det nødvendig å flekke vevet med uskyldige fargestoffer for RNA. Den påfølgende perfusjonen av tumorbærende mus med tyrodoppløsning og 30% sukrose etterfulgt av en inkubasjon over natten i 30% sukrose resulterer i bevaring av morfologien og RNA-integriteten til musevevet.Selv om paraformaldehyd vev fiksering resulterer i en høy kvalitet vev morfologi, RNA integritet er negativt påvirket. Andre tilnærminger som bruk av en tyrodoppløsningsinkubasjon eller tyrodoppløsning pluss 30 % sukroseopp inkubasjoner påvirker ikke RNA-kvaliteten, men en redusert oppløsning i vevsmorfologien observeres. Hvis vevet ikke er montert med monteringsmedium, blir seksjonene dehydrert og morfologien forverres mens montering av vevsprøvene med 15% monteringsmedium oppløst i vann opprettholder en høykvalitets vevmorfologi.Laserfangst mikrodisseksjon mikroskop imaging tillater valg av svulstvev for disseksjon. Denne regionen av interesse valg deretter tillater disseksjon av områder av interesse i hver vev prøve for RNA integritet analyse. Opprettholde en høy kvalitet tumor vev morfologi og RNA integritet er kritisk.Tyrodeløsning og 30 % sukroseperfusjon med bevaring over natten i 30 % sukrose forbedrer vevsmorfologien betydelig for LMD. Rask lyomafiksering, farging og montering med GAN-løsning er avgjørende skritt for å bevare RNA-kvalitet og forhindre sprekker fra å danne seg i vevet. Vi anbefaler at snitting av minst 2,5 ganger 10 til det sjette kvadratiske mikrometer total tumor per vev område for å oppnå passende mengder RNA for både RNA kvalitetskontroll og transkripsjonsanalyse.LMD muliggjør analyse av molekylære signalveier som regulerer glioma heterogenitet og invasjon som kan avsløre nye potensielle mål for fremtidig translasjonell utvikling i prekliniske gliommodeller.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the ...

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling  |

Non-Laser Capture Mikroskopi Approach for mikrodisseksjon av Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation og nedstrøms Next-Generation Sekvensering og Gene Expression Profiling

As technological platforms, approaches such as next-generation sequencing, microarray, and qRT-PCR have great promise for expanding our understanding of ...

Laser Capture Microdissection of Enriched Populations of Neurons or Single Neurons for Gene Expression Analysis After Traumatic Brain Injury

Laser Capture mikrodisseksjon av anriket Bestander av neuroner eller Enslige nevroner for genekspresjonsanalyse etter traumatisk hjerneskade

Long-term cognitive disability after TBI is associated with injury-induced neurodegeneration in the hippocampus-a region in the medial temporal lobe that ...

Laser Capture Microdissection of Neurons from Differentiated Human Neuroprogenitor Cells in Culture

Laser Capture microdissection av nerveceller fra Differensiert Menneskelig Neuroprogenitor celler i kultur

Neuroprogenitor cells (NPCs) isolated from the human fetal brain were expanded under proliferative conditions in the presence of epidermal growth factor ...

Production of RNA for Transcriptomic Analysis from Mouse Spinal Cord Motor Neuron Cell Bodies by Laser Capture Microdissection

Produksjon av RNA for transkripsjonsanalyse fra mus ryggmargsmotor neuroncellelegemer ved laserfangst mikrodeseksjon

Preparation of high-quality RNA from cells of interest is critical to precise and meaningful analysis of transcriptional differences among cell types or ...

Olfactory Neurons Obtained through Nasal Biopsy Combined with Laser-Capture Microdissection: A Potential Approach to Study Treatment Response in Mental Disorders

Olfactory Nevroner innhentet gjennom Nasal Biopsi Kombinert med Laser-Capture mikrodisseksjon: En Potential tilnærming til Study Behandling Response i psykiske lidelser

Bipolar disorder (BD) is a severe neuropsychiatric disorder with poorly understood pathophysiology and typically treated with the mood stabilizer, lithium ...

Laser Capture Microdissection - A Demonstration of the Isolation of Individual Dopamine Neurons and the Entire Ventral Tegmental Area

Laser Capture mikrodisseksjon - En demonstrasjon av Isolering av Individuell dopaminneuroner og hele Ventral tegmentale området

Laser capture microdissection (LCM) is used to isolate a concentrated population of individual cells or precise anatomical regions of tissue from tissue ...

Stereotactic Atlas-Guided Laser Capture Microdissection of Brain Regions Affected by Traumatic Injury

Stereotactic Atlas-guidede Laser fange Microdissection av hjernen regionene påvirkes av traumatisk skade

The ability to isolate specific brain regions of interest can be impeded in tissue disassociation techniques that do not preserve their spatial ...

Optimization of Laser-Capture Microdissection for the Isolation of Enteric Ganglia from Fresh-Frozen Human Tissue

Optimalisering av Laser-fangst Microdissection for isolering av innstigning Ganglion fra frisk-frosne menneskelig vev

The purpose of this method is to obtain high-integrity RNA samples from enteric ganglia collected from unfixed, freshly-resected human intestinal tissue ...

A Stainless Protocol for High Quality RNA Isolation from Laser Capture Microdissected Purkinje Cells in the Human Post-Mortem Cerebellum

En rustfritt protokoll for høykvalitets RNA isolasjon fra Laser fange Microdissected Purkinje celler i menneskelig obduksjon lillehjernen

Laser capture microdissection (LCM) is an advantageous tool that allows for the collection of cytologically and/or phenotypically relevant cells or ...