Name: laser capture microdissection of glioma subregions for spatial and molecular characterization of intratumoral heterogeneity, oncostreams, and invasion
Uploaded: 2020-04-12T14:00:00
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O trabalho foi apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde, (NIH/NINDS) Subsídios: R37-NS094804, R01-NS105556, R21-NS107894 a M.G.C.; (NIH/NINDS) Subsídios R01-NS076991, R01-NS096756, R01-NS082311 a P.R.L.; (NIH/NIBI): R01-EB022563; (NIH/NCI) U01CA224160; o Departamento de Neurocirurgia, O Centro de Câncer rogel na Universidade de Michigan, ChadTough Foundation, e Leah's Happy Hearts Foundation para M.G.C. e P.R.L. RNA Biomedicine Grant F046166 para M.G.C. National Institutes of Health, UL1 TR002240 for Michigan Institute for Clinical and Health Research (MICHR), Postdoctoral Translational Scholars Program (PTSP) grant, Projeto F049768 para A.C. University of Michigan Forbes Cancer Research Institute, um Prêmio Médico-Cientista de Pesquisa para Prevenir a Cegueira, Inc. (RPB), subvenção R01 EY022633 do NEI do NIH (AK), e uma subvenção irrestrita da RPB para o Departamento de Oftalmologia e Ciências Visuais. Esta pesquisa utilizou o Vision Research Core (P30 EY007003) e o Cancer Center Research Core (P30 CA046592). AK é apoiada pelo Prêmio Acadêmico Emergente Mrs. William Davidson do A. Alfred Taubman Medical Research Institute.

Todos os métodos descritos aqui que utilizam animais experimentais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade de Michigan.
NOTA: As neuroesferas glioma geradas a partir de um GEMM ou linhas estáveis podem ser usadas para enxerto de tumor intracraniano em camundongos10 e processadas para sequenciamento de LMD e RNA. Essas células expressam constitutivamente a luciferase de vagalume e as proteínas GFP, que serão ai...

<ol>
	<li>Reifenberger, G., Wirsching, H. G., Knobbe-Thomsen, C. B., Weller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+the+molecular+genetics+of+gliomas+-+implications+for+classification+and+therapy.">Advances in the molecular genetics of gliomas - implications for classification and therapy.</a> Nature Reviews Clinical Oncology. 14 (7), 434-452 (2017).</li><li>Espina, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser-capture+microdissection.">Laser-capture microdissection.</a> Nature Protocols. 1 (2), 586-603 (2006).</li><li>Rabien, A., Kristiansen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+Microdissection.">Tissue Microdissection.</a> Methods in Molecular Biology. 1381, 39-52 (2016).</li><li>Lovatt, D., Bell, T., Eberwine, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-neuron+isolation+for+RNA+analysis+using+pipette+capture+and+laser+capture+microdissection.">Single-neuron isolation for RNA analysis using pipette capture and laser capture microdissection.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (1), (2015).</li><li>Erickson, H. 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E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recovery+of+high-quality+RNA+from+laser+capture+microdissected+human+and+rodent+pancreas.">Recovery of high-quality RNA from laser capture microdissected human and rodent pancreas.</a> Journal of Histotechnology. 39 (2), 59-65 (2016).</li><li>Clement-Ziza, M., Munnich, A., Lyonnet, S., Jaubert, F., Besmond, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stabilization+of+RNA+during+laser+capture+microdissection+by+performing+experiments+under+argon+atmosphere+or+using+ethanol+as+a+solvent+in+staining+solutions.">Stabilization of RNA during laser capture microdissection by performing experiments under argon atmosphere or using ethanol as a solvent in staining solutions.</a> RNA. 14 (12), 2698-2704 (2008).</li><li>van Dijk, M. C., Rombout, P. D., Dijkman, H. B., Ruiter, D. J., Bernsen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+resolution+by+mounting+of+tissue+sections+for+laser+microdissection.">Improved resolution by mounting of tissue sections for laser microdissection.</a> Molecular Pathology. 56 (4), 240-243 (2003).</li><li>N&#250;&#241;ez, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IDH1-R132H+acts+as+a+tumor+suppressor+in+glioma+via+epigenetic+up-regulation+of+the+DNA+damage+response.">IDH1-R132H acts as a tumor suppressor in glioma via epigenetic up-regulation of the DNA damage response.</a> Science Translational Medicine. 11 (479), (2019).</li><li>Calinescu, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposon+mediated+integration+of+plasmid+DNA+into+the+subventricular+zone+of+neonatal+mice+to+generate+novel+models+of+glioblastoma.">Transposon mediated integration of plasmid DNA into the subventricular zone of neonatal mice to generate novel models of glioblastoma.</a> Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).</li><li>Koschmann, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATRX+loss+promotes+tumor+growth+and+impairs+nonhomologous+end+joining+DNA+repair+in+glioma.">ATRX loss promotes tumor growth and impairs nonhomologous end joining DNA repair in glioma.</a> Science Translational Medicine. 8 (328), (2016).</li><li>Brat, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive,+Integrative+Genomic+Analysis+of+Diffuse+Lower-Grade+Gliomas.">Comprehensive, Integrative Genomic Analysis of Diffuse Lower-Grade Gliomas.</a> The New England Journal of Medicine. 372 (26), 2481-2498 (2015).</li><li>Datta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection:+Big+data+from+small+samples.">Laser capture microdissection: Big data from small samples.</a> Histology and Histopathology. 30 (11), 1255-1269 (2015).</li><li>Lein, E., Borm, L. E., Linnarsson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+promise+of+spatial+transcriptomics+for+neuroscience+in+the+era+of+molecular+cell+typing.">The promise of spatial transcriptomics for neuroscience in the era of molecular cell typing.</a> Science. 358 (6359), 64-69 (2017).</li><li>Gagner, J. P., Zagzag, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+Glioblastoma+Tissue+Heterogeneity+with+Laser+Capture+Microdissection.">Probing Glioblastoma Tissue Heterogeneity with Laser Capture Microdissection.</a> Methods in Molecular Biology. 1741, 209-220 (2018).</li></ol>

Compreender os mecanismos moleculares subjacentes à heterogeneidade e invasão do glioma são de importância crítica para descobrir novos alvos terapêuticos13. Neste manuscrito, descrevemos um método detalhado e otimizado para analisar a paisagem molecular da heterogeneidade e invasão de glioma usando microdissecção de captura a laser (LMD) seguida de análise transcritiva.
A microdissecção de captura a laser (DMD) pode ser usada para identificar diferentes á...

Gliomas são os tumores primários mais agressivos do sistema nervoso central. São altamente invasivos e heterogêneos1. A análise dos componentes celulares e moleculares do tumor revelará novos alvos terapêuticos.
Entre os diferentes métodos disponíveis atualmente, a microdissecção de captura a laser (DLM) do tecido tumoral cerebral congelado é uma técnica econômica e confiável que permite o isolamento de áreas anatômicas discretas ou populações celulares específicas de tecidos tumorais para estudar seu perfil molecular2,3. O LMD permite a análise de perfis de expressão genética mRNA de células individuais selecionadas ou estruturas multicelulares4,5. O LMD pode ser utilizado para obter conhecimento mecanicista aprofundado sobre os eventos moleculares que ocorrem durante a progressão do tumor. A melhoria no processamento dos tecidos tumorais é necessária para obter a resolução óptica ideal da morfologia tecidual e da qualidade do RNA6. Embora a fixação do paraformaldeído seja a melhor opção para a análise morfológica, a qualidade do RNA é afetada e degradada nessas condições, resultando em má qualidade do RNA para análise de RNA-seq. O uso de seções de tecido congelado evita a formação de cristais de gelo, que poderia quebrar membranas celulares e produzir buracos dentro das células, e continua sendo a melhor opção para a análise de RNA-Seq7.
Aqui, descrevemos um método otimizado de fixação e coloração de seção para processar tecidos tumorais cerebrais congelados para LMD. Para evitar que cristais de gelo se formassem no tecido, perfundamos camundongos com uma solução de 30% de sacarose. Esta solução interrompe as interações entre moléculas de água polar e impede a formação de cristais de gelo, preservando a morfologia tecidual. A coloração tecidual é necessária para diferenciar e obter população específica de células ou áreas anatomicamente distintas dentro do tumor. É essencial fixar e manchar o tecido com corantes inócuos para manter a integridade do RNA. Foi demonstrado anteriormente que o tecido de coloração com hematoxilina/eosina (H&E) deteriora a integridade do RNA8. Corrigimos e manchamos o tecido de juros com etanol, cresyl violeta 4% e eosiny y 0,5% soluções. Cresyl violeta é um corante acidofílico que mancha o núcleo celular com uma cor azul escuro. EosinY é um tine basofílico que mancha componentes básicos das células, proporcionando uma distinção entre citoplasma e outras estruturas celulares8. Ambos os corantes são solúveis em etanol e não deterioram a qualidade do RNA. Para evitar danos teciduais e manter alta resolução óptica das estruturas celulares, montamos as seções teciduais antes do LMD9.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Accutase Cell Detachment Solution</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>423201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal-Free Recombinant Human EGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50X), serum free</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer RLT</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning PCR Tubes</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>CLS6530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cresyl Violet Acetate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C5042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 - Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11330057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Y</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E4009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiSeq 4000</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Microdissection (LMD) System</td>
			<td>Leica</td>
			<td>LMD7000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 Supplement (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normocin - Antimicrobial Reagent</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>ant-nr-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peel Away Disposable Embedding Molds</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>70182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEN Membrane Glass Slide (2 &#181;m)</td>
			<td>Lieca</td>
			<td>1150518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pinpoint Solution</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D3001-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human FGF-basic</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-18B-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Research Cryostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM3050s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZap RNase Decontamination Solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Plus Micro Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v2 - Pico Input Mammalian</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>634411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Plus O.C.T. Compound</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-730-571</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

laser capture microdissection of glioma subregions for spatial and molecular characterization of intratumoral heterogeneity, oncostreams, and invasion

Gliomas são tumores cerebrais primários caracterizados por sua invasividade e heterogeneidade. Padrões histológicos específicos como pseudopalisades, proliferação microvascular, transformação mesenquimal e necrose caracterizam a heterogeneidade histológica de gliomas de alto grau. Nosso laboratório demonstrou que a presença de altas densidades de células mesenquimais, denominadas oncostreams, se correlacionam com a malignidade tumoral. Desenvolvemos uma abordagem única para entender os mecanismos que estão por trás do crescimento e da invasão de Glioma. Aqui, descrevemos um protocolo abrangente que utiliza microdissecção de captura a laser (LMD) e sequenciamento de RNA para analisar a expressão diferencial de mRNA de estruturas multicelulares heterogêneas intratumorais (ou seja, áreas mesenquimais ou áreas de invasão de tumor). Este método mantém boa histologia tecidual e integridade do RNA. Perfusão, congelamento, incorporação, secção e coloração foram otimizadas para preservar a morfologia e obter amostras de microdissecção a laser de alta qualidade. Os resultados indicam que a perfusão de camundongos portadores de glioma usando 30% de sacarose fornece boa morfologia e qualidade de RNA. Além disso, as seções de tumor de coloração com 4% de cresípia violeta e 0,5% de eosina resultam em boa coloração nuclear e celular, preservando a integridade do RNA. O método descrito é sensível e altamente reprodutível e pode ser utilizado para estudar a morfologia tumoral em vários modelos tumorais. Em resumo, descrevemos um método completo para realizar ODL que preserva a morfologia e a qualidade do RNA para sequenciamento para estudar as características moleculares de estruturas multicelulares heterogêneas dentro de tumores sólidos.

Nosso laboratório gerou um modelo de rato geneticamente modificado (GEMMs) usando o sistema de transposase da beleza adormecida (Figura 1A). Este sistema incorpora alterações genéticas específicas no genoma de células progenitoras neurais em camundongos neonatais. Estas células progenitoras alteradas formam tumores de glioma endógenos. As sequências plasmáticas utilizadas para gerar os tumores foram: (1) pT2C-LucPGK-SB100X para Tran...

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Laser Capture Microdissection of Glioma Subregions for Spatial and Molecular Characterization of Intratumoral Heterogeneity, Oncostreams, and Invasion

A microdissecção a laser (LMD) é uma técnica sensível e altamente reprodutível que pode ser usada para descobrir caminhos que mediam a heterogeneidade e invasão do glioma. Aqui, descrevemos um protocolo otimizado para isolar áreas discretas do tecido glioma usando LMD a laser seguido de análise transcritiva.

Microdissecção de Captura a Laser de Sub-regiões de Glioma para Caracterização Espacial e Molecular da Heterogeneidade Intratumoral, Oncostreams e Invasão

Gliomas are primary brain tumors characterized by their invasiveness and heterogeneity. Specific histological patterns such as pseudopalisades, ...

Este protocolo utiliza microdissecção a laser e sequenciamento de RNA para analisar a expressão diferencial mRNA da heterogeneidade intratumor, como áreas de acúmulo de células mesenquimais ou áreas de invasão tumoral. Este método foi otimizado para preservar a histologia tecidual de boa qualidade e a integridade do RNA para facilitar a aquisição de amostras de microdisseção a laser de alta qualidade. Este método é sensível e altamente reprodutível.Pode ser utilizado para estudar morfologia tumoral e heterogeneidade em vários modelos tumorais. A microdisseção a laser do tecido tumoral cerebral congelado é uma técnica econômica e confiável para o isolamento de áreas anatômicas discretas de populações celulares de tecidos tumorais para estudar seus perfis moleculares. A LMD pode ser utilizada para obter conhecimento mecanicista aprofundado sobre os eventos moleculares que ocorrem durante a progressão do tumor, e pode revelar novos alvos terapêuticos.Uma bioluminescência in vivo da carga tumoral do camundongo atinge um sinal entre uma vez 10 a seis e uma vezes 10 para o 7º fótons. Flush solução de tirana oxigenada através do sistema circulatório do rato portador de tumor eutanizado até que o fígado e pulmões tenham sido completamente limpos de sangue. Continue perfundando o animal com solução de 30% de sacarose dissolvida em solução de tyrode por mais 15 minutos.Para avaliar o sucesso da perfusão, confirme que o pescoço, cauda e pernas são rígidos no final da circulação. Em seguida, colher o cérebro de acordo com os protocolos padrão e armazenar o cérebro durante a noite em solução fresca de 30% de sacarose. Para se preparar para a criopreservação, encha um frasco com isopentane fria-2-metilbutano e coloque o frasco em um recipiente cheio de nitrogênio líquido.Enquanto o solvente está esfriando, borre o cérebro seco em um pedaço de papel filtro e coloque o cérebro em um Cryomold rotulado. Cuidadosamente em aproximadamente cinco mililitros de temperatura ideal cortando médio para o centro do Cryomold e colocar o cérebro no molde na orientação desejada. Usando fórceps limpos, coloque rapidamente o Cryomold na isopentane-2-metilbutano refrigerado por 30 a 40 segundos.Uma vez que o meio de corte tenha se solidificado, transfira o Cryomold para gelo seco e enrole o tecido cerebral congelado cryomold e encaixe tecido cerebral congelado em papel alumínio para menos 80 graus Celsius de armazenamento. Para adquirir seções congeladas de tecido tumoral cerebral, primeiro defina a temperatura de um criostat entre menos 20 e menos 24 graus Celsius, e coloque o bloco amostral na câmara criostat por 30 a 60 minutos. Enquanto a amostra estiver equilibrando, limpe a câmara e o porta-faca com 100% de etanol e pulverize os pincéis da seção com solução de limpeza RNase.Quando a amostra estiver pronta, remova o molde e use meio de corte fresco para anexar o bloco de tecido congelado ao disco de espécime do criostat. Coloque o bloco no suporte do disco e alinhe o bloco com a lâmina da faca. Adquira 10 seções de micrômetros do cérebro usando um dos pincéis livres de Rnase para achatar cuidadosamente e desenrolar os pedaços de tecido na superfície de corte.Para montar as seções de tecido cerebral nas lâminas, pressione suavemente o lado carregado positivamente de um deslizamento de vidro PEN sem RNase rotulado sobre a seção e coloque o slide em uma caixa de armazenamento dentro da câmara. Quando todos os slides tiverem sido coletados, coloque a caixa de armazenamento a menos 80 graus Celsius. Para dissolver o meio de corte antes da micro dissecção a laser, submergir os slides em imersões sequenciais de etanol descendente de 30 segundos seguidas por coloração de solução violeta cristalina por 20 segundos e cinco segundos em solução 0,5% eosina Y.No final da incubação eosin Y, use papel filtro para bloquear os slides secos e desidratar os slides em imersões sequenciais ascendentes de etanol. Após a imersão de etanol de 60 segundos, enxágue os slides em um recipiente de xileno por três minutos. Em seguida, seque as lâminas na superfície livre de RNase à temperatura ambiente por 10 segundos antes de montar as amostras em meio de montagem preparado com água livre de RNase.Após 10 a 20 segundos, transfira os slides para a plataforma de microdisseção do microscópio. Para microdisseção de captura a laser, ligue a energia antes de ligar o laser. Em seguida, ligue o controlador de microscópio no computador e inicie o software de microdisseção de captura a laser.No painel Controle do Microscópio, selecione a ampliação de 10 vezes. Sob controle a laser, defina os parâmetros laser para dissecção tecidual e selecione uma frequência laser de 120 hertz e uma corrente laser de 100% Para microdisseção a laser precisa, defina a velocidade para 10 e defina a abertura para 10 micrômetros. Em seguida, afina a energia para 53.Carregue o coletor de tecido que capturará o tecido após a seção e clique no segundo botão Descarregar. Substitua o coletor vazio por tubos de cabeça plana PCR de 0,5 mililitros sem Dase e sem rnase contendo 30 microliters de tampão de lise por tubo. Devolva o coletor para a máquina e clique para continuar.Carregue a amostra processada no microscópio e clique em Descarregar no software de microdisseção a laser. Suba a amostra no suporte de slides e coloque o suporte de slides no palco. Clique em Continuar e selecione Cortar o corte na janela Formas de Corte.Use os controles de microscópio para encontrar a área de interesse e desenhar um contorno em torno da região de interesse. Em seguida, selecione um tubo coletor de destino e clique em Iniciar corte para prosseguir a microdisseção do tecido. Quando todas as áreas de interesse forem dissecadas, transfira os tubos coletores do suporte para o gelo seco até que estejam em processamento a jusante.Para adquirir tecidos com morfologia superior e integridade do RNA, foram avaliadas várias abordagens de perfusão. Para dissecar as áreas de interesse, é necessário manchar os tecidos com corantes inócuos para RNA. A perfusão subsequente de camundongos portadores de tumor com solução de tyrode e 30% de sacarose seguida de uma incubação durante a noite em 30% de sacarose resulta na preservação da morfologia e integridade do RNA do tecido do camundongo.Embora a fixação do tecido paraformaldeído resulte em uma morfologia tecidual de alta qualidade, a integridade do RNA é impactada negativamente. Outras abordagens como o uso de uma incubação de solução de tyrode, ou solução de tyrode mais incubações de solução de sacarose de 30% não afetam a qualidade do RNA, mas observa-se uma resolução reduzida na morfologia tecidual. Se os tecidos não forem montados com meio de montagem, as seções ficam desidratadas e a morfologia se deteriora enquanto a montagem das amostras de tecido com 15% de montagem média dissolvida na água mantém uma morfologia tecidual de alta qualidade.A imagem do microscópio de microdisseção de captura a laser permite a seleção do tecido tumoral para dissecção. Essa região de seleção de interesse permite, então, dissecção de áreas de interesse dentro de cada amostra de tecido para análise de integridade do RNA. Manter uma morfologia de tecido tumoral de alta qualidade e integridade do RNA é fundamental.A solução de tyrode e a perfusão de 30% de sacarose com preservação durante a noite em 30% de sacarose melhora significativamente a morfologia tecidual para LMD. A fixação rápida de lyoma, coloração e montagem com solução DE GAN é um passo fundamental para preservar a qualidade do RNA e evitar que as rachaduras se formem dentro do tecido. Recomendamos seccionar pelo menos 2,5 vezes 10 para o 6º tumor total de micrômetros quadrados por área de tecido para obter quantidades apropriadas de RNA para controle de qualidade de RNA e análise transcriômica.A LMD permite a análise das vias de sinalização molecular que regulam a heterogeneidade e a invasão do glioma que poderiam revelar novos alvos potenciais para o desenvolvimento translacional futuro em modelos de glioma pré-clínico.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

Laser Microdissecção Captura de Drosophila Neurônios periféricos

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the ...

Neurociência

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling  |

Laser não-Abordagem Microscopia de captura para o Microdissecção de regiões cerebrais discretas Mouse para isolamento de RNA total e Seqüenciamento Next-Generation Downstream e perfil de expressão gênica

As technological platforms, approaches such as next-generation sequencing, microarray, and qRT-PCR have great promise for expanding our understanding of ...

Laser Capture Microdissection of Enriched Populations of Neurons or Single Neurons for Gene Expression Analysis After Traumatic Brain Injury

Laser Microdissecção Captura de Populações enriquecida de neurônios ou neurônios individuais para análise de expressão gênica após a lesão cerebral traumática

Long-term cognitive disability after TBI is associated with injury-induced neurodegeneration in the hippocampus-a region in the medial temporal lobe that ...

Laser Capture Microdissection of Neurons from Differentiated Human Neuroprogenitor Cells in Culture

Captura Laser Microdissecção de neurônios a partir de células diferenciadas neuroprogenitoras humanas em cultura

Neuroprogenitor cells (NPCs) isolated from the human fetal brain were expanded under proliferative conditions in the presence of epidermal growth factor ...

Production of RNA for Transcriptomic Analysis from Mouse Spinal Cord Motor Neuron Cell Bodies by Laser Capture Microdissection

Produção de RNA para análise transcriômica de corpos celulares de neurônio motor da medula espinhal do rato por microdisseção de captura a laser

Preparation of high-quality RNA from cells of interest is critical to precise and meaningful analysis of transcriptional differences among cell types or ...

Olfactory Neurons Obtained through Nasal Biopsy Combined with Laser-Capture Microdissection: A Potential Approach to Study Treatment Response in Mental Disorders

Neurônios olfativos obtida através Nasal Biópsia Combinada com Laser-Capture Microdissection: Uma Abordagem Potencial para tratamento estudo Response em Transtornos Mentais

Bipolar disorder (BD) is a severe neuropsychiatric disorder with poorly understood pathophysiology and typically treated with the mood stabilizer, lithium ...

Laser Capture Microdissection - A Demonstration of the Isolation of Individual Dopamine Neurons and the Entire Ventral Tegmental Area

Captura Laser Microdissection - uma demonstração do Isolamento de Pessoa dopamina Neurônios e região ventral tegmental Entire

Laser capture microdissection (LCM) is used to isolate a concentrated population of individual cells or precise anatomical regions of tissue from tissue ...

Stereotactic Atlas-Guided Laser Capture Microdissection of Brain Regions Affected by Traumatic Injury

Estereotáxica guiada por Atlas Laser Microdissection de captura de regiões do cérebro afetadas por lesão traumática

The ability to isolate specific brain regions of interest can be impeded in tissue disassociation techniques that do not preserve their spatial ...

Optimization of Laser-Capture Microdissection for the Isolation of Enteric Ganglia from Fresh-Frozen Human Tissue

Otimização de captura Laser Microdissection para o isolamento dos gânglios entéricos de tecido humano fresco congelado

The purpose of this method is to obtain high-integrity RNA samples from enteric ganglia collected from unfixed, freshly-resected human intestinal tissue ...

A Stainless Protocol for High Quality RNA Isolation from Laser Capture Microdissected Purkinje Cells in the Human Post-Mortem Cerebellum

Um protocolo de aço inoxidável para isolamento de RNA de alta qualidade do Laser capturar células de Microdissected Purkinje no cerebelo humano Post Mortem

Laser capture microdissection (LCM) is an advantageous tool that allows for the collection of cytologically and/or phenotypically relevant cells or ...