Name: laser capture microdissection of glioma subregions for spatial and molecular characterization of intratumoral heterogeneity, oncostreams, and invasion
Uploaded: 2020-04-12T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Laser Capture Microdissection of Glioma Subregions for Spatial and Molecular Characterization of Intratumoral Heterogeneity, Oncostreams, and Invasion at JoVE

Работа была поддержана Национальными институтами здравоохранения ( NIH/NINDS) Гранты: R37-NS094804, R01-NS105556, R21-NS107894 до M.G.C.; (NIH/NINDS) Гранты R01-NS076991, R01-NS096756, R01-NS082311 до P.R.L.; (NIH/NIBI): R01-EB022563; (NIH/NCI) U01CA224160; Кафедра нейрохирургии, онкологический центр Рогела в Мичиганском университете, Фонд Чада Tough и Фонд «Счастливые сердца» Лии для M.G.C. и P.R.L. RNA Biomedicine Grant F046166 для M.G.C. Национальные институты здравоохранения, UL1 TR002240 для Мичиганского института клинических и медицинских исследований (MICHR), Postdoctoral Translation Проект F049768 в Университет е.С. Мичиганский институт исследований рака Forbes, Врач-ученый премии от исследований по предотвращению слепоты, Inc (RPB), грант R01 EY022633 от NEI NIH (AK), и неограниченный грант от RPB на кафедру офтальмологии и визуальных наук. В этом исследовании использовались Научно-исследовательское ядро зрения (P30 EY007003) и Научно-исследовательское ядро онкологического центра (P30 CA046592). АК поддерживается г-жой Уильям Дэвидсон Emerging Scholar Award от Медицинского научно-исследовательского института имени А. Альфреда Таубмана.

Все методы, описанные здесь, что использование экспериментальных животных были одобрены институционального ухода за животными и использования комитета (IACUC) Мичиганского университета.
ПРИМЕЧАНИЕ: Глиома нейросфер, генерируемых из GEMM или стабильные линии могут быть исп?...

<ol>
	<li>Reifenberger, G., Wirsching, H. G., Knobbe-Thomsen, C. B., Weller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+the+molecular+genetics+of+gliomas+-+implications+for+classification+and+therapy.">Advances in the molecular genetics of gliomas - implications for classification and therapy.</a> Nature Reviews Clinical Oncology. 14 (7), 434-452 (2017).</li><li>Espina, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser-capture+microdissection.">Laser-capture microdissection.</a> Nature Protocols. 1 (2), 586-603 (2006).</li><li>Rabien, A., Kristiansen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+Microdissection.">Tissue Microdissection.</a> Methods in Molecular Biology. 1381, 39-52 (2016).</li><li>Lovatt, D., Bell, T., Eberwine, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-neuron+isolation+for+RNA+analysis+using+pipette+capture+and+laser+capture+microdissection.">Single-neuron isolation for RNA analysis using pipette capture and laser capture microdissection.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (1), (2015).</li><li>Erickson, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+RT-PCR+gene+expression+analysis+of+laser+microdissected+tissue+samples.">Quantitative RT-PCR gene expression analysis of laser microdissected tissue samples.</a> Nature Protocols. 4 (6), 902-922 (2009).</li><li>Cheng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser-assisted+microdissection+in+translational+research:+theory,+technical+considerations,+and+future+applications.">Laser-assisted microdissection in translational research: theory, technical considerations, and future applications.</a> Applied Immunohistochemistry &amp; Molecular Morphology. 21 (1), 31-47 (2013).</li><li>Butler, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recovery+of+high-quality+RNA+from+laser+capture+microdissected+human+and+rodent+pancreas.">Recovery of high-quality RNA from laser capture microdissected human and rodent pancreas.</a> Journal of Histotechnology. 39 (2), 59-65 (2016).</li><li>Clement-Ziza, M., Munnich, A., Lyonnet, S., Jaubert, F., Besmond, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stabilization+of+RNA+during+laser+capture+microdissection+by+performing+experiments+under+argon+atmosphere+or+using+ethanol+as+a+solvent+in+staining+solutions.">Stabilization of RNA during laser capture microdissection by performing experiments under argon atmosphere or using ethanol as a solvent in staining solutions.</a> RNA. 14 (12), 2698-2704 (2008).</li><li>van Dijk, M. C., Rombout, P. D., Dijkman, H. B., Ruiter, D. J., Bernsen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+resolution+by+mounting+of+tissue+sections+for+laser+microdissection.">Improved resolution by mounting of tissue sections for laser microdissection.</a> Molecular Pathology. 56 (4), 240-243 (2003).</li><li>N&#250;&#241;ez, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IDH1-R132H+acts+as+a+tumor+suppressor+in+glioma+via+epigenetic+up-regulation+of+the+DNA+damage+response.">IDH1-R132H acts as a tumor suppressor in glioma via epigenetic up-regulation of the DNA damage response.</a> Science Translational Medicine. 11 (479), (2019).</li><li>Calinescu, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposon+mediated+integration+of+plasmid+DNA+into+the+subventricular+zone+of+neonatal+mice+to+generate+novel+models+of+glioblastoma.">Transposon mediated integration of plasmid DNA into the subventricular zone of neonatal mice to generate novel models of glioblastoma.</a> Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).</li><li>Koschmann, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATRX+loss+promotes+tumor+growth+and+impairs+nonhomologous+end+joining+DNA+repair+in+glioma.">ATRX loss promotes tumor growth and impairs nonhomologous end joining DNA repair in glioma.</a> Science Translational Medicine. 8 (328), (2016).</li><li>Brat, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive,+Integrative+Genomic+Analysis+of+Diffuse+Lower-Grade+Gliomas.">Comprehensive, Integrative Genomic Analysis of Diffuse Lower-Grade Gliomas.</a> The New England Journal of Medicine. 372 (26), 2481-2498 (2015).</li><li>Datta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection:+Big+data+from+small+samples.">Laser capture microdissection: Big data from small samples.</a> Histology and Histopathology. 30 (11), 1255-1269 (2015).</li><li>Lein, E., Borm, L. E., Linnarsson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+promise+of+spatial+transcriptomics+for+neuroscience+in+the+era+of+molecular+cell+typing.">The promise of spatial transcriptomics for neuroscience in the era of molecular cell typing.</a> Science. 358 (6359), 64-69 (2017).</li><li>Gagner, J. P., Zagzag, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+Glioblastoma+Tissue+Heterogeneity+with+Laser+Capture+Microdissection.">Probing Glioblastoma Tissue Heterogeneity with Laser Capture Microdissection.</a> Methods in Molecular Biology. 1741, 209-220 (2018).</li></ol>

Понимание молекулярных механизмов, лежащих в основе неоднородности глиомы и вторжения имеют решающее значение для выявления новых терапевтических целей13. В этой рукописи мы описываем подробный и оптимизированный метод анализа молекулярного ландшафта неоднородности гл?...

Глиомы являются наиболее агрессивными первичными опухолями центральной нервной системы. Они очень инвазивные и неоднородные1. Анализ клеточных и молекулярных компонентов опухоли выявит новые терапевтические цели.
Среди различных методов в настоящее время доступны, лазерный захват микродиссекции (LMD) замороженных тканей опухоли головного мозга является экономически эффективным, надежным методом, который позволяет изоляции отдельных анатомических областях или конкретных популяций клеток из опухолевых тканей для изучения их молекулярного профиля2,3. LMD позволяет анализанализ мРНК генэкспрессии профилей отдельных клеток или многоклеточных структур4,5. LMD может быть использован для получения углубленных механических знаний о молекулярных событиях, которые происходят во время прогрессирования опухоли. Улучшение обработки опухолевых тканей необходимо для получения оптимального оптического разрешения морфологии тканей и РНК-качества6. Хотя параформальдегид фиксации является лучшим вариантом для морфологического анализа, качество РНК влияет и ухудшается в этих условиях, в результате чего плохое качество РНК для анализа РНК-сек. Использование замороженных секций ткани позволяет избежать образования кристалла льда, которые могут сломать клеточные мембраны и производить отверстия в клетках, и остается лучшим вариантом для анализа РНК-Seq7.
Здесь мы описываем оптимизированный метод фиксации секции и окрашивания для обработки замороженных тканей опухоли мозга мыши для LMD. Чтобы предотвратить образование кристаллов льда в тканях, мы проникнуты мышам раствором 30% сахарозы. Это решение нарушает взаимодействие между молекулами полярной воды и предотвращает образование кристаллов льда, сохраняя морфологию тканей. Ткань окрашивания необходимо дифференцировать и получить конкретные популяции клеток или анатомически различных областях в опухоли. Важно, чтобы исправить и испачкать ткани безобидными красителей для поддержания целостности РНК. Ранее было показано, что окрашивание ткани гематоксилин / эозин (H и E) ухудшает целостность РНК8. Мы зафиксировали и запятнали ткани интереса с этанолом, cresyl фиолетовым 4% и eosin Y 0.5% разрешениями. Кресил фиолетовый является ацидофильные красителя, который пятна ядра клетки с темно-синим цветом. Eosin Y является базофильной красителя, который пятна основных компонентов клеток, обеспечивая различие между цитоплазмы и других клеточных структур8. Оба красителей растворяются в этаноле и не ухудшают качество РНК. Чтобы избежать повреждения тканей и поддерживать высокое оптическое разрешение клеточных структур, мы смонтировали секции тканей до LMD9.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Accutase Cell Detachment Solution</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>423201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal-Free Recombinant Human EGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50X), serum free</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer RLT</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning PCR Tubes</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>CLS6530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cresyl Violet Acetate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C5042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 - Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11330057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Y</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E4009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiSeq 4000</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Microdissection (LMD) System</td>
			<td>Leica</td>
			<td>LMD7000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 Supplement (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normocin - Antimicrobial Reagent</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>ant-nr-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peel Away Disposable Embedding Molds</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>70182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEN Membrane Glass Slide (2 &#181;m)</td>
			<td>Lieca</td>
			<td>1150518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pinpoint Solution</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D3001-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human FGF-basic</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-18B-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Research Cryostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM3050s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZap RNase Decontamination Solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Plus Micro Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v2 - Pico Input Mammalian</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>634411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Plus O.C.T. Compound</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-730-571</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

laser capture microdissection of glioma subregions for spatial and molecular characterization of intratumoral heterogeneity, oncostreams, and invasion

Глиомы являются первичными опухолями головного мозга, характеризующимся их инвазивностью и неоднородностью. Специфические гистологические модели, такие как псевдопализады, микрососудистая пролиферация, мезенхимальная трансформация и некроз характеризуют гистологическую неоднородность полноценных глиом. Наша лаборатория показала, что наличие высокой плотности мезенхимальных клеток, названных онкостримами, коррелирует со злокачественностью опухоли. Мы разработали уникальный подход к пониманию механизмов, лежащих в основе роста и вторжения глиомы. Здесь мы описываем всеобъемлющий протокол, который использует лазерный захват микродиссекции (LMD) и секвенирования РНК для анализа дифференциального мРНК выражение внутриопухолевых неоднородных многоклеточных структур (т.е. мезенхимальных областей или областей вторжения опухоли). Этот метод поддерживает хорошую гистологию тканей и целостность РНК. Перфузия, замораживание, встраивание, секционирование и окрашивание были оптимизированы для сохранения морфологии и получения высококачественных образцов лазерной микродиссекции. Результаты показывают, что перфузия глиомы подшипников мышей с использованием 30% сахарозы обеспечивает хорошее морфологии и качества РНК. Кроме того, окрашивание опухолевых секций с 4% Cresyl фиолетовый и 0,5% эозин приводит к хорошему ядерному и клеточному окрашиванию, сохраняя при этом целостность РНК. Описанный метод является чувствительным и высоко воспроизводимым и может быть использован для изучения морфологии опухоли в различных моделях опухолей. Таким образом, мы описываем полный метод для выполнения LMD, который сохраняет морфологию и качество РНК для секвенирования для изучения молекулярных особенностей неоднородных многоклеточных структур в твердых опухолях.

Наша лаборатория создала генетически модифицированные модели мыши (GEMMs) с использованием спящей системы транспозазии красоты(рисунок 1A). Эта система включает в себя конкретные генетические изменения в геном нервных клеток-прародителей у нео?...

Watch this Scientific Journal Video about Laser Capture Microdissection of Glioma Subregions for Spatial and Molecular Characterization of Intratumoral Heterogeneity, Oncostreams, and Invasion at JoVE

Laser Capture Microdissection of Glioma Subregions for Spatial and Molecular Characterization of Intratumoral Heterogeneity, Oncostreams, and Invasion

Лазерная микродиссекция (LMD) является чувствительным и высоко воспроизводимым методом, который может быть использован для выявления путей, которые посредничают неоднородность глиомы и вторжения. Здесь мы описываем оптимизированный протокол для изоляции дискретных областей от глиомной ткани с помощью лазерного LMD с последующим транскриптомическим анализом.

Лазерная захват микродиссекция субрегионов глиомы для пространственной и молекулярной характеристики внутриопухолевой гетерогени, онкостримов и вторжения

Gliomas are primary brain tumors characterized by their invasiveness and heterogeneity. Specific histological patterns such as pseudopalisades, ...

Этот протокол использует лазерное микроперепись и секвенирование РНК для анализа дифференциального экспрессии мРНК внутриопухолустной неоднородности, таких как области накопления мезенхимальных клеток или области вторжения опухоли. Этот метод был оптимизирован для сохранения гистологии тканей хорошего качества и целостности РНК, чтобы облегчить приобретение высококачественных образцов лазерного микродиссекции. Этот метод чувствителен и воспроизводим.Он может быть использован для изучения морфологии опухоли и неоднородности в различных моделях опухолей. Лазерная микроперемидание замороженных опухолевых тканей головного мозга является экономически эффективным, надежным методом изоляции дискретных анатомических областей популяций клеток от опухолевых тканей для изучения их молекулярных профилей. LMD можно использовать для того чтобы приобрести углубленное механистическое знание о молекулярных событиях которые происходят во время прогрессирования тумора, и смогли показать новые терапевтические цели.Виво биолюминесценции опухоли мыши бремя достигает сигнала от одного раза 10 до шести и один раз от 10 до 7 фотонов. Промыть кислородом раствор тирода через кровеносную систему усыпанной опухоленосной мыши до тех пор, пока печень и легкие не будут полностью очищены от крови. Продолжить perfusing животное с 30% растворяемой сахарозой растворяется в растворе тирода в течение еще 15 минут.Чтобы оценить успех перфузии, подтвердите, что шея, хвост и ноги являются жесткими в конце циркуляции. Затем урожай мозга в соответствии со стандартными протоколами и хранить мозг на ночь в свежем 30% раствор сахарозы. Чтобы подготовиться к криоконсервации, заполните банку холодным изопентаном-2-метилбутаном и поместите банку в контейнер, наполненный жидким азотом.В то время как растворитель охлаждается, пятно мозга сухой на листе фильтровальной бумаги и поместите мозг в помечены Cryomold. Тщательно примерно при пяти миллилитров оптимальной температуры резки среды к центру Cryomold и место мозга в форму в желаемой ориентации. Используя чистые типсы, быстро поместите Cryomold в охлажденный изопентан-2-метилбутан в течение 30 до 40 секунд.После того, как режущая среда затвердевает, перенесите Cryomold на сухой лед и оберните Cryomold и оснастки замороженных тканей мозга в алюминиевой фольге для минус 80 градусов по Цельсию хранения. Чтобы приобрести замороженные участки опухолевых тканей головного мозга, сначала установите температуру криостата между минус 20 и минус 24 градусами по Цельсию, и поместите блок образца в криостат-камеру на 30-60 минут. В то время как образец equilibrating, очистить камеру и нож держатель со 100% этанола и спрей раздел кисти с RNase очистки раствора.Когда образец будет готов, удалить плесень и использовать свежие резки среды прикрепить замороженные ткани блока к образцу диска криостата. Поместите блок в держатель диска и выровнять блок с лезвием ножа. Приобрети 10 микрометровых секций мозга с помощью одной из кистей без Рнкса, чтобы тщательно сгладить и разнести кусочки ткани на режущей поверхности.Чтобы смонтировать секции ткани мозга на слайды, плавно нажмите положительно заряженную сторону помеченного RNase-бесплатного пен-стеклянного слайда на секцию и поместите слайд в ящик для хранения внутри камеры. Когда все слайды будут собраны, поместите ящик для хранения при температуре минус 80 градусов по Цельсию. Чтобы растворить режущей среды до лазерного микро рассечения, погрузите слайды в 30-секундный последовательный нисходящий этанол погружения следуют кристально фиолетовый раствор окрашивания в течение 20 секунд и пять секунд в 0,5%eosin Y решение.В конце инкубации эозин Y используйте фильтровальную бумагу, чтобы заблокировать слайды сухими и обезвоживать слайды в последовательных восходящих погружениях этанола. После 60-секундного погружения этанола, промыть слайды в контейнере с ксиленом в течение трех минут. Затем высушите горки на поверхности, свободной от RNase, при комнатной температуре в течение 10 секунд, прежде чем монтировать образцы в монтажной среде, приготовленной с помощью воды без RNase.Через 10-20 секунд перенесите слайды на платформу микродиссекции микроскопа. Для захвата лазером микроперегибатель, включите питание перед включением лазера. Затем включите контроллер микроскопа в компьютере и запустите программное обеспечение для микродиссекции захвата лазера.В панели управления микроскопом выберите увеличение в 10 раз. Под лазерным управлением установите лазерные параметры для вскрытия тканей и выберите лазерную частоту 120 герц и лазерный ток 100% Для точного лазерного микроперемечения установите скорость до 10 и установите диафрагму до 10 микрометров. Затем установите мощность до 53.Загрузите коллектор тканей, который захватит ткань после раздела и нажмите на вторую кнопку разгрузки. Замените пустой коллектор на DNase и Rnase-бесплатные 0,5 миллилитровые плоскоголовые трубки PCR, содержащие 30 микролитров буфера лиза на трубку. Верните коллектор к машине и нажмите продолжить работу.Загрузите обработанный образец на микроскоп и нажмите Unload в программном обеспечении для микропересмешки лазера. Вверх по образцу на держатель слайда и поместите держатель слайда на сцену. Нажмите Продолжить продолжить и выбрать Draw Cut в окне Cut формы.Используйте микроскоп управления, чтобы найти область интереса и нарисовать наброски вокруг области интересов. Затем выберите трубку для сборщика назначения и нажмите Start Cut, чтобы продолжить микропересасывание тканей. Когда все области, представляющие интерес, будут вскрыты, перенесите коллекторные трубки из держателя на сухой лед до тех пор, пока они не будут обрабатываться ниже по течению.Для приобретения тканей с превосходной морфологией и целостностью РНК оценивались различные перфузионное подходы. Чтобы вскрыть области интереса, необходимо окрашивать ткани безобидными красителями для РНК. Последующая перфузия опухолевых мышей с раствором тирода и 30%сахарозой, за которой следует ночная инкубация в 30% сахарозы, приводит к сохранению морфологии и целостности РНК ткани мыши.Хотя фиксация параформальдегидной ткани приводит к высокое качество морфологии тканей, целостность РНК негативно влияет. Другие подходы, такие как использование инкубации раствора тирода, или раствор тирода плюс 30% инкубации раствора сахарозы, не влияют на качество РНК, но наблюдается снижение разрешения в морфологии тканей. Если ткани не монтируются с монтажной средой, секции обезвоживаются и морфология ухудшается при монтаже образцов тканей с 15%mounting среды растворяется в воде поддерживает высокое качество морфологии тканей.Лазерная визуализация микроскопа захвата позволяет получить выбор опухолевой ткани для вскрытия. Эта область выбора интереса затем позволяет вскрытие областей, представляющих интерес в каждом образце ткани для анализа целостности РНК. Поддержание высокого качества морфологии опухолевых тканей и целостности РНК имеет решающее значение.Тиродный раствор и 30% перфузия сахарозы с сохранением на ночь в 30%сахарозе значительно улучшают морфологию тканей для LMD. Быстрая фиксация лиомы, окрашивание и монтаж раствором GAN является критическим шагом к сохранению качества РНК и предотвращению образования трещин в тканях. Мы рекомендуем секции по крайней мере 2,5 раза от 10 до 6 квадратных микрометров общей опухоли на область ткани, чтобы получить соответствующее количество РНК для контроля качества РНК и транскриптомного анализа.LMD позволяет проводить анализ молекулярных сигнальных путей, которые регулируют глиомную гетерогенность и вторжение, которые могут выявить новые потенциальные цели для будущего трансляционного развития в доклиникальных моделях глиомы.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

Лазерная Захват микродиссекции Drosophila Периферийные Нейроны

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the ...

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling  |

Номера для лазерной микроскопии Захват подход к микродиссекция дискретных областей мозга мыши для полной изоляции РНК и переработки нового поколения Секвенирование и профилирование экспрессии генов

As technological platforms, approaches such as next-generation sequencing, microarray, and qRT-PCR have great promise for expanding our understanding of ...

Laser Capture Microdissection of Enriched Populations of Neurons or Single Neurons for Gene Expression Analysis After Traumatic Brain Injury

Лазерная Capture Microdissection обогащенного популяции нейронов или отдельных нейронов для генного анализа выражения после черепно-мозговой травмы

Long-term cognitive disability after TBI is associated with injury-induced neurodegeneration in the hippocampus-a region in the medial temporal lobe that ...

Laser Capture Microdissection of Neurons from Differentiated Human Neuroprogenitor Cells in Culture

Лазерная Захват микродиссекция нейронов от Дифференцированный человека нейрональные клетки в культуре

Neuroprogenitor cells (NPCs) isolated from the human fetal brain were expanded under proliferative conditions in the presence of epidermal growth factor ...

Production of RNA for Transcriptomic Analysis from Mouse Spinal Cord Motor Neuron Cell Bodies by Laser Capture Microdissection

Производство РНК для транскриптомного анализа от мыши спинного мозга Моторные нейронные клетки органов лазерного захвата microdissection

Preparation of high-quality RNA from cells of interest is critical to precise and meaningful analysis of transcriptional differences among cell types or ...

Olfactory Neurons Obtained through Nasal Biopsy Combined with Laser-Capture Microdissection: A Potential Approach to Study Treatment Response in Mental Disorders

Обонятельных нейронов, полученных с помощью носовой биопсии в сочетании с лазерной съемки микродиссекции: возможный подход к исследуемым препаратом ответ психических расстройств

Bipolar disorder (BD) is a severe neuropsychiatric disorder with poorly understood pathophysiology and typically treated with the mood stabilizer, lithium ...

Laser Capture Microdissection - A Demonstration of the Isolation of Individual Dopamine Neurons and the Entire Ventral Tegmental Area

Лазерная Захват микродиссекция - Демонстрация изоляции отдельных допамина нейронами и вся область брюшной покрышки

Laser capture microdissection (LCM) is used to isolate a concentrated population of individual cells or precise anatomical regions of tissue from tissue ...

Stereotactic Atlas-Guided Laser Capture Microdissection of Brain Regions Affected by Traumatic Injury

Стереотаксическая Атлас руководствуясь лазерная захватить Microdissection регионов мозга, пострадавших от травмы

The ability to isolate specific brain regions of interest can be impeded in tissue disassociation techniques that do not preserve their spatial ...

Optimization of Laser-Capture Microdissection for the Isolation of Enteric Ganglia from Fresh-Frozen Human Tissue

Оптимизации лазер захват Microdissection для изоляции кишечных ганглиев от свежемороженые тканей человека

The purpose of this method is to obtain high-integrity RNA samples from enteric ganglia collected from unfixed, freshly-resected human intestinal tissue ...

A Stainless Protocol for High Quality RNA Isolation from Laser Capture Microdissected Purkinje Cells in the Human Post-Mortem Cerebellum

Нержавеющая протокол для высокого качества изоляции РНК от лазерного захват клеток Пуркинье Microdissected мозжечка человека Post-Mortem

Laser capture microdissection (LCM) is an advantageous tool that allows for the collection of cytologically and/or phenotypically relevant cells or ...