Name: laser capture microdissection of glioma subregions for spatial and molecular characterization of intratumoral heterogeneity, oncostreams, and invasion
Uploaded: 2020-04-12T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Laser Capture Microdissection of Glioma Subregions for Spatial and Molecular Characterization of Intratumoral Heterogeneity, Oncostreams, and Invasion at JoVE

Arbetet stöddes av National Institutes of Health, (NIH/NINDS) Bidrag: R37-NS094804, R01-NS105556, R21-NS107894 till M.G.C.; (NIH/NINDS) Bidrag R01-NS076991, R01-NS096756, R01-NS082311 till P.R.L.; (NIH/NIBI): R01-EB022563; (NIH/NCI) U01CA224160; Institutionen för neurokirurgi, Rogel Cancer Center vid University of Michigan, ChadTough Foundation, och Leah's Happy Hearts Foundation till M.G.C. och P.R.L. RNA Biomedicin Grant F046166 till M.G.C. National Institutes of Health, UL1 TR002240 för Michigan Institute for Clinical and Health Research (MICHR), Postdoc Translational Scholars Program (PTSP) bidrag, Projekt F049768 till A.C. University of Michigan Forbes Cancer Research Institute, en läkare-forskare Award from Research to Prevent Blindness, Inc. (RPB), bevilja R01 EY022633 från NEI i NIH (AK), och ett obegränsat bidrag från RPB till institutionen för oftalmologi och visuella vetenskaper. Denna forskning utnyttjade Vision Research Core (P30 EY007003), och Cancer Center Research Core (P30 CA046592). AK stöds av Mrs William Davidson Emerging Scholar Award från A. Alfred Taubman Medical Research Institute.

Alla metoder som beskrivs här som använder försöksdjur har godkänts av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) vid University of Michigan.
OBS: Glioma neurospheres genereras från en GEMM eller stabila linjer kan användas för intrakraniell tumör engraftment hos möss10 och bearbetas för LMD och RNA sekvensering. Dessa celler utgörs av uttryckliga firefly luciferas och GFP proteiner, som kommer att utnyttjas ytterligare för tumör tillväxt analys ...

<ol>
	<li>Reifenberger, G., Wirsching, H. G., Knobbe-Thomsen, C. B., Weller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+the+molecular+genetics+of+gliomas+-+implications+for+classification+and+therapy.">Advances in the molecular genetics of gliomas - implications for classification and therapy.</a> Nature Reviews Clinical Oncology. 14 (7), 434-452 (2017).</li><li>Espina, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser-capture+microdissection.">Laser-capture microdissection.</a> Nature Protocols. 1 (2), 586-603 (2006).</li><li>Rabien, A., Kristiansen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+Microdissection.">Tissue Microdissection.</a> Methods in Molecular Biology. 1381, 39-52 (2016).</li><li>Lovatt, D., Bell, T., Eberwine, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-neuron+isolation+for+RNA+analysis+using+pipette+capture+and+laser+capture+microdissection.">Single-neuron isolation for RNA analysis using pipette capture and laser capture microdissection.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (1), (2015).</li><li>Erickson, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+RT-PCR+gene+expression+analysis+of+laser+microdissected+tissue+samples.">Quantitative RT-PCR gene expression analysis of laser microdissected tissue samples.</a> Nature Protocols. 4 (6), 902-922 (2009).</li><li>Cheng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser-assisted+microdissection+in+translational+research:+theory,+technical+considerations,+and+future+applications.">Laser-assisted microdissection in translational research: theory, technical considerations, and future applications.</a> Applied Immunohistochemistry &amp; Molecular Morphology. 21 (1), 31-47 (2013).</li><li>Butler, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recovery+of+high-quality+RNA+from+laser+capture+microdissected+human+and+rodent+pancreas.">Recovery of high-quality RNA from laser capture microdissected human and rodent pancreas.</a> Journal of Histotechnology. 39 (2), 59-65 (2016).</li><li>Clement-Ziza, M., Munnich, A., Lyonnet, S., Jaubert, F., Besmond, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stabilization+of+RNA+during+laser+capture+microdissection+by+performing+experiments+under+argon+atmosphere+or+using+ethanol+as+a+solvent+in+staining+solutions.">Stabilization of RNA during laser capture microdissection by performing experiments under argon atmosphere or using ethanol as a solvent in staining solutions.</a> RNA. 14 (12), 2698-2704 (2008).</li><li>van Dijk, M. C., Rombout, P. D., Dijkman, H. B., Ruiter, D. J., Bernsen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+resolution+by+mounting+of+tissue+sections+for+laser+microdissection.">Improved resolution by mounting of tissue sections for laser microdissection.</a> Molecular Pathology. 56 (4), 240-243 (2003).</li><li>N&#250;&#241;ez, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IDH1-R132H+acts+as+a+tumor+suppressor+in+glioma+via+epigenetic+up-regulation+of+the+DNA+damage+response.">IDH1-R132H acts as a tumor suppressor in glioma via epigenetic up-regulation of the DNA damage response.</a> Science Translational Medicine. 11 (479), (2019).</li><li>Calinescu, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposon+mediated+integration+of+plasmid+DNA+into+the+subventricular+zone+of+neonatal+mice+to+generate+novel+models+of+glioblastoma.">Transposon mediated integration of plasmid DNA into the subventricular zone of neonatal mice to generate novel models of glioblastoma.</a> Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).</li><li>Koschmann, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATRX+loss+promotes+tumor+growth+and+impairs+nonhomologous+end+joining+DNA+repair+in+glioma.">ATRX loss promotes tumor growth and impairs nonhomologous end joining DNA repair in glioma.</a> Science Translational Medicine. 8 (328), (2016).</li><li>Brat, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive,+Integrative+Genomic+Analysis+of+Diffuse+Lower-Grade+Gliomas.">Comprehensive, Integrative Genomic Analysis of Diffuse Lower-Grade Gliomas.</a> The New England Journal of Medicine. 372 (26), 2481-2498 (2015).</li><li>Datta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection:+Big+data+from+small+samples.">Laser capture microdissection: Big data from small samples.</a> Histology and Histopathology. 30 (11), 1255-1269 (2015).</li><li>Lein, E., Borm, L. E., Linnarsson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+promise+of+spatial+transcriptomics+for+neuroscience+in+the+era+of+molecular+cell+typing.">The promise of spatial transcriptomics for neuroscience in the era of molecular cell typing.</a> Science. 358 (6359), 64-69 (2017).</li><li>Gagner, J. P., Zagzag, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+Glioblastoma+Tissue+Heterogeneity+with+Laser+Capture+Microdissection.">Probing Glioblastoma Tissue Heterogeneity with Laser Capture Microdissection.</a> Methods in Molecular Biology. 1741, 209-220 (2018).</li></ol>

Förstå de molekylära mekanismerna bakom gliom heterogenitet och invasion är av avgörande betydelse för att avslöja nya terapeutiska mål13. I detta manuskript beskriver vi en detaljerad och optimerad metod för att analysera det molekylära landskapet av gliom heterogenitet och invasion med hjälp av laser capture microdissection (LMD) följt av transkriptomanalys.
Laseravskiljning microdissection (LMD) kan användas för att identifiera olika områden eller enst...

Gliom är de mest aggressiva primära tumörerna i centrala nervsystemet. De är mycket invasiva och heterogena1. Analys av cellulära och molekylära komponenter i tumören kommer att avslöja nya terapeutiska mål.
Bland olika metoder som för närvarande finns, laser fånga microdissection (LMD) av fryst hjärntumör vävnad är en kostnadseffektiv, tillförlitlig teknik som gör det möjligt att isolera diskreta anatomiska områden eller specifika cellpopulationer från tumörvävnader för att studera deras molekylärprofil2,3. LMD möjliggör analys av mRNA genuttrycksprofiler för utvalda encelliga celler eller flercelliga strukturer4,5. LMD kan användas för att få djupgående mekanistisk kunskap om de molekylära händelser som sker under tumörprogression. Förbättring av bearbetningen av tumörvävnader är nödvändig för att få optimal optisk upplösning av vävnadsmorfologi och RNA-kvalitet6. Även om paraformaldehyd fixering är det bästa alternativet för morfologiska analys, RNA kvalitet påverkas och försämras under dessa förhållanden, vilket resulterar i dålig RNA kvalitet för RNA-seq analys. Användningen av frysta vävnadssektioner undviker iskristallbildning, som kan bryta cellmembranen och producera hål i celler, och är fortfarande det bästa alternativet för RNA-Seq-analys7.
Här beskriver vi en optimerad avsnitt fixering och färgning metod för att bearbeta frysta mus hjärntumör vävnader för LMD. För att förhindra att iskristaller bildas i vävnaden perfunderade vi möss med en lösning på 30% sackaros. Denna lösning stör växelverkan mellan polarvattenmolekyler och förhindrar bildandet av iskristaller, bevara vävnadmorfologi. Vävnad färgning är nödvändigt att skilja och få specifik population av celler eller anatomiskt distinkta områden inom tumören. Det är viktigt att fixa och färga vävnaden med ofarliga färgämnen för att upprätthålla RNA integritet. Det har tidigare visats att färgning vävnad med hematoxylin / eosin (H & E) försämrar RNA integritet8. Vi fixade och färgade vävnaden av intresse med etanol, Cresyl violett 4% och eosin Y 0,5% lösningar. Cresyl violett är ett acidophilic färgämne som fläckar cellkärnan med en mörkblå färg. Eosin Y är ett basofilt färgämne som färgar grundläggande komponenter i cellerna, vilket ger en skillnad mellan cytoplasman och andra cellulära strukturer8. Båda färgämnena är lösliga i etanol och försämrar inte RNA-kvaliteten. För att undvika vävnadsskador och bibehålla en hög optisk upplösning av cellstrukturerna monterade vi vävnadssektionerna före LMD9.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Accutase Cell Detachment Solution</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>423201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal-Free Recombinant Human EGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50X), serum free</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer RLT</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning PCR Tubes</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>CLS6530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cresyl Violet Acetate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C5042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 - Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11330057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Y</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E4009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiSeq 4000</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Microdissection (LMD) System</td>
			<td>Leica</td>
			<td>LMD7000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 Supplement (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normocin - Antimicrobial Reagent</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>ant-nr-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peel Away Disposable Embedding Molds</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>70182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEN Membrane Glass Slide (2 &#181;m)</td>
			<td>Lieca</td>
			<td>1150518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pinpoint Solution</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D3001-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human FGF-basic</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-18B-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Research Cryostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM3050s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZap RNase Decontamination Solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Plus Micro Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v2 - Pico Input Mammalian</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>634411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Plus O.C.T. Compound</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-730-571</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

laser capture microdissection of glioma subregions for spatial and molecular characterization of intratumoral heterogeneity, oncostreams, and invasion

Gliom är primära hjärntumörer som kännetecknas av deras invasivitet och heterogenitet. Specifika histologiska mönster såsom pseudopalisades, microvascular spridning, mesenchymal omvandling och nekros karakterisera histologiska heterogenitet av högvärdiga gliom. Vårt laboratorium har visat att förekomsten av höga tätheter av mesenkymala celler, som heter oncostreams, korrelerar med tumör malignitet. Vi har utvecklat ett unikt tillvägagångssätt för att förstå de mekanismer som ligger till grund för gliomas tillväxt och invasion. Här beskriver vi ett omfattande protokoll som använder laser fånga microdissection (LMD) och RNA sekvensering för att analysera differentiell mRNA uttryck för intra-tumoral heterogena multicellulära strukturer (dvs. mesenkymala områden eller områden av tumör invasion). Denna metod upprätthåller god vävnad histologi och RNA integritet. Perfusion, frysning, inbäddning, snittning och färgning optimerades för att bevara morfologi och få högkvalitativa laser microdissection prover. Resultaten visar att perfusion av gliombärande möss med 30% sackaros ger god morfologi och RNA-kvalitet. Dessutom, färgning tumör sektioner med 4% Cresyl violett och 0,5% eosin resulterar i god nukleära och cellulära färgning, samtidigt som RNA integritet. Den beskrivna metoden är känslig och mycket reproducerbar och det kan användas för att studera tumörmorfologi i olika tumörmodeller. Sammanfattningsvis beskriver vi en komplett metod för att utföra LMD som bevarar morfologi och RNA kvalitet för sekvensering att studera molekylära funktioner i heterogena multicellulära strukturer inom solida tumörer.

Vårt laboratorium har genererat en genetiskt modifierad mus modeller (GEMMs) med hjälp av törnrosa transposase system(figur 1A). Detta system innehåller specifika genetiska förändringar i arvsmassan hos neurala stamceller hos neonatala möss. Dessa förändrade stamfaderceller bildar endogena gliom tumörer. Plasmid sekvenser som används för att generera tumörer var: (1) pT2C-LucPGK-SB100X för Törnrosa transposon & luciferas uttryc...

Watch this Scientific Journal Video about Laser Capture Microdissection of Glioma Subregions for Spatial and Molecular Characterization of Intratumoral Heterogeneity, Oncostreams, and Invasion at JoVE

Laser Capture Microdissection of Glioma Subregions for Spatial and Molecular Characterization of Intratumoral Heterogeneity, Oncostreams, and Invasion

Laser microdissection (LMD) är en känslig och mycket reproducerbar teknik som kan användas för att avslöja vägar som medlar gliom heterogenitet och invasion. Här beskriver vi ett optimerat protokoll för att isolera diskreta områden från gliomvävnad med laser LMD följt av transkriptomisk analys.

Laser Capture Microdissection av Glioma subregioner för rumslig och molekylär karakterisering av intratumoral heterogenitet, oncostreams och invasion

Gliomas are primary brain tumors characterized by their invasiveness and heterogeneity. Specific histological patterns such as pseudopalisades, ...

Detta protokoll använder laser microdissection och RNA sekvensering för att analysera differential mRNA uttryck för intratumor heterogenitet, såsom områden av ackumulering av mesenchymala celler eller områden av tumör invasion. Denna metod har optimerats för att bevara god kvalitet vävnad histologi och RNA integritet för att underlätta förvärv av högkvalitativa laser mikrodissektion prover. Denna metod är känslig och mycket reproducerbar.Det kan utnyttjas för att studera tumör morfologi och heterogenitet i olika tumörmodeller. Laser mikrodissektion av frysta hjärntumör vävnad är en kostnadseffektiv, tillförlitlig teknik för isolering av diskreta anatomiska områden av cellpopulationer från tumör vävnader att studera deras molekylära profiler. LMD kan utnyttjas för att få fördjupad mekanistisk kunskap om de molekylära händelser som äger rum under tumörprogression, och kan avslöja nya terapeutiska mål.En in vivo bioluminescens av musen tumör börda når en signal mellan en gånger 10 till de sex och en gånger 10 till den 7: e fotoner. Spola syresatt tyrode lösning genom cirkulationssystemet av avlivade tumörbärande mus tills levern och lungorna har helt rensats från blod. Fortsätt perfusera djuret med 30%sackaroslösning upplöst i tyrodelösning i ytterligare 15 minuter.För att utvärdera framgången för perfusionen, bekräfta att nacke, svans och ben är stela i slutet av cirkulationen. Sedan skörda hjärnan enligt standardprotokoll och lagra hjärnan över natten i färsk 30%sackaros lösning. För att förbereda för kryokonservering, fyll en burk med kall isopentane-2-metylbutan och placera burken i en behållare fylld med flytande kväve.Medan lösningsmedlet är kylning, blot hjärnan torr på en bit filterpapper och placera hjärnan i en märkt Cryomold. Försiktigt vid ungefär fem milliliter av optimal temperatur skärmedium till mitten av Cryomold och placera hjärnan i formen i önskad orientering. Med hjälp av rena tövoftar, placera snabbt Cryomold i den kylda isopentan-2-metylbutan i 30 till 40 sekunder.När skärmediet har stelnat, överför Cryomold på torris och linda Cryomold och snap fryst hjärnvävnad i aluminiumfolie för minus 80 grader Celsius lagring. Att förvärva fryst hjärntumör vävnad sektioner, först ställa in temperaturen på en kryostat mellan minus 20 och minus 24 grader Celsius, och placera provet blocket i kryostatkammaren i 30 till 60 minuter. Medan provet är jämvikt, rengör kammaren och knivhållaren med 100%etanol och spraya sektionsborstarna med RNase rengöringslösning.När provet är klart, ta bort formen och använd färskt skärmedium för att fästa det frysta vävnadsblocket på kryostats preparatskiva. Placera blocket i skivhållaren och rikta in blocket mot knivbladet. Förvärva 10 mikrometer delar av hjärnan med hjälp av en av de Rnase-fria borstarna för att noggrant platta och uncurl vävnaden bitar på skärytan.För att montera hjärnvävnadssektionerna på bilderna, tryck smidigt på den positivt laddade sidan av en märkt RNase-fri PEN-glas glida på sektionen och placera bilden i en förvaringslåda inuti kammaren. När alla objektglasen har samlats in placerar du förvaringsboxen på minus 80 grader Celsius. För att lösa upp skärmediet före lasermikdissektion, dränka objektglasen i 30 sekunders fallande etanol nedsänkning följt av kristall violett lösning färgning i 20 sekunder och fem sekunder i 0,5%eosin Y lösning.I slutet av inkubationen eosin Y använder du filterpapper för att blockera objektglasen torra och torka av objektglasen i sekventiella uppstigande etanolsänkningar. Efter 60-sekunders etanolbadningen sköljer du objektglasen i en behållare med xylen i tre minuter. Torka därefter rutschkanorna på RNase-fri yta vid rumstemperatur i 10 sekunder innan du monterar proverna i monteringsmedium förberett med RNase-fritt vatten.Efter 10 till 20 sekunder, överför du glidbanorna till mikroskopmikrsektionsplattformen. För laserfånga mikrodissektion, slå på strömmen innan du slår på lasern. Därefter slår du på mikroskopet styrenheten i datorn och starta lasern fånga microdissection programvara.Välj 10 gånger förstoringen i panelen Mikroskopkontroll. Under Laser Control, ställ in laserparametrarna för vävnadsdissektion och välj en laserfrekvens på 120 hertz och en laserström på 100%För exakt lasermikrodissektion, ställ in hastigheten till 10 och ställ in bländaren på 10 mikrometer. Ställ sedan in strömmen på 53.Ladda vävnadsuppsamlaren som kommer att fånga vävnaden efter avsnittet och klicka på den andra Avlastningsknappen. Byt ut den tomma kollektorn mot DNase och Rnase-fria 0,5 milliliter PCR flathead-rör som innehåller 30 mikroliter lysbuffert per rör. Returnera uppsamlaren till maskinen och klicka på Fortsätt för att fortsätta.Ladda det bearbetade preparatet på mikroskopet och klicka på Lossa i programvaran för lasermikrodissektion. Upp provet på bildhållaren och placera bildhållaren på scenen. Klicka på Fortsätt för att gå vidare och välj Rita klipp ut i fönstret Klipp ut former.Använd mikroskopkontrollerna för att hitta det intresseområde och dra en disposition runt den region av intresse. Välj sedan ett målsamlarrör och klicka på Start Cut för att fortsätta vävnadsmikrodissektionen. När alla de områden av intresse har dissekeras, överföra kollektor rör från innehavaren på torris tills de är nedströms bearbetning.För att förvärva vävnader med en överlägsen morfologi och RNA integritet utvärderades olika perfusion tillvägagångssätt. För att dissekera de intresseområden är det nödvändigt att fläcka vävnaderna med ofarliga färgämnen för RNA. Den efterföljande perfusion av tumörbärande möss med tyrodelösning och 30%sackaros följt av en övernattning inkubation i 30%sackaros resulterar i bevarandet av morfologi och RNA integritet av musvävnaden.Även om paraformaldehyd vävnad fixering resulterar i en hög kvalitet vävnad morfologi, är RNA integritet påverkas negativt. Andra tillvägagångssätt som att använda en inkubation av tyrodlösning, eller tyrodelösning plus 30%sackaroslösningsinkubationer påverkar inte RNA-kvaliteten, men en reducerad upplösning i vävnadsmorfologin observeras. Om vävnaderna inte är monterade med monteringsmedium, blir sektionerna uttorkade och morfologin försämras samtidigt som montering av vävnadsproverna med 15%monteringsmedium upplöst i vatten upprätthåller en vävnadsmorfologi av hög kvalitet.Laser fånga microdissection mikroskop avbildning möjliggör val av tumören vävnad för dissektion. Denna region av intresseval tillåter sedan dissektion av områden av intresse inom varje vävnadsprov för RNA integritet analys. Att upprätthålla en hög kvalitet tumörvävnad morfologi och RNA integritet är avgörande.Tyrodelösning och 30%sackarosperfusion med övernattning konservering i 30%sackaros förbättrar avsevärt vävnadsmorfologi för LMD. Snabb lyomfixering, färgning och montering med GAN-lösning är kritiskt steg för att bevara RNA-kvalitet och förhindra att sprickor bildas inom vävnaden. Vi rekommenderar snittning minst 2,5 gånger 10 till 6: e kvadratiska mikrometer totala tumör per vävnad område för att få lämpliga mängder av RNA för både RNA kvalitetskontroll och transkriptomisk analys.LMD möjliggör analys av de molekylära signalvägar som reglerar glioma heterogenitet och invasion som kan avslöja nya potentiella mål för framtida translationell utveckling i prekliniska gliommodeller.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

Laser Capture Microdissection av Drosophila Neuron

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the ...

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling  |

Icke-Laser Capture Mikroskopi metoden för Microdissection diskreta Regioner Mouse Brain för Total RNA Isolering och nedströms nästa generations sekvensering och Gene expression profiling

As technological platforms, approaches such as next-generation sequencing, microarray, and qRT-PCR have great promise for expanding our understanding of ...

Laser Capture Microdissection of Enriched Populations of Neurons or Single Neurons for Gene Expression Analysis After Traumatic Brain Injury

Laser Capture mikrodissektion av berikade populationer av nervceller eller Single neuroner för genuttrycksanalys efter traumatisk hjärnskada

Long-term cognitive disability after TBI is associated with injury-induced neurodegeneration in the hippocampus-a region in the medial temporal lobe that ...

Laser Capture Microdissection of Neurons from Differentiated Human Neuroprogenitor Cells in Culture

Laser Capture Microdissection av nervceller från Differentierad Human Neuroprogenitor Celler i kultur

Neuroprogenitor cells (NPCs) isolated from the human fetal brain were expanded under proliferative conditions in the presence of epidermal growth factor ...

Production of RNA for Transcriptomic Analysis from Mouse Spinal Cord Motor Neuron Cell Bodies by Laser Capture Microdissection

Produktion av RNA för transkriptomisk analys från mus ryggmärg motor neuron cellkroppar av laser capture mikrodissektion

Preparation of high-quality RNA from cells of interest is critical to precise and meaningful analysis of transcriptional differences among cell types or ...

Olfactory Neurons Obtained through Nasal Biopsy Combined with Laser-Capture Microdissection: A Potential Approach to Study Treatment Response in Mental Disorders

Lukt Nervceller erhållits genom Nasal Biopsi Kombinerad med Laser-Capture Microdissection: En Potentiell Approach att studera behandlingssvar hos psykiska störningar

Bipolar disorder (BD) is a severe neuropsychiatric disorder with poorly understood pathophysiology and typically treated with the mood stabilizer, lithium ...

Laser Capture Microdissection - A Demonstration of the Isolation of Individual Dopamine Neurons and the Entire Ventral Tegmental Area

Laser Capture Microdissection - En demonstration av Isolering av Individuell dopaminneuroner och hela Ventrala tegmentområdet

Laser capture microdissection (LCM) is used to isolate a concentrated population of individual cells or precise anatomical regions of tissue from tissue ...

Stereotactic Atlas-Guided Laser Capture Microdissection of Brain Regions Affected by Traumatic Injury

Stereotaktisk Atlas-guidad Laser fånga lokalt i hjärnregioner påverkas av traumatiska skador

The ability to isolate specific brain regions of interest can be impeded in tissue disassociation techniques that do not preserve their spatial ...

Optimization of Laser-Capture Microdissection for the Isolation of Enteric Ganglia from Fresh-Frozen Human Tissue

Optimering av Laser-Capture lokalt för isolering av enteriska ganglier från färskfryst mänsklig vävnad

The purpose of this method is to obtain high-integrity RNA samples from enteric ganglia collected from unfixed, freshly-resected human intestinal tissue ...

A Stainless Protocol for High Quality RNA Isolation from Laser Capture Microdissected Purkinje Cells in the Human Post-Mortem Cerebellum

Ett rostfritt protokoll för högkvalitativa RNA isolering från Laser fånga Microdissected Purkinje celler i människans postmortala lillhjärnan

Laser capture microdissection (LCM) is an advantageous tool that allows for the collection of cytologically and/or phenotypically relevant cells or ...