Name: laser capture microdissection of glioma subregions for spatial and molecular characterization of intratumoral heterogeneity, oncostreams, and invasion
Uploaded: 2020-04-12T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Laser Capture Microdissection of Glioma Subregions for Spatial and Molecular Characterization of Intratumoral Heterogeneity, Oncostreams, and Invasion at JoVE

Çalışmalar Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH/NINDS) Hibeleri tarafından desteklendi: R37-NS094804, R01-NS105556, R21-NS107894 to M.G.C.; (NIH/NINDS) R01-NS076991, R01-NS096756, R01-NS082311'den P.R.L.'ye hibeler; (NIH/NIBI): R01-EB022563; (NIH/NCI) U01CA224160; Nöroşirürji Bölümü, Michigan Üniversitesi Rogel Kanser Merkezi, ChadTough Vakfı ve Leah's Happy Hearts Vakfı M.G.C. ve P.R.L. RNA Biyotıp Hibe F046166 M.G.C. Ulusal Sağlık Enstitüleri, UL1 TR002240 Michigan Klinik ve Sağlık Araştırma Enstitüsü (MICHR), Doktora Sonrası Çeviri Akademisyenler Programı (PTSP) hibe, hibe Proje F049768 Michigan Üniversitesi Forbes Kanser Araştırma Enstitüsü, Körlük Önlemek Için Araştırma bir Hekim-Bilim Adamı Ödülü, Inc (RPB), NIH (AK) NEI R01 EY022633 hibe ve RPB oftalmoloji ve Görsel Bilimler Bölümü için sınırsız hibe. Bu araştırmada Görme Araştırma Çekirdeği (P30 EY007003) ve Kanser Merkezi Araştırma Çekirdeği (P30 CA046592) kullanılmıştır. AK, A. Alfred Taubman Tıbbi Araştırma Enstitüsü'nden Bayan William Davidson Emerging Scholar Ödülü tarafından desteklenmiştir.

Burada deneysel hayvanların kullanıldığı belirtilen tüm yöntemler Michigan Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.
NOT: GEMM veya stabil hatlardan üretilen glioma nörosferleri farelerde intrakranial tümör engraftment için kullanılabilir10 ve LMD ve RNA dizilimi için işlenebilir. Bu hücreler, tümör büyüme analizi ve lokalizasyonu için daha fazla kullanılacak olan ateş böceği luciferase ve G...

<ol>
	<li>Reifenberger, G., Wirsching, H. G., Knobbe-Thomsen, C. B., Weller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+the+molecular+genetics+of+gliomas+-+implications+for+classification+and+therapy.">Advances in the molecular genetics of gliomas - implications for classification and therapy.</a> Nature Reviews Clinical Oncology. 14 (7), 434-452 (2017).</li><li>Espina, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser-capture+microdissection.">Laser-capture microdissection.</a> Nature Protocols. 1 (2), 586-603 (2006).</li><li>Rabien, A., Kristiansen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+Microdissection.">Tissue Microdissection.</a> Methods in Molecular Biology. 1381, 39-52 (2016).</li><li>Lovatt, D., Bell, T., Eberwine, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-neuron+isolation+for+RNA+analysis+using+pipette+capture+and+laser+capture+microdissection.">Single-neuron isolation for RNA analysis using pipette capture and laser capture microdissection.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (1), (2015).</li><li>Erickson, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+RT-PCR+gene+expression+analysis+of+laser+microdissected+tissue+samples.">Quantitative RT-PCR gene expression analysis of laser microdissected tissue samples.</a> Nature Protocols. 4 (6), 902-922 (2009).</li><li>Cheng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser-assisted+microdissection+in+translational+research:+theory,+technical+considerations,+and+future+applications.">Laser-assisted microdissection in translational research: theory, technical considerations, and future applications.</a> Applied Immunohistochemistry &amp; Molecular Morphology. 21 (1), 31-47 (2013).</li><li>Butler, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recovery+of+high-quality+RNA+from+laser+capture+microdissected+human+and+rodent+pancreas.">Recovery of high-quality RNA from laser capture microdissected human and rodent pancreas.</a> Journal of Histotechnology. 39 (2), 59-65 (2016).</li><li>Clement-Ziza, M., Munnich, A., Lyonnet, S., Jaubert, F., Besmond, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stabilization+of+RNA+during+laser+capture+microdissection+by+performing+experiments+under+argon+atmosphere+or+using+ethanol+as+a+solvent+in+staining+solutions.">Stabilization of RNA during laser capture microdissection by performing experiments under argon atmosphere or using ethanol as a solvent in staining solutions.</a> RNA. 14 (12), 2698-2704 (2008).</li><li>van Dijk, M. C., Rombout, P. D., Dijkman, H. B., Ruiter, D. J., Bernsen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+resolution+by+mounting+of+tissue+sections+for+laser+microdissection.">Improved resolution by mounting of tissue sections for laser microdissection.</a> Molecular Pathology. 56 (4), 240-243 (2003).</li><li>N&#250;&#241;ez, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IDH1-R132H+acts+as+a+tumor+suppressor+in+glioma+via+epigenetic+up-regulation+of+the+DNA+damage+response.">IDH1-R132H acts as a tumor suppressor in glioma via epigenetic up-regulation of the DNA damage response.</a> Science Translational Medicine. 11 (479), (2019).</li><li>Calinescu, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposon+mediated+integration+of+plasmid+DNA+into+the+subventricular+zone+of+neonatal+mice+to+generate+novel+models+of+glioblastoma.">Transposon mediated integration of plasmid DNA into the subventricular zone of neonatal mice to generate novel models of glioblastoma.</a> Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).</li><li>Koschmann, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATRX+loss+promotes+tumor+growth+and+impairs+nonhomologous+end+joining+DNA+repair+in+glioma.">ATRX loss promotes tumor growth and impairs nonhomologous end joining DNA repair in glioma.</a> Science Translational Medicine. 8 (328), (2016).</li><li>Brat, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive,+Integrative+Genomic+Analysis+of+Diffuse+Lower-Grade+Gliomas.">Comprehensive, Integrative Genomic Analysis of Diffuse Lower-Grade Gliomas.</a> The New England Journal of Medicine. 372 (26), 2481-2498 (2015).</li><li>Datta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection:+Big+data+from+small+samples.">Laser capture microdissection: Big data from small samples.</a> Histology and Histopathology. 30 (11), 1255-1269 (2015).</li><li>Lein, E., Borm, L. E., Linnarsson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+promise+of+spatial+transcriptomics+for+neuroscience+in+the+era+of+molecular+cell+typing.">The promise of spatial transcriptomics for neuroscience in the era of molecular cell typing.</a> Science. 358 (6359), 64-69 (2017).</li><li>Gagner, J. P., Zagzag, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+Glioblastoma+Tissue+Heterogeneity+with+Laser+Capture+Microdissection.">Probing Glioblastoma Tissue Heterogeneity with Laser Capture Microdissection.</a> Methods in Molecular Biology. 1741, 209-220 (2018).</li></ol>

Glioma heterojenitesinin ve invazyonunun altında yatan moleküler mekanizmaların anlaşılması, yeni terapötik hedefleri ortaya çıkarmak için kritik öneme sahiptir13. Bu yazıda, lazer yakalama mikrodisyonu (LMD) kullanılarak glioma heterojenitesinin ve istilasının moleküler manzarasını analiz etmek ve ardından transkripsiyonanalizini yapmak için ayrıntılı ve optimize edilmiş bir yöntem açıklanmıştır.
Lazer yakalama mikrodiseksiyon (LMD) tümö...

Gliomas merkezi sinir sisteminin en agresif primer tümörlerdir. Onlar son derece invaziv ve heterojen1. Tümörün hücresel ve moleküler bileşenlerinin analizi yeni terapötik hedefleri ortaya çıkaracaktır.
Şu anda mevcut farklı yöntemler arasında, dondurulmuş beyin tümör dokusunun lazer yakalama mikrodizması (LMD) kendi moleküler profil2,3çalışma tümör dokularından ayrık anatomik alanların veya belirli hücre popülasyonlarının izolasyon sağlayan bir maliyet-etkin, güvenilir bir tekniktir., LMD seçilen tek hücre veya çok hücreli yapıların mRNA gen ekspresyon profillerianalizi sağlar4,5. LMD tümör ilerlemesi sırasında meydana gelen moleküler olaylar hakkında derinlemesine mekanik bilgi kazanmak için kullanılabilir. Doku morfolojisi ve RNA kalitesinde6'nınen uygun optik çözünürlüğünü elde etmek için tümör dokularının işlenmesinde iyileştirme gereklidir. Paraformaldehit fiksasyonu morfolojik analiz için en iyi seçenek olmasına rağmen, RNA kalitesi etkilenir ve bu koşullar altında bozulur, RNA-seq analizi için düşük RNA kalitesi ile sonuçlanır. Dondurulmuş doku bölümlerinin kullanımı hücre zarlarını kırmak ve hücreler içinde delik üretebilir buz kristaloluşumunu önler, ve RNA-Seq analizi için en iyi seçenek kalır7.
Burada, LMD için dondurulmuş fare beyin tümörü dokuları işlemek için optimize edilmiş bir kesit fiksasyon ve boyama yöntemi açıklar. Dokuda buz kristallerinin oluşmasını önlemek için fareleri %30 sakaroz çözeltisi ile perfüzyonladık. Bu çözelti kutup su molekülleri arasındaki etkileşimleri bozar ve doku morfolojisini koruyarak buz kristallerinin oluşumunu önler. Doku boyama ayırt etmek ve tümör içinde hücrelerin veya anatomik olarak farklı alanlarda belirli nüfus elde etmek için gereklidir. RNA bütünlüğünü korumak için dokuyu zararsız boyalarla onarmak ve lekelemek esastır. Daha önce hematoksilin/eozin (H&E) ile boyama dokusunun RNA bütünlüğünü bozdığı gösterilmiştir8. Biz sabit ve etanol, Cresyl menekşe% 4 ve eozin Y 0.5% çözümleri ile ilgi doku lekeli. Cresyl menekşe koyu mavi renk ile hücre çekirdeği lekeler asiofilik boya. Eozin Y hücrelerin temel bileşenleri lekeler bir bazofilik boya, sitoplazma ve diğer hücresel yapılar arasında bir ayrım sağlayan8. Her iki boya da etanolde çözünür ve RNA kalitesini bozmaz. Doku hasarını önlemek ve hücresel yapıların yüksek optik çözünürlüğünü korumak için, DOKU KESİmLERINI LMD9'danönce monte ettik.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Accutase Cell Detachment Solution</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>423201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal-Free Recombinant Human EGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50X), serum free</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer RLT</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning PCR Tubes</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>CLS6530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cresyl Violet Acetate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C5042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 - Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11330057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Y</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E4009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiSeq 4000</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Microdissection (LMD) System</td>
			<td>Leica</td>
			<td>LMD7000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 Supplement (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normocin - Antimicrobial Reagent</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>ant-nr-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peel Away Disposable Embedding Molds</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>70182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEN Membrane Glass Slide (2 &#181;m)</td>
			<td>Lieca</td>
			<td>1150518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pinpoint Solution</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D3001-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human FGF-basic</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-18B-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Research Cryostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM3050s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZap RNase Decontamination Solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Plus Micro Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v2 - Pico Input Mammalian</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>634411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Plus O.C.T. Compound</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-730-571</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

laser capture microdissection of glioma subregions for spatial and molecular characterization of intratumoral heterogeneity, oncostreams, and invasion

Gliomlar invazivlik leri ve heterojenlikleri ile karakterize primer beyin tümörleridir. Psödopalisatlar, mikrovasküler proliferasyon, mezenkimal transformasyon ve nekroz gibi spesifik histolojik paternler yüksek dereceli gliomların histolojik heterojenliğini karakterize eder. Laboratuvarımız, oncostreams adı verilen mezenkimal hücrelerin yüksek yoğunluklarının varlığının tümör malignitesi ile ilişkili olduğunu göstermiştir. Glioma'nın büyüme ve istilasının altında yatan mekanizmaları anlamak için eşsiz bir yaklaşım geliştirdik. Burada, intra-tümöral heterojen multisellüler yapıların diferansiyel mRNA ekspresyonunu (yani mezenkimal alanlar veya tümör invazyonu alanları) analiz etmek için lazer yakalama mikrodizesi (LMD) ve RNA dizilimi kullanan kapsamlı bir protokol açıklıyoruz. Bu yöntem iyi doku histolojisi ve RNA bütünlüğünü korur. Perfüzyon, donma, gömme, kesit ve boyama morfolojisini korumak ve yüksek kaliteli lazer mikrodiskes örnekleri elde etmek için optimize edildi. Sonuçlar, %30 sakaroz kullanan glioma taşıyan farelerin perfüzyonunun iyi morfoloji ve RNA kalitesi sağladığını göstermektedir. Buna ek olarak,% 4 Cresyl menekşe ve% 0.5 eozin ile tümör bölümleri boyama iyi nükleer ve hücresel boyama ile sonuçlanır, RNA bütünlüğünü korurken. Açıklanan yöntem hassas ve son derece tekrarlanabilir ve çeşitli tümör modellerinde tümör morfolojisi çalışmak için kullanılabilir. Özetle, katı tümörler deki heterojen çok hücreli yapıların moleküler özelliklerini incelemek için sıralama için morfolojive RNA kalitesini koruyan LMD'yi gerçekleştirmek için tam bir yöntem açıklıyoruz.

Laboratuvarımız, uyuyan güzellik transposaz sistemini kullanarak genetiği değiştirilmiş fare modelleri (GEMM) üretmiştir(Şekil 1A). Bu sistem, yenidoğan farelerde nöral progenitor hücrelerinin genomuna özel genetik değişiklikler içermektedir. Bu değiştirilmiş progenitor hücreleri endojen glioma tümörleri oluşturur. Tümörleri oluşturmak için kullanılan plazmid dizileri: (1) pT2C-LucPGK-SB100X Sleeping Beauty transp...

Watch this Scientific Journal Video about Laser Capture Microdissection of Glioma Subregions for Spatial and Molecular Characterization of Intratumoral Heterogeneity, Oncostreams, and Invasion at JoVE

Laser Capture Microdissection of Glioma Subregions for Spatial and Molecular Characterization of Intratumoral Heterogeneity, Oncostreams, and Invasion

Lazer mikrodisesi ( LMD) glioma heterojenite ve invazyon aracılık yolları ortaya çıkarmak için kullanılabilecek hassas ve son derece tekrarlanabilir bir tekniktir. Burada lazer LMD kullanarak glioma dokusundan ayrık alanları izole etmek ve ardından transkripsiyonanalizi yapmak için optimize edilmiş bir protokol tanımlıyoruz.

İntratümöral Heterojenite, Oncostreams ve Invasion'ın Mekansal ve Moleküler Karakterizasyonu için Glioma Alt Bölgelerinin Lazer Yakalama Mikrodizması

Gliomas are primary brain tumors characterized by their invasiveness and heterogeneity. Specific histological patterns such as pseudopalisades, ...

Bu protokol, mezenkimal hücrelerin veya tümör invazyonunun birikme alanları gibi intratümör heterojenitesinin diferansiyel mRNA ekspresyonunu analiz etmek için lazer mikrodisseksi ve RNA dizilimi kullanır. Bu yöntem kaliteli doku histolojisi ve RNA bütünlüğünü korumak için yüksek kaliteli lazer mikrodiskes örneklerinin elde kolaylaştırmak için optimize edilmiştir. Bu yöntem hassas ve son derece tekrarlanabilir.Çeşitli tümör modellerinde tümör morfolojisi ve heterojenitesini incelemek için kullanılabilir. Dondurulmuş beyin tümör dokusunun lazer mikrodizması, tümör dokularından hücre popülasyonlarının ayrık anatomik alanlarının moleküler profillerini incelemek için izole edilmesi için uygun maliyetli ve güvenilir bir tekniktir. LMD tümör ilerlemesi sırasında meydana gelen moleküler olaylar hakkında derinlemesine mekanik bilgi kazanmak için kullanılabilir, ve yeni terapötik hedefleri ortaya çıkarabilir.Fare tümörü yükünün in vivo biyolüminesansı bir sinyale 10 ile 10 arasında altı ile 10 arasında 7. Karaciğer ve akciğerler tamamen kan temizlenmiş olana kadar ötenazi tümör taşıyan farenin dolaşım sistemi aracılığıyla flush oksijenli tyrode çözeltisi. Daha 15 dakika boyunca tyrode çözeltisi içinde çözünmüş% 30 sakaroz çözeltisi ile hayvan perfüzyon devam edin.Perfüzyonun başarısını değerlendirmek için, boyun, kuyruk ve bacakların sirkülasyon sonunda sert olduğunu doğrulayın. Sonra standart protokollere göre beyin hasat ve taze% 30 sakaroz çözeltisi gecede beyin saklamak. Kriyopreservation hazırlanmak için, soğuk isopentane-2-metilbütan ile bir kavanoz doldurun ve sıvı nitrojen dolu bir kap içine kavanoz yerleştirin.Çözücü soğurken, beyni bir filtre kağıdının üzerine kurutun ve beyni etiketli bir Cryomold'a yerleştirin. Cryomold merkezine optimum sıcaklık kesme orta yaklaşık beş mililitre dikkatle ve istenilen yönde kalıp içine beyin yerleştirin. Temiz forsepskullanarak, cryomold'u hızlı bir şekilde soğutulmuş isopentane-2-methylbutane'ye 30 ila 40 saniye süreyle yerleştirin.Kesme ortamı katıladıktan sonra, Cryomold'ı kuru buza aktarın ve Cryomold'u sarın ve dondurulmuş beyin dokusunu eksi 80 santigrat derece depolama için alüminyum folyoya sarın. Dondurulmuş beyin tümörü doku bölümleri elde etmek için, ilk eksi 20 ve eksi 24 santigrat derece arasında bir kriyostat sıcaklığı ayarlayın ve 30 ila 60 dakika için kriyostat odasına örnek blok yerleştirin. Numune dengelenirken, oda ve bıçak tutucuyu %100 etanol ile temizleyin ve kesit fırçalarını RNase temizleme solüsyonuyla püskürtün.Numune hazır olduğunda, kalıbı çıkarın ve dondurulmuş doku bloğunu kriyostat numune diskine takmak için taze kesme ortamı kullanın. Bloğu disk tutucuya yerleştirin ve bloğu bıçak bıçağıyla hizala. Doku parçalarını kesme yüzeyine dikkatlice düzleştirmek ve çıkarmak için Rnase içermeyen fırçalardan birini kullanarak beynin 10 mikrometrelik bölümlerini edinin.Beyin dokusu bölümlerini slaytların üzerine monte etmek için, etiketli RNase içermeyen PEN cam kaydırağının pozitif yüklü tarafına düzgün bir şekilde bastırın ve kaydırağı odanın içindeki bir saklama kutusuna yerleştirin. Tüm slaytlar toplandığında, depolama kutusunu eksi 80 dereceye yerleştirin. Lazer mikro diseksiyondan önce kesme ortamını eritmek için, slaytları 30 saniyelik sıralı alçalan etanol daldırmalarında batırın ve ardından kristal mor çözeltisi %0,5 eozin Y çözeltisinde 20 saniye ve beş saniye boyunca boyanın.Eozin Y kuluçka sonunda, slaytlar kuru engellemek ve sırayla artan etanol daldırma slaytlar dehydrate için filtre kağıdı kullanın. 60 saniyelik etanol daldırma sonra, üç dakika ksilen bir kapta slaytlar durulayın. Daha sonra, rnase içermeyen su ile hazırlanan montaj ortamıörnekleri montaj önce oda sıcaklığında 10 saniye boyunca RNase içermeyen yüzeyüzerinde slaytlar kuru.10 ila 20 saniye sonra slaytları mikroskop mikrodisesise platformuna aktarın. Lazer yakalama mikrodisseksiiçin, lazer açmadan önce gücü açın. Ardından, bilgisayardaki mikroskop denetleyicisini açın ve lazer yakalama mikrodiseksiyon yazılımını başlatın.Mikroskop Kontrol panelinde, 10 kat büyütme yi seçin. Lazer Kontrol altında, doku diseksiyonu için lazer parametrelerini ayarlayın ve 120 hertz lazer frekansı ve doğru lazer mikrodisseksi için% 100 lazer akımı seçin, 10 hızı ayarlayın ve diyafram ayarlamak 10 mikrometre. O zaman gücü 53'e ayarla.Bölümü takip eden dokuyu yakalayacak doku kollektörüne yükleyin ve ikinci Boşalt düğmesini tıklatın. Boş kolektörü, tüp başına 30 mikrolitre lysis tamponu içeren DNase ve Rnase içermeyen 0,5 mililitre PCR düz baş tüpleri ile değiştirin. Toplayıcıyı makineye döndürün ve devam edin'i tıklatın.İşlenmiş numuneyi mikroskoba yükleyin ve lazer mikrodiseksiyon yazılımında Boşalt'ı tıklatın. Örneği slayt tutucuya yerleştirin ve slayt tutucuyu sahneye yerleştirin. Devam etmek için Devam Et'i tıklatın ve Şekilleri Kes penceresinde Kes'i Çiz'i seçin.İlgi alanını bulmak ve ilgi alanı etrafında bir anahat çizmek için mikroskop kontrollerini kullanın. Sonra bir hedef kollektör tüp seçin ve doku mikrodisseksi devam etmek için Başlat Cut tıklayın. Tüm ilgi alanları incelendiğinde, kolektör tüplerini tutucudan aşağı işlenene kadar kuru buza aktarın.Üstün morfolojisi ve RNA bütünlüğü olan dokuların elde edilmesi için çeşitli perfüzyon yaklaşımları değerlendirildi. İlgi alanlarını incelemek için, RNA için zararsız boyalar ile dokuları lekelemek için gereklidir. Daha sonra timon solüsyonu ve %30 sakaroz içeren tümör taşıyan farelerin perfüzyonu ve ardından %30 sakarozda bir gecede kuluçka makinesi fare dokusunun morfolojisi ve RNA bütünlüğünün korunmasına neden olarak sonuçlanır.Paraformaldehit doku fiksasyonu yüksek kaliteli doku morfolojisi ile sonuçlansa da RNA bütünlüğü olumsuz etkilenir. Tyrode solüsyonu veya tiroit çözeltisi ve %30 sakaroz solüsyonu kuluçkaları gibi diğer yaklaşımlar RNA kalitesini etkilemez, ancak doku morfolojisinde azalmış bir çözünürlük gözlenir. Dokular montaj ortamı ile monte edilmezse, kesitler susuz kalır ve morfoloji bozulurken, doku örneklerinin %15 montaj ortamı ile suda çözünmüş yüksek kaliteli doku morfolojisi korunur.Lazer yakalama mikrodisze mikroskop görüntüleme diseksiyon için tümör dokusunun seçimi sağlar. Bu ilgi alanı seçimi, RNA bütünlük analizi için her doku numunesi içinde ilgi alanlarının diseksiyonuna olanak tanır. Yüksek kaliteli tümör doku morfolojisi ve RNA bütünlüğünün korunması çok önemlidir.Tyrode solüsyonu ve %30 sakarozda gece muhafazası ile %30 sakaroz perfüzyonu LMD için doku morfolojisini önemli ölçüde geliştirir. Gan çözeltisi ile hızlı bir şekilde fiksasyon, boyama ve montaj, RNA kalitesinin korunması ve doku içinde çatlakların oluşmasını önlemek için kritik bir adımdır. Hem RNA kalite kontrolü hem de transkripsiyonanalizi için uygun miktarda RNA elde etmek için doku alanı başına 6.mikrometre toplam tümöre en az 2.5 kat 10 kesit lemenizi öneririz.LMD, preklinik glioma modellerinde gelecekteki çevirisel gelişim için yeni potansiyel hedefleri ortaya çıkarabilecek glioma heterojenitesini ve invazyonunu düzenleyen moleküler sinyal yollarının analizini sağlar.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

Lazer Yakalama Mikrodisseksiyon Drosophila Periferik Nöronlar

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the ...

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling  |

Toplam RNA İzolasyonu ve Alt Nesil Sıralama ve Kaynak gösterilmeden kullanılamaz Ayrık Fare Beyin Bölgeler Mikrodisseksiyon Sigara Lazer Yakalama Mikroskopi Yaklaşım

As technological platforms, approaches such as next-generation sequencing, microarray, and qRT-PCR have great promise for expanding our understanding of ...

Laser Capture Microdissection of Enriched Populations of Neurons or Single Neurons for Gene Expression Analysis After Traumatic Brain Injury

Travmatik Beyin Hasarı Sonrası Nöronlar veya gen ekspresyon analizi için Tek Nöron zenginleştirilmiştir Populasyonlarının Lazer Yakalama Mikrodisseksiyon

Long-term cognitive disability after TBI is associated with injury-induced neurodegeneration in the hippocampus-a region in the medial temporal lobe that ...

Laser Capture Microdissection of Neurons from Differentiated Human Neuroprogenitor Cells in Culture

Kültür farklılaştırılmış insan Neuroprogenitor Hücreler Nöronlar Lazer Yakalama Mikrodisseksiyon

Neuroprogenitor cells (NPCs) isolated from the human fetal brain were expanded under proliferative conditions in the presence of epidermal growth factor ...

Production of RNA for Transcriptomic Analysis from Mouse Spinal Cord Motor Neuron Cell Bodies by Laser Capture Microdissection

Lazer Yakalama Mikroseksiyonu ile Fare Omurilik Motor Nöron Hücre Gövdelerinden Transkriptomik Analiz için RNA Üretimi

Preparation of high-quality RNA from cells of interest is critical to precise and meaningful analysis of transcriptional differences among cell types or ...

Olfactory Neurons Obtained through Nasal Biopsy Combined with Laser-Capture Microdissection: A Potential Approach to Study Treatment Response in Mental Disorders

Lazer Yakalama Mikrodisseksiyon ile Burun Biyopsi Kombine yoluyla elde Koku Nöronlar: Mental Bozuklukların Tedavi Tepki Eğitim Bir Potansiyel Yaklaşım

Bipolar disorder (BD) is a severe neuropsychiatric disorder with poorly understood pathophysiology and typically treated with the mood stabilizer, lithium ...

Laser Capture Microdissection - A Demonstration of the Isolation of Individual Dopamine Neurons and the Entire Ventral Tegmental Area

Lazer Yakalama Mikrodisseksiyon - Bireysel Dopamin Nöronlar İzolasyonu ve Tüm ventral tegmental Area bir Gösteri

Laser capture microdissection (LCM) is used to isolate a concentrated population of individual cells or precise anatomical regions of tissue from tissue ...

Stereotactic Atlas-Guided Laser Capture Microdissection of Brain Regions Affected by Traumatic Injury

Stereotaksik Atlas güdümlü lazer yakalama mikrodiseksiyon travma yaralanma tarafından etkilenen beyin bölgeleri

The ability to isolate specific brain regions of interest can be impeded in tissue disassociation techniques that do not preserve their spatial ...

Optimization of Laser-Capture Microdissection for the Isolation of Enteric Ganglia from Fresh-Frozen Human Tissue

Lazer-yakalama mikrodiseksiyon optimizasyonu gelen insan dokusu taze donmuş enterik gangliyon yalıtım için

The purpose of this method is to obtain high-integrity RNA samples from enteric ganglia collected from unfixed, freshly-resected human intestinal tissue ...

A Stainless Protocol for High Quality RNA Isolation from Laser Capture Microdissected Purkinje Cells in the Human Post-Mortem Cerebellum

Yüksek kaliteli lazer RNA izolasyonu için paslanmaz bir protokol yakalama insan öldükten sonra beyincik Microdissected Purkinje hücreleri

Laser capture microdissection (LCM) is an advantageous tool that allows for the collection of cytologically and/or phenotypically relevant cells or ...