Name: field identification of matricaria chamomilla using a portable qpcr system
Uploaded: 2020-10-10T12:30:00
Duration: 12 min 8 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Field Identification of Matricaria chamomilla using a Portable qPCR System at JoVE.com

نشكر جيمس شان على جهوده في تسجيل الفيديو الميداني. نشكر جون بايرون وماثيو سيراو على عملهما في تحرير الفيديو. ونشكر أنسن لوه، وهاري دو، وفرانك دينغ على دعمهم لتحديد موقع حقل الاختبار. نشكر ماريا روبنسكي على تعليقاتها القيمة على المخطوطة بأكملها. جميع الأشخاص المعترف بها هي موظفات في شركة Herbalife International of America, Inc.

1. عينة جمع
<ol><li>قم بإعداد منطقة اختبار في الحقل بسطح مستو وأفقي.</li>
	<li>تحديد النبات التمثيلي الذي يعكس خصائص غالبية النباتات في حقل زهرة البابونج (الشكل 4).</li>
	<li>اختيار رأس زهرة من النباتات ممثل باستخدام قفازات معقمة.</li>
	<li>ضع العينة في أنبوب جمع 2.0 مل.</li>
	<li>كرر الخطوات من 1.3 إلى 1.4 وجمع منشور (حوالي 0.5-0.7 سم) من نفس المصنع. ملاحظة: M. زهرة chamomilla وأوراق صغيرة بما يكفي للجلوس في الجزء السفلي من أنبوب جمع 2.0 مل. بالنسبة للنباتات الأخرى ذات المساحة السطحية الأكبر، يمكن استخدام لكمة أو مقصات ورقية (شطفها في 70٪ من الإيثانول قبل الاستخدام) لعزل عينات الأنسجة للاختبار. عندما يتطلب أخذ عينات متعددة، شطف لكمة الورق أو مقص بين التعامل مع عينات مختلفة.</li>
</ol>2. استخراج الحمض النووي
<ol><li>سخني حاضنة الحمام الجاف إلى 95 درجة مئوية.</li>
	<li>إلى كل أنبوب جمع، إضافة 100 μL من محلول الاستخراج من مجموعة استخراج الحمض النووي النباتي (المدرجة في جدول المواد). للحصول على كفاءة أفضل في استخراج الحمض النووي، طحن عينة الأنسجة في محلول الاستخراج باستخدام حشرات الأنسجة.</li>
	<li>أغلق الأنبوب. تأكد من أن الأنسجة النباتية مغطاة بمحلول الاستخراج طوال عملية الاستخراج.</li>
	<li>ضع أنابيب الجمع في حاضنة حمام جاف محمّى مسبقاً وحضن أنابيب الجمع عند 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.</li>
	<li>بعد 10 دقائق، أخرج الأنابيب من حاضنة الحمام الجاف.</li>
	<li>أضف 100 ميكرولتر من محلول التخفيف من نفس مجموعة استخراج الحمض النووي ومزج الحل عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا عدة مرات.</li>
	<li>كرر نفس الخطوة لاستخراج المنشورات.</li>
	<li>يهز لخلط الحل أكثر من ذلك. لا يبدو أن الأنسجة النباتية عادة ما تكون متدهورة بعد هذه المعاملة. قد يتغير لون السائل ويصبح غائما. ملاحظة: يمكن تخزين المحلّل المخفف في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها إن لم يكن يسير على الفور. ليس من الضروري إزالة الحطام الخلوي من الأنسجة النباتية قبل التخزين. السائل في الأنابيب يحمل قوالب الحمض النووي للمصب تضخيم PCR.</li>
</ol>3. PCR رد الفعل الإعداد
<ol><li>تكوين جهاز qPCR ظروف الدراجات الحرارية وفقا لمواصفات الشركة المصنعة. تطبيق ملف تعريف الدراجات الحرارية PCR المذكورة في (الجدول 1) ، والذي يبدأ مع درجة حرارة ثابتة خطوة لdenaturation الأولية ، تليها 25 دورة من التضخيم ، وينتهي مع درجة الحرارة المنحدر للحصول على منحنى ذوبان عالية الدقة.</li>
	<li>ذوبان خلط الرئيسي qPCR وال التمهيديات (الجدول 2) في درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام.</li>
	<li>تخطيط رد الفعل الذي سيتم تحميله في كل بئر: الآبار التي تحتوي على سيطرة إيجابية مع الأنواع المستهدفة، والسيطرة الإيجابية مع الأنواع غير المستهدفة، والعينات، والسيطرة السلبية(الشكل 5).<ol>
<li>في هذا المثال، يتم استخدام عشرة آبار - خمسة لاختبار تحديد البابونج الألماني والخمسة المتبقية لاختبار تحديد البابونج الروماني. ولكل نوع من أنواع اختبار تحديد الأنواع، يحتوي بئر واحد على سيطرة إيجابية مع الحمض النووي المستخرج من المواد المرجعية للأنواع المستهدفة، ويحتوي بئر واحد على سيطرة إيجابية مع الحمض النووي المستخرج من المواد المرجعية للأنواع غير المستهدفة، ويتم تعبئة بئرين معاينات من الزهور والأوراق من الحمض النووي المستخرجة من الحقل، ويتم تخصيص بئر واحد للسيطرة السلبية. ويصف الجدول 3 كل نوع من أنواع الآبار.</li>
	</ol>
</li>
	<li>إعداد رد فعل ماجستير مزيج وفقا لدليل لكل اختبار تحديد الأنواع النباتية. يحتوي مزيج رئيسي نموذجي للتفاعل على مزيج رئيسي qPCR عالمي (2x) ، واوباير أولية مخصصة للأنواع الأمامية والالعكسية ، ومياه خالية من النوى. الجدول 4 يسرد تكوين نظام التفاعل. ملاحظة: إذا لم تستخدم على الفور، تخزين التفاعل qPCR ماجستير مزيج في +2 درجة مئوية إلى +8 درجة مئوية في برودة أو ثلاجة صغيرة.</li>
	<li>خلط دقيق التفاعل الرئيسي مزيج عن طريق pipetting قبل الاستخدام.</li>
	<li>ضع خرطوشة qPCR وجهًا فوق سطحًا مستوًا ومستقرًا.</li>
	<li>قم بتحميل 18 ميكرولتر من المزيج الرئيسي للتفاعل الذي تم تكوينه في الخطوة 3.4 في آبار الخراطيش وفقًا للآبار المحددة في الخطوة 3.3. لهذا العرض التوضيحي، إضافة البابونج البابونج تحديد اختبار التفاعل الرئيسي مزيج رد فعل ماجستير في الآبار المسمى لاختبار GC (GCT في الآبار 1، 3، 5، 7، 9) والبابونج الروماني تحديد اختبار التفاعل الرئيسي مزيج في آبار المسمى لاختبار RC (RCT في الآبار 2، 4، 6، 8، 10) (انظر الشكل 5).</li>
	<li>نقل 2 ميكرولتر من الحمض النووي عينة من افراط من أنابيب استخراج الحمض النووي والضوابط الإيجابية الحمض النووي المستخرجة مسبقا في آبار خرطوشة محملة مسبقا مع مزيج سيد qPCR. بعد إضافة كل قالب الحمض النووي إلى مزيج سيد qPCR، بلطف مزيج الحل عن طريق الأنابيب. ملاحظة: تجنب المخلفات الخلوية العائمة عند نقل الحمض النووي من أنبوب استخراج الحمض النووي. استخدام minicentrifuge لفصل الحطام فوق والخلايا، إذا لزم الأمر.</li>
	<li>ختم بعناية خرطوشة مع فيلم لاصق. قم بتحميل الكارتريدج على غرفة الدراجات الحرارية ثم أغلقها.</li>
	<li>تعيين أداة qPCR لتشغيل.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Smith, T., Gillespie, M., Eckl, V., Knepper, J., Reynolds, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herbal+supplement+sales+in+US+increase+by+9.4%+in+2018.">Herbal supplement sales in US increase by 9.4% in 2018.</a> HerbalGram. 123, 62-73 (2019).</li><li>Israelsen, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+challenge+of+regulation,+globalization+and+climate+change+on+botanicals+and+traditional+medicines:+respecting+tradition+while+embracing+change.">The challenge of regulation, globalization and climate change on botanicals and traditional medicines: respecting tradition while embracing change.</a> Planta Medica. 74 (3), 36 (2008).</li><li>Cardellina, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+and+opportunities+confronting+the+botanical+dietary+supplement+industry.">Challenges and opportunities confronting the botanical dietary supplement industry.</a> Journal of Natural Products. 65 (7), 1073-1084 (2002).</li><li>Foster, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+peripatetic+maze+of+black+cohosh+adulteration:+a+review+of+the+nomenclature,+distribution,+chemistry,+market+status,+analytical+methods+and+safety.">Exploring the peripatetic maze of black cohosh adulteration: a review of the nomenclature, distribution, chemistry, market status, analytical methods and safety.</a> HerbalGram. 98, 32-51 (2013).</li><li>Vanherweghem, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Misuse+of+herbal+remedies:+The+case+of+an+outbreak+of+terminal+renal+failure+in+Belgium+(Chinese+herbs+nephropathy).">Misuse of herbal remedies: The case of an outbreak of terminal renal failure in Belgium (Chinese herbs nephropathy).</a> The Journal of Alternative and Complementary Medicine. 4 (1), 9-13 (1998).</li><li>Vanherweghem, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapidly+progressive+interstitial+renal+fibrosis+in+young+women:+association+with+slimming+regimen+including+Chinese+herbs.">Rapidly progressive interstitial renal fibrosis in young women: association with slimming regimen including Chinese herbs.</a> The Lancet. 341 (8842), 387-391 (1993).</li><li>Khan, I. A., Smillie, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implementing+a+"quality+by+design"+approach+to+assure+the+safety+and+integrity+of+botanical+dietary+supplements.">Implementing a "quality by design" approach to assure the safety and integrity of botanical dietary supplements.</a> Journal of Natural Products. 75 (9), 1665-1673 (2012).</li><li>Applequist, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Identification of Medicinal Plants: A Handbook of the Morphology of Botanicals in Commerce. , (2006).</li><li>Upton, R., Graff, A., Jolliffe, G., L&#228;nger, R., Williamson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> American Herbal Pharmacopoeia: Botanical Pharmacognosy - Microscopic Characterization of Botanical Medicines. , (2016).</li><li>Frommenwiler, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+HPTLC+fingerprinting+for+quality+control+of+an+herbal+drug+-+the+case+of+angelica+gigas+root.">Comprehensive HPTLC fingerprinting for quality control of an herbal drug - the case of angelica gigas root.</a> Planta Medica. 84 (6-7), 465-474 (2018).</li><li>Heyman, H. M., Meyer, J. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMR-based+metabolomics+as+a+quality+control+tool+for+herbal+products.">NMR-based metabolomics as a quality control tool for herbal products.</a> South African Journal of Botany. 82, 21-32 (2012).</li><li>Lazarowych, N. J., Pekos, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+fingerprinting+and+marker+compounds+for+identification+and+standardization+of+botanical+drugs:+strategies+for+applying+pharmaceutical+HPLC+analysis+to+herbal+products.">Use of fingerprinting and marker compounds for identification and standardization of botanical drugs: strategies for applying pharmaceutical HPLC analysis to herbal products.</a> Drug Information Journal. 32 (2), 497-512 (1998).</li><li>Tankeu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperspectral+imaging+and+support+vector+machine:+a+powerful+combination+to+differentiate+black+cohosh+(actaea+racemosa)+from+other+cohosh+species.">Hyperspectral imaging and support vector machine: a powerful combination to differentiate black cohosh (actaea racemosa) from other cohosh species.</a> Planta Medica. 84 (6-7), 407-419 (2018).</li><li>Rodman, J. E., Cody, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+taxonomic+impediment+overcome:+NSF's+Partnerships+for+Enhancing+Expertise+in+Taxonomy+(PEET)+as+a+model.">The taxonomic impediment overcome: NSF's Partnerships for Enhancing Expertise in Taxonomy (PEET) as a model.</a> Systematic Biology. 52 (3), 428-435 (2003).</li><li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+renaissance+in+herbal+medicine+identification:+from+morphology+to+DNA.">A renaissance in herbal medicine identification: from morphology to DNA.</a> Biotechnology Advances. 32 (7), 1237-1244 (2014).</li><li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+DNA+barcoding:+from+gene+to+genome.">Plant DNA barcoding: from gene to genome.</a> Biological Reviews. 90 (1), 157-166 (2015).</li><li>Madesis, P., Ganopoulos, I., Sakaridis, I., Argiriou, A., Tsaftaris, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+of+DNA-based+methods+for+tracing+the+botanical+origin+of+food+products.">Advances of DNA-based methods for tracing the botanical origin of food products.</a> Food Research International. 60, 163-172 (2014).</li><li>Newmaster, S. G., Ragupathy, S., Janovec, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+botanical+renaissance:+state-of-the-art+DNA+bar+coding+facilitates+an+automated+identification+technology+system+for+plants.">A botanical renaissance: state-of-the-art DNA bar coding facilitates an automated identification technology system for plants.</a> International Journal of Computer Applications in Technology. 35 (1), 50-60 (2009).</li><li>Parveen, I., Gafner, S., Techen, N., Murch, S. J., Khan, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+barcoding+for+the+identification+of+botanicals+in+herbal+medicine+and+dietary+supplements:+strengths+and+limitations.">DNA barcoding for the identification of botanicals in herbal medicine and dietary supplements: strengths and limitations.</a> Planta Medica. 82 (14), 1225-1235 (2016).</li><li>Agrawal, N., Hassan, Y. A., Ugaz, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pocket-sized+convective+PCR+thermocycler.">A pocket-sized convective PCR thermocycler.</a> Angewandte Chemie International Edition. 46 (23), 4316-4319 (2007).</li><li>Almassian, D. R., Cockrell, L. M., Nelson, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Portable+nucleic+acid+thermocyclers.">Portable nucleic acid thermocyclers.</a> Chemical Society Reviews. 42 (22), 8769-8798 (2013).</li><li>Ben&#237;tez-P&#225;ez, A., Portune, K. J., Sanz, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Species-level+resolution+of+16S+rRNA+gene+amplicons+sequenced+through+the+MinION+portable+nanopore+sequencer.">Species-level resolution of 16S rRNA gene amplicons sequenced through the MinION portable nanopore sequencer.</a> Gigascience. 5 (1), 4 (2016).</li><li>Emanuel, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+Francisella+tularensis+within+infected+mouse+tissues+by+using+a+hand-held+PCR+thermocycler.">Detection of Francisella tularensis within infected mouse tissues by using a hand-held PCR thermocycler.</a> Journal of Clinical Microbiology. 41 (2), 689-693 (2003).</li><li>Quick, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time,+portable+genome+sequencing+for+Ebola+surveillance.">Real-time, portable genome sequencing for Ebola surveillance.</a> Nature. 530 (7589), 228 (2016).</li><li>Lu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-laboratory+validation+of+a+two-tiered+DNA+barcoding+method+for+raw+botanical+identification.">Single-laboratory validation of a two-tiered DNA barcoding method for raw botanical identification.</a> Journal of AOAC International. 102 (5), 1435-1447 (2019).</li><li>Sgamma, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+barcoding+for+industrial+quality+assurance.">DNA barcoding for industrial quality assurance.</a> Planta Medica. 83 (14-15), 1117-1129 (2017).</li><li>Wallinger, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+plant+identification+using+species-and+group-specific+primers+targeting+chloroplast+DNA.">Rapid plant identification using species-and group-specific primers targeting chloroplast DNA.</a> PLoS One. 7 (1), 29473 (2012).</li><li>Newmaster, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recommendations+for+validation+of+real-time+PCR+methods+for+molecular+diagnostic+identification+of+botanicals.">Recommendations for validation of real-time PCR methods for molecular diagnostic identification of botanicals.</a> Journal of AOAC International. , (2019).</li><li>Singh, O., Khanam, Z., Misra, N., Srivastava, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chamomile+(Matricaria+chamomilla+L.):+an+overview.">Chamomile (Matricaria chamomilla L.): an overview.</a> Pharmacognosy Reviews. 5 (9), 82 (2011).</li><li>Mills, S. Y., Bone, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Essential+Guide+to+Herbal+Safety.">The Essential Guide to Herbal Safety.</a> Elsevier Health Sciences. , 325 (2004).</li><li>Avula, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+determination+of+phenolic+compounds+by+UHPLC-UV-MS+and+use+of+partial+least-square+discriminant+analysis+to+differentiate+chemo-types+of+Chamomile/Chrysanthemum+flower+heads.">Quantitative determination of phenolic compounds by UHPLC-UV-MS and use of partial least-square discriminant analysis to differentiate chemo-types of Chamomile/Chrysanthemum flower heads.</a> Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 88, 278-288 (2014).</li><li>Guzelmeric, E., Vovk, I., Yesilada, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+validation+of+an+HPTLC+method+for+apigenin+7-O-glucoside+in+chamomile+flowers+and+its+application+for+fingerprint+discrimination+of+chamomile-like+materials.">Development and validation of an HPTLC method for apigenin 7-O-glucoside in chamomile flowers and its application for fingerprint discrimination of chamomile-like materials.</a> Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 107, 108-118 (2015).</li><li>Dieffenbach, C. W., Lowe, T. M., Dveksler, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+concepts+for+PCR+primer+design.">General concepts for PCR primer design.</a> Genome Research. 3 (3), 30-37 (1993).</li><li>Untergasser, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primer3Plus,+an+enhanced+web+interface+to+Primer3.">Primer3Plus, an enhanced web interface to Primer3.</a> Nucleic Acids Research. 35, 71-74 (2007).</li><li>Bustin, S., Huggett, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=qPCR+primer+design+revisited.">qPCR primer design revisited.</a> Biomolecular Detection and Quantification. 14, 19-28 (2017).</li><li>Brownie, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+elimination+of+primer-dimer+accumulation+in+PCR.">The elimination of primer-dimer accumulation in PCR.</a> Nucleic Acids Research. 25 (16), 3235-3241 (1997).</li><li>Dwight, Z., Palais, R., Wittwer, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=uMELT:+prediction+of+high-resolution+melting+curves+and+dynamic+melting+profiles+of+PCR+products+in+a+rich+web+application.">uMELT: prediction of high-resolution melting curves and dynamic melting profiles of PCR products in a rich web application.</a> Bioinformatics. 27 (7), 1019-1020 (2011).</li><li>Heikrujam, J., Kishor, R., Mazumder, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemistry+behind+plant+DNA+isolation+protocols.">The chemistry behind plant DNA isolation protocols.</a> Biochemical Analysis Tools - Methods for Bio-Molecules Studies. , (2020).</li><li>Blum-Silva, C. H., Chaves, V. C., Schenkel, E. P., Coelho, G. C., Reginatto, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+leaf+age+on+methylxanthines,+total+phenolic+content,+and+free+radical+scavenging+capacity+of+Ilex+paraguariensis+aqueous+extracts.">The influence of leaf age on methylxanthines, total phenolic content, and free radical scavenging capacity of Ilex paraguariensis aqueous extracts.</a> Revista Brasileira de Farmacognosia. 25 (1), 1-6 (2015).</li><li>Lu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+a+targeted+PCR+method+for+raw+and+processed+botanical+material+identification:+an+example+using+matricaria+chamomilla+(chamomile).">Validation of a targeted PCR method for raw and processed botanical material identification: an example using matricaria chamomilla (chamomile).</a> Journal of AOAC International. 102 (6), 1787-1797 (2019).</li></ol>

نحن نشهد أن Zhengxiu يانغ ، تشنغ تشيوان ، تيفاني تشوا ، ليو لي ، يانجون تشانغ ، سيلفا باباجانيان ، تريشيا تشوا ، بيتر تشانغ ، غاري سوانسون ، Zhengfei لو هم من موظفي Herbalife الدولية الأمريكية ، وشركة نحن نشهد أن فرانشيسكو Buongiorno، إيزابيلا ديلا نوس، ولورينزو كولومبو هم من موظفي شركة هيريس المحدودة التي تنتج أداة qPCR المحمولة المستخدمة في هذه المقالة.

تصميم التمهيدي واختيار قالب هي الخطوات الحاسمة في الحصول على كفاءة ومحددة QPCR التضخيم. بعد تحديد قالب مناسب ، وعادة ما يستخدم تصميم التمهيدي البرمجيات للمساعدة في اختيار التمهيديات على أساس متغيرات التصميم مثل طول التمهيدي ودرجة حرارة الذوبان ، و GC المحتوى33،34. يمكن إجراء التحسين والتحقق في ظل الظروف التجريبية المتوقعة من الفحص لضمان خصوصية وحساسية ومتانة تفاعل PCR35. قد ينتج تصميم التمهيدي دون الأمثل في تشكيل التمهيدي- الديم، حيث تنتج التفاعلات التمهيدية منتجات غير محددة36.
لا يوجد نموذج الضوابط (NTC) المستخدمة في هذه الدراسة للتحقق من كل من تلوث الحمض النووي ووجود التمهيدي- الخافتات التي يمكن أن تؤثر على الفحص. وأظهرت النتائج أي تضخيم، وهو مؤشر جيد على أن كلا من تلوث الحمض النووي والضمير التمهيدي ليست مصدر قلق. ويتضح تلوث الحمض النووي والضمير التمهيدي في منحنيات تذوب من خلال عدم وجود عناصر تحكم القالب، وكذرات إضافية في منحنيات تذوب من عناصر التحكم الإيجابية. عادةً ما يتوقع أن يحتوي منحنى الذوبان لعنصر تحكم موجب على ذروة واحدة، ما لم تتسبب النطاقات الفرعية الغنية بـ AT في القالب في ذوبان غير متساوٍ. ويمكن التنبؤ القمم المزدوجة عن طريق محاكاة ذوبان المقايسات باستخدام uMELT البرمجيات37. في هذه الدراسة، تم استخدام معيار الذهب لتشغيل المنتج PCR على هلام agarose لتأكيد وجود المنتج PCR الهدف وعدم وجود التلوث وdr-dimers.
وهناك تحد كبير في التحليل الجزيئي للمواد النباتية هو الحصول على الحمض النووي ذات النوعية الجيدة بعد عملية استخراج الحمض النووي النباتي. يتم تداول المواد النباتية واستهلاكها للمركبات الكيميائية النشطة المرتبطة بالفوائد الصحية. وفي عملية استخراج الحمض النووي، سيتم أيضاً إطلاق هذه المركبات الكيميائية في محلول استخلاص الحمض النووي، مما قد يسبب تثبيط PCR، مما يؤدي إلى فشل في تضخيم PCR. وقد تم تطوير مختلف مجموعات تنقية الحمض النووي النباتي باستخدام المذيبات العضوية والأعمدة لإزالة المركبات الكيميائية المستمدة من النباتات38. ومع ذلك، فإن غطاء الدخان والطرد المركزي عالي السرعة المطلوبين لمساعدة هذه المجموعات غير متوفرة في الميدان.
في البروتوكول الحالي، تستخدم طريقة استخلاص الحمض النووي المبسطة مجموعة استخراج الحمض النووي النباتية التجارية (انظر جدول المواد للحصول على التفاصيل). كان لديه القدرة على تحييد المواد المثبطة المشتركة لنتائج قابلة للتكاثر، وأسفر عن نتائج متسقة ل M. chamomilla وC. nobile. كل من M. chamomilla وC. رؤساء الزهور والأوراق التي أسفرت عن تضخيم PCR مع قمم تذوب محددة، مما يشير إلى أن وجود مثبطات PCR لم يكن مصدر قلق. بالنسبة للنباتات الأخرى ذات المستويات الأعلى من مثبطات PCR ، قد يكون تضخيم الحمض النووي في استخراجها الأصلي أقل كفاءة. للحد من تثبيط وتحسين كفاءة التضخيم، مع الوصول إلى المصنع كله، يمكن أيضا أجزاء أخرى من النباتات مع أقل محتوى السكريات والبوليفينول يمكن استخدامها لأغراض تحديد الهوية. إذا كان هناك وصول محدود إلى أجزاء نباتية مختلفة، والأوراق الأصغر سنا أو بتلات تشريح من رؤساء الزهور، والتي عادة ما يكون محتوى أقل الفينولية39، قد توفر فرصة أفضل للنجاح. وبما أن تسلسل الحمض النووي متسق عبر النبات بأكمله، يمكن استخدام أي جزء نباتي لتأكيد هوية الأنواع. إذا كان التضخيم PCR لا يزال دون المستوى الأمثل، يمكن أن يتم تخفيف استخراج الحمض النووي الأصلي أكثر قبل PCR، أو يمكن استخدام بروتوكولات تنقية المختبرات أكثر تطورا.
10- وثمة تحد آخر لتحليل الـ PCR يتمثل في النتائج الإيجابية الخاطئة الناجمة عن تلوث الحمض النووي، والتي يمكن أن تؤثر سلباً على تفسير البيانات. وعادة ما يتم التحكم فيها عن طريق التدبير المنزلي النشط ، وذلك باستخدام معدات مخصصة ، وتقييد العمل في مناطق معينة. باستخدام qPCR، يمكن إنجاز جميع تحليل PCR في نظام مغلق، مما يقلل إلى حد كبير من فرصة تلوث PCR أمبيرليكون في بيئة لا يتم التحكم فيها بشكل جيد. الى جانب ذلك ، يجب أن الحمض النووي البيئي أيضا لا تظهر إيجابية كاذبة بسبب خصوصية الفحص ، وفقا لدراسة التحقق السابقة40.
هناك مجال للتحسين. في البروتوكول المقدم هنا، تم استخدام صبغة التشابك لإظهار تضخيم جزء الهدف في الوقت الحقيقي. وتثبت خصوصية الطريقة كذلك من خلال درجة حرارة الذوبان المميزة، التي تتميز بين M. chamomilla وC. ناول أمبيرليكونات. ولذلك، يمكن للربط بين الصباغ PCR الإجابة بكفاءة على السؤال "ما هو هذا النوع النباتي؟" في هذا المجال. ومع ذلك، وبالإضافة إلى الحاجة إلى إجراء عملية تحديد نباتية في مصنع واحد معزول عن الحقل، فإن المساحيق أو المستخلصات النباتية في المستودع تستفيد أيضاً في كثير من الظروف من تقييم سريع للهوية في الموقع. بالنسبة لهذه الأنواع من المواد، قد تحتاج إلى معالجة أسئلة إضافية، مثل "ما هو في هذه المادة؟" و "هل تحتوي على الأنواع النباتية التي أبحث عنها؟" و "هل تحتوي على زناة أريد تجنبها؟" و "هل يتم استبدالها كليا أو جزئيا بالأنواع النباتية الأخرى الضارة؟". بدلا من استخدام صبغة التشابك، يمكن تصميم مسابير qPCR مختلفة لاستهداف amplicons من النباتات المختلفة في نظام رد فعل واحد، مع الحفاظ على خصوصية عالية وكفاءة من المقايسة. تطوير qPCR القائم على المسبار والاستفادة من نظام qPCR المحمولة التي توفر الكشف عن قنوات متعددة يمكن أن تزيد من تطبيق الاختبار الميداني كمقايسة مناسبة لهذا الغرض إلى بيئة أوسع، مثل مستودعات المواد النباتية ومراكز التوزيع للإجابة على أسئلة أكثر تعقيدا. وبالإضافة إلى ذلك، فإن استخدام مسبارات متعددة يسمح أيضا للمستخدم بتضمين التضخيم الداخلي في كل نظام رد فعل، بحيث تكون هناك معلومات إضافية تكون متاحة عندما يشتبه في تثبيط PCR.
البروتوكول المعروض هنا له المزايا التالية بالمقارنة مع التكنولوجيات الموجودة المستخدمة لنفس الغرض. أولاً، بالنسبة لأساليب التعرف المورفولوجية والكيميائية التقليدية، يلزم أن يقوم الخبراء بإجراء الإجراء ونتائجه وتفسيرها. يمكن إجراء اختبارات تحديد الهوية qPCR من قبل أشخاص لديهم تدريب أساسي في البيولوجيا الجزيئية وتفسيرها بطريقة أكثر توحيدًا. ثانياً، بالمقارنة مع تحديد الأنواع القائمة على qPCR والتمايز الذي يتم عادة في المختبر، لا يتطلب بروتوكول تحديد الهوية الميداني باستخدام جهاز محمول أدوات ذات بصمة كبيرة، مثل جهاز طرد مركزي عالي السرعة، ومعدات تقييم جودة الحمض النووي، ودورة حرارية مع كاشف الفلور، وجهاز كمبيوتر يعمل على برنامج خاص. وهكذا، يمكن إجراء تحديد الأنواع القائمة على الحمض النووي في أي مكان دون تأخير. ثالثاً، البحث عن المواد النباتية هو مهمة تتطلب عملية عالمية. مع التقدم في الخدمات السحابية والذكاء الاصطناعي، يمكن للجهاز المحمول تلقي الأساليب التي تم تطويرها والتحقق من صحتها من قبل الخبراء في المختبر، ويتم تشغيلها من قبل غير الخبراء في المناطق النائية، وإنتاج شهادات موضوعية من أطراف ثالثة. لذلك، هذا الخيار هو أكثر إلحاحا من أي وقت مضى مع العمل عن بعد أصبح الاتجاه.
باختصار، أظهر البروتوكول هنا تحديدًا ميدانيًا لـ M. chamomilla باستخدام نظام qPCR محمول. والتطبيق الناجح لهذه التقنية سوف تولد نتائج دقيقة للغاية على تحديد النباتية ومساعدة مصنعي النباتات والموردين تأهيل المواد النباتية في الوقت المناسب وبطريقة فعالة من حيث التكلفة.

ممارسة استخدام النباتات للحفاظ على وتحسين الصحة يعود إلى آلاف السنين. بسبب الضغوط على سلسلة التوريد التي جلبتها زيادة الطلب المستهلك1, ممارسات الحصاد غير المستدامة وتغير المناخ2, الزنا النباتية أصبحت مصدر قلق متزايد في صناعة المكملات الغذائية والغذائية3. قد يؤدي وجود أنواع نباتية غير معلنة أو غير محددة إلى انخفاض الفعالية، أو حتى إلى قضايا السلامة. على سبيل المثال ، يمكن استبدال كوهوش السوداء(Actaea racemosa) ، المستخدمة لعلاج الانزعاج ما قبل الحيض ، مع الأنواع الآسيوية منخفضة الثمن مع دعم محدود للبيانات السريرية لفعاليتها4. في حالة أكثر خطورة، استبدال أرييستوولوتشي fangchi ل ستيفانيا تيراندرا في دراسة سريرية لفقدان الوزن باستخدام الأعشاب الصينية أدى إلى تسمم الكلية الشديد والفشل الكلوي في بعض المشاركين5,6. وتقاسم النوعان المختلفان اسما صينيا شائعا هو "فانغ جي". وتبرز هذه الحالات الحاجة إلى مراقبة أكثر صرامة للجودة، بدءاً من تحديد المواد الخام7،ويفضل أن يكون أقرب إلى نقطة منشأ سلسلة التوريد قدر الإمكان، حتى يمكن تخصيص الموارد بكفاءة لمواد الهوية الصحيحة.
ويمكن استخدام عدد من الأساليب المتعامدة لتحديد هوية النباتات. تقليديا، يتم إجراء تحديد النباتات من خلال التقييم المورفولوجي8،,9 وطرق التحليل الكيميائي10،11،12،13. ويستند تحديد المورفولوجية على الاختلافات في السمات العيانية والمجهرية للمواد النباتية إذا كانت هناك اختلافات (الشكل 1). ومع ذلك ، فإن عدم وجود برامج تدريبية على علم النبات الكلاسيكي في السنوات الأخيرة أدى إلى نقص في الخبراء14، مما يجعل هذا النهج غير عملي لمراقبة الجودة الروتينية. كما أن تطبيقه في المواد النباتية المسحوقة محدود أيضاً. وتستخدم على نطاق واسع أساليب التحليل الكيميائي في الأدوية والمختبرات، ولكنها ليست مثالية للاختبار الميداني نظرا لحجم الأدوات مثل جودة كروماتوغرافيا طبقة رقيقة عالية الأداء (HPTLC)، والكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء (HPLC)، والمجهر الطيفي بالرنين المغناطيسي النووي (NMR) (الشكل 2)،ومتطلبات البيئة. وقد ظهرت مؤخراً طرق الجينوم كتقنية بديلة للتحقق من صحة الأنواع النباتية واكتشافها للاستعاضة عنها، وأثبتت أنها فعالة ودقيقة. أساليب الجينوم تستغل الدقة العالية وخصوصية المعلومات الوراثية في المواد النباتية15،16،17،18،19. تتوفر أدوات التشخيص الجزيئي في شكل أجهزة محمولة، وغالبا ما تتضمن أدوات تفسير البيانات الآلية التي تقلل من حاجز استخدام التكنولوجيا، مما يجعل هذا النهج مثاليا لتحديد الحقل20،21،22،23،24. مرة واحدة وقد تم تصميم طريقة التحليل الجزيئي والتحقق من صحة25،26،27، يمكن أن يؤديها أي أفراد مع التدريب البيولوجيا الجزيئية الأساسية. من بين الأدوات المحمولة المختلفة المتاحة ، PCR في الوقت الحقيقي على تسلسل الحمض النووي هو واحد من الخيارات فعالة من حيث التكلفة28. ويتيح الجمع بين جهاز محمول، إلى جانب التحليل الجزيئي المخصص والمتحقق منه، التحقق من الأنواع والمكونات النباتية خارج المختبر، كما هو الحال في المزارع ومستودعات المواد النباتية، مما يقلل من الوقت والتكاليف المرتبطة بالطرق التقليدية.
والهدف من هذا البروتوكول هو إدخال طريقة لتحديد النباتات في الحالات التي يكون فيها الوصول إلى معدات المختبرات والخبرة محدوداً أو غير متاح، وذلك باستخدام نظام qPCR محمول. وقد ثبت الأسلوب على حقل من Chamomilla Matricaria (الشكل 3A) ، المعروف باسم البابونج الألماني ، وتستخدم على نطاق واسع لخصائصه المضادة للالتهابات ومضادات الأكسدة29. ويمكن الخلط بينه وبين الأنواع ذات الصلة ذات المظهر أو الرائحة المماثلة، وخاصة من أجناس Chamaemelum، Tanacetum، والأححوان30،31،32. من بين الأنواع ذات الصلة، Chamaemelum نبيلي، المعروف أيضا باسم البابونج الروماني، هو واحد ملحوظ مع مستويات الإنتاج مماثلة في التجارة(الشكل 3B). تم تصميم الطريقة التي تم إثباتها ليس فقط لتحديد الأنواع النباتية المستهدفة M. chamomilla، ولكن أيضا الكشف عن قريب لها ، C. nobile، على أساس تضخيم محدد من تسلسل الحمض النووي.
يشرح هذا المقال، بالتفصيل، كيفية تنفيذ تحديد الحقل النباتية من M. chamomilla باستخدام qPCR القائم على صبغة التشابك وتحليل منحنى تذوب على جهاز محمول. ويتضمن البروتوكول جمع العينات النباتية من الحقل، واستخراج الحمض النووي في الموقع، وإعداد تفاعل PCR في الوقت الحقيقي. لضمان استنتاج صحيح، الهدف النباتية M. chamomilla وغير المستهدفة الحمض النووي الجينومي C. نتيل، المستخرجة مسبقا من المواد المرجعية النباتية المعتمدة، وتستخدم كتحكم إيجابي. وتتجلى خصوصية هذه الطريقة من خلال إجراء اختبارات تحديد الهوية M. chamomilla و C. nobile بشكل فردي على العينات والضوابط. يتم استخدام التحكم السلبي غير القالب لاستبعاد نتائج إيجابية كاذبة الناجمة عن التلوث PCR.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Battery</td>
			<td>TNE</td>
			<td>78000mAh</td>
			<td>Provide field power supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bCUBE</td>
			<td>HYRIS</td>
			<td>bCUBE 2.0</td>
			<td>Portable qPCR instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cartridges(16 Well)</td>
			<td>HYRIS</td>
			<td>NA</td>
			<td>Consumables for bCUBE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electric pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>NA</td>
			<td>Handling liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extract-N-AmpTM plant PCR kit</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>XNAP2-1KT</td>
			<td>Plant DNA extraction kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>German chamomile (Matricaria chamomilla L) flower botanical reference materials</td>
			<td>AHP</td>
			<td>2264</td>
			<td>Used as positive control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini dry bath</td>
			<td>Yooning</td>
			<td>MiniH-100L</td>
			<td>For DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>AMBION</td>
			<td>AM9937</td>
			<td>qPCR reaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NA</td>
			<td>qPCR reaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roman chamomile (Chamaemelum nobile) flower botancial reference materials</td>
			<td>ChromaDex</td>
			<td>ASB-00030806-005</td>
			<td>Used as positive control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luna universal qPCR master mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M3003L</td>
			<td>qPCR reaction</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

field identification of matricaria chamomilla using a portable qpcr system

مراقبة الجودة في المنتجات النباتية يبدأ مع المواد الخام المعروضة. تقليدياً، يتم إجراء تحديد النباتات من خلال التقييم المورفولوجي وطرق التحليل الكيميائي. غير أن عدم توافر علماء النبات، لا سيما في السنوات الأخيرة، إلى جانب الحاجة إلى تعزيز مراقبة الجودة لمكافحة الضغوط على سلسلة العرض الناجمة عن زيادة الطلب الاستهلاكي وتغير المناخ، يتطلب اتباع نهج بديلة. والهدف من هذا البروتوكول هو تيسير تحديد الأنواع النباتية باستخدام نظام QPCR محمول في الميدان أو في أي مكان، حيث يكون الوصول إلى معدات المختبرات والخبرة محدوداً. يتم تضخيم الحمض النووي الهدف باستخدام qPCR القائم على الصبغة ، مع الحمض النووي المستخرج من المواد المرجعية النباتية بمثابة عنصر تحكم إيجابي. يتم تحديد الحمض النووي الهدف من خلال تضخيم محددة ومطابقة ذروة ذوبان ضد السيطرة الإيجابية. وقد أدرج وصف مفصل للخطوات والمعلمات، من عملية جمع العينات الميدانية، إلى استخراج الحمض النووي، والتضخيم PCR، متبوعاً بتفسير البيانات، لضمان أن القراء يمكنهم تكرار هذا البروتوكول. تتماشى النتائج التي تم إنتاجها مع أساليب التعرف النباتية التقليدية في المختبر. وهذا البروتوكول سهل التنفيذ وفعال من حيث التكلفة، مما يتيح إجراء اختبارات نوعية على المواد الخام في أقرب وقت ممكن من نقطة منشأ سلسلة التوريد.

Watch this Scientific Journal Video about Field Identification of Matricaria chamomilla using a Portable qPCR System at JoVE.com

Field Identification of Matricaria chamomilla using a Portable qPCR System

هنا هو بروتوكول لتحديد الميدان من Chamomميلا Matricaria باستخدام نظام qPCR المحمولة. ويعتبر هذا البروتوكول الذي يسهل تنفيذه مثالياً كوسيلة لتأكيد هوية الأنواع النباتية في المواقع التي يكون فيها الوصول إلى معدات المختبرات والخبرة محدوداً، مثل المزارع والمستودعات.

التعرف الميداني على Chamomilla Matricaria باستخدام نظام qPCR المحمولة

Quality control in botanical products begins with the raw material supply. Traditionally, botanical identification is performed through morphological ...

تعود ممارسة استخدام النباتات لتحسين الصحة إلى آلاف السنين. وفي الآونة الأخيرة، أدى ازدياد الطلب، مقترنا بممارسات الحصاد غير المستدامة وتغير المناخ، إلى الضغط على سلسلة التوريد. وبسبب هذا، أصبح الزنا النباتي مصدر قلق متزايد، مما يجعل تحديد النباتات جزءًا أساسيًا بشكل متزايد من مراقبة الجودة.ومن الناحية المثالية، يتم إجراء عملية تحديد الهوية في أقرب مكان ممكن من المصدر، بحيث يمكن تخصيص الموارد بكفاءة لمواد الهوية الصحيحة. هناك عدد من الأساليب لتحديد النباتات. تقليدياً، يتم إجراء تحديد النباتات من خلال التقييم المورفولوجي وطرق التحليل الكيميائي.ويستند تحديد المورفولوجية على الاختلافات في السمات المجهرية والمجهرية للمواد النباتية. ومع ذلك ، فإنه يتطلب عالم النبات المدربين تدريبا جيدا وتطبيقه على المواد النباتية مسحوق محدود. تستخدم طرق التحليل الكيميائي على نطاق واسع في الأدوية والمختبرات، ولكنها ليست مثالية للاختبار الميداني بسبب حجم الأدوات ومتطلبات البيئة.وقد برزت مؤخراً طرق الجينوم كتقنية بديلة لتحديد الأنواع النباتية نظراً لالإخلاص العالية وخصوصية المعلومات الجينية في المواد النباتية. مع أدوات التشخيص الجزيئي المتاحة الآن في شكل من أشكال الأجهزة المحمولة، يصبح هذا النهج ممكنا للتطبيق الميداني. والهدف من هذا البروتوكول هو إدخال طريقة لتحديد النباتات في الحالات التي يكون فيها الوصول إلى معدات المختبرات والخبرة محدوداً، مثل المزرعة التي تزود المادة النباتية، باستخدام نظام QPCR محمول.وقد استخدمت Matricaria chamomilla، المعروف باسم البابونج الألماني، كدواء العشبية لتعزيز الصحة لعدة قرون. ولإثبات خصوصية الطريقة الحالية، يتم تضمين تمايز البابونج الألماني عن زهرة البابونج الأخرى الشائعة الاستخدام، المعروفة باسم البابونج الروماني، للمقارنة. يتم إثبات إجراء تحديد الحقل في وسط مزرعة البابونج الألمانية.قم بإعداد منطقة اختبار في الحقل بسطح مستو وأفقي. تحديد النبات التمثيلي الذي يعكس خصائص غالبية النباتات في حقل زهرة البابونج. اختيار رأس زهرة من النباتات ممثل باستخدام قفازات معقمة.ضع العينة في أنبوب جمع 2.0 ملليلتر. كرر وجمع نشرة ما يقرب من 0.5 إلى 0.7 سنتيمتر طويلة من نفس المصنع. سخني حاضنة الحمام الجاف إلى 95 درجة مئوية.إلى كل أنبوب جمع، إضافة 100 ميكرولترات من محلول الاستخراج من مجموعة استخراج الحمض النووي النباتي. للحصول على كفاءة أفضل لاستخراج الحمض النووي، طحن العينة باستخدام مبيد الأنسجة. أغلق الأنبوب.تأكد من أن الأنسجة النباتية مشمولة بمحلول الاستخراج طوال عملية الاستخراج. ضع أنابيب الجمع في حاضنة حمام جاف محمّى مسبقًا، وحضن أنابيب التجميع عند درجة حرارة 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق بعد 10 دقائق، أخرج الأنابيب من حاضنة الحمام الجاف. إضافة 100 ميكرولترات من محلول التخفيف من عدة استخراج الحمض النووي وخلط الحل عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا عدة مرات.كرر نفس الخطوة لاستخراج المنشورات. يهز لخلط الحل أكثر من ذلك. لا يبدو أن المشكلة النباتية عادةً قد تدهورت بعد هذه المعاملة.قد يتغير لون السائل ويصبح غائما. تكوين ظروف الدراجات الحرارية صك qPCR وفقا للجدول الأول، الذي يبدأ مع خطوة درجة حرارة ثابتة للdenaturation الأولية، تليها 25 دورة من التضخيم وينتهي مع درجة الحرارة المنحدر للحصول على منحنى ذوبان عالية الدقة. اذيب المزيج الرئيسي qPCR وال التمهيديات المدرجة في الجدول الثاني في درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام.خطة رد الفعل التي سيتم تحميلها في كل بئر. الآبار التي تحتوي على ضوابط إيجابية مع الأنواع المستهدفة، وضوابط إيجابية مع الأنواع غير المستهدفة، والعينات والضوابط السلبية. وفي هذا المثال، تستخدم 10 آبار، خمسة منها لاختبار تحديد هوية البابونج الألماني، وخمسة أخرى لاختبار تحديد هوية البابونج الروماني.لكل نوع من أنواع اختبار تحديد الأنواع، يحتوي بئر واحد على تحكم إيجابي مع الحمض النووي المستخرج من المواد المرجعية للأنواع المستهدفة، ويحتوي بئر واحد على تحكم إيجابي مع الحمض النووي المستخرج من المواد المرجعية للأنواع غير المستهدفة، ويتم تعبئة بئرين مع عينات من الحمض النووي زهرة وأوراق استخراجها من الحقل، ويتم تخصيص بئر واحد للسيطرة السلبية. ويصف الجدول الثالث كل نوع من أنواع الآبار. إعداد مزيج ماجستير رد فعل وفقا للجدول الرابع لكل اختبار تحديد الأنواع النباتية.يحتوي مزيج رئيسي نموذجي على مزيج رئيسي qPCR عالمي، مرتين، وا النوع الأمامي وعكسي وا النوع المحدد، والمياه الخالية من النوى. مختلطة تماما مزيج ماجستير رد فعل عن طريق pipetting قبل الاستخدام. ضع خرطوشة تفاعل PCR على سطح مستو ومستقر.تحميل 18 ميكرولترات من مزيج ماجستير رد فعل تكوينها في الخطوة السابقة في آبار خرطوشة وفقا لآبار محددة هنا. لهذه التظاهرة، إضافة البابونج البابونج تحديد اختبار اختبار ماجستير مزيج التفاعل الرئيسي في الآبار المسمى لاختبار GC، GCT في الآبار واحد، ثلاثة، خمسة، سبعة، تسعة، والبابون الروماني تحديد اختبار التفاعل ماجستير مزيج التفاعل في آبار وصفت لاختبار RC، RCT في الآبار اثنين، أربعة، ستة، ثمانية، 10. نقل اثنين من ميكرولترات من الحمض النووي عينة من عظمى من أنابيب استخراج الحمض النووي والضوابط الحمض النووي إيجابية المستخرجة مسبقا في آبار خرطوشة محملة مسبقا مع مزيج سيد qPCR.بعد إضافة كل قالب الحمض النووي إلى مزيج سيد qPCR، بلطف مزيج الحل عن طريق الأنابيب. ختم بعناية خرطوشة مع فيلم لاصق. قم بتحميل الكارتريدج على غرفة الدراجات الحرارية ثم أغلقها.تعيين أداة qPCR لتشغيل. وفي البروتوكول الحالي، تستخدم الصبغة المتداخلة لقياس تضخيم الشظايا المستهدفة في الوقت الحقيقي. يتم تعريف قيمة Ct على أنها عدد الدورات المطلوبة للإشارة الفلورسنت لعبور العتبة المحددة مسبقاً.واعتبرت قيمة Ct أقل من 25 دورات تضخيم إيجابي. في هذا الرقم، تم تضخيم السيطرة الإيجابية الرومانية فقط في اختبار تحديد البابونج الروماني، ولكن ليس في اختبار تحديد البابونج الألماني. تم تضخيم التحكم الإيجابي للبابونج الألماني وعينات الحقل فقط في اختبار تحديد هوية البابونج الألماني ، ولكن ليس في اختبار تحديد البابونج الروماني.لم يتم تضخيم عنصر التحكم السالب في أي من الاختبارين. وللتأكد من زيادة التضخيم المحدد في الضوابط الإيجابية والعينات، تم تشغيل كسور من PCR ومنتجات من كل بئر على جل agarose بنسبة 2٪في المختبر. جميع الآبار ذات القيمة المقطعية أقل من 25 أمبيركونز التي أسفرت عن أحجامها المتوقعة، والتي تختلف بين البابونج الألماني والبابونج الروماني.ولم تُظهر بقية الممرات أي منتج تضخيم محدد، بالاتفاق مع عدم وجود إشارة فلورية لهذه الآبار كما لوحظ في الاختبار الميداني. وبعد تضخيم نظام PCR، تم إجراء تحليل لمنحنى الذوبان باستخدام نفس البرنامج الذي استخدم لرصد الإشارة الفلورية. مع زيادة درجة الحرارة ، تبدأ أمبيركونات ذات حبلا مزدوج في التفكك ، مما يؤدي إلى انخفاض كثافة الفلوريسين.تم تحويل التغيرات كثافة الفلوريسين إلى منحنيات ذروة الذوبان لمزيد من التمييز بين البابونج الألماني من البابونج الروماني من خلال قمم ذوبانها المميزة. في هذا الرقم، ذروة ذوبان السيطرة الإيجابية البابونج الألمانية 85.6 درجة مئوية، وهو متميز عن ذروة ذوبان السيطرة الإيجابية البابونج الرومانية. تنتج أمبيركونات PCR من عينات الحقل قمم ذوبان قريبة من السيطرة الإيجابية البابونج الألمانية.يتم تحديد هوية عينة الحقل على أساس تضخيم معين ودرجة حرارة ذوبان مميزة تتطابق مع الضوابط. في هذا المثال، يتم تحديد كل من الزهور والأوراق التي تم جمعها في الحقل باسم Chamomilla Matricaria، البابونج الألماني. نتائج اختبار البابونج الروماني لهذه العينات اثنين سلبية.ويوضح البروتوكول تحديد البابونج الألماني في الميدان باستخدام نظام qPCR محمول. ويمكن أن نطور أساليب مماثلة لتوسيع محفظة النباتات التي يمكن اختبارها. نأمل أن يوفر هذا الفيديو مواد تدريبية قيمة للعلماء، حتى غير الخبراء لإجراء عملية تحديد النباتات في هذا المجال أو في بيئة ذات معدات مختبرية محدودة.ولا يسفر اختبار تحديد الهوية الميدانية المستند إلى الحمض النووي عن نتائج دقيقة للغاية تضاهي التحليل المختبري فحسب، بل يقلل أيضاً من الوقت والتكاليف المرتبطة بالطرق التقليدية التي يتم تنفيذها في المختبر.

Research

JoVE Journal

Biology

Field Identification of Matricaria chamomilla using a Portable qPCR System

Long-term Imaging Mammalian Cells using Wide-Field Microscopy

التصوير خلايا الثدييات على المدى الطويل باستخدام الميكروسكوب واسعة الميدانية

Quantitative Real-Time PCR using the Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

الكمية في الوقت الحقيقي باستخدام PCR العلمية الحرارية سولاريس qPCR الفحص

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and ...

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR (qPCR) Arrays

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR qPCR Arrays

من التنميط المسبق الجزئي الرناوات و microRNAs باستخدام الكمية في الوقت الحقيقي PCR (qPCR) صالحة

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower ...

Visualization of Caenorhabditis elegans Cuticular Structures Using the Lipophilic Vital Dye DiI

Visualization of Caenorhabditis elegans Cuticular Structures Using the Lipophilic Vital Dye DiI

تصور انواع معينة ايليجانس</emالهياكل البشرة> استخدام الصبغة الحيوية محبة للدهون ، صلاح الغيدان

The cuticle of C. elegans is a highly resistant structure that surrounds the exterior of the animal1-4. The cuticle not only protects the animal from the ...

Identification of Protein Interacting Partners Using Tandem Affinity Purification

تحديد الشركاء البروتين عن طريق التفاعل جنبا الى جنب الانجذاب تنقية

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein ...

Pyrosequencing for Microbial Identification and Characterization

Pyrosequencing لتحديد وتوصيف الميكروبية

Pyrosequencing is a versatile technique that facilitates microbial genome sequencing that can be used to identify bacterial species, discriminate ...

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

الكشف عن لايف<em&gt; كولاي</em&gt; O157: H7 من قبل خلايا PMA-QPCR

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. ...

A Strategy for Sensitive, Large Scale Quantitative Metabolomics

استراتيجية للحساسية، مقياس كبيرة الكمية الايض

Metabolite profiling has been a valuable asset in the study of metabolism in health and disease. However, current platforms have different limiting ...

qPCR Is a Sensitive and Rapid Method for Detection of Cytomegaloviral DNA in Formalin-fixed, Paraffin-embedded Biopsy Tissue

QPCR هو أسلوب حساس وسريع للكشف عن الحمض النووي من Cytomegaloviral في الفورمالين الثابتة، جزءا لا يتجزأ من البارافين-الأنسجة خزعة

It is crucial to identify cytomegalovirus (CMV) infection in the gastrointestinal (GI) tract of immunosuppressed patients, given their greater risk for ...

Identification of Kinase-substrate Pairs Using High Throughput Screening

تحديد أزواج كيناز الركيزة عن طريق فحص إنتاجية عالية


We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel ...