Name: field identification of matricaria chamomilla using a portable qpcr system
Uploaded: 2020-10-10T12:30:00
Duration: 12 min 8 s
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我们感谢詹姆斯·山在现场录像方面的努力。我们感谢乔恩·拜伦和马修·塞默劳在视频编辑方面的工作。我们感谢罗安森、杜丽和邓弗兰克在选址方面给予的支持。我们感谢玛丽亚·鲁宾斯基对整个手稿的宝贵评论。所有被承认的人都是美国康宝莱国际公司的雇员。

1. 样品收集
<ol><li>在具有平面和水平曲面的字段中设置一个测试区域。</li>
	<li>确定一种具有代表性的植物，反映洋甘菊花田中大多数植物的特征（图4）。</li>
	<li>使用无菌手套从代表性植物中挑选花头。</li>
	<li>将样品放入 2.0 mL 收集管中。</li>
	<li>重复步骤 1.3 到 1.4，然后从同一工厂收集传单（约 0.5~0.7 厘米长）。 注： M. 香莫 米拉花和叶子足够小，可以坐在 2.0 mL 收集管的底部。对于表面积较大的其他植物，可以使用纸冲头或剪刀（使用前用 70% 乙醇冲洗）来分离组织样本进行测试。当需要多次采样时，在处理不同样品之间冲洗纸冲孔或剪刀。</li>
</ol>2. DNA提取
<ol><li>将干浴培养箱预热至95°C。</li>
	<li>在每个收集管中，从植物DNA提取试剂盒中加入100μL的萃取溶液（见 材料表）。为提高DNA提取效率，使用组织虫害研磨提取溶液中的组织样本。</li>
	<li>合上管子。确保整个提取过程中植物组织都覆盖着萃取溶液。</li>
	<li>将收集管放在预热干浴培养箱中，并在 95 °C 下孵育收集管 10 分钟。</li>
	<li>10分钟后，将管子从干浴培养箱中取出。</li>
	<li>从同一DNA提取试剂盒中加入100μL的稀释溶液，通过上下移液多次混合溶液。</li>
	<li>重复相同的步骤进行传单提取。</li>
	<li>摇动以进一步混合溶液。这种治疗后，植物组织通常不会退化。液体的颜色可能会改变，变得多云。 注：如果不立即进行，稀释溶液可以在室温下过夜储存。储存前不需要从植物组织中去除细胞碎片。管中的液体保存着用于下游PCR扩增的DNA模板。</li>
</ol>3. PCR 反应设置
<ol><li>根据制造商的规格配置 qPCR 仪器热循环条件。应用 （表1）中列出的 PCR 热循环轮廓，该轮廓从初始变性的恒定温度步长开始，然后是 25 个放大周期，最后以温度上升结束，以获得高分辨率熔化曲线。</li>
	<li>使用前在室温下解冻 qPCR 主混合和底图 （ 表2） 。</li>
	<li>计划每个油井中将加载的反应：包含对目标物种的正对控制的井，对非目标物种的正对照，样品和负对（图5）。<ol>
<li>在此示例中，使用十口井 - 五口用于德国洋甘菊识别测试，其余五口用于罗马洋甘菊识别测试。对于每种类型的物种鉴定试验，一口井含有从目标物种的参考材料中提取的DNA的阳性对照，一口井含有从非靶向物种的参考材料中提取的DNA对照，两口井中含有从田间提取的花叶DNA样本，一口井为阴性对照。 表 3 描述了每种井类型。</li>
	</ol>
</li>
	<li>根据每个植物物种鉴定测试的手册准备反应主混合。典型的反应主混合包含通用 qPCR 主混合 （2x），向前和反向物种特异性底转，以及无核酸酶水。 表4 列出了反应系统的组成。 注：如果不立即使用，将 qPCR 反应主混合存储在 +2 °C 至 +8 °C 的冷却器或迷你冰箱中。</li>
	<li>使用前，通过移液彻底混合反应主混合。</li>
	<li>将 qPCR 墨盒面朝上放在平坦稳定的表面上。</li>
	<li>根据步骤 3.3 中定义的井，将步骤 3.4 中配置的反应主混合物的负载 18 μL 加载到弹壳井中。对于本演示，将德国洋甘菊识别测试测试主混合添加到标有 GC 测试（1、3、5、7、9 孔中的 GCT）和罗马洋甘菊识别测试总混合到标有 RC 测试的井中（2、4、6、8、10）中的 RCT（参见图 5）。</li>
	<li>从DNA提取管的上流液中转移2μL的DNA样本，并预先提取DNA阳性对比，进入预装 qPCR 主混合物的墨盒井中。将每个 DNA 模板添加到 qPCR 主混合后，通过移液轻轻混合溶液。 注：从DNA提取管转移DNA时，避免漂浮的细胞碎片。如有必要，使用微型离心分离上流液和细胞碎片。</li>
	<li>用胶粘膜小心地密封墨盒。将墨盒装到热循环室并关闭。</li>
	<li>将 qPCR 仪器设置为运行。</li>
</ol>

<ol>
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我们证明杨正秀、郑泉、蔡蒂芙尼、李丽奥、张彦军、席尔瓦·巴巴贾尼安、蔡三西娅、张彼得、加里·斯旺森、陆正飞是美国康宝莱国际有限公司的员工。我们证明弗朗切斯科·邦焦尔诺、伊莎贝拉·德拉·诺塞和洛伦佐·科伦坡是Hyris有限公司的员工，该公司生产本文中使用的便携式qPCR仪器。

底器设计和模板选择是获得高效、具体的 qPCR 扩增的关键步骤。在确定合适的模板后，底像设计软件通常用于根据底像长度、熔化温度和GC含量33、34等设计变量来帮助选择底像。优化和验证可以在测定的预期实验条件下进行，以确保PCR反应的特异性、灵敏度和鲁棒性。次优底转设计可能导致底转-二丁车的形成，其中底转相互作用产生非特异性产品36。
本研究中使用的无模板控制 （NTC） 检查 DNA 污染和可能影响测定的底剂- 二丁体是否存在。结果显示没有扩增，这很好地表明DNA污染和底光二十二种不是问题。脱氧核糖核酸污染和底像在熔体曲线中表现为通过模板控制，以及正对波的熔体曲线中的额外峰值。通常，正控的熔体曲线预计将包含单个峰值，除非模板中具有 AT 丰富子域导致不均匀的熔化。通过使用 uMELT 软件37模拟熔化测定，可以预测双峰。在这项研究中，使用在阿加罗斯凝胶上运行PCR产品的黄金标准来确认目标PCR产品的存在以及无污染和底金- 二丁。
植物材料分子分析面临的一个重大挑战是，在植物DNA提取过程之后获得高质量的DNA。植物材料被交易并用于与健康益处相关的活性化合物。在DNA提取过程中，这些化合物也会释放到DNA提取溶液中，从而可能导致PCR抑制，从而导致PCR扩增失败。已开发出各种植物DNA纯化试剂盒，利用有机溶剂和柱子去除植物38中衍生的化合物。但是，现场没有用于协助这些套件所需的烟罩和高速离心机。
在当前协议中，简化的DNA提取方法使用商业植物DNA提取试剂盒（详情见材料表）。它有能力中和常见的抑制物质，以产生可重复的结果，并产生一致的结果，为M.查莫米拉和C.诺比勒。M. chamomilla 和 C. nobile花头和叶子都产生了具有特定熔峰的 PCR 安普利森， 表明 PCR 抑制剂的存在不是问题。对于PCR抑制剂水平较高的其他植物，在原始萃取中扩增DNA的效率可能较低。为了减少抑制和提高扩增效率，通过进入整个工厂，其他植物部件的聚糖和多酚含量较低，也可用于识别目的。如果获得不同植物部分的机会有限，从花头上解剖的年轻叶子或花瓣，通常含有较低的酚类含量39，可能会提供更好的成功机会。由于DNA序列在整个植物中是一致的，任何植物部分都可以用来确认物种的身份。如果 PCR 扩增仍然不理想，则原始 DNA 提取物可以在 PCR 之前进一步稀释，或者使用更复杂的实验室纯化方案。
PCR分析的另一个挑战是DNA污染引起的误报结果，这会对数据解释产生负面影响。它通常由主动内务管理、使用专用设备以及将工作限制在指定区域。使用 qPCR，所有 PCR 分析都可以在封闭的系统中完成，从而大大减少了在未很好地控制的环境中 PCR 放大器污染的可能性。此外，根据先前的验证研究40，环境DNA也不应显示假阳性，因为测定的特异性。
还有改进的余地。在此介绍的协议中，用于实时显示目标片段放大。该方法的特异性进一步证实了具有特征的熔化温度，这种熔化温度在M.chamomilla和C.nobile amplicons之间是分不一的。因此，基于染料的分型PCR可以有效地回答"这种植物种类是什么？然而，除了需要对与实地隔离的单个植物进行植物鉴定外，在许多情况下，仓库中的植物粉或提取物也将受益于现场快速身份评估。对于这些类型的材料，可能需要解决其他问题，例如"这种材料中有什么？"，"它包含我要找的植物物种吗？"，"它包含我想避免的通奸剂吗？"，"它全部或部分被其他有害植物物种所替代？"不同的 qPCR 探头可以设计为在一个反应系统中针对不同植物的安普利素，同时保持检测的高特异性和效率，而不是使用中间染料。开发基于探针的 qPCR 并利用提供多通道检测的便携式 qPCR 系统，可以进一步将现场测试的应用扩展至更广泛的环境环境环境中，如植物材料仓库和配送中心，以回答更复杂的问题。此外，使用多个探头还允许用户在每个反应系统中包括内部扩增，以便当怀疑 PCR 抑制时，将有更多的信息可用。
与用于同一目的的现有技术相比，此处介绍的协议具有以下优势。首先，对于传统的形态和化学鉴定方法，需要专家对程序及其结果进行和解释。基于qPCR的识别测试可以由具有基本分子生物学训练的人进行，并且以更标准化的方式进行解释。其次，与通常采用qPCR的物种识别和分化相比，使用便携式仪器的现场识别协议不需要具有较大足迹的仪器，如高速离心机、DNA质量评估设备、带荧光探测器的热循环器以及运行特殊软件的计算机。因此，任何环境中都可以毫不拖延地进行基于DNA的物种鉴定。第三，寻找植物材料是一项需要全球行动的任务。随着云服务和人工智能的进步，便携式设备有可能接收实验室专家开发和验证的方法，由偏远地区的非专家操作，并产生来自第三方的客观认证。因此，随着远程工作成为趋势，此选项就变得越引人注目。
总之，此处的协议演示了使用便携式 qPCR 系统对 M. chamomilla 的现场识别。这项技术的成功应用将产生高度准确的植物鉴定结果，并帮助植物制造商和供应商及时、经济高效地鉴定植物材料。

使用植物来维持和改善健康的实践可以追溯到几千年前。由于消费需求增加给供应链带来的压力1、不可持续的收获做法和气候变化2，植物掺假正日益成为食品和膳食补充剂行业3中日益关注的问题。未申报或误认的植物物种的存在可能导致疗效下降，甚至安全问题。例如，用于治疗经前不适的黑科什（Actaea racemosa），可以用一个价格低廉的亚洲物种代替，其疗效为4的临床数据支持有限。在更严重的情况下，在临床研究中用中草药代替亚里斯托洛Stephania terandra奇亚·特兰德拉代替斯蒂芬妮娅·特兰德拉，导致一些参与者严重,肾毒性和肾衰竭。这两个不同的物种共享一个中国人共同的名字"方吉"。这些案例突出表明，需要更严格的质量控制，从原材料的识别开始，最好尽可能接近供应链的产地，以便将资源有效地分配给正确标识的材料。
许多正交方法可用于植物鉴定。传统上,，植物鉴定是通过形态学评估8，9,和化学分析方法10，11，12，1312,进行。10,11形态学鉴定基于植物材料的宏观和微观特征差异（如图1）。然而，近年来缺乏传统植物学培训计划，导致专家短缺，使得这种方法对常规质量控制不切实际。其在粉状植物材料中的应用也有限。化学分析方法广泛应用于药典和实验室，但由于高性能薄层色谱 （HPTLC）、高性能液相色谱 （HPLC） 和核磁共振光谱 （NMR） （图2）和环境要求等仪器的大小，因此不适合现场测试。近年来，基因组方法已成为植物物种鉴定和替代检测的替代技术，并被证明是高效和精确的。基因组方法利用,植物材料15、16、17、18、19,16,17中的遗传信息的高保真度和特异性。分子诊断工具以便携式设备的形式提供，通常包括自动数据解释工具，可降低技术使用的障碍，使这种方法非常适合现场识别20、21、22、23、24。20,21,22,23,24分子分析方法经过设计验证后，可,26,27由任何具有基本分子生物学训练的人员进行。在现有的不同便携式工具中，DNA序列上的实时PCR是具有成本效益的选择之一。便携式设备与定制和验证的分子分析相结合，可以验证实验室外的植物物种和成分，例如在农场和植物材料仓库中，从而减少与传统方法相关的时间和成本。
该协议的目标是在使用便携式 qPCR 系统有限或无法获得实验室设备和专业知识的情况下引入一种植物鉴定方法。该方法在马特里卡里亚半角肌（图3A）领域得到证明，俗称德国洋甘菊，广泛用于其抗炎和抗氧化特性29。它可以与类似的外观或气味的相关物种混淆，特别是从基因查马梅鲁姆，塔纳塞图姆，和菊花30，31，32。30,31,32在相关物种中，查马梅卢姆诺比勒，也被称为罗马洋甘菊，是一个明显的一个具有可比生产水平的商业（图3B）。所演示的方法不仅旨在识别目标植物物种M.Chamomilla，而且根据DNA序列的特定扩增来检测其近亲C.nobile。
本文详细介绍了如何使用基于染料的中分 qPCR 和便携式设备上的熔体曲线分析对 M. chamomilla 进行现场植物识别。该协议包括从现场采集植物样本，现场DNA提取，并设置实时PCR反应。为了确保有效结论，目标植物 M.查莫 米拉和非靶向植物 C.nobile 基因组DNA，从认证植物参考材料中预提取，用作阳性对照。通过分别对样品和控件执行 M. chamomilla 和 C. nobile 识别测试 ，证明了此方法的特异性。非模板负控制用于排除由 PCR 污染引起的误报结果。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Battery</td>
			<td>TNE</td>
			<td>78000mAh</td>
			<td>Provide field power supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bCUBE</td>
			<td>HYRIS</td>
			<td>bCUBE 2.0</td>
			<td>Portable qPCR instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cartridges(16 Well)</td>
			<td>HYRIS</td>
			<td>NA</td>
			<td>Consumables for bCUBE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electric pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>NA</td>
			<td>Handling liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extract-N-AmpTM plant PCR kit</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>XNAP2-1KT</td>
			<td>Plant DNA extraction kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>German chamomile (Matricaria chamomilla L) flower botanical reference materials</td>
			<td>AHP</td>
			<td>2264</td>
			<td>Used as positive control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini dry bath</td>
			<td>Yooning</td>
			<td>MiniH-100L</td>
			<td>For DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>AMBION</td>
			<td>AM9937</td>
			<td>qPCR reaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NA</td>
			<td>qPCR reaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roman chamomile (Chamaemelum nobile) flower botancial reference materials</td>
			<td>ChromaDex</td>
			<td>ASB-00030806-005</td>
			<td>Used as positive control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luna universal qPCR master mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M3003L</td>
			<td>qPCR reaction</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

field identification of matricaria chamomilla using a portable qpcr system

植物产品的质量控制始于原材料供应。传统上，植物鉴定是通过形态评估和化学分析方法进行的。然而，由于缺乏植物学家，特别是近年来，加上必须加强质量控制，以对抗消费需求增加和气候变化给供应链带来的压力，因此需要采取替代办法。该协议的目标是利用现场或任何环境中的便携式 qPCR 系统，在获得实验室设备和专门知识的机会有限的情况下，促进植物物种的鉴定。使用基于染料的 qPCR 扩增目标 DNA，从植物参考材料中提取的 DNA 作为阳性对照。目标DNA通过其特定的扩增和匹配其熔融峰与正对照来识别。详细描述了步骤和参数，从动手现场样品收集，到DNA提取，PCR扩增，然后是数据解释，以确保读者能够复制此协议。结果与传统的实验室植物鉴定方法一致。该协议易于执行且具有成本效益，使原材料的质量测试尽可能接近供应链的产地。

按照第1节所述的协议，在收集管在95°C下热孵育10分钟后，从花头和叶子中提取植物DNA进入上经剂中。在目前的研究中，上流剂显示了花和叶的黄色和绿色，表明各种天然化合物通过植物DNA释放到上流剂中（图6）。虽然后来在所有现场提取的DNA模板的三联法中实现了可靠的PCR扩增，但DNA质量评估在实验室中作为参考进行。由氟学测定的花头DNA提取物的浓度范围为3.69~5.36纳克/μL，而叶头DNA提取物的浓度范围为6.42~9.29纳克/μL。通过分光光度测量花和叶DNA提取物的A 260 /A 280和 A 260 /A 230 吸收比。280 260然而，由于DNA和植物化学UV吸收光谱之间的重叠，这些比率无法可靠地测量（数据未显示）。
用于实时监测目标片段的放大。由于特定的底法M.chamomilla和C.nobile都瞄准了内部转录的分版空间2（ITS2）区域，该区域在植物基因组中有数十到数百份拷贝，因此25个PCR扩增周期足以产生足够的安普利森，用于识别洋甘菊物种。在图7中，M. chamomilla识别测试中M.chamomilla阳性控制的Ct值小于25 （GCP_GCT），而经过25个放大周期后，C.nobile识别测试中同一对照的荧光低于检测阈值（GCP_RCT）。另一方面，经过25个周期后，M. chamomilla识别测试中C.nobile阳性控制的荧光低于检测阈值（RCP_GCT），而C.nobile识别测试中同一对C的C值小于25（RCP_RCT）。在各自的测定中对靶点和非靶向阳性对数的放大表明M.chamomilla鉴定测定的特异性。对于样本DNA，田花头和叶DNA提取物在M.chamomilla鉴定测试中分别产生15.18和19.41的Ct值（样本1（花）_GCT和样本2（LEAF）_GCT）。这两个样品在C.nobile鉴定测试（样本1（花）和样品2（LEAF）_RCT中未_RCT。两个样本的放大模式与M.chamomilla阳性对照的放大模式相匹配。在M.chamomilla和C.nobile鉴定测试C. nobile（NC_GCT和NC_RCT）中，阴性对比没有放大，排除了PCR污染导致的误报的可能性。为了进一步确认阳性对控和样品中的具体扩增，在实验室中，每井中每一个井的PCR最终产品的分数在2%的阿加罗斯凝胶上运行（图8）。对于M. chamomilla识别测试，两个现场样本都产生与M. chamomilla阳性对照相同的位置运行的 amplicons，估计大小略高于 100 bp（理论尺寸 102 bp）。对于C.nobile鉴定测试，非目标物种C.nobile阳性控制产生一个带在50和100bp之间，符合65个基点的理论大小。其余通道没有显示具体的放大产品，这与这些油井的荧光信号的缺乏一致，如现场测试所观察到的。
在PCR扩增之后，进行了熔融曲线分析，以评估加热过程中双链DNA（dsDNA）的分离特性。当熔体曲线分析的最后周期温度升高时，温度升高导致双链安普利森分离。中间荧光染料逐渐释放到溶液中，降低了荧光强度（图9A）。第一导数曲线的拐点用于确定熔融温度（Tm）（图9B），这主要取决于DNA片段长度和GC含量。将Ct值与熔化温度相结合，可提高qPCR分析的特异性。在目前的研究中 ，M. chamomilla 正控PCR放大器的熔融温度峰值发生在85.6°C（GCP_GCT），与79.1°C（RCP_RCT°C）的 C.nobile 正对PCR放大器的熔融温度峰值不同。田间花头和叶子的PCR放大器在85.2°C和84.8°C下产生熔融温度峰值（样本1（花）_GCT和样品2（LEAF）_GCT）。为了评估便携式 qPCR 系统测量的熔融温度变化，收集了额外的数据点，以确认样品熔化温度始终接近 从 M. chamomilla 阳性 控制（2 °C 内）获得的熔化温度，并且远离 C. nobile 正对安培的熔化温度（图10）。其他油井有时会报告熔化温度峰值。然而，它们的Ct值不低于25，熔化温度峰值不接近 M.chamomilla 或 C.nobile 正对照（相距超过2°C）。
总之，字段 M. chamomilla 识别测试可以根据表 5 中总结的决策 规则进行解释。由于所有阳性对子对试验均呈阳性，其他物种为阴性，阴性对子检测为阴性，因此两个现场样本均被确定为 含有M.chamomilla， 但不含 C.nobile。此外，为了使现场测试结果与其他分析技术保持一致，现场结论得到了先前验证的DNA条形码方法25 的进一步证实（数据未显示）。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60940/60940fig01.jpg"> 图1：植物材料的形态鉴定。（A）芙蓉罗萨-西宁西斯花，柯尔库马龙加根，马尔瓦西尔维斯特里斯叶，罗斯马里努斯奥菲西纳利斯叶，科里安德鲁姆萨蒂夫姆种子，津吉伯奥西纳勒根。（B ） 石油精脆片和阿皮姆甲酸片很难区分。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60940/60940fig01large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60940/60940fig02.jpg"> 图2：植物材料的化学鉴定。（A） HPTLC 仪器和具有代表性的 HPTLC 色谱图。（B） HPLC 仪器和具有代表性的 HPLC 色谱图。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60940/60940fig02large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60940/60940fig03.jpg"> 图3： 马特里卡里亚·查 莫米拉 和查梅梅卢姆· 诺比勒在外地。（A） 根据CC BY-SA 3.0改编的《马特里卡里亚·查莫米拉https://en.wikipedia.org/wiki/Matricaria_chamomilla#/media/File:Matricaria_February_2008-1.jpg。（B） 查梅梅鲁姆诺比勒，改编 自根据CC BY-SA 3.0的维基百https://en.wikipedia.org/wiki/Chamomile#/media/File:Chamaemelum_nobile_001.JPG。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60940/60940fig03large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60940/60940fig04.jpg"> 图4：从现场收集M.查莫米拉植物零件。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60940/60940fig04large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60940/60940fig05.jpg"> 图5：试验井的布局演示。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60940/60940fig05large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60940/60940fig06.jpg"> 图6：采集管中的现场DNA提取物。植物组织保留在原始管中，并覆盖在黄色DNA提取物。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60940/60940fig06large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60940/60940fig07.jpg"> 图7：荧光图显示PCR产品在25个循环的环循环中积累。M. chamomilla 阳性控制和 C. nobile 阳性控制分别显示 M. chamomilla 和 C. nobile 识别测试中的 Ct 值小于 25。田间花和叶样本通过 M.chamomilla鉴定 测试放大，Ct值为15.18和19.41。其余的油井没有放大。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60940/60940fig07large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60940/60940fig08.jpg"> 图8：现场PCR扩增产品的凝胶电泳。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60940/60940fig08large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60940/60940fig09.jpg"> 图9：熔化温度分析。（A） 每一井的荧光信号随着温度的升高而降低。（B） 在熔融曲线分析中，熔融温度峰值证实了PCR产品的身份。田间花叶样品在85.2°C和84.8°C时显示峰值。 这些接近由M. 查莫米拉正对产生的 峰值。 C. nobile 阳性控制在 79.1 °C 时产生峰值，这与其他三个样本不同。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60940/60940fig09large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60940/60940fig10.jpg"> 图10：正对照和现场样品之间的熔融温度峰值变化。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60940/60940fig10large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>阶段</td>
			<td>周期</td>
			<td>温度</td>
			<td>时间</td>
		</tr>
<tr>
<td>恒温</td>
			<td>1</td>
			<td>95 °C</td>
			<td>60 年 代</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">放大</td>
			<td rowspan="2">25</td>
			<td>95 °C</td>
			<td>30s</td>
		</tr>
<tr>
<td>60 °C</td>
			<td>30s</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">熔融曲线</td>
			<td rowspan="2">1</td>
			<td>60 °C</td>
			<td rowspan="2">斜坡 0.05 °C/s</td>
		</tr>
<tr>
<td>95 °C</td>
		</tr>
</tbody></table>表1：M.查莫米拉和 C.诺比勒识别试验的qPCR热循环 条件。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>测定</td>
			<td>底写名称</td>
			<td colspan="2">序列 5'-3'</td>
			<td>位置</td>
			<td>地区</td>
			<td>安培孔尺寸</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">马特里卡里亚·雷库蒂塔</td>
			<td>ZL3</td>
			<td colspan="2">Tcgtcggtcggataag</td>
			<td>向前</td>
			<td rowspan="2">Its2</td>
			<td rowspan="2">102 bp</td>
		</tr>
<tr>
<td>ZL4</td>
			<td colspan="2">塔卡特卡格塔格塔格克</td>
			<td>反向</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">查梅梅卢姆 · 诺比勒</td>
			<td>ZL11</td>
			<td colspan="2">特格特克卡格特格格塔加加加卡</td>
			<td>向前</td>
			<td rowspan="2">Its2</td>
			<td rowspan="2">65 bp</td>
		</tr>
<tr>
<td>ZL12</td>
			<td colspan="2">特加格格特卡特卡加卡克</td>
			<td>反向</td>
		</tr>
</tbody></table>表2：M.查莫米拉和C.诺比勒识别测试的底注对。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>井位置</td>
			<td>好名字</td>
			<td colspan="2">描述</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>GC_PosCtrl_GC_Test</td>
			<td colspan="2">德国洋甘菊在GC测试下阳性控制</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>GC_PosCtrl_RC_Test</td>
			<td colspan="2">RC 测试下的德国洋甘菊阳性控制</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>RC_PosCtrl_GC_Test</td>
			<td colspan="2">在GC测试中对罗马洋甘菊进行阳性控制</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>RC_PosCtrl_RC_Test</td>
			<td colspan="2">RC 测试下的罗马洋甘菊阳性控制</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td>Field_Sample_GC_Test</td>
			<td colspan="2">GC 测试下的叶组织样本</td>
		</tr>
<tr>
<td>6</td>
			<td>Field_Sample_RC_Test</td>
			<td colspan="2">RC 测试下的叶组织样本</td>
		</tr>
<tr>
<td>7</td>
			<td>Field_Sample_GC_Test</td>
			<td colspan="2">GC 测试下的花卉组织样本</td>
		</tr>
<tr>
<td>8</td>
			<td>Field_Sample_RC_Test</td>
			<td colspan="2">RC测试下花卉组织样本</td>
		</tr>
<tr>
<td>9</td>
			<td>NegCtrl_GC_Test</td>
			<td colspan="2">GC 测试下的负对控制样本</td>
		</tr>
<tr>
<td>10</td>
			<td>NegCtrl_RC_Test</td>
			<td colspan="2">RC 测试下的负对控制样品</td>
		</tr>
</tbody></table>表3：M.查莫米拉 和C.诺比勒 识别 测试的井型和 说明。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>试剂</td>
			<td>GC_Test</td>
			<td>RC_Test</td>
		</tr>
<tr>
<td>通用 qPCR 混合*</td>
			<td>10 μL</td>
			<td>10 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>ZL3 底明 （10 μM）</td>
			<td>0.4 μL</td>
			<td>那</td>
		</tr>
<tr>
<td>ZL4 底是：10 μM）</td>
			<td>0.4 μL</td>
			<td>那</td>
		</tr>
<tr>
<td>ZL11 底明（10 μM）</td>
			<td>那</td>
			<td>0.4 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>ZL12 底是：10 μM）</td>
			<td>那</td>
			<td>0.4 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>H2O （无核酶）</td>
			<td>7.2 μL</td>
			<td>7.2 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">* 包含热启动 Taq DNA 聚合酶</td>
		</tr>
</tbody></table>表4：M.查莫米拉 和C. 诺比勒识别 测试的主混合 组合。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td rowspan="2">好名字</td>
			<td rowspan="2">预期结果</td>
			<td>积极结果标准</td>
			<td>负结果标准</td>
		</tr>
<tr>
<td>已检测到/存在</td>
			<td>未检测到/不存在</td>
		</tr>
<tr>
<td>GC_PosCtrl_GC_Test</td>
			<td>检测</td>
			<td>Ct < 25 和 84 <\ Tm <= 86</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>GC_PosCtrl_RC_Test</td>
			<td>未检测到</td>
			<td>-</td>
			<td>25 个周期内无 Ct 值</td>
		</tr>
<tr>
<td>RC_PosCtrl_GC_Test</td>
			<td>未检测到</td>
			<td>-</td>
			<td>25 个周期内无 Ct 值</td>
		</tr>
<tr>
<td>RC_PosCtrl_RC_Test</td>
			<td>检测</td>
			<td>Ct < 25 和 79 <\ Tm <= 81</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>Field_Sample_Leaf_GC_Test</td>
			<td>目前</td>
			<td>Ct < 25 和 84 <\ Tm <= 86</td>
			<td>25 个周期内无 Ct 值</td>
		</tr>
<tr>
<td>Field_Sample_Leaf_RC_Test</td>
			<td>缺席</td>
			<td>-</td>
			<td>25 个周期内无 Ct 值</td>
		</tr>
<tr>
<td>Field_Sample_Flower_GC_Test</td>
			<td>目前</td>
			<td>Ct < 25 和 84 <\ Tm <= 86</td>
			<td>25 个周期内无 Ct 值</td>
		</tr>
<tr>
<td>Field_Sample_Flower_RC_Test</td>
			<td>缺席</td>
			<td>-</td>
			<td>25 个周期内无 Ct 值</td>
		</tr>
<tr>
<td>NegCtrl_GC_Test</td>
			<td>未检测到</td>
			<td>-</td>
			<td>25 个周期内无 Ct 值</td>
		</tr>
<tr>
<td>NegCtrl_RC_Test</td>
			<td>未检测到</td>
			<td>-</td>
			<td>25 个周期内无 Ct 值</td>
		</tr>
</tbody></table>表5：qPCR结果解释规则。

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Field Identification of Matricaria chamomilla using a Portable qPCR System

此处介绍的是使用便携式 qPCR 系统对马特里卡 里亚查莫米拉进行现场识别的协议。这种易于执行的协议是确认植物物种在实验室设备和专业知识有限的地方（如农场和仓库）的身份的理想方法。

使用便携式 qPCR 系统对 马特里卡里亚查莫米拉进行现场识别

Quality control in botanical products begins with the raw material supply. Traditionally, botanical identification is performed through morphological ...

使用植物来改善健康的实践可以追溯到几千年前。最近，需求增加，加上不可持续的收获做法和气候变化，给供应链带来压力。因此，植物掺假正日益成为人们关注的焦点，使植物鉴定成为质量控制中日益重要的一部分。理想情况下，标识尽可能靠近源，以便可以有效地将资源分配给正确标识的材料。植物鉴定的方法有很多种。传统上，植物鉴定是通过形态评估和化学分析方法进行的。形态学鉴定基于植物材料宏观和微观特征的差异。然而，它需要一个训练有素的植物学家，其应用粉状植物材料是有限的。化学分析方法广泛应用于药典和实验室，但由于仪器尺寸和环境要求，不理想的现场测试。近年来，由于植物材料中基因组信息的高保真度和特异性，基因组方法已成为植物物种鉴定的替代技术。现在，分子诊断工具以便携式设备的形式提供，这种方法可用于现场应用。该协议的目标是在实验室设备和专门知识有限的情况下引入一种植物鉴定方法，例如使用便携式 qPCR 系统提供植物材料的农场。几个世纪以来，马特里卡里亚香米拉，俗称德国洋甘菊，一直被用作促进健康的药物。为了证明目前方法的特异性，包括德国洋甘菊与其他常用的洋甘菊花（罗马洋甘菊）的区分进行比较。在德国洋甘菊农场中间演示了现场识别程序。在具有平面和水平曲面的字段中设置一个测试区域。确定一种具有代表性的植物，该植物反映了洋甘菊花田中大多数植物的特征。使用无菌手套从代表性植物中挑选花头。将样品放入 2.0 毫升收集管中。重复并收集同一植物约 0.5 至 0.7 厘米长的传单。将干浴孵化器预热至 95 摄氏度。在每个采集管中，从植物DNA提取试剂盒中加入100微升的萃取溶液。为了更好的DNA提取效率，使用组织虫害研磨样品。合上管子。确保在整个萃取过程中，提取溶液覆盖植物组织。将收集管放在预热干浴培养箱中，在 95 摄氏度下孵育收集管 10 分钟后，将收集管从干浴培养箱中取出。从DNA提取试剂盒中加入100微升稀释溶液，通过上下移液多次混合溶液。重复相同的步骤进行传单提取。摇动以进一步混合溶液。植物问题通常不会在此处理后退化。液体的颜色可能会改变，变得多云。根据表一配置 qPCR 仪器热循环条件，表一从初始变性的恒定温度步长开始，然后是 25 个放大周期，最后以温度斜坡结束，以获得高分辨率熔化曲线。使用前在室温下解冻表 2 中列出的 qPCR 主混合物和底向。计划每个井中加载的反应。包含对目标物种的正对控制、非目标物种的正对等对等井、样本和阴性对等。在此示例中，使用 10 口井，5 口用于德国洋甘菊识别测试，另外 5 口用于罗马洋甘菊识别测试。对于每种类型的物种鉴定测试，一口井包含从目标物种参考材料中提取的DNA阳性对照，一口井包含从非靶类物种参考材料中提取的DNA阳性对照，两口井中填充从田间提取的花叶DNA样本，一口井为阴性对照分配。表三描述了每种井型。根据每个植物物种鉴定测试的表四准备反应主组合。典型的反应主混合包含通用 qPCR 主混合，两次，向前和反向物种特定的底剂，和无核酸酶水。使用前通过移液彻底混合反应母体混合物。将 PCR 反应盒面朝上放在平坦稳定的表面上。根据此处定义的油井，将上一步配置的反应主混合物的 18 微升加载到墨盒井中。为进行本演示，将德国洋甘菊识别试验反应主混合添加到标有GC测试的井中，GCT在井中标有一、三、五、七、九，将罗马洋甘菊识别试验反应主混合到标有RC测试的井中，RCT在孔中标注二、四、六、八、十。从DNA提取管的上流液中转移两个微升的DNA样本，并预先提取DNA阳性对照器到预装 qPCR 主混合物的墨盒井中。将每个 DNA 模板添加到 qPCR 主混合后，通过移液轻轻混合溶液。用胶粘膜小心地密封墨盒。将墨盒装到热循环室并关闭。将 qPCR 仪器设置为运行。在目前的协议中，用于实时测量目标片段的放大。Ct 值定义为荧光信号跨过预定义阈值所需的周期数。小于 25 个周期的 Ct 值被视为正放大。在这个数字中，罗马阳性控制只在罗马洋甘菊识别测试中放大，而在德国洋甘菊识别测试中没有放大。德国的洋甘菊阳性对照和现场样品只在德国洋甘菊鉴定测试中放大，而在罗马洋甘菊鉴定测试中没有放大。在这两次测试中，阴性控制都没有放大。为了进一步确认阳性对控和样品中的具体扩增，在实验室中，每井中每一个井的PCR和产品的分数都运行在2%的气糖凝胶上。所有 Ct 值小于 25 的井都以预期尺寸生成安普利森，这与德国洋甘菊和罗马洋甘菊不同。其余通道没有显示具体的放大产品，与现场测试中观察到的这些油井没有荧光信号一致。PCR 扩增后，使用用于监测荧光信号的相同软件进行了熔融曲线分析。随着温度的升高，双链安普利森开始分离，导致荧光强度降低。荧光强度变化进一步转化为融化峰曲线，通过其特有的融化峰进一步区分德国洋甘菊与罗马洋甘菊。在这个数字中，德国洋甘菊正控的融化峰值为85.6摄氏度，与罗马洋甘菊正控的融化峰值不同。来自现场样品的PCR安普利森产生接近德国洋甘菊阳性控制的熔融峰。现场样品的标识基于与控制装置匹配的特定放大和特征熔化温度确定。在此示例中，在田间收集的花和叶均被识别为德国洋甘菊马特里卡里亚洋甘菊。这两个样品的罗马洋甘菊测试结果为阴性。该协议演示了使用便携式 qPCR 系统现场识别德国洋甘菊。我们可以开发类似的方法来扩大可以测试的植物组合。我们希望这个视频将为科学家，甚至非专家提供宝贵的培训材料，在实验室设备有限的领域或环境中进行植物鉴定。基于DNA的现场鉴定测试不仅产生与实验室分析相匹配的高精度结果，而且减少了与实验室中的传统方法相关的时间和成本。

Research

JoVE Journal

Biology

Field Identification of Matricaria chamomilla using a Portable qPCR System

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科研

生物学

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