Name: field identification of matricaria chamomilla using a portable qpcr system
Uploaded: 2020-10-10T12:30:00
Duration: 12 min 8 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Field Identification of Matricaria chamomilla using a Portable qPCR System at JoVE.com

Vi takker James Shan for hans indsats i marken videooptagelse. Vi takker Jon Byron og Matthew Semerau for deres arbejde med videoredigering. Vi takker Ansen Luo, Harry Du og Frank Deng for deres støtte til at lokalisere testfeltet. Vi takker Maria Rubinsky for hendes værdifulde kommentarer til hele manuskriptet. Alle de anerkendte personer er ansatte i Herbalife International of America, Inc.

1. Indsamling af prøver
<ol><li>Opret et testområde i marken med en flad og vandret overflade.</li>
	<li>Identificer en repræsentativ plante, der afspejler de fleste planters karakteristika i kamilleblomstfeltet (Figur 4).</li>
	<li>Vælg et blomsterhoved fra den repræsentative plante ved hjælp af sterile handsker.</li>
	<li>Prøven anbringes i et 2,0 ml opsamlingsrør.</li>
	<li>Trin 1.3 til 1.4 gentages, og der indsamles en folder (ca. 0,5-0,7 cm lang) fra samme plante. BEMÆRK: M. chamomilla blomst og blade er små nok til at sidde i bunden af en 2,0 ml opsamlingsrør. For andre planteekstrakter med større overfladeareal kan en papirpunch eller saks (skyllet i 70% ethanol før brug) bruges til at isolere vævsprøver til test. Når der kræves flere prøver, skylles papirpunch eller saks mellem håndtering af forskellige prøver.</li>
</ol>2. DNA-ekstraktion
<ol><li>Forvarm det tørre bad inkubator til 95 °C.</li>
	<li>Til hvert opsamlingsrør tilsættes 100 μL ekstraktionsopløsning fra plantens DNA-ekstraktionskit (opført i materialetabel). For bedre DNA-ekstraktion effektivitet, male vævsprøven i ekstraktionen løsning ved hjælp af en væv støder.</li>
	<li>Luk røret. Sørg for, at det botaniske væv er dækket med ekstraktionsopløsningen under hele ekstraktionsprocessen.</li>
	<li>Opsamlingsrørene anbringes i en forvarmet tørbadekubator, og opsamlingsrørene inkuberes ved 95 °C i 10 min.</li>
	<li>Efter 10 min, tage rørene ud af det tørre bad inkubator.</li>
	<li>Der tilsættes 100 μL fortyndingsopløsning fra samme DNA-ekstraktionssæt, og opløsningen blandes ved at pipettere op og ned flere gange.</li>
	<li>Gentag det samme trin for indlægsseddelekstraktion.</li>
	<li>Ryst for at blande opløsningen yderligere. Plantevævet normalt ikke synes at være nedbrudt efter denne behandling. Den flydende farve kan ændre sig og blive uklar. BEMÆRK: Den fortyndede opløsning kan opbevares ved stuetemperatur natten over, hvis den ikke fortsætter med det samme. Det er ikke nødvendigt at fjerne cellulære rester fra plantevæv før opbevaring. Væsken i rørene indeholder DNA-skabeloner til downstream PCR forstærkning.</li>
</ol>3. PCR reaktion setup
<ol><li>Konfigurer betingelserne for termocykling af qPCR-instrumentet i overensstemmelse med producentens specifikationer. Påfør den PCR-termocyklingsprofil, der er anført i (tabel 1), som starter med et konstant temperaturtrin til indledende denaturering efterfulgt af 25 cyklusser af forstærkning og slutter med temperaturramning for at opnå en smeltekurve med høj opløsning.</li>
	<li>Optø qPCR Master Mix og primere (Tabel 2) ved stuetemperatur før brug.</li>
	<li>Planlæg den reaktion, der vil blive indlæst i hver brønd: brønde, der indeholder positiv kontrol med målarter, positiv kontrol med ikke-målarter, prøver og negativ kontrol (figur 5).<ol>
<li>I dette eksempel bruges der ti brønde – fem til den tyske kamilleidentifikationstest og de resterende fem til den romerske kamilleidentifikationstest. For hver type artsidentifikationstest indeholder en brønd positiv kontrol med DNA udvundet af den målrettede arts referencemateriale, en brønd indeholder positiv kontrol med DNA udvundet af ikke-målrettet arts referencemateriale, to brønde fyldes med blomster- og blad-DNA-prøver udvundet fra marken, og en brønd tildeles en negativ kontrol. Tabel 3 beskriver hver brøndtype.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Der forberedes en reaktionsmasterblanding i henhold til manualen for hver identifikationstest for botaniske arter. En typisk reaktion master-mix indeholder universelle qPCR Master Mix (2x), frem og tilbage arter-specifikke primere, og nuklease-fri vand. Tabel 4 viser reaktionssystemets sammensætning. BEMÆRK: Hvis qPCR-reaktionsmasteren opbevares ikke med det samme ved +2 °C til +8 °C i køligere eller minikøleskab.</li>
	<li>Bland reaktionsmaster-mix grundigt ved pipettering før brug.</li>
	<li>Placer qPCR-patronen med forsiden af den på en flad og stabil overflade.</li>
	<li>18 μL af den reaktionsmaster-mix, der er konfigureret i trin 3.4, indlæses i patronbæderne i henhold til de brønde, der er defineret i trin 3.3. Til denne demonstration skal den tyske kamilleidentifikationstestmaster blandes i brønde mærket til GC-test (GCT i brønde 1, 3, 5, 7, 9) og den romerske kamilleidentifikationstest master-mix i brønde mærket til RC-test (RCT i brønde 2, 4, 6, 8, 10) (se figur 5).</li>
	<li>2 μL prøve-DNA overføres fra supernatanten af DNA-ekstraktionsrør og forudsugede DNA-positive kontroller i patronbængsterne forudindlæst med qPCR-masterblanding. Når hver DNA-skabelon er tilføjet til qPCR-masterblandingen, blandes opløsningen forsigtigt ved pipettering. BEMÆRK: Undgå flydende cellulære rester, når DNA overføres fra DNA-ekstraktionsrøret. Brug minicentrifuge til at adskille supernatant og cellulære snavs, hvis det er nødvendigt.</li>
	<li>Forsegle patronen forsigtigt med klæbefilm. Læg patronen på termocyklingkammeret, og luk den.</li>
	<li>Indstil qPCR-instrumentet til at køre.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Smith, T., Gillespie, M., Eckl, V., Knepper, J., Reynolds, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herbal+supplement+sales+in+US+increase+by+9.4%+in+2018.">Herbal supplement sales in US increase by 9.4% in 2018.</a> HerbalGram. 123, 62-73 (2019).</li><li>Israelsen, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+challenge+of+regulation,+globalization+and+climate+change+on+botanicals+and+traditional+medicines:+respecting+tradition+while+embracing+change.">The challenge of regulation, globalization and climate change on botanicals and traditional medicines: respecting tradition while embracing change.</a> Planta Medica. 74 (3), 36 (2008).</li><li>Cardellina, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+and+opportunities+confronting+the+botanical+dietary+supplement+industry.">Challenges and opportunities confronting the botanical dietary supplement industry.</a> Journal of Natural Products. 65 (7), 1073-1084 (2002).</li><li>Foster, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+peripatetic+maze+of+black+cohosh+adulteration:+a+review+of+the+nomenclature,+distribution,+chemistry,+market+status,+analytical+methods+and+safety.">Exploring the peripatetic maze of black cohosh adulteration: a review of the nomenclature, distribution, chemistry, market status, analytical methods and safety.</a> HerbalGram. 98, 32-51 (2013).</li><li>Vanherweghem, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Misuse+of+herbal+remedies:+The+case+of+an+outbreak+of+terminal+renal+failure+in+Belgium+(Chinese+herbs+nephropathy).">Misuse of herbal remedies: The case of an outbreak of terminal renal failure in Belgium (Chinese herbs nephropathy).</a> The Journal of Alternative and Complementary Medicine. 4 (1), 9-13 (1998).</li><li>Vanherweghem, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapidly+progressive+interstitial+renal+fibrosis+in+young+women:+association+with+slimming+regimen+including+Chinese+herbs.">Rapidly progressive interstitial renal fibrosis in young women: association with slimming regimen including Chinese herbs.</a> The Lancet. 341 (8842), 387-391 (1993).</li><li>Khan, I. A., Smillie, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implementing+a+"quality+by+design"+approach+to+assure+the+safety+and+integrity+of+botanical+dietary+supplements.">Implementing a "quality by design" approach to assure the safety and integrity of botanical dietary supplements.</a> Journal of Natural Products. 75 (9), 1665-1673 (2012).</li><li>Applequist, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Identification of Medicinal Plants: A Handbook of the Morphology of Botanicals in Commerce. , (2006).</li><li>Upton, R., Graff, A., Jolliffe, G., L&#228;nger, R., Williamson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> American Herbal Pharmacopoeia: Botanical Pharmacognosy - Microscopic Characterization of Botanical Medicines. , (2016).</li><li>Frommenwiler, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+HPTLC+fingerprinting+for+quality+control+of+an+herbal+drug+-+the+case+of+angelica+gigas+root.">Comprehensive HPTLC fingerprinting for quality control of an herbal drug - the case of angelica gigas root.</a> Planta Medica. 84 (6-7), 465-474 (2018).</li><li>Heyman, H. M., Meyer, J. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMR-based+metabolomics+as+a+quality+control+tool+for+herbal+products.">NMR-based metabolomics as a quality control tool for herbal products.</a> South African Journal of Botany. 82, 21-32 (2012).</li><li>Lazarowych, N. J., Pekos, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+fingerprinting+and+marker+compounds+for+identification+and+standardization+of+botanical+drugs:+strategies+for+applying+pharmaceutical+HPLC+analysis+to+herbal+products.">Use of fingerprinting and marker compounds for identification and standardization of botanical drugs: strategies for applying pharmaceutical HPLC analysis to herbal products.</a> Drug Information Journal. 32 (2), 497-512 (1998).</li><li>Tankeu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperspectral+imaging+and+support+vector+machine:+a+powerful+combination+to+differentiate+black+cohosh+(actaea+racemosa)+from+other+cohosh+species.">Hyperspectral imaging and support vector machine: a powerful combination to differentiate black cohosh (actaea racemosa) from other cohosh species.</a> Planta Medica. 84 (6-7), 407-419 (2018).</li><li>Rodman, J. E., Cody, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+taxonomic+impediment+overcome:+NSF's+Partnerships+for+Enhancing+Expertise+in+Taxonomy+(PEET)+as+a+model.">The taxonomic impediment overcome: NSF's Partnerships for Enhancing Expertise in Taxonomy (PEET) as a model.</a> Systematic Biology. 52 (3), 428-435 (2003).</li><li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+renaissance+in+herbal+medicine+identification:+from+morphology+to+DNA.">A renaissance in herbal medicine identification: from morphology to DNA.</a> Biotechnology Advances. 32 (7), 1237-1244 (2014).</li><li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+DNA+barcoding:+from+gene+to+genome.">Plant DNA barcoding: from gene to genome.</a> Biological Reviews. 90 (1), 157-166 (2015).</li><li>Madesis, P., Ganopoulos, I., Sakaridis, I., Argiriou, A., Tsaftaris, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+of+DNA-based+methods+for+tracing+the+botanical+origin+of+food+products.">Advances of DNA-based methods for tracing the botanical origin of food products.</a> Food Research International. 60, 163-172 (2014).</li><li>Newmaster, S. G., Ragupathy, S., Janovec, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+botanical+renaissance:+state-of-the-art+DNA+bar+coding+facilitates+an+automated+identification+technology+system+for+plants.">A botanical renaissance: state-of-the-art DNA bar coding facilitates an automated identification technology system for plants.</a> International Journal of Computer Applications in Technology. 35 (1), 50-60 (2009).</li><li>Parveen, I., Gafner, S., Techen, N., Murch, S. J., Khan, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+barcoding+for+the+identification+of+botanicals+in+herbal+medicine+and+dietary+supplements:+strengths+and+limitations.">DNA barcoding for the identification of botanicals in herbal medicine and dietary supplements: strengths and limitations.</a> Planta Medica. 82 (14), 1225-1235 (2016).</li><li>Agrawal, N., Hassan, Y. A., Ugaz, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pocket-sized+convective+PCR+thermocycler.">A pocket-sized convective PCR thermocycler.</a> Angewandte Chemie International Edition. 46 (23), 4316-4319 (2007).</li><li>Almassian, D. R., Cockrell, L. M., Nelson, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Portable+nucleic+acid+thermocyclers.">Portable nucleic acid thermocyclers.</a> Chemical Society Reviews. 42 (22), 8769-8798 (2013).</li><li>Ben&#237;tez-P&#225;ez, A., Portune, K. J., Sanz, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Species-level+resolution+of+16S+rRNA+gene+amplicons+sequenced+through+the+MinION+portable+nanopore+sequencer.">Species-level resolution of 16S rRNA gene amplicons sequenced through the MinION portable nanopore sequencer.</a> Gigascience. 5 (1), 4 (2016).</li><li>Emanuel, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+Francisella+tularensis+within+infected+mouse+tissues+by+using+a+hand-held+PCR+thermocycler.">Detection of Francisella tularensis within infected mouse tissues by using a hand-held PCR thermocycler.</a> Journal of Clinical Microbiology. 41 (2), 689-693 (2003).</li><li>Quick, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time,+portable+genome+sequencing+for+Ebola+surveillance.">Real-time, portable genome sequencing for Ebola surveillance.</a> Nature. 530 (7589), 228 (2016).</li><li>Lu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-laboratory+validation+of+a+two-tiered+DNA+barcoding+method+for+raw+botanical+identification.">Single-laboratory validation of a two-tiered DNA barcoding method for raw botanical identification.</a> Journal of AOAC International. 102 (5), 1435-1447 (2019).</li><li>Sgamma, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+barcoding+for+industrial+quality+assurance.">DNA barcoding for industrial quality assurance.</a> Planta Medica. 83 (14-15), 1117-1129 (2017).</li><li>Wallinger, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+plant+identification+using+species-and+group-specific+primers+targeting+chloroplast+DNA.">Rapid plant identification using species-and group-specific primers targeting chloroplast DNA.</a> PLoS One. 7 (1), 29473 (2012).</li><li>Newmaster, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recommendations+for+validation+of+real-time+PCR+methods+for+molecular+diagnostic+identification+of+botanicals.">Recommendations for validation of real-time PCR methods for molecular diagnostic identification of botanicals.</a> Journal of AOAC International. , (2019).</li><li>Singh, O., Khanam, Z., Misra, N., Srivastava, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chamomile+(Matricaria+chamomilla+L.):+an+overview.">Chamomile (Matricaria chamomilla L.): an overview.</a> Pharmacognosy Reviews. 5 (9), 82 (2011).</li><li>Mills, S. Y., Bone, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Essential+Guide+to+Herbal+Safety.">The Essential Guide to Herbal Safety.</a> Elsevier Health Sciences. , 325 (2004).</li><li>Avula, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+determination+of+phenolic+compounds+by+UHPLC-UV-MS+and+use+of+partial+least-square+discriminant+analysis+to+differentiate+chemo-types+of+Chamomile/Chrysanthemum+flower+heads.">Quantitative determination of phenolic compounds by UHPLC-UV-MS and use of partial least-square discriminant analysis to differentiate chemo-types of Chamomile/Chrysanthemum flower heads.</a> Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 88, 278-288 (2014).</li><li>Guzelmeric, E., Vovk, I., Yesilada, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+validation+of+an+HPTLC+method+for+apigenin+7-O-glucoside+in+chamomile+flowers+and+its+application+for+fingerprint+discrimination+of+chamomile-like+materials.">Development and validation of an HPTLC method for apigenin 7-O-glucoside in chamomile flowers and its application for fingerprint discrimination of chamomile-like materials.</a> Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 107, 108-118 (2015).</li><li>Dieffenbach, C. W., Lowe, T. M., Dveksler, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+concepts+for+PCR+primer+design.">General concepts for PCR primer design.</a> Genome Research. 3 (3), 30-37 (1993).</li><li>Untergasser, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primer3Plus,+an+enhanced+web+interface+to+Primer3.">Primer3Plus, an enhanced web interface to Primer3.</a> Nucleic Acids Research. 35, 71-74 (2007).</li><li>Bustin, S., Huggett, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=qPCR+primer+design+revisited.">qPCR primer design revisited.</a> Biomolecular Detection and Quantification. 14, 19-28 (2017).</li><li>Brownie, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+elimination+of+primer-dimer+accumulation+in+PCR.">The elimination of primer-dimer accumulation in PCR.</a> Nucleic Acids Research. 25 (16), 3235-3241 (1997).</li><li>Dwight, Z., Palais, R., Wittwer, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=uMELT:+prediction+of+high-resolution+melting+curves+and+dynamic+melting+profiles+of+PCR+products+in+a+rich+web+application.">uMELT: prediction of high-resolution melting curves and dynamic melting profiles of PCR products in a rich web application.</a> Bioinformatics. 27 (7), 1019-1020 (2011).</li><li>Heikrujam, J., Kishor, R., Mazumder, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemistry+behind+plant+DNA+isolation+protocols.">The chemistry behind plant DNA isolation protocols.</a> Biochemical Analysis Tools - Methods for Bio-Molecules Studies. , (2020).</li><li>Blum-Silva, C. H., Chaves, V. C., Schenkel, E. P., Coelho, G. C., Reginatto, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+leaf+age+on+methylxanthines,+total+phenolic+content,+and+free+radical+scavenging+capacity+of+Ilex+paraguariensis+aqueous+extracts.">The influence of leaf age on methylxanthines, total phenolic content, and free radical scavenging capacity of Ilex paraguariensis aqueous extracts.</a> Revista Brasileira de Farmacognosia. 25 (1), 1-6 (2015).</li><li>Lu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+a+targeted+PCR+method+for+raw+and+processed+botanical+material+identification:+an+example+using+matricaria+chamomilla+(chamomile).">Validation of a targeted PCR method for raw and processed botanical material identification: an example using matricaria chamomilla (chamomile).</a> Journal of AOAC International. 102 (6), 1787-1797 (2019).</li></ol>

Vi bekræfter, at Zhengxiu Yang, Zheng Quan, Tiffany Chua, Leo Li, Yanjun Zhang, Silva Babajanian, Tricia Chua, Peter Chang, Gary Swanson, Zhengfei Lu er ansatte i Herbalife International of America, Inc. Vi bekræfter, at Francesco Buongiorno, Isabella Della Noce, og Lorenzo Colombo er ansatte i Hyris Ltd. der producerer den bærbare qPCR instrument, der anvendes i denne artikel.

Udformningen af primere og skabelon udvælgelse er de afgørende skridt i at opnå en effektiv og specifik qPCR forstærkning. Efter at have identificeret en passende skabelon, primer design software bruges typisk til at hjælpe udvælgelse af primers baseret på design variabler såsom primer længde, smeltetemperatur, og GC indhold33,34. Optimering og validering kan udføres under de forventede eksperimentelle betingelser for analysen for at sikre specificitet, følsomhed og robusthed af en PCR-reaktion35. Suboptimal primer design kan resultere i primer-dimer dannelse, hvor primer interaktioner producere ikke-specifikke produkter36.
De ingen skabelonkontroller (NTC), der anvendes i denne undersøgelse, kontrollerer både DNA-kontaminering og tilstedeværelsen af primer-dimers, der kan påvirke analysen. Resultaterne viste ingen forstærkning, en god indikation af, at både DNA-kontaminering og primer-dimers ikke er et problem. DNA-forurening og primer-dimers manifesteres i smeltekurver gennem ingen skabelon kontrol, og som ekstra toppe i smelte kurver af positive kontroller. Smeltekurven for en positiv kontrol forventes typisk at indeholde en enkelt top, medmindre AT-rige underdomæner i skabelonen forårsager ujævn smeltning. Dobbelt toppe kunne forudsiges ved at simulere smeltende analyser ved hjælp af uMELT software37. I denne undersøgelse blev guldstandarden for at køre PCR-produktet på agarosegel anvendt til at bekræfte tilstedeværelsen af mål-PCR-produkt og fravær af kontaminering og primerdæmpere.
En betydelig udfordring i botanisk materiale molekylær analyse er at opnå god kvalitet DNA efter den botaniske DNA ekstraktion proces. Botaniske materialer handles og forbruges for de aktive kemiske forbindelser, der er forbundet med sundhedsmæssige fordele. I processen med DNA-ekstraktion, disse kemiske forbindelser vil også blive frigivet i DNA-ekstraktion løsning, potentielt forårsager PCR-hæmning, hvilket resulterer i fejl i PCR forstærkning. Forskellige plante DNA rensning kits ved hjælp af organiske opløsningsmidler og kolonner er blevet udviklet til at fjerne kemiske forbindelser stammer fra botaniske38. Men røghætte og højhastighedscentrifuge, der kræves for at hjælpe disse kits er ikke tilgængelige i marken.
I den nuværende protokol anvender den forenklede DNA-ekstraktionsmetode et kommercielt dna-ekstraktionssæt (se Tabel over materialer for nærmere oplysninger). Det havde evnen til at neutralisere fælles hæmmende stoffer for reproducerbare resultater og produceret ensartede resultater for M. chamomilla og C. nobile. Både M. chamomilla og C. nobile blomsterhoveder og blade gav PCR amplicons med specifikke smeltetoppe, hvilket indikerer, at tilstedeværelsen af PCR-hæmmere ikke var et problem. For andre planter med højere niveauer af PCR-hæmmere kan det være mindre effektivt at forstærke DNA i deres oprindelige ekstraktion. For at reducere hæmning og forbedre forstærkningseffektiviteten kan andre plantedele med lavere polysaccharid og polyfenolindhold også anvendes til identifikationsformål med adgang til hele anlægget. Hvis der er begrænset adgang til forskellige plantedele, yngre blade eller kronblade dissekeret fra blomsterhoveder, som typisk har lavere phenolindhold39, kan tilbyde en bedre chance for succes. Da DNA-sekvenser er konsistente på tværs af hele planten, kan enhver plantedel bruges til at bekræfte arternes identitet. Hvis PCR-forstærkningen stadig er suboptimale, kan det oprindelige DNA-ekstrakt fortyndes yderligere, før PCR eller mere avancerede laboratorierensningsprotokoller kan anvendes.
En anden udfordring for PCR-analyse er falske positive resultater forårsaget af DNA-kontaminering, som kan have en negativ indvirkning på datafortolkningen. Det er normalt kontrolleres af aktiv husholdning, ved hjælp af dedikeret udstyr, og begrænse arbejdet til udpegede områder. Ved hjælp af qPCR kan al PCR-analyse udføres i et lukket system, hvilket i høj grad reducerer risikoen for PCR-ampliconforurening i et miljø, der ikke er godt kontrolleret. Udover, miljømæssige DNA bør heller ikke vise en falsk positiv på grund af specificiteten af analysen, ifølge en tidligere valideringsundersøgelse40.
Der er plads til forbedringer. I protokollen præsenteres her, intercalating farvestof blev brugt til at vise mål fragment forstærkning i realtid. Metodens specificitet bekræftes yderligere af den karakteristiske smeltetemperatur, som er forskellig mellem M. chamomilla og C. nobile amplicons. Derfor kan intercalating farvestof-baserede PCR effektivt besvare spørgsmålet "Hvad er denne planteart?" i marken. Ud over behovet for at udføre botanisk identifikation på en enkelt plante, der er isoleret fra marken, vil botaniske pulvere eller ekstrakter på lageret dog også drage fordel af en hurtig identitetsvurdering på stedet. For disse typer af materialer, kan yderligere spørgsmål skal løses, såsom "Hvad er der i dette materiale?", "Indeholder det den botaniske art, jeg leder efter?", "Indeholder det ægteskabsbrydere jeg ønsker at undgå?", Og "Er det erstattet helt eller delvist af andre botaniske arter, der er skadelige?". I stedet for at bruge intercalating farvestof, forskellige qPCR sonder kan designes til at målrette ampliconer fra forskellige planteekstrakter i en reaktion system, samtidig med at høj specificitet og effektivitet af analysen. Udvikling af sonde-baserede qPCR og udnyttelse af en bærbar qPCR-system, der tilbyder flere kanal detektion kan yderligere udvide anvendelsen af felttest som en egnet-til-formål assay til et bredere miljø indstilling, såsom botaniske materiale lagre og distributionscentre til at besvare mere komplicerede spørgsmål. Desuden, ved hjælp af flere sonder giver også brugeren mulighed for at medtage intern forstærkning i hvert reaktionssystem, således at flere oplysninger vil være tilgængelige, når PCR hæmning er mistanke.
Den protokol, der præsenteres her, har følgende fordele i forhold til eksisterende teknologier, der anvendes til samme formål. For det første skal proceduren og dens resultater for traditionelle morfologiske og kemiske identifikationsmetoder gennemføres og fortolkes af eksperter. qPCR-baserede identifikationstest kan udføres af personer med grundlæggende molekylærbiologisk uddannelse og fortolkes på en mere standardiseret måde. For det andet kræver feltidentifikationsprotokollen ved hjælp af et bærbart instrument ved hjælp af et bærbart instrument ikke instrumenter med et stort fodaftryk, såsom en højhastighedscentrifuge, DNA-kvalitetsevalueringsudstyr, termisk cykelløber med fluorescensdetektor og en computer, der kører en speciel software. Dna-baseret artsidentifikation kan således udføres i enhver indstilling uden forsinkelse. For det tredje, søger efter botaniske materialer er en opgave, der kræver en global operation. Med fremskridt inden for cloud-tjenester og kunstig intelligens, en bærbar enhed kan potentielt modtage metoder udviklet og valideret af eksperter i laboratoriet, betjenes af ikke-eksperter i fjerntliggende områder, og producere objektive certificeringer fra tredjeparter. Derfor er denne mulighed er mere overbevisende end nogensinde med fjernarbejde bliver tendensen.
Kort sagt, protokollen her viste felt identifikation af M. chamomilla ved hjælp af en bærbar qPCR system. En vellykket anvendelse af denne teknik vil generere meget præcise resultater på botanisk identifikation og hjælpe botaniske producenter og leverandører kvalificere botaniske materialer i en rettidig og omkostningseffektiv måde.

Praksis med at bruge planteekstrakter til at opretholde og forbedre sundheden går tilbage til tusinder af år. På grund af stress på forsyningskæden som følge af denøgede forbrugerefterspørgsel 1, ikke-bæredygtige høstmetoderog klimaændringer 2bliver den botaniske fordæmning et voksende problem i fødevare - og kosttilskudsindustrien3. Tilstedeværelsen af sort eller fejlidentificeret botaniske arter kan føre til nedsat effekt, eller endda sikkerhedsspørgsmål. For eksempel, sort cohosh (Actaea racemosa), anvendes til behandling af præmenstruel ubehag, kan erstattes med en billig asiatiske arter med begrænset klinisk data støtte til dens effektivitet4. I et mere alvorligt tilfælde, substitution af Aristolochia fangchi for Stephania terandra i en klinisk undersøgelse for vægttab ved hjælp af kinesiske urter førte til svær nefrotoksicitet og nyresvigt i nogle deltagere5,6. De to forskellige arter delte et kinesisk fællesnavn "Fang Ji". Disse tilfælde understreger behovet for en strengere kvalitetskontrol, begyndende med identifikation afråmaterialer 7, helst så tæt på forsyningskædens oprindelsessted som muligt, så ressourcerne kan fordeles effektivt på det materiale, der er korrekt identitet.
En række ortogonale tilgange kan bruges til botanisk identifikation. Traditionelt udføres botanisk identifikation vedmorfologisk vurdering 8,9 og kemiskeanalysemetoder 10,11,12,13. Morfologisk identifikation er baseret på forskelle i plantematerialers makroskopiske og mikroskopiske egenskaber, hvis der er forskelle (figur 1). Men manglen på uddannelsesprogrammer om klassisk botanik i de seneste år har resulteret i en mangel på eksperter14, hvilket gør denne tilgang upraktisk for rutinemæssig kvalitetskontrol. Dens anvendelse i pulverform botaniske materialer er også begrænset. Kemiske analysemetoder anvendes i vid udstrækning i farmcopoeias og laboratorier, men er ikke ideelle til felttest på grund af størrelsen af instrumenter som High Performance Thin Layer Chromatography (HPTLC), High Performance Liquid Chromatography (HPLC) og Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (NMR) (Figur 2) og miljøkrav. For nylig er genomiske metoder fremkommet som en alternativ teknik til godkendelse og substitutionsdetektion af botaniske arter og har vist sig at være effektiv og præcis. Genomiske metoder udnytter den høje nøjagtighed og specificitet af genetisk information i plantematerialer15,16,17,18,19. Molekylære diagnostiske værktøjer er tilgængelige i form af bærbare enheder, og omfatter ofte automatiserede data fortolkningsværktøjer, der sænker barrieren for brug af teknologi, hvilket gør denne fremgangsmåde ideel til feltidentifikation20,21,,22,23,24. Når den molekylære analysemetode er designet ogvalideret 25,26,27, det kan udføres af ethvert personale med grundlæggende molekylær biologi uddannelse. Blandt de forskellige bærbare værktøjer til rådighed, real-time PCR på DNA-sekvenser er en af de omkostningseffektive valg28. Kombinationen af en bærbar anordning, sammen med tilpassede og validerede molekylære analyse, giver mulighed for verifikation af botaniske arter og ingredienser uden for laboratoriet, såsom i gårde og botaniske materiale lagre, hvilket reducerer tid og omkostninger forbundet med traditionelle metoder.
Målet med denne protokol er at indføre en metode til botanisk identifikation i situationer, hvor adgangen til laboratorieudstyr og ekspertise er begrænset eller utilgængelig ved hjælp af et bærbart qPCR-system. Metoden er demonstreret på et felt af Matricaria chamomilla (Figur 3A), almindeligvis kendt som tysk kamille, almindeligt anvendt for sin anti-inflammatoriske og antioxidant egenskaber29. Det kan forveksles med beslægtede arter af lignende udseende eller lugt, især fra slægterne Chamaemelum, Tanacetum, og Krysantemum30,31,32. Blandt de beslægtede arter er Chamaemelum nobile, også kendt som romersk kamille , en mærkbar en med sammenlignelige produktionsniveauer i handel (figur 3B). Den viste metode var designet til ikke kun at identificere målet botaniske arter M. chamomilla, men også opdage sin nære slægtning, C. nobile, baseret på specifik forstærkning af DNA-sekvenser.
Denne artikel forklarer i detaljer, hvordan man udfører felt botanisk identifikation af M. chamomilla ved hjælp af intercalating farvestof-baserede qPCR og smelte kurve analyse på en bærbar enhed. Protokollen omfatter indsamling af botaniske prøver fra marken, dna-ekstraktion på stedet og opsætning af PCR-reaktion i realtid. For at sikre en gyldig konklusion anvendes målaneringsanering m. chamomilla og ikke-mål botanisk C. nobile genomisk DNA, forudvundet af certificerede botaniske referencematerialer, som positiv kontrol. Specificiteten af denne metode påvises ved at udføre både M. chamomilla og C. nobile identifikationstest individuelt på prøver og kontroller. Negativ kontrolelement, der ikke er skabelon, bruges til at udelukke falske positive resultater forårsaget af PCR-kontaminering.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Battery</td>
			<td>TNE</td>
			<td>78000mAh</td>
			<td>Provide field power supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bCUBE</td>
			<td>HYRIS</td>
			<td>bCUBE 2.0</td>
			<td>Portable qPCR instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cartridges(16 Well)</td>
			<td>HYRIS</td>
			<td>NA</td>
			<td>Consumables for bCUBE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electric pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>NA</td>
			<td>Handling liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extract-N-AmpTM plant PCR kit</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>XNAP2-1KT</td>
			<td>Plant DNA extraction kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>German chamomile (Matricaria chamomilla L) flower botanical reference materials</td>
			<td>AHP</td>
			<td>2264</td>
			<td>Used as positive control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini dry bath</td>
			<td>Yooning</td>
			<td>MiniH-100L</td>
			<td>For DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>AMBION</td>
			<td>AM9937</td>
			<td>qPCR reaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NA</td>
			<td>qPCR reaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roman chamomile (Chamaemelum nobile) flower botancial reference materials</td>
			<td>ChromaDex</td>
			<td>ASB-00030806-005</td>
			<td>Used as positive control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luna universal qPCR master mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M3003L</td>
			<td>qPCR reaction</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

field identification of matricaria chamomilla using a portable qpcr system

Kvalitetskontrol i botaniske produkter begynder med råvareforsyningen. Traditionelt udføres botanisk identifikation ved hjælp af morfologisk vurdering og kemiske analysemetoder. Den manglende adgang til botanikere, især i de senere år, kombineret med behovet for at forbedre kvalitetskontrol for at bekæmpe de belastninger af forsyningskæden, som den stigende forbrugerefterspørgsel og klimaændringer har medført, kræver imidlertid alternative tilgange. Målet med denne protokol er at lette identifikation af botaniske arter ved hjælp af et bærbart qPCR-system på marken eller i enhver indstilling, hvor adgangen til laboratorieudstyr og ekspertise er begrænset. Target DNA forstærkes ved hjælp af farvestofbaseret qPCR, hvor DNA udvundet af botaniske referencematerialer fungerer som en positiv kontrol. Mål-DNA'et identificeres ved dens specifikke forstærkning og matcher dets smeltende top mod den positive kontrol. En detaljeret beskrivelse af de trin og parametre, fra hands-on felt prøve indsamling, til DNA-ekstraktion, PCR forstærkning, efterfulgt af data fortolkning, er blevet inkluderet for at sikre, at læserne kan kopiere denne protokol. De resultater, der produceres tilpasse sig traditionelle laboratorium botaniskidentifikation metoder. Protokollen er nem at udføre og omkostningseffektiv, hvilket muliggør kvalitetstest på råvarer så tæt på forsyningskædens oprindelsessted som muligt.

Efter den protokol, der er beskrevet i afsnit 1, blev botanisk DNA fra blomsterhoved og blad ekstraheret ind i supernatanten efter varmeinkubation af opsamlingsrøret ved 95 °C i 10 min. I den nuværende undersøgelse viste supernatanten en gul og grønlig farve til både blomst og blad, hvilket indikerer, at en række naturlige forbindelser blev frigivet til supernatanten med botanisk DNA (Figur 6). Selv om pålidelig PCR-forstærkning blev opnået senere i tre eksemplarer for al udvundet DNA-skabelon i marken, blev DNA-kvalitetsvurdering udført i laboratoriet som reference. Koncentrationen af blomsterhoved DNA ekstrakt, bestemt ved fluorometri, varierede fra 3.69-5.36 ng/μL, mens koncentrationen af blad DNA ekstrakt varierede fra 6.42-9.29 ng/μL. A260/A280 og A260/A230 absorbansforholdet for blomster- og blad-DNA-ekstrakter blev målt ved spektrofotometri. På grund af overlapningen mellem DNA og fytokemisk UV-absorptionsspektrum kunne disse nøgletal imidlertid ikke måles pålidelighed (data ikke vist).
Intercalating fluorescerende farvestof blev brugt til at overvåge forstærkningen af målfragmenter i realtid. Da både de specifikke primere M. chamomilla og C. nobile er rettet mod den interne transskriberede spacer 2 (ITS2) region, som har snesevis til hundredvis af kopier i plantens genom, 25 PCR forstærkning cykler er tilstrækkelige til at generere nok amplicons til identifikation af kamille arter. I figur 7var ct-værdien for M. chamomilla positiv kontrol i M. chamomilla identifikationstest mindre end 25 (GCP_GCT), mens fluorescensen af den samme kontrol i C. nobile-identifikationstest efter 25 forstærkningscyklusser lå under detektionstærsklen (GCP_RCT). På den anden side lå fluorescensen for C. nobile positiv kontrol i M. chamomilla identifikationstest under detektionstærsklen (RCP_GCT), mens Ct-værdien for samme kontrol i C. nobile-identifikationstest var mindre end 25 (RCP_RCT). Forstærkningen af mål- og ikke-måls positiv kontrol i deres respektive analyser viser specificiteten af M. chamomilla identifikationsanalyse. For prøve-DNA gav feltblomsthoved og blad-DNA-ekstrakt Ct-værdier på henholdsvis 15,18 og 19,41 i M. chamomilla-identifikationstest (henholdsvis Prøve1(FLOWER) _GCT og Sample2(LEAF)_GCT). Begge disse prøver blev ikke forstærket i C. nobile identification test (Sample1(FLOWER)_RCT og Sample2(LEAF)_RCT). Forstærkningsmønstrene for begge prøverne matchede forstærkningsmønsteret af M. chamomilla positiv kontrol. Negative kontroller blev ikke forstærket i både M. chamomilla og C. nobile identifikationstest (NC_GCT og NC_RCT), bortset fra muligheden for falske positiver forårsaget af PCR-kontaminering. For yderligere at bekræfte specifik forstærkning i positive kontroller og prøver blev fraktioner af PCR-slutproduktet fra hver brønd kørt på 2 % agarosegel i laboratoriet (figur 8). For M. chamomilla identifikation test, begge feltprøver gav ampliconer kører på samme position som M. chamomilla positiv kontrol med en anslået størrelse lidt over 100 bp (teoretisk størrelse 102 bp). For C. nobile identifikationstest gav ikke-målart C. nobile positiv kontrol et bånd mellem 50 og 100 bp, der passede til den teoretiske størrelse på 65 bp. Resten af banerne viste ingen specifik forstærkning produkt, som var i overensstemmelse med manglen på fluorescerende signal for disse brønde, som observeret i marken test.
Efter PCR-forstærkning blev der udført en smeltekurveanalyse for at vurdere dissociationsegenskaberne for dobbeltstrenget DNA (dsDNA) under opvarmning. Som temperaturen ramped op i løbet af den sidste cyklus for smeltekurve analyse, stigninger i temperaturen forårsaget dobbelt-strand ampliconer til at adskille. Det intercalerende fluorescerende farvestof blev gradvist frigivet til opløsningen, faldende fluorescensintensitet (figur 9A). Bøjningspunktet for den første derivatkurve blev anvendt til at bestemme smeltetemperaturen (Tm) (Figur 9B), som hovedsagelig afhænger af DNA-fragmenternes længde og GC-indhold. Kombinere Ct værdi med smeltetemperatur kan øge specificiteten af qPCR analyse. I den nuværende undersøgelse forekom smeltetemperaturtoppen af M. chamomilla positiv kontrol PCR amplicon ved 85,6 °C (GCP_GCT), og den adskilte sig fra smeltetemperaturtoppen af C. nobile positiv kontrol PCR amplicon ved 79,1 °C (RCP_RCT). PCR-ampliconen fra feltblomsthoved og -blad frembragte smeltetemperaturtoppe ved henholdsvis 85,2 °C og 84,8 °C (henholdsvis prøve1(FLOWER) _GCT og Sample2(LEAF)_GCT). For at vurdere smeltetemperaturvariationer målt ved hjælp af det bærbare qPCR-system blev der indsamlet yderligere datapunkter for at bekræfte, at prøvesmeltningstemperaturerne altid var tæt på smeltetemperaturen opnået ved M. chamomilla positiv kontrol (inden for 2 °C) og var langt fra smeltetemperaturen i C. nobile positiv kontrolkoncylon (Figur 10). Smeltende temperatur toppe blev undertiden rapporteret i andre brønde. Deres Ct-værdier var imidlertid ikke mindre end 25, og smeltende temperaturtoppe var ikke tæt på M. chamomilla eller C. nobile positiv kontrol (mere end 2 °C fra hinanden).
Kort sagt kan felt M. chamomilla identifikationstest fortolkes på grundlag af beslutningsregler, der er opsummeret i tabel 5. Med alle de positive kontroller test positiv for den formodede botaniske arter, negativ for de andre arter, og negativ kontrol test negativ, begge feltprøver blev bestemt til at indeholde M. chamomilla men ikke C. nobile. For at tilpasse resultaterne af felttesten til andre analyseteknikker blev feltkonklus konklusioner desuden yderligere bekræftet ved en tidligere valideret DNA-stregkodemetode25 (data ikke vist).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60940/60940fig01.jpg"> Figur 1: Morfologisk identifikation af botaniske materialer. (A) Hibiscus rosa-sinensis blomster, Curcuma longa rødder, Malva Sylvestris blade, Rosmarinus officinalis blade, Coriandrum sativum frø, Zingiber officinale rødder. (B) Petroselinum crispum og Apium graveolens flager er vanskelige at skelne. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60940/60940fig01large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60940/60940fig02.jpg"> Figur 2: Kemisk identifikation af botaniske materialer. aA) HPTLC-instrument og et repræsentativt HPTLC-kromatogram. bB) HPLC-instrument og et repræsentativt HPLC-kromatogram. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60940/60940fig02large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60940/60940fig03.jpg"> Figur 3: Matricaria chamomilla og Chamaemelum nobile i marken. (A) Matricaria chamomilla, tilpasset fra Wikipedia under CC BY-SA 3,0, https://en.wikipedia.org/wiki/Matricaria_chamomilla#/media/File:Matricaria_February_2008-1.jpg. (B) Chamaemelum nobile, tilpasset fra Wikipedia under CC BY-SA 3,0, https://en.wikipedia.org/wiki/Chamomile#/media/File:Chamaemelum_nobile_001.JPG. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60940/60940fig03large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60940/60940fig04.jpg"> Figur 4: Indsamling M. chamomilla plante dele fra marken. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60940/60940fig04large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60940/60940fig05.jpg"> Figur 5: Udformning af teststing i demonstrationen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60940/60940fig05large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60940/60940fig06.jpg"> Figur 6: Felt-DNA-ekstrakt i opsamlingsrør. Botanisk væv forbliver i det oprindelige rør og er dækket af gullig DNA ekstrakt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60940/60940fig06large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60940/60940fig07.jpg"> Figur 7: Fluorescensplot, der viser akkumulering af PCR-produkter over 25 cyklusser af termocykling. M. chamomilla positiv kontrol og C. nobile positiv kontrol viser Ct værdier mindre end 25 i M. chamomilla og C. nobile identifikation test, henholdsvis. Feltblomst- og bladprøverne blev forstærket af M. chamomilla identifikationstest med Ct-værdier på 15,18 og 19,41. Resten af brøndene blev ikke forstærket. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60940/60940fig07large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60940/60940fig08.jpg"> Figur 8: Gelelektrophoresis af felt-PCR-forstærkningsprodukter. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60940/60940fig08large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60940/60940fig09.jpg"> Figur 9: Analyse af smeltetemperatur. (A) Fluorescenssignalet i hvert brønd falder med den stigende temperatur. bB) PCR-produkternes identitet blev bekræftet af smeltetemperaturtoppen i smeltningskurveanalysen. Feltblomst- og bladprøverne viser toppe ved 85,2 °C og 84,8 °C. Disse er tæt på toppen produceret af M. chamomilla positiv kontrol. C. nobile positiv kontrol produceret et højdepunkt ved 79,1 °C, hvilket er forskelligt fra de tre andre prøver. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60940/60940fig09large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60940/60940fig10.jpg"> Figur 10: Spidsbelastningsvariationen ved smeltetemperaturen mellem positiv kontrol og feltprøver. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60940/60940fig10large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Fase</td>
			<td>Cyklus</td>
			<td>Temperatur</td>
			<td>Tidspunkt</td>
		</tr>
<tr>
<td>Konstant temperatur</td>
			<td>1</td>
			<td>95 °C</td>
			<td>60 ' erne</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">Forstærkning</td>
			<td rowspan="2">25</td>
			<td>95 °C</td>
			<td>30s</td>
		</tr>
<tr>
<td>60 °C</td>
			<td>30s</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">Smeltekurve</td>
			<td rowspan="2">1</td>
			<td>60 °C</td>
			<td rowspan="2">Rampe 0,05 °C/s</td>
		</tr>
<tr>
<td>95 °C</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1: qPCR-termocyklingsbetingelser for M. chamomilla- og C. nobile-identifikationstest.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Undersøgelse</td>
			<td>Navn på Primer</td>
			<td colspan="2">Sekvens 5'-3'</td>
			<td>Position</td>
			<td>Region</td>
			<td>Amplicon-størrelse</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">Matricaria recutita</td>
			<td>ZL3</td>
			<td colspan="2">TCGTCGGTCGCAAGGATAAG</td>
			<td>Frem</td>
			<td rowspan="2">KR.</td>
			<td rowspan="2">102 bp</td>
		</tr>
<tr>
<td>ZL4</td>
			<td colspan="2">TAAACTCAGCGGGTAGTCCC</td>
			<td>Omvendt</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">Chamaemelum adel</td>
			<td>ZL11</td>
			<td colspan="2">TGTCCCGTTGCTAGGAAGCA</td>
			<td>Frem</td>
			<td rowspan="2">KR.</td>
			<td rowspan="2">65 bp</td>
		</tr>
<tr>
<td>ZL12</td>
			<td colspan="2">TCGAAGCGTCATCCTAAGACAAC</td>
			<td>Omvendt</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 2: Primerpar til M. chamomilla og C. nobile identifikationstest.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Nå position</td>
			<td>Godt navn</td>
			<td colspan="2">Beskrivelse</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>GC_PosCtrl_GC_Test</td>
			<td colspan="2">Tysk kamille positiv kontrol under GC Test</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>GC_PosCtrl_RC_Test</td>
			<td colspan="2">Tysk kamille positiv kontrol under RC Test</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>RC_PosCtrl_GC_Test</td>
			<td colspan="2">Romersk kamille positiv kontrol under GC Test</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>RC_PosCtrl_RC_Test</td>
			<td colspan="2">Romersk kamille positiv kontrol under RC Test</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td>Field_Sample_GC_Test</td>
			<td colspan="2">Prøve af bladvæv under GC-test</td>
		</tr>
<tr>
<td>6</td>
			<td>Field_Sample_RC_Test</td>
			<td colspan="2">Prøve af bladvæv under RC Test</td>
		</tr>
<tr>
<td>7</td>
			<td>Field_Sample_GC_Test</td>
			<td colspan="2">Prøve af blomstervæv under GC-test</td>
		</tr>
<tr>
<td>8</td>
			<td>Field_Sample_RC_Test</td>
			<td colspan="2">Prøve af blomstervæv under RC Test</td>
		</tr>
<tr>
<td>9</td>
			<td>NegCtrl_GC_Test</td>
			<td colspan="2">Prøve til negativ kontrol under GC-test</td>
		</tr>
<tr>
<td>10</td>
			<td>NegCtrl_RC_Test</td>
			<td colspan="2">Prøve til negativ kontrol under RC-test</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 3: Brøndtyper og beskrivelser af M. chamomilla og C. nobile identifikationstest.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Reagens</td>
			<td>GC_Test</td>
			<td>RC_Test</td>
		</tr>
<tr>
<td>Universel qPCR-blanding*</td>
			<td>10 μL</td>
			<td>10 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>ZL3 primer (10 μM)</td>
			<td>0,4 μL</td>
			<td>Na</td>
		</tr>
<tr>
<td>ZL4 primer (10 μM)</td>
			<td>0,4 μL</td>
			<td>Na</td>
		</tr>
<tr>
<td>ZL11 primer (10 μM)</td>
			<td>Na</td>
			<td>0,4 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>ZL12 primer (10 μM)</td>
			<td>Na</td>
			<td>0,4 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>H2O (Nuclease-fri)</td>
			<td>7,2 μL</td>
			<td>7,2 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">* indeholder Hot Start Taq DNA Polymerase</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 4: Master-mix sammensætning for M. chamomilla og C. nobile identifikationstest.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td rowspan="2">Godt navn</td>
			<td rowspan="2">Forventet resultat</td>
			<td>Kriterier for positivt resultat</td>
			<td>Kriterier for negativt resultat</td>
		</tr>
<tr>
<td>Registreret /til stede</td>
			<td>Ikke registreret / fraværende</td>
		</tr>
<tr>
<td>GC_PosCtrl_GC_Test</td>
			<td>Opdaget</td>
			<td>Ct < 25 og 84 <= Tm <= 86</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>GC_PosCtrl_RC_Test</td>
			<td>Blev ikke fundet</td>
			<td>-</td>
			<td>Ingen Ct-værdi inden for 25 cyklusser</td>
		</tr>
<tr>
<td>RC_PosCtrl_GC_Test</td>
			<td>Blev ikke fundet</td>
			<td>-</td>
			<td>Ingen Ct-værdi inden for 25 cyklusser</td>
		</tr>
<tr>
<td>RC_PosCtrl_RC_Test</td>
			<td>Opdaget</td>
			<td>Ct < 25 og 79 <= Tm <= 81</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>Field_Sample_Leaf_GC_Test</td>
			<td>Stede</td>
			<td>Ct < 25 og 84 <= Tm <= 86</td>
			<td>Ingen Ct-værdi inden for 25 cyklusser</td>
		</tr>
<tr>
<td>Field_Sample_Leaf_RC_Test</td>
			<td>Fraværende</td>
			<td>-</td>
			<td>Ingen Ct-værdi inden for 25 cyklusser</td>
		</tr>
<tr>
<td>Field_Sample_Flower_GC_Test</td>
			<td>Stede</td>
			<td>Ct < 25 og 84 <= Tm <= 86</td>
			<td>Ingen Ct-værdi inden for 25 cyklusser</td>
		</tr>
<tr>
<td>Field_Sample_Flower_RC_Test</td>
			<td>Fraværende</td>
			<td>-</td>
			<td>Ingen Ct-værdi inden for 25 cyklusser</td>
		</tr>
<tr>
<td>NegCtrl_GC_Test</td>
			<td>Blev ikke fundet</td>
			<td>-</td>
			<td>Ingen Ct-værdi inden for 25 cyklusser</td>
		</tr>
<tr>
<td>NegCtrl_RC_Test</td>
			<td>Blev ikke fundet</td>
			<td>-</td>
			<td>Ingen Ct-værdi inden for 25 cyklusser</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 5: Regler for fortolkning af qPCR-resultat.

Watch this Scientific Journal Video about Field Identification of Matricaria chamomilla using a Portable qPCR System at JoVE.com

Field Identification of Matricaria chamomilla using a Portable qPCR System

Præsenteret her er en protokol for felt identifikation af Matricaria chamomilla ved hjælp af en bærbar qPCR system. Denne protokol, der er nem at udføre, er ideel som en metode til at bekræfte identiteten af en botanisk art på steder, hvor adgangen til laboratorieudstyr og ekspertise er begrænset, såsom gårde og lagre.

Feltidentifikation af Matricaria chamomilla ved hjælp af et bærbart qPCR-system

Quality control in botanical products begins with the raw material supply. Traditionally, botanical identification is performed through morphological ...

Praksis med at bruge planteekstrakter til at forbedre sundheden går tilbage tusinder af år. For nylig har den øgede efterspørgsel kombineret med ikke-bæredygtige høstmetoder og klimaændringer lagt pres på forsyningskæden. På grund af dette, botanisk for adulteration bliver en voksende bekymring, hvilket gør botanisk identifikation en stadig vigtigere del af kvalitetskontrol.Ideelt set udføres identifikation så tæt på kilden som muligt, så ressourcer effektivt kan allokeres til materialet af korrekt identitet. Der er en række tilgange til botanisk identifikation. Traditionelt udføres botanisk identifikation ved hjælp af morfologisk vurdering og kemiske analysemetoder.Morfologisk identifikation er baseret på forskelle i makroskopiske og mikroskopiske egenskaber ved plantematerialer. Men det kræver en veluddannet botaniker og dens anvendelse på pulveriserede botaniske materialer er begrænset. Kemiske analysemetoder anvendes i vid udstrækning i farmakoper og laboratorier, men er ikke ideelle til felttest på grund af instrumenternes størrelse og miljøkrav.For nylig er genomiske metoder fremkommet som en alternativ teknik til identifikation af botaniske arter på grund af den høje pålidelighed og specificitet af genomisk information i plantematerialer. Med molekylære diagnostiske værktøjer nu tilgængelig i en form for bærbare enheder, denne fremgangsmåde bliver muligt for feltapplikation. Målet med denne protokol er at indføre en metode til botanisk identifikation i situationer, hvor adgangen til laboratorieudstyr og ekspertise er begrænset, såsom den bedrift, der leverer det botaniske materiale, ved hjælp af et bærbart qPCR-system.Matricaria chamomilla, almindeligvis kendt som tysk kamille, har været brugt som en urtemedicin til at fremme sundheden i århundreder. For at påvise den nuværende metodes specificitet er differentiering af tysk kamille fra en anden almindeligt anvendt kamilleblomst, kendt som romersk kamille, inkluderet til sammenligning. Feltidentifikationsproceduren demonstreres midt i en tysk kamillefarm.Opret et testområde i marken med en flad og vandret overflade. Identificer en repræsentativ plante, der afspejler de fleste planters karakteristika i kamilleblomstfeltet. Vælg et blomsterhoved fra den repræsentative plante ved hjælp af sterile handsker.Prøven anbringes i et 2,0 milliliteropsamlingsrør. Gentag og indsamle en folder ca 0,5 til 0,7 centimeter lang fra samme plante. Forvarm det tørre bad inkubator til 95 grader Celsius.Til hvert opsamlingsrør tilsættes 100 mikroliter af ekstraktionsopløsningen fra plantens DNA-ekstraktionssæt. For bedre DNA-ekstraktion effektivitet, male prøven ved hjælp af et væv støder. Luk røret.Sørg for, at det botaniske væv er dækket af ekstraktionsopløsningen under hele ekstraktionsprocessen. Opsamlingsrørene anbringes i en forvarmet tørbadekubator, og opsamlingsrørene inkuberes ved 95 grader Celsius i 10 minutter Efter 10 minutter skal rørene ud af det tørre badskuvøse. Der tilsættes 100 mikroliter af fortyndingsopløsningen fra DNA-ekstraktionssættet, og opløsningen blandes ved at pipettere op og ned flere gange.Gentag det samme trin for indlægsseddelekstraktion. Ryst for at blande opløsningen yderligere. Anlægget spørgsmål normalt ikke synes at være forringet efter denne behandling.Den flydende farve kan ændre sig og blive uklar. Konfigurer qPCR-instrumentets termocyklingsbetingelser i henhold til tabel et, som starter med et konstant temperaturtrin til indledende denaturering efterfulgt af 25 cyklusser af forstærkning og slutter med temperaturramning for at opnå en smeltekurve med høj opløsning. Optø qPCR master mix og primere, der er anført i tabel to ved stuetemperatur før brug.Planlæg den reaktion, der vil blive indlæst i hver brønd. Brønde, der indeholder positive kontroller med målarterne, positiv kontrol med ikke-målarter, prøver og negativ kontrol. I dette eksempel anvendes 10 brønde, fem til den tyske kamilleidentifikationstest og yderligere fem til den romerske kamilleidentifikationstest.For hver type art identifikationstest indeholder en brønd en positiv kontrol med DNA udvundet fra referencematerialet til målarter, en brønd indeholder en positiv kontrol med DNA udvundet fra ikke-målrettet artsreferencemateriale, to brønde fyldes med blomster- og blad-DNA-prøver udvundet fra marken, og en brønd tildeles en negativ kontrol. Tabel tre beskriver hver brøndtype. Der forberedes en reaktionsmasterblanding i henhold til tabel fire for hver identifikationstest for botaniske arter.En typisk reaktion master mix indeholder universelle qPCR master mix, to gange, frem og tilbage arter specifikke primere, og nuklease-fri vand. Bland reaktionsmesteren grundigt ved pipettering før brug. Placer PCR-reaktionspatronen med forsiden på en flad og stabil overflade.Indlæs 18 mikroliter af reaktionsmasterblandingen, der er konfigureret i det foregående trin, ind i patronbæderne i henhold til de brønde, der er defineret her. Til denne demonstration skal du tilføje den tyske kamille identifikation testreaktion master mix i brønde mærket til GC test, GCT i brønde en, tre, fem, syv, ni, og den romerske kamille identifikation testreaktion master mix i brønde mærket for RC test, RCT i brønde to, fire, seks, otte, 10. Overfør to mikroliter af prøve-DNA fra supernatanten i DNA-ekstraktionsrørene og forududsugning af DNA-positive kontroller i patronbæst, der er forudinstalleret med qPCR-mastermix.Når hver DNA-skabelon er tilføjet til qPCR-masterblandingen, blandes opløsningen forsigtigt ved pipettering. Forsegle patronen forsigtigt med klæbefilm. Læg patronen på termocyklingkammeret, og luk den.Indstil qPCR-instrumentet til at køre. I den nuværende protokol anvendes intercalating farvestof til at måle forstærkningen af målfragmenter i realtid. Ct-værdien defineres som det antal cyklusser, der kræves, for at fluorescerende signalet kan krydse den foruddefinerede tærskel.En Ct-værdi på under 25 cyklusser blev betragtet som positiv forstærkning. I dette tal blev den romerske positive kontrol kun forstærket i den romerske kamille identifikation test, men ikke i den tyske kamille identifikation test. Den tyske kamille positiv kontrol og feltprøver blev kun forstærket i den tyske kamille identifikation test, men ikke i den romerske kamille identifikation test.Den negative kontrol blev ikke forstærket i nogen af testene. For yderligere at bekræfte specifik forstærkning i positive kontroller og prøver blev fraktioner af PCR og produkter fra hver brønd kørt på 2% agarosegel i laboratoriet. Alle brønde med en Ct-værdi på mindre end 25 gav ampliconer på deres forventede størrelser, som varierer mellem tysk kamille og romersk kamille.Resten af banerne viste ingen specifik forstærkning produkt, i overensstemmelse med manglen på fluorescerende signal for disse brønde som observeret i marken test. Efter PCR-forstærkning blev der udført en smeltekurveanalyse ved hjælp af den samme software, der blev brugt til at overvåge fluorescerende signalet. Med stigningen i temperaturen, dobbelt-streng amplicons begynder at adskille, hvilket resulterer i et fald i fluorescens intensitet.Fluorescensintensitetsændringerne blev yderligere omdannet til smeltende peak kurver for yderligere differentiering af tysk kamille fra romersk kamille ved deres karakteristiske smeltende toppe. I dette tal er den smeltende top af den tyske kamille positiv kontrol 85,6 grader Celsius, og det adskiller sig fra smeltende toppen af den romerske kamille positiv kontrol. PCR-ampliconerne fra markprøver producerer smeltende toppe tæt på den tyske kamille positiv kontrol.Feltprøvens identitet bestemmes på grundlag af specifik forstærkning og karakteristisk smeltetemperatur, der svarer til kontrollerne. I dette eksempel identificeres både blomster og blade, der er indsamlet i marken, som Matricaria chamomilla, tysk kamille. Romerske kamille testresultater for disse to prøver er negative.Protokollen viser identifikationen af tysk kamille i marken ved hjælp af et bærbart qPCR-system. Lignende metoder kan vi udvikle til at udvide porteføljen af planteekstrakter, der kan testes. Vi håber, at denne video vil give værdifulde undervisningsmaterialer til forskere, selv ikke-eksperter til at udføre botanisk identifikation i marken eller i et miljø med begrænset laboratorieudstyr.DNA-baseret feltidentifikationstest giver ikke kun meget nøjagtige resultater, der matcher laboratorieanalyse, men reducerer også den tid og de omkostninger, der er forbundet med traditionelle metoder, der udføres i et laboratorium.

Research

JoVE Journal

Biology

Field Identification of Matricaria chamomilla using a Portable qPCR System

Long-term Imaging Mammalian Cells using Wide-Field Microscopy

Quantitative Real-Time PCR using the Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and ...

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR (qPCR) Arrays

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR qPCR Arrays

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower ...

Visualization of Caenorhabditis elegans Cuticular Structures Using the Lipophilic Vital Dye DiI

Visualization of Caenorhabditis elegans Cuticular Structures Using the Lipophilic Vital Dye DiI

Visualisering af Caenorhabditis elegans Cuticle strukturer ved hjælp af de lipofile Vital Dye, DII

The cuticle of C. elegans is a highly resistant structure that surrounds the exterior of the animal1-4. The cuticle not only protects the animal from the ...

Identification of Protein Interacting Partners Using Tandem Affinity Purification

Identifikation af Protein Interagerende Partners Brug Tandem Affinitetsrensning

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein ...

Pyrosequencing for Microbial Identification and Characterization

Pyrosequencing for Mikrobiel identifikation og karakterisering

Pyrosequencing is a versatile technique that facilitates microbial genome sequencing that can be used to identify bacterial species, discriminate ...

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

Detection Live<em&gt; Escherichia coli</em&gt; O157: H7 celler ved PMA-qPCR

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. ...

A Strategy for Sensitive, Large Scale Quantitative Metabolomics

En strategi for følsomme, Large Scale Kvantitative Metabolomics

Metabolite profiling has been a valuable asset in the study of metabolism in health and disease. However, current platforms have different limiting ...

qPCR Is a Sensitive and Rapid Method for Detection of Cytomegaloviral DNA in Formalin-fixed, Paraffin-embedded Biopsy Tissue

qPCR er en følsom og hurtig metode til påvisning af Cytomegaloviral DNA i formalin-faste, paraffinindstøbt biopsivæv

It is crucial to identify cytomegalovirus (CMV) infection in the gastrointestinal (GI) tract of immunosuppressed patients, given their greater risk for ...

Identification of Kinase-substrate Pairs Using High Throughput Screening

Identifikation af kinase-substrat Pairs Brug højkapacitetsscreening


We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel ...