Name: field identification of matricaria chamomilla using a portable qpcr system
Uploaded: 2020-10-10T12:30:00
Duration: 12 min 8 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Field Identification of Matricaria chamomilla using a Portable qPCR System at JoVE.com

Ringraziamo James Shan per i suoi sforzi nella registrazione video sul campo. Ringraziamo Jon Byron e Matthew Semerau per il loro lavoro nell'editing video. Ringraziamo Ansen Luo, Harry Du e Frank Deng per il loro sostegno nell'individuazione del campo di prova. Ringraziamo Maria Rubinsky per i suoi preziosi commenti sull'intero manoscritto. Tutte le persone riconosciute sono dipendenti di Herbalife International of America, Inc.

1. Raccolta di campioni
<ol><li>Impostare un'area di prova sul campo con una superficie piana e orizzontale.</li>
	<li>Identificare una pianta rappresentativa che rifletta le caratteristiche della maggior parte delle piante nel campo dei fiori di camomilla (Figura 4).</li>
	<li>Raccogliere una testa di fiore dalla pianta rappresentativa con guanti sterili.</li>
	<li>Collocare il campione in un tubo di raccolta di 2,0 mL.</li>
	<li>Ripetere i passaggi da 1,3 a 1,4 e raccogliere un volantino (circa 0,5–0,7 cm di lunghezza) dallo stesso impianto. NOTA: M. chamomilla fiore e foglia sono abbastanza piccoli per sedersi sul fondo di un tubo di raccolta di 2,0 mL. Per altri prodotti botanici con superficie più ampia, un punzone di carta o forbici (risciacquato nel 70% di etanolo prima dell'uso) può essere utilizzato per isolare campioni di tessuto per il test. Quando è richiesto il campionamento multiplo, sciacquare il punzone di carta o le forbici tra la manipolazione di campioni diversi.</li>
</ol>2. Estrazione del DNA
<ol><li>Preriscaldare l'incubatrice del bagno asciutto a 95 gradi centigradi.</li>
	<li>Per ogni tubo di raccolta, aggiungere 100 L della soluzione di estrazione dal kit di estrazione del DNA vegetale (elencato nella Tabella dei Materiali). Per una migliore efficienza di estrazione del DNA, macinare il campione di tessuto nella soluzione di estrazione utilizzando un pestello di tessuto.</li>
	<li>Chiudi il tubo. Assicurarsi che il tessuto botanico sia coperto con la soluzione di estrazione durante tutto il processo di estrazione.</li>
	<li>Collocare i tubi di raccolta in un'incubatrice a secco preriscaldata e incubare i tubi di raccolta a 95 gradi centigradi per 10 minuti.</li>
	<li>Dopo 10 minuti, togliere i tubi dall'incubatrice del bagno asciutto.</li>
	<li>Aggiungere 100 L della soluzione di diluizione dallo stesso kit di estrazione del DNA e mescolare la soluzione pipettando su e giù più volte.</li>
	<li>Ripetere lo stesso passaggio per l'estrazione del volantino.</li>
	<li>Agitare ulteriormente per mescolare ulteriormente la soluzione. Il tessuto vegetale di solito non sembra essere degradato dopo questo trattamento. Il colore liquido può cambiare e diventare nuvoloso. NOTA: La soluzione diluita può essere conservata a temperatura ambiente durante la notte se non procede immediatamente. Non è necessario rimuovere i detriti cellulari dal tessuto vegetale prima dello stoccaggio. Il liquido nei tubi contiene i modelli di DNA per l'amplificazione PCR a valle.</li>
</ol>3. Configurazione della reazione PCR
<ol><li>Configurare le condizioni di termociclismo dello strumento qPCR in base alle specifiche del produttore. Applicare il profilo termociclico PCR elencato nella Tabella1, che inizia con un passaggio di temperatura costante per la denaturazione iniziale, seguito da 25 cicli di amplificazione, e termina con la rampa di temperatura per ottenere una curva di fusione ad alta risoluzione.</li>
	<li>Scongelare il qPCR Master Mix e i primer (Tabella 2) a temperatura ambiente prima dell'uso.</li>
	<li>Pianificare la reazione che verrà caricata in ogni pozzo: pozzi contenenti controllo positivo con specie bersaglio, controllo positivo con specie non bersaglio, campioni e controllo negativo (Figura 5).<ol>
<li>In questo esempio vengono utilizzati dieci pozzi: cinque per il test di identificazione della camomilla tedesca e i restanti cinque per il test di identificazione della camomilla romana. Per ogni tipo di test di identificazione delle specie, un pozzo contiene un controllo positivo con il DNA estratto dal materiale di riferimento delle specie bersaglio, uno contiene un controllo positivo con il DNA estratto dal materiale di riferimento delle specie non mirate, due pozzi sono riempiti con campioni di DNA di fiori e foglie estratti dal campo e uno è assegnato per un controllo negativo. La tabella 3 descrive ogni tipo di pozzo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparare un master-mix di reazione secondo il manuale per ogni test di identificazione delle specie botaniche. Un tipico master-mix di reazione contiene qPCR Master Mix universale (2x), primer specifici delle specie in avanti e inversa e acqua senza nuclease. La tabella 4 elenca la composizione del sistema di reazione. NOTA: Se non si utilizza immediatamente, conservare il master-mix di reazione qPCR a 2 gradi centigradi in un dispositivo di raffreddamento o mini-frigo.</li>
	<li>Mescolare accuratamente il master-mix di reazione pipettando prima dell'uso.</li>
	<li>Posizionare la cartuccia qPCR a faccia in su su su una superficie piana e stabile.</li>
	<li>Caricare 18 L del mix principale di reazione configurato nel passaggio 3.4 nei pozzetti della cartuccia in base ai pozzetti definiti al punto 3.3. Per questa dimostrazione, aggiungere il mix master di reazione di reazione test di identificazione della camomilla tedesca in pozzi etichettati per il test GC (GCT nei pozzi 1, 3, 5, 7, 9) e il test di identificazione della camomilla romana reazione master-mix in pozzi etichettati per il test RC (RCT nei pozzi 2, 4, 6, 8, 10) (vedere Figura 5).</li>
	<li>Trasferire 2 L del DNA campione dal supernante dei tubi di estrazione del DNA e dai controlli positivi del DNA pre-estratti in pozzi di cartuccia precaricati con mix master qPCR. Dopo aver aggiunto ogni modello di DNA al mix master qPCR, mescolare delicatamente la soluzione pipettando. NOTA: Evitare di galleggiare detriti cellulari durante il trasferimento del DNA dal tubo di estrazione del DNA. Utilizzare minicentrifuge per separare i detriti supernatant e cellulari, se necessario.</li>
	<li>Sigillare con cura la cartuccia con pellicola adesivo. Caricare la cartuccia sulla camera termociclica e chiuderla.</li>
	<li>Impostare lo strumento qPCR per l'esecuzione.</li>
</ol>

<ol>
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Noi certifichiamo che gli shengxiu Yang, i dipendenti di Herbalife International of America, Inc. Certifichiamo che Francesco Buongiorno, Isabella Della Noce e Lorenzo Colombo sono dipendenti di Hyris Ltd. che produce lo strumento portatile qPCR utilizzato in questo articolo.

La progettazione dei primer e la selezione dei modelli sono i passaggi cruciali per ottenere un'amplificazione qPCR efficiente e specifica. Dopo aver identificato un modello adatto, il software di progettazione primer viene in genere utilizzato per facilitare la selezione dei primer in base a variabili di progettazione quali la lunghezza del primer, la temperatura di fusione e il contenuto GC33,34. L'ottimizzazione e la convalida possono essere eseguite nelle condizioni sperimentali previste del saggio per garantire specificità, sensibilità e robustezza di una reazione PCR35. La progettazione di primer non ottimale può provocare la formazione di primer-dimer, in cui le interazioni primer producono prodotti non specifici36.
I controlli no template (NTC) utilizzati in questo studio controllano sia la contaminazione del DNA che la presenza di primer-dimer che potrebbero influenzare il saggio. I risultati non hanno mostrato amplificazione, una buona indicazione che sia la contaminazione del DNA che i primer-dimer non sono una preoccupazione. La contaminazione del DNA e i primi-dimer si manifestano in curve di fusione senza controlli di modello e come picchi extra nelle curve di fusione dei controlli positivi. In genere, la curva di fusione di un controllo positivo dovrebbe contenere un singolo picco, a meno che i sottodomini ricchi di AT nel modello non causino una fusione non uniforme. I doppi picchi potrebbero essere previsti simulando i saggi di fusione utilizzando il software uMELT37. In questo studio, il gold standard di esecuzione del prodotto PCR su gel di agarose è stato utilizzato per confermare la presenza di prodotto PCR di destinazione e l'assenza di contaminazione e primer-dimers.
Una notevole sfida nell'analisi molecolare dei materiali botanici è l'ottenimento di DNA di buona qualità dopo il processo di estrazione del DNA botanico. Materiali botanici sono scambiati e consumati per i composti chimici attivi che sono associati con benefici per la salute. Nel processo di estrazione del DNA, questi composti chimici saranno anche rilasciati nella soluzione di estrazione del DNA, causando potenzialmente l'inibizione della PCR, causando così guasti nell'amplificazione PCR. Sono stati sviluppati vari kit di purificazione del DNA vegetale utilizzando solventi organici e colonne per rimuovere i composti chimici derivati dai prodotti botanici38. Tuttavia, il cofano fume e la centrifuga ad alta velocità necessari per assistere questi kit non sono disponibili sul campo.
Nell'attuale protocollo, il metodo semplificato di estrazione del DNA utilizza un kit commerciale di estrazione del DNA delle piante (vedere Tabella dei materiali per i dettagli). Aveva la capacità di neutralizzare le sostanze inibitorie comuni per risultati riproducibili e ha prodotto risultati coerenti per M. camomillia e C. nobile. Sia M. cammomilla che C. nobile fioriscono teste e foglie hanno prodotto amplificatori PCR con picchi di fusione specifici, indicando che la presenza di inibitori PCR non era una preoccupazione. Per altre piante con livelli più elevati di inibitori PCR, amplificare il DNA nella loro estrazione originale può essere meno efficiente. Per ridurre l'inibizione e migliorare l'efficienza di amplificazione, con accesso all'intera pianta, altre parti dell'impianto con basso contenuto di polisacrica e polifenolo possono essere utilizzate anche per scopi di identificazione. Se c'è un accesso limitato a diverse parti della pianta, foglie più giovani o petali sezionati da teste di fiori, che in genere hanno un contenuto fenolicoinferiore 39, può offrire una migliore possibilità di successo. Poiché le sequenze di DNA sono coerenti nell'intera pianta, qualsiasi parte della pianta può essere utilizzata per confermare l'identità delle specie. Se l'amplificazione PCR è ancora non ottimale, l'estratto di DNA originale può essere ulteriormente diluito prima della PCR, o possono essere utilizzati protocolli di purificazione di laboratorio più sofisticati.
Un'altra sfida per l'analisi PCR sono i risultati falsi positivi causati dalla contaminazione del DNA, che può avere un impatto negativo sull'interpretazione dei dati. Di solito è controllato da pulizie attive, utilizzando attrezzature dedicate e limitando il lavoro alle aree designate. Utilizzando qPCR, tutte le analisi PCR possono essere eseguite in un sistema chiuso, il che riduce notevolmente la possibilità di contaminazione da amplificatori PCR in un ambiente non ben controllato. Inoltre, il DNA ambientale non dovrebbe anche mostrare un falso positivo a causa della specificità del saggio, secondo un precedente studio di convalida40.
C'è spazio per miglioramenti. Nel protocollo qui presentato, il colorante intercalante è stato utilizzato per mostrare l'amplificazione del frammento di bersaglio in tempo reale. La specificità del metodo è ulteriormente confermata dalla caratteristica temperatura di fusione, che si distingue tra gli ampliconi M. camomilla e C. nobile. Pertanto, l'intercalazione pcR basata sulla colorante può rispondere in modo efficiente alla domanda "Cos'è questa specie vegetale?" nel campo. Tuttavia, oltre alla necessità di eseguire l'identificazione botanica su una singola pianta isolata dal campo, in molte circostanze, polveri botaniche o estratti nel magazzino beneficeranno anche di una rapida valutazione dell'identità in loco. Per questi tipi di materiali, potrebbe essere necessario affrontare ulteriori domande, come "Cosa c'è in questo materiale?", "Contiene le specie botaniche che sto cercando?", "Contiene adulteranti che voglio evitare?" e "È sostituito interamente o parzialmente da altre specie botaniche che sono dannose?". Invece di utilizzare coloranti intercalanti, diverse sonde qPCR possono essere progettate per indirizzare ampliconi provenienti da diversi prodotti botanici in un unico sistema di reazione, mantenendo alta specificità ed efficienza del saggio. Lo sviluppo di qPCR basato su probe e l'utilizzo di un sistema qPCR portatile che offre il rilevamento di più canali possono estendere ulteriormente l'applicazione dei test sul campo come analisi adatta allo scopo a un ambiente più ampio, come magazzini di materiali botanici e centri di distribuzione per rispondere a domande più complesse. Inoltre, l'utilizzo di più sonde consente inoltre all'utente di includere l'amplificazione interna in ogni sistema di reazione, in modo che siano disponibili ulteriori informazioni quando si sospetta l'inibizione della PCR.
Il protocollo qui presentato presenta i seguenti vantaggi rispetto alle tecnologie esistenti utilizzate per lo stesso scopo. In primo luogo, per i metodi di identificazione morfologica e chimica tradizionali, la procedura e i suoi risultati devono essere condotti e interpretati da esperti. I test di identificazione basati su qPCR possono essere condotti da persone con formazione di biologia molecolare di base e interpretati in modo più standardizzato. In secondo luogo, rispetto all'identificazione e alla differenziazione delle specie basate su qPCR normalmente eseguite in laboratorio, il protocollo di identificazione sul campo che utilizza uno strumento portatile non richiede strumenti con un ingombro elevato, come una centrifuga ad alta velocità, apparecchiature di valutazione della qualità del DNA, ciclo termico con rilevatore di fluorescenza e un computer che esegue un software speciale. Pertanto, l'identificazione delle specie basate sul DNA può essere eseguita senza indugio in qualsiasi ambiente. In terzo luogo, la ricerca di materiali botanici è un compito che richiede un'operazione globale. Con i progressi nei servizi cloud e nell'intelligenza artificiale, un dispositivo portatile può potenzialmente ricevere metodi sviluppati e convalidati da esperti in laboratorio, essere gestito da non esperti in aree remote e produrre certificazioni oggettive da terze parti. Pertanto, questa opzione è più convincente che mai con il lavoro remoto diventando la tendenza.
In sintesi, il protocollo qui ha dimostrato l'identificazione sul campo di M. camomilla utilizzando un sistema portatile qPCR. Il successo dell'applicazione di questa tecnica genererà risultati altamente accurati sull'identificazione botanica e aiuterà i produttori e i fornitori botanici a qualificare i materiali botanici in modo tempestivo ed economico.

La pratica di utilizzare botanici per mantenere e migliorare la salute risale a migliaia di anni. A causa delle sollecitazioni sulla filiera portate dall'aumento della domanda dei consumatori1, pratiche di raccolta insostenibili e cambiamenticlimatici 2, l'adulterazione botanica sta diventando una preoccupazione crescente nell'industria alimentare e degli integratorialimentari 3. La presenza di specie botaniche non dichiarate o non identificate in modo improprio può portare a una riduzione dell'efficacia o addirittura a problemi di sicurezza. Ad esempio, il cohosh nero (Actaea racemosa), utilizzato per il trattamento del disagio premestruale, può essere sostituito con una specie asiatica a basso prezzo con un supporto limitato di dati clinici per la suaefficacia 4. In un caso più grave, la sostituzione di Aristolochia fangchi per Stephania terandra in uno studio clinico per la perdita di peso utilizzando erbe cinesi ha portato a grave nefrotossicità e insufficienza renale in alcuni partecipanti5,6. Le due diverse specie condividevano un nome comune cinese "Fang Ji". Questi casi evidenziano la necessità di un controllo di qualità più rigoroso, a partire dall'identificazione delle materie prime7, preferibilmente il più vicino possibile al punto di origine della catena di approvvigionamento, in modo che le risorse possano essere allocate in modo efficiente al materiale di corretta identità.
Un certo numero di approcci ortogonali può essere utilizzato per l'identificazione botanica. Tradizionalmente, l'identificazione botanica viene eseguita attraverso la valutazionemorfologica 8,9 e i metodi analitici chimici10,11,12,13. L'identificazione morfologica si basa sulle differenze nelle caratteristiche macroscopiche e microscopiche dei materiali vegetali se esistono differenze (Figura 1). Tuttavia, la mancanza di programmi di formazione sulla botanica classica negli ultimi anni ha provocato una carenza di esperti14, rendendo questo approccio impraticabile per il controllo di qualità di routine. La sua applicazione in materiali botanici in polvere è anche limitata. I metodi analitici chimici sono ampiamente utilizzati in farmacia e laboratori, ma non sono ideali per i test sul campo a causa delle dimensioni di strumenti come la cromatografia a strato sottile ad alte prestazioni (HPTLC), la cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) e la spettroscopia a risonanza magnetica nucleare (NMR)(Figura 2)e i requisiti dell'ambiente. Recentemente, i metodi genomici sono emersi come una tecnica alternativa per l'autenticazione e il rilevamento della sostituzione delle specie botaniche e si sono dimostrati efficienti e precisi. I metodi genomici sfruttano l'alta fedeltà e specificità delle informazioni genetiche nei materialivegetali 15,16,17,18,19. Gli strumenti di diagnostica molecolare sono disponibili sotto forma di dispositivi portatili e spesso includono strumenti automatizzati di interpretazione dei dati che abbassano la barriera all'uso della tecnologia, rendendo questo approccio ideale perl'identificazione sul campo 20,21,22,23,24. Una volta che il metodo di analisi molecolareè stato progettato e convalidato 25,26,27, può essere eseguito da qualsiasi personale con formazione di biologia molecolare di base. Tra i diversi strumenti portatili disponibili, PCR in tempo reale su sequenze di DNA è una delle scelte convenienti28. La combinazione di un dispositivo portatile, insieme all'analisi molecolare personalizzata e convalidata, consente la verifica di specie e ingredienti botanici al di fuori del laboratorio, come nelle aziende agricole e nei magazzini di materiale botanico, riducendo i tempi e i costi associati ai metodi tradizionali.
L'obiettivo di questo protocollo è quello di introdurre un metodo per l'identificazione botanica in situazioni in cui l'accesso alle attrezzature e alle competenze di laboratorio è limitato o non disponibile, utilizzando un sistema qPCR portatile. Il metodo è dimostrato su un campo di matricaria cammomilla (Figura 3A), comunemente noto come camomilla tedesca, ampiamente utilizzato per le sue proprietà antinfiammatoriee antiossidanti 29. Può essere confuso con specie correlate di aspetto o odore simile, in particolare dai generi Chamaemelum, Tanacetume Chrysanthemum30,31,32. Tra le specie correlate, Chamaemelum nobile, noto anche come camomilla romana, è evidente con livelli di produzione comparabili nel commercio (Figura 3B). Il metodo dimostrato è stato progettato non solo per identificare la specie botanica bersaglio M. cammomilla, ma anche rilevare il suo parente stretto, C. nobile, sulla base di amplificazione specifica delle sequenze di DNA.
Questo articolo spiega, in dettaglio, come eseguire l'identificazione botanica sul campo di M. cammomilla utilizzando l'analisi qPCR a base di colorante intercalante e curva di fusione su un dispositivo portatile. Il protocollo include la raccolta di campioni botanici dal campo, l'estrazione del DNA in loco e la configurazione della reazione PCR in tempo reale. Per garantire una conclusione valida, come controllo positivo vengono utilizzati il DNA genomico botanico M. cammomilla e il DNA genomico C. nobile botanico non bersaglio, pre-estratto da materiali di riferimento botanici certificati. La specificità di questo metodo è dimostrata eseguendo sia M. cammomilla che C. nobile test di identificazione singolarmente su campioni e controlli. Il controllo negativo non modello viene utilizzato per escludere i risultati falsi positivi causati dalla contaminazione da PCR.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Battery</td>
			<td>TNE</td>
			<td>78000mAh</td>
			<td>Provide field power supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bCUBE</td>
			<td>HYRIS</td>
			<td>bCUBE 2.0</td>
			<td>Portable qPCR instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cartridges(16 Well)</td>
			<td>HYRIS</td>
			<td>NA</td>
			<td>Consumables for bCUBE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electric pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>NA</td>
			<td>Handling liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extract-N-AmpTM plant PCR kit</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>XNAP2-1KT</td>
			<td>Plant DNA extraction kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>German chamomile (Matricaria chamomilla L) flower botanical reference materials</td>
			<td>AHP</td>
			<td>2264</td>
			<td>Used as positive control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini dry bath</td>
			<td>Yooning</td>
			<td>MiniH-100L</td>
			<td>For DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>AMBION</td>
			<td>AM9937</td>
			<td>qPCR reaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NA</td>
			<td>qPCR reaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roman chamomile (Chamaemelum nobile) flower botancial reference materials</td>
			<td>ChromaDex</td>
			<td>ASB-00030806-005</td>
			<td>Used as positive control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luna universal qPCR master mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M3003L</td>
			<td>qPCR reaction</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

field identification of matricaria chamomilla using a portable qpcr system

Il controllo di qualità nei prodotti botanici inizia con l'approvvigionamento di materie prime. Tradizionalmente, l'identificazione botanica viene eseguita attraverso la valutazione morfologica e i metodi analitici chimici. Tuttavia, la mancanza di disponibilità dei botanici, soprattutto negli ultimi anni, unita alla necessità di migliorare il controllo di qualità per combattere gli stress sulla catena di approvvigionamento, causata dall'aumento della domanda dei consumatori e dei cambiamenti climatici, richiede approcci alternativi. L'obiettivo di questo protocollo è facilitare l'identificazione delle specie botaniche utilizzando un sistema qPCR portatile sul campo o in qualsiasi ambiente, in cui l'accesso alle attrezzature e alle competenze di laboratorio sia limitato. Il DNA bersaglio viene amplificato utilizzando il qPCR a base di colorante, con il DNA estratto da materiali di riferimento botanici che funge da controllo positivo. Il DNA bersaglio è identificato dalla sua amplificazione specifica e abbina il suo picco di fusione con il controllo positivo. È stata inclusa una descrizione dettagliata dei passaggi e dei parametri, dalla raccolta di campioni di campo pratico, all'estrazione del DNA, all'amplificazione PCR, seguita dall'interpretazione dei dati, per garantire che i lettori possano replicare questo protocollo. I risultati prodotti si allineano con i metodi di identificazione botanica tradizionali di laboratorio. Il protocollo è facile da eseguire e conveniente, consentendo test di qualità sulle materie prime il più vicino possibile al punto di origine della catena di approvvigionamento.

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Field Identification of Matricaria chamomilla using a Portable qPCR System

Presentato qui è un protocollo per l'identificazione sul campo della camomillia Matricaria utilizzando un sistema qPCR portatile. Questo protocollo facile da eseguire è ideale come metodo per confermare l'identità di una specie botanica in luoghi in cui l'accesso alle attrezzature e alle competenze di laboratorio è limitato, come aziende agricole e magazzini.

Identificazione sul campo della camomillia Matricaria utilizzando un sistema qPCR portatile

Quality control in botanical products begins with the raw material supply. Traditionally, botanical identification is performed through morphological ...

La pratica di utilizzare le botaniche per migliorare la salute risale a migliaia di anni fa. Recentemente, l'aumento della domanda, unito a pratiche di raccolta insostenibili e ai cambiamenti climatici, ha posto l'accento sulla catena di approvvigionamento. Per questo motivo, l'adulterazione botanica sta diventando una preoccupazione crescente, rendendo l'identificazione botanica una parte sempre più essenziale del controllo di qualità.Idealmente, l'identificazione viene eseguita il più vicino possibile alla fonte, in modo che le risorse possano essere allocate in modo efficiente al materiale di corretta identità. Ci sono una serie di approcci per l'identificazione botanica. Tradizionalmente, l'identificazione botanica viene eseguita attraverso la valutazione morfologica e metodi analitici chimici.L'identificazione morfologica si basa sulle differenze nelle caratteristiche macroscopiche e microscopiche dei materiali vegetali. Tuttavia, richiede un botanico ben addestrato e la sua applicazione ai materiali botanici in polvere è limitata. I metodi di analisi chimica sono ampiamente utilizzati nelle farmacopee e nei laboratori, ma non sono ideali per i test sul campo a causa delle dimensioni degli strumenti e dei requisiti ambientali.Recentemente, i metodi genomici sono emersi come tecnica alternativa per l'identificazione delle specie botaniche a causa dell'alta fedeltà e specificità delle informazioni genomiche nei materiali vegetali. Con strumenti diagnostici molecolari ora disponibili sotto forma di dispositivi portatili, questo approccio diventa possibile per l'applicazione sul campo. L'obiettivo di questo protocollo è quello di introdurre un metodo per l'identificazione botanica in situazioni in cui l'accesso alle attrezzature e alle competenze di laboratorio è limitato, come l'azienda agricola che fornisce il materiale botanico, utilizzando un sistema qPCR portatile.La camomilla matricaria, comunemente nota come camomilla tedesca, è stata utilizzata come farmaco a base di erbe per promuovere la salute per secoli. Per dimostrare la specificità del metodo attuale, la differenziazione della camomilla tedesca da un altro fiore di camomilla comunemente usato, noto come camomilla romana, è inclusa per il confronto. La procedura di identificazione sul campo è dimostrata nel mezzo di una fattoria di camomilla tedesca.Impostare un'area di test sul campo con una superficie piana e orizzontale. Identificare una pianta rappresentativa che rifletta le caratteristiche della maggior parte delle piante nel campo dei fiori di camomilla. Scegli una testa di fiore dalla pianta rappresentativa usando guanti sterili.Posizionare il campione in un tubo di raccolta da 2,0 millilitri. Ripetere e raccogliere un foglio illustrativo lungo circa 0,5-0,7 centimetri dalla stessa pianta. Preriscaldare l'incubatore di bagni secchi a 95 gradi Celsius.Ad ogni tubo di raccolta aggiungere 100 microlitri della soluzione di estrazione dal kit di estrazione del DNA vegetale. Per una migliore efficienza di estrazione del DNA, macinare il campione utilizzando un pestello tissutale. Chiudi il tubo.Assicurarsi che il tessuto botanico sia coperto dalla soluzione di estrazione durante tutto il processo di estrazione. Posizionare i tubi di raccolta in un incubatore di bagno secco preriscaldato e incubare i tubi di raccolta a 95 gradi Celsius per 10 minuti Dopo 10 minuti, eserti i tubi dall'incubatrice del bagno asciutto. Aggiungere 100 microlitri della soluzione di diluizione dal kit di estrazione del DNA e mescolare la soluzione tubazione su e giù più volte.Ripetere lo stesso passaggio per l'estrazione del foglio illustrativo. Agitare per mescolare ulteriormente la soluzione. Il problema della pianta di solito non sembra essere degradato dopo questo trattamento.Il colore liquido può cambiare e diventare torbido. Configurare le condizioni di termociclismo dello strumento qPCR in base alla tabella uno, che inizia con un passo di temperatura costante per la denaturazione iniziale, seguito da 25 cicli di amplificazione e termina con la rampa di temperatura per ottenere una curva di fusione ad alta risoluzione. Scongelare il mix principale qPCR e i primer elencati nella tabella due a temperatura ambiente prima dell'uso.Pianificare la reazione che verrà caricata in ogni pozzo. Pozzi contenenti controlli positivi con le specie bersaglio, controlli positivi con specie non bersaglio, campioni e controlli negativi. In questo esempio vengono utilizzati 10 pozzi, cinque per il test di identificazione della camomilla tedesca e altri cinque per il test di identificazione della camomilla romana.Per ogni tipo di test di identificazione delle specie, un pozzo contiene un controllo positivo con DNA estratto dal materiale di riferimento della specie bersaglio, un pozzo contiene un controllo positivo con DNA estratto da materiale di riferimento di specie non bersaglio, due pozzi sono riempiti con campioni di DNA di fiori e foglie estratti dal campo e un pozzo è assegnato per un controllo negativo. La tabella tre descrive ogni tipo di pozzo. Preparare un mix di maestri di reazione secondo la tabella quattro per ogni test di identificazione delle specie botaniche.Un tipico mix di master di reazione contiene un mix di master qPCR universale, due volte, primer specifici per specie in avanti e in retromarcia e acqua priva di nucleasi. Mescolare accuratamente la miscela del master di reazione pipettando prima dell'uso. Posizionare la cartuccia di reazione PCR a faccia in su su una superficie piatta e stabile.Caricare 18 microlitri del mix di master di reazione configurato nel passaggio precedente nei pozzi della cartuccia in base ai pozzi qui definiti. Per questa dimostrazione, aggiungere il mix di master di reazione del test di identificazione della camomilla tedesca in pozzi etichettati per il test GC, GCT nei pozzi uno, tre, cinque, sette, nove e il mix di master di reazione del test di identificazione della camomilla romana in pozzi etichettati per il test RC, RCT nei pozzi due, quattro, sei, otto, 10. Trasferire due microlitri di DNA campione dal supernatante dei tubi di estrazione del DNA e controlli positivi del DNA pre-estratti in pozzi di cartuccia precaricati con mix master qPCR.Dopo aver aggiunto ogni modello di DNA al mix master qPCR, mescolare delicatamente la soluzione pipettando. Sigillare con cura la cartuccia con pellicola adesiva. Caricare la cartuccia sulla camera di termociclismo e chiuderla.Impostare lo strumento qPCR per l'esecuzione. Nel protocollo attuale, il colorante intercalante viene utilizzato per misurare l'amplificazione dei frammenti bersaglio in tempo reale. Il valore Ct è definito come il numero di cicli necessari affinché il segnale fluorescente attraversi la soglia predefinita.Un valore Ct inferiore a 25 cicli è stato considerato come amplificazione positiva. In questa figura, il controllo positivo romano è stato amplificato solo nel test di identificazione della camomilla romana, ma non nel test di identificazione della camomilla tedesca. Il controllo positivo della camomilla tedesca e i campioni di campo sono stati amplificati solo nel test di identificazione della camomilla tedesca, ma non nel test di identificazione della camomilla romana.Il controllo negativo non è stato amplificato in nessuno dei due test. Per confermare ulteriormente l'amplificazione specifica nei controlli positivi e nei campioni, le frazioni di PCR e i prodotti di ciascun pozzo sono stati eseguiti su gel di agarosio al 2% in laboratorio. Tutti i pozzi con un valore Ct inferiore a 25 producono ampliconi alle loro dimensioni previste, che differiscono tra camomilla tedesca e camomilla romana.Il resto delle corsie non ha mostrato alcun prodotto di amplificazione specifico, in accordo con l'assenza di segnale fluorescente per questi pozzi osservata nelle prove sul campo. A seguito dell'amplificazione PCR, è stata eseguita un'analisi della curva di fusione utilizzando lo stesso software utilizzato per monitorare il segnale fluorescente. Con l'aumento della temperatura, gli ampliconi a doppio filamento iniziano a dissociarsi, con conseguente diminuzione dell'intensità della fluorescenza.I cambiamenti di intensità della fluorescenza furono ulteriormente convertiti in curve di picco di fusione per un'ulteriore differenziazione della camomilla tedesca dalla camomilla romana per i loro caratteristici picchi di fusione. In questa figura, il picco di fusione del controllo positivo della camomilla tedesca è di 85,6 gradi Celsius ed è distinto dal picco di fusione del controllo positivo della camomilla romana. Gli ampli PCR provenienti da campioni di campo producono picchi di fusione vicini al controllo positivo della camomilla tedesca.L'identità del campione di campo è determinata in base all'amplificazione specifica e alla temperatura di fusione caratteristica che corrisponde ai controlli. In questo esempio, sia il fiore che la foglia raccolti nel campo sono identificati come Matricaria chamomilla, camomilla tedesca. I risultati dei test di camomilla romana per questi due campioni sono negativi.Il protocollo dimostra l'identificazione della camomilla tedesca sul campo utilizzando un sistema qPCR portatile. Metodi simili possiamo sviluppare per espandere il portafoglio di botaniche che possono essere testate. Speriamo che questo video fornisca preziosi materiali di formazione per scienziati, anche non esperti per eseguire l'identificazione botanica sul campo o in un ambiente con attrezzature di laboratorio limitate.I test di identificazione sul campo basati sul DNA non solo producono risultati altamente accurati che corrispondono all'analisi di laboratorio, ma riducono anche i tempi e i costi associati ai metodi tradizionali eseguiti in laboratorio.

Research

JoVE Journal

Biology

Field Identification of Matricaria chamomilla using a Portable qPCR System

Long-term Imaging Mammalian Cells using Wide-Field Microscopy

A lungo termine Imaging cellule di mammifero utilizzando Wide-Field Microscopia

Ricerca

Biologia

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