Name: field identification of matricaria chamomilla using a portable qpcr system
Uploaded: 2020-10-10T12:30:00
Duration: 12 min 8 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Field Identification of Matricaria chamomilla using a Portable qPCR System at JoVE.com

ジェームズ・シャンのフィールドビデオ録画の努力に感謝します。ジョン・バイロンとマシュー・セメラウのビデオ編集の仕事に感謝します。アンセン・ルオ、ハリー・デュ、フランク・デンがテストフィールドを見つけてくれたことに感謝します。私たちは、原稿全体に彼女の貴重なコメントのためにマリア・ルビンスキーに感謝します。すべての認められた人は、ハーバライフ・インターナショナル・オブ・アメリカ社の従業員です。

1. サンプルコレクション
<ol><li>平らで水平な面を持つフィールドにテストエリアを設定します。</li>
	<li>カモミール花畑の植物の大部分の特徴を反映した代表的な植物を特定する(図4)。</li>
	<li>滅菌手袋を使用して代表的な植物から花の頭を選びます。</li>
	<li>サンプルを2.0 mLのコレクションチューブに入れる。</li>
	<li>ステップ 1.3 ~ 1.4 を繰り返し、同じプラントからリーフレット (長さ約 0.5 ~ 0.7 cm) を収集します。 注 :M.シャモミラ の花と葉は、2.0 mLコレクションチューブの底に座るのに十分な小ささです。表面積が大きい他の植物の場合、ペーパーパンチまたはハサミ(使用前に70%エタノールですすい)を使用して、試験のために組織サンプルを分離することができます。複数のサンプリングが必要な場合は、異なるサンプルの取り扱いの間にペーパーパンチまたははさみをすすきます。</li>
</ol>2. DNA抽出
<ol><li>乾式バスインキュベーターを95°Cに予熱します。</li>
	<li>各採取チューブに、植物DNA抽出キットから抽出液の100 μLを加 える(材料表に記載)。DNA抽出効率を向上させるには、組織のペスルを用いて抽出液中の組織試料を粉砕する。</li>
	<li>チューブを閉じます。植物組織が抽出プロセス全体を通して抽出液で覆われていることを確認します。</li>
	<li>コレクションチューブを予熱乾燥式バスインキュベーターに入れ、95°Cのコレクションチューブを10分間インキュベートします。</li>
	<li>10分後、乾燥したバスインキュベーターからチューブを取り出します。</li>
	<li>同じDNA抽出キットから100μLの希釈液を加え、上下にピペットを数回加えることで溶液を混合します。</li>
	<li>リーフレット抽出についても同じ手順を繰り返します。</li>
	<li>さらに溶液を混ぜるために振ります。植物組織は通常、この治療後に分解されているようには見えない。液体の色が変わり、曇りになる可能性があります。 注:希釈溶液は、すぐに進まない場合は、一晩室温で保存することができます。貯蔵前に植物組織から細胞の破片を取り除く必要はない。チューブ内の液体は、下流のPCR増幅のためのDNAテンプレートを保持しています。</li>
</ol>3. PCR反応のセットアップ
<ol><li>qPCR機器のサーモサイクリング条件をメーカーの仕様に従って設定します。に示した PCR サーモサイクリング プロファイル (表 1)を適用し、最初の変性のための一定温度ステップから始まり、25 サイクルの増幅が続き、温度ランプで終わり、高解像融解曲線を得ます。</li>
	<li>使用前に室温でqPCRマスターミックスとプライマー(表2)を解凍します。</li>
	<li>各ウェルにロードされる反応を計画する:標的種との陽性対照を含む井戸、非標的種による陽性対照、サンプル、および陰性対照(図5)。<ol>
<li>この例では、ドイツのカモミール識別試験には5つの井戸が使用され、残りの5つのウェルはローマのカモミール識別試験に使用されます。各種同定試験の種類ごとに、1つの井戸は、対象種の参照材料から抽出されたDNAで陽性対照を含み、1つは非標的種の参照材料から抽出されたDNAで陽性の対照を含み、2つの井戸はフィールドから抽出された花と葉のDNAサンプルで満たされ、1つの井戸は否定的な対照のために割り当てられます。 表 3 に、各ウェルタイプについて説明します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>各植物種同定試験のマニュアルに従って反応マスターミックスを準備します。典型的な反応マスターミックスは、普遍的なqPCRマスターミックス(2x)、前方および逆種特異的プライマー、およびヌクレアーゼフリー水が含まれています。 表4 に反応系の組成を示す。 注:すぐに使用しない場合は、qPCR反応マスターミックスを+2°C~+8°Cのクーラーまたはミニ冷蔵庫に保管してください。</li>
	<li>使用前にピペッティングして反応マスターミックスを十分に混ぜます。</li>
	<li>qPCRカートリッジを面を上にして平らで安定した面に置きます。</li>
	<li>ステップ3.4で構成された反応マスターミックスの18 μLを、ステップ3.3で定義されたウェルに従ってカートリッジウェルにロードします。このデモでは、ドイツのカモミール同定試験反応マスターミックスをGCテスト用にラベル付けされたウェル(井戸1、3、5、7、9のGCT)に追加し、ローマカモミール同定試験反応マスターミックスをRCテスト用にラベル付けされたウェル(ウェル2、4、6、8、10)に追加します( 図5を参照)。</li>
	<li>DNA抽出チューブの上清から2μLのサンプルDNAを、あらかじめ抽出したDNA陽性制御から、qPCRマスターミックスをプリロードしたカートリッジウェルに移します。各DNAテンプレートをqPCRマスターミックスに加えた後、ピペット処理で溶液を軽く混ぜます。 注:DNA抽出チューブからDNAを転送する際は、細胞の破片を浮遊しないでください。必要に応じて、上清と細胞の破片を分離するために小型遠心分離剤を使用してください。</li>
	<li>カートリッジを粘着フィルムで丁寧に密封します。カートリッジをサーモサイクリング室に積み込み、閉じます。</li>
	<li>実行する qPCR インストゥルメントを設定します。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Smith, T., Gillespie, M., Eckl, V., Knepper, J., Reynolds, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herbal+supplement+sales+in+US+increase+by+9.4%+in+2018.">Herbal supplement sales in US increase by 9.4% in 2018.</a> HerbalGram. 123, 62-73 (2019).</li><li>Israelsen, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+challenge+of+regulation,+globalization+and+climate+change+on+botanicals+and+traditional+medicines:+respecting+tradition+while+embracing+change.">The challenge of regulation, globalization and climate change on botanicals and traditional medicines: respecting tradition while embracing change.</a> Planta Medica. 74 (3), 36 (2008).</li><li>Cardellina, J. 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鄭秀陽、鄭権、ティファニー・チュア、レオ・リー、ヤンジュン・ザン、シルバ・ババジャニアン、トリシア・チュア、ピーター・チャン、ゲイリー・スワンソン、鄭飛・ルーがハーバライフ・インターナショナル・オブ・アメリカ社の従業員であることを証明します。フランチェスコ・ブオンジョルノ、イザベラ・デッラ・ノーセ、ロレンツォ・コロンボは、この記事で使用されるポータブルqPCR機器を生産するハイリス株式会社の従業員であることを証明しています。

プライマーとテンプレート選択の設計は、効率的かつ特異的なqPCR増幅を得る上で重要なステップです。適切なテンプレートを同定した後、プライマー設計ソフトウェアは、典型的には、プライマー長、融解温度、およびGC含有量33、34,34などの設計変数に基づいてプライマーの選択を支援するために使用される。最適化および検証は、PCR反応35の特異性、感度、および堅牢性を確保するために、アッセイの予想される実験条件の下で行うことができる。最適でないプライマー設計はプライマーダイマー形成をもたらし、プライマー相互作用が非特異的な産物を生成する36.
この研究で使用されるテンプレートなし制御(NTC)は、DNA汚染とアッセイに影響を与える可能性のあるプライマーダイマーの存在の両方をチェックします。結果は増幅を示さなかった、DNA汚染およびプライマーダイマーの両方が懸念されないことを示す良い徴候である。DNA汚染およびプライマーダイマーは、テンプレートコントロールを通らず、正のコントロールのメルトカーブの余分なピークとしてメルトカーブに現れます。一般的に、正のコントロールのメルト曲線は、テンプレート内のATリッチサブドメインが不均一な融解を引き起こさない限り、単一のピークを含むことが期待される。uMELTソフトウェア37を用いて融解アッセイをシミュレートすることで、二重ピークを予測できる。本研究では、アガロースゲル上でPCR産物を実行するゴールドスタンダードを用いて、標的PCR産物の存在および汚染およびプライマーダイマーの存在を確認した。
植物材料分子解析における大きな課題は、植物DNA抽出プロセスに従って良質DNAを得ることです。植物材料は、健康上の利点に関連付けられている活性化学化合物のために取引され、消費されます。.DNA抽出の過程で、これらの化学化合物もDNA抽出溶液中に放出され、PCR阻害を引き起こす可能性があり、これによりPCR増幅の失敗を引き起こす可能性があります。有機溶媒およびカラムを用いた各種植物DNA精製キットは、植物由来の化学化合物38を除去するために開発されている。しかし、これらのキットを支援するために必要なヒュームフードと高速遠心分離機は、フィールドでは利用できません。
現在のプロトコルでは、簡略化されたDNA抽出方法は、市販の植物DNA抽出キットを使用しています(詳細については 、材料表 を参照)。それは再現可能な結果のために一般的な阻害物質を中和する能力を有し 、M.シャモミラ および C.ノビレ のための一貫した結果を生み出した。 M.シャモミラ と C.ノビレ の両花頭と葉は、特定の溶融ピークを有するPCRアンプリコンを生じ、PCR阻害剤の存在が懸念されないことを示す。PCR阻害剤のレベルが高い他の植物の場合、元の抽出でDNAを増幅することは効率が悪いかもしれません。阻害を低減し、増幅効率を向上させるために、植物全体へのアクセスを伴い、より低い多糖類およびポリフェノール含有量を有する他の植物部分も同定目的に使用することができる。異なる植物部分へのアクセスが限られている場合、花の頭から解剖された若い葉や花びらは、典型的には、より低いフェノール含有量39を有する、成功のより良いチャンスを提供するかもしれない。DNA配列は植物全体で一貫しているため、種の同一性を確認するために任意の植物部分を使用することができます。PCR増幅がまだ最適でない場合、元のDNA抽出物はPCRの前にさらに希釈することができ、より高度な実験室浄化プロトコルを使用することができます。
PCR 分析のもう 1 つの課題は、DNA 汚染によって引き起こされる偽陽性の結果であり、データ解釈に悪影響を与える可能性があります。通常、アクティブなハウスキーピング、専用機器の使用、指定されたエリアへの作業の制限によって制御されます。qPCRを使用すると、すべてのPCR分析を閉じたシステムで行うことができるため、十分に制御されていない環境でのPCRアンプリコン汚染の可能性を大幅に低減できます。また、以前の検証研究40によると、環境DNAはまた、アッセイの特異性のために偽陽性を示すべきではない。
改善の余地がある。ここで提示するプロトコルでは、中間色素を使用して、標的断片増幅をリアルタイムで示した。この方法の特異性は 、M.シャモミラ と C.ノビレ アンプリコンの間で明確である特徴的な融解温度によってさらに確認される。そのため、インターカレート色素ベースPCRは、現場で「この植物種は何ですか」という質問に効率的に答えることができます。しかし、現場から隔離された単一の植物に対して植物同定を行う必要性に加えて、多くの状況において、倉庫内の植物粉末または抽出物は、現場での迅速な識別評価の恩恵を受ける。この種の材料については、「この材料には何が含まれているのか」、「私が探している植物種が含まれているのか」、「避けたい汚染物質が含まれているのか」、「有害な他の植物種によって部分的に置き換えられるのか」など、追加の質問に対処する必要があります。インターカレート色素を使用する代わりに、異なるqPCRプローブは、アッセイの高い特異性と効率を維持しながら、1つの反応系で異なる植物からのアンプリコンを標的にするように設計することができます。プローブベースのqPCRの開発と、複数のチャネル検出を提供するポータブルqPCRシステムの利用により、より複雑な質問に答えるために、植物材料倉庫や流通センターなどのより広範な環境環境に対する目的に適合するアッセイとしてのフィールドテストの適用をさらに拡張することができます。さらに、複数のプローブを使用すると、ユーザーは各反応系に内部増幅を含めることができるように、PCR阻害が疑われる場合により多くの情報が利用可能になる。
ここで示すプロトコルは、同じ目的で使用される既存の技術と比較して、次の利点があります。まず、従来の形態学的および化学的同定法では、手順とその結果を専門家が行い、解釈する必要があります。qPCRベースの同定試験は、基本的な分子生物学の訓練を受けた人々によって行われ、より標準化された方法で解釈することができます。第二に、実験室で通常行われるqPCRベースの種同定と分化と比較して、ポータブル機器を用いたフィールド識別プロトコルは、高速遠心分離機、DNA品質評価装置、蛍光検出器付きサーマルサイクラー、および特別なソフトウェアを実行するコンピュータのような大きなフットプリントを有する機器を必要としない。従って、DNAベースの種同定は、遅延なく任意の設定で行うことができる。第三に、植物材料の探索は、グローバルな操作を必要とするタスクです。クラウド サービスと人工知能の進歩により、ポータブル デバイスは、研究室の専門家によって開発および検証された方法を受け取り、遠隔地の専門家が運用し、第三者から客観的な認定を取得する可能性があります。したがって、このオプションは、リモート作業がトレンドになる中で、これまで以上に魅力的です。
要約すると、ここでのプロトコルは、ポータブルqPCRシステムを使用して M.チャモミラ のフィールド識別を実証した。この技術の成功した適用は植物の識別に非常に正確な結果を生成し、植物の製造業者およびサプライヤーが適時かつコスト効率の高い方法で植物材料を修飾するのを助ける。

健康を維持し改善するために植物を使用する習慣は、数千年にさかのぼります。消費者需要の増加によってもたらされるサプライチェーンのストレス1,持続不可能な収穫慣行と気候変動2,植物の姦淫は、食品および栄養補助食品業界での懸念が高まりつつあります3.宣言されていない植物種や誤認された植物種の存在は、有効性の低下、あるいは安全性の問題につながる可能性があります。例えば、ブラックコホシュ(Actaea racemosa)は、月経前の不快感を治療するために使用され、その有効性4に対する限定的な臨床データサポートを有する低価格のアジア種に置換され得る。より深刻なケースでは、中国のハーブを用いた減量の臨床研究におけるステファニー・テランドラのアリストロキア・ファンチの置換は、一部の参加者5,66において重度の腎毒性および腎不5全につながった。2つの異なる種は、中国の共通名「ファンジ」を共有しました。これらのケースは、原材料の同定から始まるより厳格な品質管理の必要性を強調しています7(できればサプライチェーンの起点に近い場所にできるだけ近い方が好ましいため, 資源を正しいアイデンティティの材料に効率的に割り当てることができる。
多くの直交アプローチを植物の同定に使用できます。従来、植物同定は形態学的評価8、9および9化学分析8法10、11、12、13,11,12,13を介して行われる。形態学的同定は、植物材料の巨視的特徴と微視的特徴の違いがある場合の違いに基づいている(図1)。しかし、近年の古典的な植物学に関するトレーニングプログラムの欠如は、専門家の不足をもたらしました 14,このアプローチは、日常的な品質管理のために実用的ではありません.粉末植物材料でのその用途も限られています。化学分析法は、薬理工学や研究所で広く使用されていますが、高性能薄層クロマトグラフィー(HPTLC)、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)、核磁気共鳴分光法(図2)、環境要件などの機器のサイズにより、フィールドテストには適していません。近年、ゲノム法は植物種の認証と置換検出の代替技術として登場し、効率的かつ正確であることが証明されています。ゲノム法,は、植物材料15、16、17、18、19,16における遺伝情報の高い忠実度と特異性18を19利用する。,17分子診断ツールは、ポータブルデバイスの形で利用可能であり、多くの場合、技術の使用障壁を下げる自動化されたデータ解釈ツールが含まれている、このアプローチは、フィールド識別20、21、22、23、24に最適です。20,21,22,23,24分子解析方法を設計し、検証した後 25,,26,,27,それは基本的な分子生物学の訓練を受けた任意の人員によって行うことができます。利用可能なさまざまなポータブルツールの中で、DNA配列上のリアルタイムPCRは、費用対効果の高い選択肢の1つです28.ポータブルデバイスの組み合わせは、カスタマイズされ、検証された分子分析と共に、農場や植物材料倉庫などの実験室外の植物種や成分の検証を可能にし、従来の方法に関連する時間とコストを削減します。
このプロトコルの目的は、ポータブルqPCRシステムを使用して、実験室の機器や専門知識へのアクセスが制限されているか利用できない状況で植物の同定のための方法を導入することです。この方法は、マトリカリア・シャモミラ(図3A)の分野で実証され、一般的にはドイツのカモミールとして知られており、その抗炎症および抗酸化特性29に広く使用されている。それは、特に属チャマエメラム、タナセタム、および菊30、31、32,31,32から、類似した外観や臭気の関連種と混同することができます。関連種の中で、ローマのカモミールとしても知られるチャマエムム・ノビレは、商業における同等の生産レベルを有する顕著なものです(図3B)。実証された方法は、標的植物種M.シャモミラを同定するだけでなく、DNA配列の特異的増幅に基づいてその近親的なC.nobileを検出するように設計された。
この記事では、インターカレート色素ベースのqPCRとメルトカーブ解析をポータブルデバイス上で使用して 、M.chamomilla のフィールドボタニカル同定を実行する方法を詳細に説明します。このプロトコルには、現場からの植物サンプルの収集、現場でのDNA抽出、リアルタイムPCR反応のセットアップが含まれます。有効な結論を確実にするために、標的植物 M.シャモミラ および非標的植物性 C.ノビレ ゲノムDNAは、認定された植物基準材料から事前に抽出され、陽性対照として使用される。この方法の特異性は 、M.シャモミラ と C.ノビレ の両方の同定試験をサンプルおよびコントロールで個別に行うことによって実証される。非テンプレート陰性制御はPCR汚染によって引き起こされる偽陽性の結果を除外するために使用される。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Battery</td>
			<td>TNE</td>
			<td>78000mAh</td>
			<td>Provide field power supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bCUBE</td>
			<td>HYRIS</td>
			<td>bCUBE 2.0</td>
			<td>Portable qPCR instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cartridges(16 Well)</td>
			<td>HYRIS</td>
			<td>NA</td>
			<td>Consumables for bCUBE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electric pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>NA</td>
			<td>Handling liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extract-N-AmpTM plant PCR kit</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>XNAP2-1KT</td>
			<td>Plant DNA extraction kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>German chamomile (Matricaria chamomilla L) flower botanical reference materials</td>
			<td>AHP</td>
			<td>2264</td>
			<td>Used as positive control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini dry bath</td>
			<td>Yooning</td>
			<td>MiniH-100L</td>
			<td>For DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>AMBION</td>
			<td>AM9937</td>
			<td>qPCR reaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NA</td>
			<td>qPCR reaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roman chamomile (Chamaemelum nobile) flower botancial reference materials</td>
			<td>ChromaDex</td>
			<td>ASB-00030806-005</td>
			<td>Used as positive control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luna universal qPCR master mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M3003L</td>
			<td>qPCR reaction</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

field identification of matricaria chamomilla using a portable qpcr system

植物製品の品質管理は原料供給から始まります。従来、植物同定は形態学的評価と化学分析法によって行われる。しかし、特に近年の植物学者の入手可能性の欠如は、消費者の需要の増加と気候変動によってもたらされるサプライチェーンのストレスに対処するために品質管理を強化する必要性と相まって、代替アプローチを必要とします。このプロトコルの目的は、実験室の機器や専門知識へのアクセスが制限されているフィールドまたは任意の設定でポータブルqPCRシステムを使用して植物種の同定を容易にすることです。標的DNAは色素ベースのqPCRを用いて増幅され、植物の参照材料から抽出されたDNAが陽性対照となる。標的DNAは、その特異的な増幅によって同定され、その融解ピークを正の対照に一致させる。実践的なフィールドサンプル収集からDNA抽出、PCR増幅、データ解釈まで、ステップとパラメータの詳細な説明が含まれており、読者がこのプロトコルを確実に複製できるようにしています。結果は、従来の実験室の植物同定方法と一致して生成された。このプロトコルは、実行が容易でコスト効率が高く、サプライチェーンの原点に近い原材料の品質テストを可能にします。

セクション1に記載されたプロトコルに従い、花頭および葉から植物DNAを、95°Cでの回収管の熱インキュベーション後に上清に10分間抽出した。現在の研究では、上清は花と葉の両方に黄色と緑がかった色を示し、植物DNAを用いて様々な天然化合物が上清に放出されたことを示す(図6)。確かなPCR増幅は、後に、全てのフィールド抽出DNA鋳型に対して三重化で達成されたが、DNA品質評価は参照として実験室で行った。蛍光測定によって決定される花頭DNA抽出物の濃度は3.69〜5.36 ng/μL、葉DNA抽出物の濃度は6.42〜9.29 ng/μLの範囲でした。A260/A280及びA260/A230の花および葉のDNA抽出物の吸光度比を分光光度法により測定した。しかし、DNAと植物化学UV吸収スペクトルとの重複のために、これらの比率は信頼性を測定することができなかった(データは示していない)。
インターカレル蛍光色素を用い、標的断片の増幅をリアルタイムでモニタリングした。特定のプライマー M.シャモミラとC.ノビレの両方が、植物ゲノムに数十〜数百部のコピーを有する内部転写スペーサ2(ITS2)領域を標的とするため、25のPCR増幅サイクルはカモミール種の同定に十分なアンプリコンを生成するのに十分である。図7において、M.シャモミラ同定試験におけるM.シャモミラ陽性対照のCt値は25(GCP_GCT)未満であったが、一方、25回の増幅サイクル後、同一対照の蛍光は検出閾値(GCP_RCT)を下回った。一方、25サイクル後、M.チャモミラ同定試験におけるC.ノビレ陽性対照の蛍光は検出閾値(RCP_GCT)を下回り、C.ノビレ同定試験における同一対照のCt値は25(RCP_RCT)未満であった。それぞれのアッセイにおける標的および非標的陽性制御の増幅は、M.シャモミラ同定アッセイの特異性を示す。サンプルDNAの場合、フィールドフラワーヘッドと葉のDNA抽出物は、それぞれM.シャモミラ同定試験で15.18および19.41のCt値を得た(Sample1(FLOWER)_GCTおよびSample2(LEAF)_GCT)。これらのサンプルはいずれもC.ノビレ同定試験(サンプル1(FLOWER)_RCTおよびサンプル2(リーフ)_RCT)では増幅されなかった。両サンプルの増幅パターンは、M.シャモミラ陽性対照の増幅パターンと一致した。陰性コントロールは、PCR汚染によって引き起こされる偽陽性の可能性を除いて、M.シャモミラおよびC.ノビレ同定試験(NC_GCTおよびNC_RCT)の両方で増幅されなかった。陽性制御およびサンプルにおける特異的増幅をさらに確認するために、各ウェルからのPCR末産物の画分を、実験室で2%アガロースゲル上で実行した(図8)。M.シャモミラ同定試験では、両方のフィールドサンプルがM.chamomilla陽性対照と同じ位置で実行されるアンプリコンを100bp(理論サイズ102 bp)をわずかに上回る推定サイズで生成した。C.ノビレ同定試験の場合、非標的種C.ノビレ陽性対照は、50〜100bpの間のバンドを生じ、理論サイズ65bpに適合した。残りの車線は、フィールドテストで観察されるように、これらの井戸の蛍光シグナルの欠如と一致していた特定の増幅産物を示さなかった。
PCR増幅後、融解曲線解析を行い、加熱時の二本鎖DNA(dsDNA)の解離特性を評価した。メルトカーブ解析の最終サイクル中に温度が上昇するにつれて、温度が上昇すると二本鎖アンプリコンの解別が起きました。インターカレーション蛍光色素を徐々に溶液中に放出し、蛍光強度を低下させた(図9A)。第1誘導曲線の変曲点を用いて、溶融温度(図9B)を決定し、これは主にDNA断片長およびGC含有量に依存する。Ct値と融解温度を組み合わせることで、qPCR分析の特異性を高めることができます。現在の研究では 、M.シャモミラ 陽性対照PCRアンプリコンの融解温度ピークは85.6°C(GCP_GCT)で発生し、79.1°C(RCP_RCT)における C.ノビレ 陽性対照PCRアンプリコンの融解温度ピークとは異なっていた。フィールドフラワーヘッドと葉のPCRアンプリコンは、それぞれ85.2°Cと84.8°Cで融解温度のピークを生成しました(Sample1(FLOWER)_GCTとサンプル2(LEAF)_GCT)。ポータブルqPCRシステムで測定した融点変動を評価するために、試料融解温度がM. シャモミラ 陽性対照(2°C以内)から得られる融点に常に近く 、C.ノビレ 正気制御アンプリコンの融解温度から遠く離れていることを確認するために、追加のデータポイントを収集した(図10)。融解温度ピークは、他の井戸で報告された。しかし、それらのCt値は25以上であり、融解温度ピークは M.シャモミラ または C.ノビレ 陽性対照(2°C以上離れている)に近いではなかった。
要約すると、フィールド M. チャモミラ 識別検定は 、表 5に要約された決定規則に基づいて解釈できます。すべての陽性対照は、推定植物種に陽性、他の種に対して陰性、および陰性対照試験陰性で、両方のフィールドサンプルは M.チャモミラ を含むが C.ノビレを含まないと決定された。さらに、フィールドテスト結果を他の分析技術と一致させるために、フィールド結論は、以前に検証されたDNAバーコード方式25( データは示されていない)によってさらに確認された。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60940/60940fig01.jpg"> 図1:植物材料の形態学的同定(A)ハイビスカス・ローザ・シネンシスの花、クルクマロンガの根、マルヴァ・シルヴェストリスの葉、ロスマリヌス・オフィシナリスの葉、コリンドラム・サティバム種子、ジンギバー・オフィシナールの根。(B)ペトロセリナムクリスプとアピウム砂利石片は区別が困難である。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60940/60940fig01large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60940/60940fig02.jpg"> 図2:植物材料の化学的同定()HPTLC機器と代表的なHPTLCクロマトグラム。(B)HPLC装置および代表的なHPLCクロマトグラム。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60940/60940fig02large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60940/60940fig03.jpg"> 図3:マトリカリアシャモミラとチャマエムラム・ノビレ(A)マトリカリア・シャモミラは、ウィキペディアからCC BY-SA 3.0の下で適応した、https://en.wikipedia.org/wiki/Matricaria_chamomilla#/media/File:Matricaria_February_2008-1.jpg。(B)カマエムム・ノビレは、CC BY-SA 3.0のウィキペディアから適応した、https://en.wikipedia.org/wiki/Chamomile#/media/File:Chamaemelum_nobile_001.JPG。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60940/60940fig03large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60940/60940fig04.jpg"> 図4:M.チャモミラ植物部品を現場から回収する。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60940/60940fig04large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60940/60940fig05.jpg"> 図 5: デモでのテスト井戸のレイアウト<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60940/60940fig05large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60940/60940fig06.jpg"> 図6:採取管内のフィールドDNA抽出物植物組織は元のチューブに残り、黄色がかったDNA抽出物で覆われています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60940/60940fig06large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60940/60940fig07.jpg"> 図7:25サイクルにわたるサーモサイクリングのPCR産物の蓄積を示す蛍光プロット。M.シャモミラ 陽性対照および C.ノビレ 陽性対照は、それぞれ M.シャモミラ および C.ノビレ 同定試験において25未満のCt値を示す。フィールドの花と葉のサンプルは、15.18と19.41のCt値を有する M.シャモミラ 同定試験によって増幅された。残りの井戸は増幅されなかった。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60940/60940fig07large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60940/60940fig08.jpg"> 図8:フィールドPCR増幅産物のゲル電気泳動<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60940/60940fig08large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60940/60940fig09.jpg"> 図9:溶融温度解析(A)各ウェルの蛍光シグナルは温度上昇に伴って減少する。(B)PCR産物の同一性を、融解曲線解析における融解温度ピークにより確認した。フィールドの花と葉のサンプルは、85.2 °Cと84.8 °Cでピークを示しています。 これらは、M.シャモミラ陽性対照によって生成されたピークに近いです。C.ノビレ陽性対照は、他の3つのサンプルとは異なる79.1°Cでピークを生み出した。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60940/60940fig09large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60940/60940fig10.jpg"> 図10:正の制御とフィールドサンプルの間の溶融温度ピーク変動。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60940/60940fig10large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>段階</td>
			<td>サイクル</td>
			<td>温度</td>
			<td>時間</td>
		</tr>
<tr>
<td>一定温度</td>
			<td>1</td>
			<td>95°C</td>
			<td>60 年代</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">増幅</td>
			<td rowspan="2">25</td>
			<td>95°C</td>
			<td>30 代</td>
		</tr>
<tr>
<td>60°C</td>
			<td>30 代</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">融解曲線</td>
			<td rowspan="2">1</td>
			<td>60°C</td>
			<td rowspan="2">ランプ 0.05 °C/s</td>
		</tr>
<tr>
<td>95°C</td>
		</tr>
</tbody></table>表 1:M.シャモミラおよびC.ノビレ 同定試験のqPCR熱サイクル条件
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>試験</td>
			<td>プライマー名</td>
			<td colspan="2">シーケンス 5'-3'</td>
			<td>位置</td>
			<td>地域</td>
			<td>アンプリコンサイズ</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">マトリカリア・リカティータ</td>
			<td>ZL3</td>
			<td colspan="2">CCGTCGGTCGCAAGGATAAG</td>
			<td>転送</td>
			<td rowspan="2">ITS2</td>
			<td rowspan="2">102 bp</td>
		</tr>
<tr>
<td>ZL4</td>
			<td colspan="2">タアクトカグッガグタグタグタグタル</td>
			<td>逆</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">チャマエメルム・ノビレ</td>
			<td>ZL11</td>
			<td colspan="2">TGTCGCACGTTGCTAGGAAGCA</td>
			<td>転送</td>
			<td rowspan="2">ITS2</td>
			<td rowspan="2">65 bp</td>
		</tr>
<tr>
<td>ZL12</td>
			<td colspan="2">TCGAAGCGTCATTAAGACAAC</td>
			<td>逆</td>
		</tr>
</tbody></table>表 2:M.シャモミラ と C.ノビレ 同定試験用プライマーペア。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>まあ位置</td>
			<td>よく名前</td>
			<td colspan="2">説明</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>GC_PosCtrl_GC_Test</td>
			<td colspan="2">GC試験下のドイツカモミール陽性制御</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>GC_PosCtrl_RC_Test</td>
			<td colspan="2">RC試験下のドイツのカモミール陽性制御</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>RC_PosCtrl_GC_Test</td>
			<td colspan="2">GC試験下のローマカモミール陽性制御</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>RC_PosCtrl_RC_Test</td>
			<td colspan="2">RCテスト下のローマカモミール陽性制御</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td>Field_Sample_GC_Test</td>
			<td colspan="2">GC試験下の葉組織のサンプル</td>
		</tr>
<tr>
<td>6</td>
			<td>Field_Sample_RC_Test</td>
			<td colspan="2">RC試験下の葉組織のサンプル</td>
		</tr>
<tr>
<td>7</td>
			<td>Field_Sample_GC_Test</td>
			<td colspan="2">GC試験下の花組織のサンプル</td>
		</tr>
<tr>
<td>8</td>
			<td>Field_Sample_RC_Test</td>
			<td colspan="2">RC試験下の花組織のサンプル</td>
		</tr>
<tr>
<td>9</td>
			<td>NegCtrl_GC_Test</td>
			<td colspan="2">GCテスト下の陰性制御サンプル</td>
		</tr>
<tr>
<td>10</td>
			<td>NegCtrl_RC_Test</td>
			<td colspan="2">RCテスト下の陰性制御サンプル</td>
		</tr>
</tbody></table>表 3:M.シャモミラ と C.ノビレ 識別試験の種類と説明。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>試薬</td>
			<td>GC_Test</td>
			<td>RC_Test</td>
		</tr>
<tr>
<td>ユニバーサル qPCR ミックス*</td>
			<td>10 μL</td>
			<td>10 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>ZL3プライマー(10μM)</td>
			<td>0.4 μL</td>
			<td>Na</td>
		</tr>
<tr>
<td>ZL4プライマー(10μM)</td>
			<td>0.4 μL</td>
			<td>Na</td>
		</tr>
<tr>
<td>ZL11 プライマー (10 μM)</td>
			<td>Na</td>
			<td>0.4 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>ZL12 プライマー (10 μM)</td>
			<td>Na</td>
			<td>0.4 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>H2O (ヌクレアーゼフリー)</td>
			<td>7.2 μL</td>
			<td>7.2 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">*ホットスタートTaq DNAポリメラーゼが含まれています</td>
		</tr>
</tbody></table>表 4:M.シャモミラ および C.ノビレ 同定試験用のマスターミックス組成物。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td rowspan="2">ウェルネーム</td>
			<td rowspan="2">期待される結果</td>
			<td>正の結果の抽出条件</td>
			<td>負の結果の抽出条件</td>
		</tr>
<tr>
<td>検出/現在</td>
			<td>検出されない/存在しない</td>
		</tr>
<tr>
<td>GC_PosCtrl_GC_Test</td>
			<td>検出</td>
			<td>Ct < 25 と 84 <= Tm <= 86</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>GC_PosCtrl_RC_Test</td>
			<td>検出されませんでした</td>
			<td>-</td>
			<td>25 サイクル以内に Ct 値なし</td>
		</tr>
<tr>
<td>RC_PosCtrl_GC_Test</td>
			<td>検出されませんでした</td>
			<td>-</td>
			<td>25 サイクル以内に Ct 値なし</td>
		</tr>
<tr>
<td>RC_PosCtrl_RC_Test</td>
			<td>検出</td>
			<td>Ct < 25 と 79 <= Tm <= 81</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>Field_Sample_Leaf_GC_Test</td>
			<td>存在</td>
			<td>Ct < 25 と 84 <= Tm <= 86</td>
			<td>25 サイクル以内に Ct 値なし</td>
		</tr>
<tr>
<td>Field_Sample_Leaf_RC_Test</td>
			<td>欠席</td>
			<td>-</td>
			<td>25 サイクル以内に Ct 値なし</td>
		</tr>
<tr>
<td>Field_Sample_Flower_GC_Test</td>
			<td>存在</td>
			<td>Ct < 25 と 84 <= Tm <= 86</td>
			<td>25 サイクル以内に Ct 値なし</td>
		</tr>
<tr>
<td>Field_Sample_Flower_RC_Test</td>
			<td>欠席</td>
			<td>-</td>
			<td>25 サイクル以内に Ct 値なし</td>
		</tr>
<tr>
<td>NegCtrl_GC_Test</td>
			<td>検出されませんでした</td>
			<td>-</td>
			<td>25 サイクル以内に Ct 値なし</td>
		</tr>
<tr>
<td>NegCtrl_RC_Test</td>
			<td>検出されませんでした</td>
			<td>-</td>
			<td>25 サイクル以内に Ct 値なし</td>
		</tr>
</tbody></table>表 5: qPCR 結果解釈の規則

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Field Identification of Matricaria chamomilla using a Portable qPCR System

ここで提示されるのが、ポータブルqPCRシステムを用いた マトリカリア・シャモミラ のフィールド識別プロトコルです。この実行が容易なプロトコルは、農場や倉庫などの実験室設備や専門知識へのアクセスが制限されている場所で植物種の身元を確認する方法として理想的です。

ポータブルqPCRシステムを用いた マトリカリアシャモミラ のフィールド同定

Quality control in botanical products begins with the raw material supply. Traditionally, botanical identification is performed through morphological ...

健康を改善するために植物を使用する習慣は何千年も前にさかのぼります。最近、需要の増加は、持続不可能な収穫慣行や気候変動と相まって、サプライチェーンにストレスを与えています。このため、植物の不調が懸念されつつあり、植物の識別は品質管理のますます不可欠な部分となっています。理想的には、識別はソースにできるだけ近く行われるため、リソースを適切な ID の材料に効率的に割り当てることができます。植物の識別には多くのアプローチがあります。従来、植物同定は形態学的評価と化学分析法によって行われる。形態学的同定は、植物材料の巨視的および顕微鏡的特徴の違いに基づいている。しかし、それは十分な訓練を受けた植物学者を必要とし、粉末植物材料への適用は限られています。化学分析法は、薬理工学や研究所で広く使用されていますが、機器の大きさや環境要件により、現場試験には適していません。近年、植物材料におけるゲノム情報の高い忠実度と特異性により、植物種同定の代替技術としてゲノム法が出現しています。分子診断ツールをポータブルデバイスの形で利用できるようになったので、このアプローチは、フィールドアプリケーションのために可能になります。このプロトコルの目的は、移植性qPCRシステムを使用して、植物材料を供給する農場など、実験室の機器や専門知識へのアクセスが制限されている状況で植物同定の方法を導入することです。マトリカリアシャモミラ, 一般的にドイツのカモミールとして知られています, 何世紀にもわたって健康を促進するためのハーブ薬として使用されています。.現在の方法の特異性を実証するために、ローマのカモミールとして知られている別の一般的に使用されるカモミールの花からのドイツのカモミールの分化が比較のために含まれています。フィールド識別手順は、ドイツのカモミール農場の真ん中で実証されています。平らで水平な面を持つフィールドにテストエリアを設定します。カモミールの花畑の植物の大半の特性を反映する代表的な植物を特定します。滅菌手袋を使用して代表的な植物から花の頭を選びます。サンプルを2.0ミリリットルの回収チューブに入れる。同じ植物から約0.5〜0.7センチメートルのリーフレットを繰り返し収集します。乾式バスインキュベーターを摂氏95度に予熱します。各回収管に、植物DNA抽出キットから100マイクロリットルの抽出液を加える。DNA抽出効率を向上するために、組織の害虫を使用してサンプルを粉砕します。チューブを閉じます。植物組織が抽出プロセス全体を通して抽出液で覆われていることを確認します。コレクションチューブを予熱乾燥式バスインキュベーターに入れ、10分後に摂氏95度で回収管を10分間インキュベートし、乾燥浴インキュベーターからチューブを取り出します。DNA抽出キットから100マイクロリットルの希釈液を加え、上下にピペットを数回加えることで溶液を混合します。リーフレット抽出についても同じ手順を繰り返します。さらに溶液を混ぜるために振ります。植物の問題は、通常、この治療後に劣化しているようには見えません。液体の色が変わり、曇りになる可能性があります。表1に従ってqPCR器のサーモサイクリング条件を設定し、最初の変性のための一定温度ステップから始まり、25サイクルの増幅が続き、温度ランピングで終わり、高解像度の融解曲線を得る。使用前に、表2に記載されているqPCRマスターミックスとプライマーを解凍します。各井戸にロードされる反応を計画します。標的種との陽性対照を含むウェル、非標的種、サンプルおよび陰性対照を有する陽性対照。この例では、10の井戸が使用され、5つはドイツのカモミール識別試験に用いられ、もう5つはローマのカモミール識別試験のために使用される。各種同定試験の種類ごとに、1つの井戸は、対象種の参照材料から抽出されたDNAを有する陽性対照を含み、1つの井戸は非標的種基準物質から抽出されたDNAを有する陽性対照を含み、2つの井戸はフィールドから抽出された花および葉のDNAサンプルで満たされ、1つの井戸は否定的な対照のために割り当てられる。表 3 は、各ウェル・タイプについて説明しています。各植物種同定試験用に表4に従って反応マスターミックスを用意する。典型的な反応マスターミックスは、普遍的なqPCRマスターミックス、2回、順方向および逆種特異的プライマー、およびヌクレアーゼフリー水が含まれています。使用前にピペッティングして反応マスターミックスを十分に混合した。PCR 反応カートリッジの表面を平らで安定した面に置きます。ここで定義されたウェルに従って、前のステップで構成された反応マスターミックスの18マイクロリットルをカートリッジウェルにロードします。このデモンストレーションでは、ドイツのカモミール同定試験反応マスターミックスをGCテスト用にラベル付けされたウェル、GCTを井戸1、3、5、7、9、およびローマカモミール同定試験反応マスターミックスをRCテスト用にラベル付けされたウェルに、RCTをウェル2、4、6、8、10に追加します。DNA抽出チューブの上清から2マイクロリットルのサンプルDNAを、あらかじめ抽出したDNA陽性制御をqPCRマスターミックスでプリロードされたカートリッジウェルに移します。各DNAテンプレートをqPCRマスターミックスに加えた後、ピペット処理で溶液を軽く混ぜます。カートリッジを粘着フィルムで丁寧に密封します。カートリッジをサーモサイクリング室に積み込み、閉じます。実行する qPCR インストゥルメントを設定します。現在のプロトコルでは、中間色素を使用して、標的断片の増幅をリアルタイムで測定します。Ct値は、蛍光シグナルが事前定義された閾値を超えるために必要なサイクル数として定義されます。25サイクル未満のCt値は、陽性増幅と考えられた。この図では、ローマ陽性対照はローマのカモミール同定試験でのみ増幅されたが、ドイツのカモミール同定試験では増幅されなかった。ドイツのカモミール陽性対照およびフィールドサンプルは、ドイツのカモミール同定試験でのみ増幅されたが、ローマのカモミール同定試験では増幅されなかった。どちらの試験でも陰性対照は増幅されなかった。陽性制御およびサンプルにおける特異的な増幅をさらに確認するために、各ウェルからのPCRおよび産物の画分を実験室で2%アガロースゲルで実行した。Ct値が25未満のすべてのウェルは、ドイツのカモミールとローマのカモミールの間で異なる予想サイズでアンプリコンを生み出しました。残りの車線は、フィールドテストで観察されたこれらのウェルの蛍光シグナルの欠如と一致して、特定の増幅産物を示さなかった。PCR増幅後、蛍光シグナルをモニタリングするために使用したのと同じソフトウェアを用いて融解曲線解析を行った。温度の上昇に伴い、二本鎖アンプリコンは解化を開始し、蛍光強度の低下をもたらす。蛍光強度の変化はさらに、その特徴的な融解ピークによってローマのカモミールからドイツのカモミールをさらに分化するために融解ピーク曲線に変換された。この図では、ドイツのカモミール正の対照の融解ピークは摂氏85.6度であり、それはローマのカモミール正の対照の融解ピークとは異なる。フィールドサンプルのPCRアンプリコンは、ドイツのカモミール陽性制御に近い融解ピークを生成します。フィールドサンプルのアイデンティティは、制御に一致する特定の増幅と特性融解温度に基づいて決定されます。この例では、畑で採取された花と葉の両方が、マトリカリア・シャモミラ、ドイツのカモミールとして識別されます。これら2つのサンプルのローマカモミール試験結果は陰性である。このプロトコルは、携帯用qPCRシステムを使用して、フィールド内のドイツのカモミールの同定を示しています。同様の方法を開発して、テストできる植物のポートフォリオを拡大することができます。このビデオは、現場や限られた実験室機器を持つ環境で植物の同定を行う非専門家でさえ、科学者にとって貴重なトレーニング資料を提供することを願っています。DNAベースのフィールド同定試験は、実験室での分析に一致する高精度な結果を生み出すだけでなく、実験室で行われる従来の方法に関連する時間とコストを削減します。

Research

JoVE Journal

Biology

Field Identification of Matricaria chamomilla using a Portable qPCR System

Long-term Imaging Mammalian Cells using Wide-Field Microscopy

広視野顕微鏡を用いて長期的なイメージング哺乳類細胞

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サーモサイエンティフィックのSolaris定量PCRアッセイを用いて定量的リアルタイムPCR

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ポータブルqPCRシステムを用いた マトリカリアシャモミラ のフィールド同定

ポータブルqPCRシステムを用いたマトリカリアシャモミラのフィールド同定