Name: field identification of matricaria chamomilla using a portable qpcr system
Uploaded: 2020-10-10T12:30:00
Duration: 12 min 8 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Field Identification of Matricaria chamomilla using a Portable qPCR System at JoVE.com

Мы благодарим Джеймса Шана за его усилия в области видеозаписи. Мы благодарим Джона Байрона и Мэтью Семерау за их работу в области редактирования видео. Мы благодарим Ансена Луо, Гарри Ду и Фрэнка Денга за поддержку в поиске испытательного поля. Мы благодарим Марию Рубинских за ценные комментарии по всей рукописи. Все признанные лица являются сотрудниками Herbalife International of America, Inc.

1. Сбор образцов
<ol><li>Настройка испытательного полигона в поле с плоской и горизонтальной поверхностью.</li>
	<li>Определите репрезентативное растение, которое отражает характеристики большинства растений в поле цветка ромашки(рисунок 4).</li>
	<li>Выберите головку цветка от представительного завода используя стерильные перчатки.</li>
	<li>Поместите образец в трубку для сбора 2,0 мл.</li>
	<li>Повторите шаги от 1,3 до 1,4 и соберите листовку (примерно 0,5-0,7 см в длину) с того же растения. ПРИМЕЧАНИЕ: Цветок и лист М. шамомиллы достаточно малы, чтобы сидеть на дне трубки сбора 2,0 мл. Для других растительных растений с большей площадью поверхности, бумажный пунш или ножницы (промытые в 70% этанола до использования) могут быть использованы для изоляции образцов тканей для тестирования. Когда требуется несколько проб, промыть бумажный пунш или ножницы между обработкой различных образцов.</li>
</ol>2. Извлечение ДНК
<ol><li>Разогреть инкубатор сухой ванны до 95 градусов по Цельсию.</li>
	<li>К каждой коллекторной трубке добавьте 100 МКЛ раствора экстракции из набора для извлечения ДНК растений (перечислено в таблице материалов). Для лучшей эффективности извлечения ДНК, молоть образец ткани в экстракции раствора с помощью ткани пестик.</li>
	<li>Закройте трубку. Убедитесь, что ботаническая ткань покрыта раствором экстракции на протяжении всего процесса экстракции.</li>
	<li>Поместите трубки для сбора в разогретый инкубатор сухой ванны и инкубировать трубки коллекции при 95 градусов по Цельсию в течение 10 минут.</li>
	<li>Через 10 минут вынюхив трубки из инкубатора сухой ванны.</li>
	<li>Добавьте 100 МКЛ раствора разбавления из одного и того же набора для извлечения ДНК и смешайте раствор, несколько раз смояв трубку вверх и вниз.</li>
	<li>Повторите тот же шаг для извлечения листовок.</li>
	<li>Встряхните, чтобы смешать раствор дальше. Ткань растения, как правило, не кажется, деградировали после этого лечения. Цвет жидкости может измениться и стать облачным. ПРИМЕЧАНИЕ: Разбавленный раствор может храниться при комнатной температуре на ночь, если не происходит немедленно. Перед хранением не стоит удалять клеточный мусор из растительной ткани. В жидкости в трубках содержится шаблоны ДНК для усиления ПЦР ниже по течению.</li>
</ol>3. Настройка реакции ПЦР
<ol><li>Настройте условия термоцикла прибора qPCR в соответствии со спецификациями производителя. Применить PCR термоциклинг профиль, перечисленный в (Таблица 1), который начинается с постоянной температуры шаг для первоначального денатурации, а затем 25 циклов усиления, и заканчивается повышением температуры, чтобы получить высокое разрешение плавления кривой.</li>
	<li>Оттепель qPCR Мастер Mix и грунтовки (Таблица 2) при комнатной температуре до использования.</li>
	<li>План реакции, которые будут загружены в каждой скважине: скважины, содержащие положительный контроль с целевыми видами, положительный контроль с нецелемых видов, образцы, иотрицательный контроль (рисунок 5).<ol>
<li>В этом примере используется десять скважин : пять для немецкого теста на идентификацию ромашки и остальные пять для римского теста по идентификации ромашки. Для каждого типа теста на идентификацию видов, один хорошо содержит положительный контроль с ДНК, извлеченной из эталонного материала целевых видов, один хорошо содержит положительный контроль с ДНК, извлеченной из справочного материала не целевых видов, две скважины заполнены образцами ДНК цветка и листьев, извлеченными из поля, и одна скважина выделена для отрицательного контроля. Таблица 3 описывает каждый тип хорошо.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Подготовь реакцию мастер-микс в соответствии с руководством для каждого ботанического вида идентификации теста. Типичная реакция мастер-микс содержит универсальный qPCR Master Mix (2x), вперед и обратного видов конкретных грунтовки, и нуклеазы свободной воды. В таблице 4 перечислен состав системы реакции. ПРИМЕЧАНИЕ: Если не использовать немедленно, хранить qPCR реакции мастер-микс при 2 градусов по Цельсию до 8 градусов по Цельсию в кулер или мини-холодильник.</li>
	<li>Тщательно смешать реакцию мастер-микс путем пипетки перед использованием.</li>
	<li>Поместите картридж qPCR лицом вверх на плоскую и стабильную поверхность.</li>
	<li>Загрузите 18 мкл мастер-микса реакции, настроенного в шаге 3.4 в картриджные скважины в соответствии с скважинами, определенными в шаге 3.3. Для этой демонстрации, добавить немецкий ромашки идентификации тест реакции мастер смеси в скважины помечены для испытания GC (GCT в скважинах 1, 3, 5, 7, 9) и римской ромашки идентификации тест реакции мастер-микс в скважины помечены для RC испытаний (RCT в скважинах 2, 4, 6, 8, 10) (см. Рисунок 5).</li>
	<li>Передача 2 МКЛ образцов ДНК из супернатанта трубок для извлечения ДНК и предварительно извлеченных положительных элементов ДНК в картриджные скважины, предварительно загруженные мастер-миксом qPCR. После добавления каждого шаблона ДНК в мастер-микс qPCR, аккуратно смешайте раствор с помощью пипетки. ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте плавающего клеточного мусора при передаче ДНК из трубки извлечения ДНК. При необходимости используйте миницентрифуг для разъегония супернатантного и клеточного мусора.</li>
	<li>Аккуратно загерметив картридж клейкой пленкой. Загрузите картридж на термоциклинговую камеру и закройте его.</li>
	<li>Установите инструмент qPCR для запуска.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Smith, T., Gillespie, M., Eckl, V., Knepper, J., Reynolds, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herbal+supplement+sales+in+US+increase+by+9.4%+in+2018.">Herbal supplement sales in US increase by 9.4% in 2018.</a> HerbalGram. 123, 62-73 (2019).</li><li>Israelsen, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+challenge+of+regulation,+globalization+and+climate+change+on+botanicals+and+traditional+medicines:+respecting+tradition+while+embracing+change.">The challenge of regulation, globalization and climate change on botanicals and traditional medicines: respecting tradition while embracing change.</a> Planta Medica. 74 (3), 36 (2008).</li><li>Cardellina, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+and+opportunities+confronting+the+botanical+dietary+supplement+industry.">Challenges and opportunities confronting the botanical dietary supplement industry.</a> Journal of Natural Products. 65 (7), 1073-1084 (2002).</li><li>Foster, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+peripatetic+maze+of+black+cohosh+adulteration:+a+review+of+the+nomenclature,+distribution,+chemistry,+market+status,+analytical+methods+and+safety.">Exploring the peripatetic maze of black cohosh adulteration: a review of the nomenclature, distribution, chemistry, market status, analytical methods and safety.</a> HerbalGram. 98, 32-51 (2013).</li><li>Vanherweghem, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Misuse+of+herbal+remedies:+The+case+of+an+outbreak+of+terminal+renal+failure+in+Belgium+(Chinese+herbs+nephropathy).">Misuse of herbal remedies: The case of an outbreak of terminal renal failure in Belgium (Chinese herbs nephropathy).</a> The Journal of Alternative and Complementary Medicine. 4 (1), 9-13 (1998).</li><li>Vanherweghem, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapidly+progressive+interstitial+renal+fibrosis+in+young+women:+association+with+slimming+regimen+including+Chinese+herbs.">Rapidly progressive interstitial renal fibrosis in young women: association with slimming regimen including Chinese herbs.</a> The Lancet. 341 (8842), 387-391 (1993).</li><li>Khan, I. A., Smillie, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implementing+a+"quality+by+design"+approach+to+assure+the+safety+and+integrity+of+botanical+dietary+supplements.">Implementing a "quality by design" approach to assure the safety and integrity of botanical dietary supplements.</a> Journal of Natural Products. 75 (9), 1665-1673 (2012).</li><li>Applequist, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Identification of Medicinal Plants: A Handbook of the Morphology of Botanicals in Commerce. , (2006).</li><li>Upton, R., Graff, A., Jolliffe, G., L&#228;nger, R., Williamson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> American Herbal Pharmacopoeia: Botanical Pharmacognosy - Microscopic Characterization of Botanical Medicines. , (2016).</li><li>Frommenwiler, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+HPTLC+fingerprinting+for+quality+control+of+an+herbal+drug+-+the+case+of+angelica+gigas+root.">Comprehensive HPTLC fingerprinting for quality control of an herbal drug - the case of angelica gigas root.</a> Planta Medica. 84 (6-7), 465-474 (2018).</li><li>Heyman, H. M., Meyer, J. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMR-based+metabolomics+as+a+quality+control+tool+for+herbal+products.">NMR-based metabolomics as a quality control tool for herbal products.</a> South African Journal of Botany. 82, 21-32 (2012).</li><li>Lazarowych, N. J., Pekos, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+fingerprinting+and+marker+compounds+for+identification+and+standardization+of+botanical+drugs:+strategies+for+applying+pharmaceutical+HPLC+analysis+to+herbal+products.">Use of fingerprinting and marker compounds for identification and standardization of botanical drugs: strategies for applying pharmaceutical HPLC analysis to herbal products.</a> Drug Information Journal. 32 (2), 497-512 (1998).</li><li>Tankeu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperspectral+imaging+and+support+vector+machine:+a+powerful+combination+to+differentiate+black+cohosh+(actaea+racemosa)+from+other+cohosh+species.">Hyperspectral imaging and support vector machine: a powerful combination to differentiate black cohosh (actaea racemosa) from other cohosh species.</a> Planta Medica. 84 (6-7), 407-419 (2018).</li><li>Rodman, J. E., Cody, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+taxonomic+impediment+overcome:+NSF's+Partnerships+for+Enhancing+Expertise+in+Taxonomy+(PEET)+as+a+model.">The taxonomic impediment overcome: NSF's Partnerships for Enhancing Expertise in Taxonomy (PEET) as a model.</a> Systematic Biology. 52 (3), 428-435 (2003).</li><li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+renaissance+in+herbal+medicine+identification:+from+morphology+to+DNA.">A renaissance in herbal medicine identification: from morphology to DNA.</a> Biotechnology Advances. 32 (7), 1237-1244 (2014).</li><li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+DNA+barcoding:+from+gene+to+genome.">Plant DNA barcoding: from gene to genome.</a> Biological Reviews. 90 (1), 157-166 (2015).</li><li>Madesis, P., Ganopoulos, I., Sakaridis, I., Argiriou, A., Tsaftaris, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+of+DNA-based+methods+for+tracing+the+botanical+origin+of+food+products.">Advances of DNA-based methods for tracing the botanical origin of food products.</a> Food Research International. 60, 163-172 (2014).</li><li>Newmaster, S. G., Ragupathy, S., Janovec, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+botanical+renaissance:+state-of-the-art+DNA+bar+coding+facilitates+an+automated+identification+technology+system+for+plants.">A botanical renaissance: state-of-the-art DNA bar coding facilitates an automated identification technology system for plants.</a> International Journal of Computer Applications in Technology. 35 (1), 50-60 (2009).</li><li>Parveen, I., Gafner, S., Techen, N., Murch, S. J., Khan, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+barcoding+for+the+identification+of+botanicals+in+herbal+medicine+and+dietary+supplements:+strengths+and+limitations.">DNA barcoding for the identification of botanicals in herbal medicine and dietary supplements: strengths and limitations.</a> Planta Medica. 82 (14), 1225-1235 (2016).</li><li>Agrawal, N., Hassan, Y. A., Ugaz, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pocket-sized+convective+PCR+thermocycler.">A pocket-sized convective PCR thermocycler.</a> Angewandte Chemie International Edition. 46 (23), 4316-4319 (2007).</li><li>Almassian, D. R., Cockrell, L. M., Nelson, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Portable+nucleic+acid+thermocyclers.">Portable nucleic acid thermocyclers.</a> Chemical Society Reviews. 42 (22), 8769-8798 (2013).</li><li>Ben&#237;tez-P&#225;ez, A., Portune, K. J., Sanz, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Species-level+resolution+of+16S+rRNA+gene+amplicons+sequenced+through+the+MinION+portable+nanopore+sequencer.">Species-level resolution of 16S rRNA gene amplicons sequenced through the MinION portable nanopore sequencer.</a> Gigascience. 5 (1), 4 (2016).</li><li>Emanuel, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+Francisella+tularensis+within+infected+mouse+tissues+by+using+a+hand-held+PCR+thermocycler.">Detection of Francisella tularensis within infected mouse tissues by using a hand-held PCR thermocycler.</a> Journal of Clinical Microbiology. 41 (2), 689-693 (2003).</li><li>Quick, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time,+portable+genome+sequencing+for+Ebola+surveillance.">Real-time, portable genome sequencing for Ebola surveillance.</a> Nature. 530 (7589), 228 (2016).</li><li>Lu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-laboratory+validation+of+a+two-tiered+DNA+barcoding+method+for+raw+botanical+identification.">Single-laboratory validation of a two-tiered DNA barcoding method for raw botanical identification.</a> Journal of AOAC International. 102 (5), 1435-1447 (2019).</li><li>Sgamma, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+barcoding+for+industrial+quality+assurance.">DNA barcoding for industrial quality assurance.</a> Planta Medica. 83 (14-15), 1117-1129 (2017).</li><li>Wallinger, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+plant+identification+using+species-and+group-specific+primers+targeting+chloroplast+DNA.">Rapid plant identification using species-and group-specific primers targeting chloroplast DNA.</a> PLoS One. 7 (1), 29473 (2012).</li><li>Newmaster, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recommendations+for+validation+of+real-time+PCR+methods+for+molecular+diagnostic+identification+of+botanicals.">Recommendations for validation of real-time PCR methods for molecular diagnostic identification of botanicals.</a> Journal of AOAC International. , (2019).</li><li>Singh, O., Khanam, Z., Misra, N., Srivastava, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chamomile+(Matricaria+chamomilla+L.):+an+overview.">Chamomile (Matricaria chamomilla L.): an overview.</a> Pharmacognosy Reviews. 5 (9), 82 (2011).</li><li>Mills, S. Y., Bone, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Essential+Guide+to+Herbal+Safety.">The Essential Guide to Herbal Safety.</a> Elsevier Health Sciences. , 325 (2004).</li><li>Avula, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+determination+of+phenolic+compounds+by+UHPLC-UV-MS+and+use+of+partial+least-square+discriminant+analysis+to+differentiate+chemo-types+of+Chamomile/Chrysanthemum+flower+heads.">Quantitative determination of phenolic compounds by UHPLC-UV-MS and use of partial least-square discriminant analysis to differentiate chemo-types of Chamomile/Chrysanthemum flower heads.</a> Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 88, 278-288 (2014).</li><li>Guzelmeric, E., Vovk, I., Yesilada, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+validation+of+an+HPTLC+method+for+apigenin+7-O-glucoside+in+chamomile+flowers+and+its+application+for+fingerprint+discrimination+of+chamomile-like+materials.">Development and validation of an HPTLC method for apigenin 7-O-glucoside in chamomile flowers and its application for fingerprint discrimination of chamomile-like materials.</a> Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 107, 108-118 (2015).</li><li>Dieffenbach, C. W., Lowe, T. M., Dveksler, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+concepts+for+PCR+primer+design.">General concepts for PCR primer design.</a> Genome Research. 3 (3), 30-37 (1993).</li><li>Untergasser, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primer3Plus,+an+enhanced+web+interface+to+Primer3.">Primer3Plus, an enhanced web interface to Primer3.</a> Nucleic Acids Research. 35, 71-74 (2007).</li><li>Bustin, S., Huggett, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=qPCR+primer+design+revisited.">qPCR primer design revisited.</a> Biomolecular Detection and Quantification. 14, 19-28 (2017).</li><li>Brownie, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+elimination+of+primer-dimer+accumulation+in+PCR.">The elimination of primer-dimer accumulation in PCR.</a> Nucleic Acids Research. 25 (16), 3235-3241 (1997).</li><li>Dwight, Z., Palais, R., Wittwer, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=uMELT:+prediction+of+high-resolution+melting+curves+and+dynamic+melting+profiles+of+PCR+products+in+a+rich+web+application.">uMELT: prediction of high-resolution melting curves and dynamic melting profiles of PCR products in a rich web application.</a> Bioinformatics. 27 (7), 1019-1020 (2011).</li><li>Heikrujam, J., Kishor, R., Mazumder, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemistry+behind+plant+DNA+isolation+protocols.">The chemistry behind plant DNA isolation protocols.</a> Biochemical Analysis Tools - Methods for Bio-Molecules Studies. , (2020).</li><li>Blum-Silva, C. H., Chaves, V. C., Schenkel, E. P., Coelho, G. C., Reginatto, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+leaf+age+on+methylxanthines,+total+phenolic+content,+and+free+radical+scavenging+capacity+of+Ilex+paraguariensis+aqueous+extracts.">The influence of leaf age on methylxanthines, total phenolic content, and free radical scavenging capacity of Ilex paraguariensis aqueous extracts.</a> Revista Brasileira de Farmacognosia. 25 (1), 1-6 (2015).</li><li>Lu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+a+targeted+PCR+method+for+raw+and+processed+botanical+material+identification:+an+example+using+matricaria+chamomilla+(chamomile).">Validation of a targeted PCR method for raw and processed botanical material identification: an example using matricaria chamomilla (chamomile).</a> Journal of AOAC International. 102 (6), 1787-1797 (2019).</li></ol>

Мы подтверждаем, что Чжэнсяу Ян, Чжэн Цюань, Тиффани Чуа, Лео Ли, Янцзюнь Чжан, Сильва Бабаджанян, Триша Чуа, Питер Чанг, Гэри Свонсон, Чжэнфэй Лу являются сотрудниками Herbalife International of America, Inc. Мы подтверждаем, что Франческо Буонджорно, Изабелла Делла Ноче и Лоренцо Коломбо являются сотрудниками Hyris Ltd., которая производит портативный инструмент qPCR, используемый в данной статье.

Проектирование грунтовок и выбор шаблонов являются важнейшими шагами в получении эффективного и специфического усиления qPCR. После определения подходящего шаблона, грунтовка дизайн программного обеспечения, как правило, используется для оказания помощи выбор грунтовки на основе переменных дизайна, таких как грунтовка длины, температура плавления, исодержание GC 33,34. Оптимизация и проверка могут быть выполнены в ожидаемых экспериментальных условиях анализа для обеспечения специфичности, чувствительности и надежности реакции ПЦР35. Субоптимальный дизайн грунтовки может привести к образованию грунтовки-димера, в результате чего взаимодействия грунтовки производят неспецифическиепродукты 36.
Нет шаблон управления (NTC), используемых в этом исследовании проверить как загрязнение ДНК и наличие грунтовки-димеры, которые могут повлиять на анализ. Результаты не показали никакого усиления, хороший признак того, что как загрязнение ДНК и грунтовки-димеры не являются проблемой. Загрязнение ДНК и грунтовки-димеры проявляются в кривых расплава без элементов управления шаблонами, а также в качестве дополнительных пиков в кривых расплава положительных элементов управления. Как правило, кривая расплава положительного контроля, как ожидается, будет содержать один пик, если БОГАТЫе AT субдомени в шаблоне вызывают неравномерное таяние. Двойные пики можно предсказать, имитируя анализы плавления с помощью программного обеспечения uMELT37. В этом исследовании, золотой стандарт запуска продукта ПЦР на агарозный гель был использован для подтверждения наличия целевого продукта ПЦР и отсутствие загрязнения и грунтовки-димеры.
Значительной проблемой в молекулярном анализе ботанического материала является получение высококачественной ДНК после ботанического процесса извлечения ДНК. Ботанические материалы торгуются и потребляются для активных химических соединений, которые связаны с пользой для здоровья. В процессе извлечения ДНК, эти химические соединения будут также выпущены в раствор извлечения ДНК, потенциально вызывая ингибирование ПЦР, тем самым приводя к сбоям в усилении ПЦР. Различные наборы очистки ДНК растений с использованием органических растворителей и колонн были разработаны для удаления химических соединений, полученных израстительных 38. Тем не менее, дым капот и высокоскоростные центрифуги, необходимые для оказания помощи эти комплекты не доступны в этой области.
В действующем протоколе упрощенный метод извлечения ДНК использует коммерческий набор для извлечения ДНК растений (подробнее см. таблицу материалов). Он имел способность нейтрализовать общие ингибирующие вещества для воспроизводимых результатов и производил последовательные результаты для M. chamomilla и C. nobile. И M. chamomilla и C. nobile цветочные головки и листья дали ПЦР ампликонов с конкретными пиками расплава, что свидетельствует о том, что наличие ингибиторов ПЦР не было проблемой. Для других растений с более высоким уровнем ингибиторов ПЦР, усиление ДНК в их первоначальной экстракции может быть менее эффективным. Для снижения ингибирования и повышения эффективности усиления, с доступом ко всему заводу, другие части растений с более низким содержанием полисахарида и полифенола также могут быть использованы для целей идентификации. Если есть ограниченный доступ к различным частям растений, молодые листья или лепестки, расчлененные из цветочных голов, которые, как правило, имеют более низкоесодержание фенола 39, может предложить больше шансов на успех. Так как последовательности ДНК являются последовательными по всему растению, любая часть растения может быть использована для подтверждения идентичности вида. Если усиление ПЦР все еще неоптимальным, оригинальный экстракт ДНК может быть дополнительно разбавлен до ПЦР, или более сложные протоколы лабораторной очистки могут быть использованы.
Еще одной проблемой для анализа ПЦР являются ложноположимые результаты, вызванные загрязнением ДНК, что может негативно сказаться на интерпретации данных. Обычно он контролируется активным ведением домашнего хозяйства, использованием специального оборудования и ограничением работы в специально отведенных местах. Используя qPCR, весь анализ ПЦР может быть выполнен в закрытой системе, что значительно снижает вероятность загрязнения ПЦР ампликона в среде, которая недостаточно хорошо контролируется. Кроме того, экологическая ДНК также не должна показывать ложноположительный из-за специфики анализа, согласно предыдущему исследованию проверки40.
Есть возможности для совершенствования. В представленном здесь протоколе интеркалирование красителя использовалось для доказательства усиления фрагмента цели в режиме реального времени. Специфика метода подтверждается характерной температурой плавления, которая отличается между M. chamomilla и C. nobile amplicons. Таким образом, интеркалирование ПЦР на основе красителя может эффективно ответить на вопрос "Что это за вид растений?" в этой области. Однако, помимо необходимости проведения ботанической идентификации на одном заводе, изолированном от поля, во многих случаях ботанические порошки или экстракты на складе также выиграют от быстрой оценки личности на месте. Для этих типов материалов, дополнительные вопросы, возможно, должны быть рассмотрены, такие как "Что в этом материале?", "Содержит ли он ботанических видов я ищу?", "Есть ли в нем прелюбодеяния я хочу избежать?", И "Является ли он заменить полностью или частично других ботанических видов, которые являются вредными?". Вместо того, чтобы использовать интеркалирующий краситель, различные зонды qPCR могут быть предназначены для целевой ампликонов из различных растительных в одной системе реакции, сохраняя при этом высокую специфичность и эффективность анализа. Разработка зонда на основе qPCR и использование портативной системы qPCR, которая предлагает несколько обнаружения каналов, может еще больше расширить применение полевых испытаний в качестве пригодного для использования анализа в более широких условиях, таких как склады ботанических материалов и распределительные центры, чтобы ответить на более сложные вопросы. Кроме того, использование нескольких зондов также позволяет пользователю включать внутреннее усиление в каждую систему реакции, так что больше информации будет доступно, когда ПЦР ингибирование подозревается.
Представленный здесь протокол имеет следующие преимущества по сравнению с существующими технологиями, используемыми для той же цели. Во-первых, для традиционных методов морфологической и химической идентификации процедура и ее результаты должны проводиться и интерпретироваться экспертами. Идентификационные тесты на основе qPCR могут проводиться людьми с базовой молекулярной биологией и интерпретироваться более стандартизированным образом. Во-вторых, по сравнению с идентификацией и дифференциацией видов на основе qPCR, обычно выполняемой в лаборатории, протокол идентификации поля с использованием портативного инструмента не требует инструментов с большим следом, таких как высокоскоростная центрифуга, оборудование для оценки качества ДНК, тепловой циклер с детектором флуоресценции и компьютер, работающий под специальным программным обеспечением. Таким образом, идентификация видов на основе ДНК может быть выполнена в любой обстановке без промедления. В-третьих, поиск ботанических материалов является задачей, которая требует глобальной работы. С достижениями в области облачных сервисов и искусственного интеллекта, портативное устройство потенциально может получать методы, разработанные и проверенные экспертами в лаборатории, управляться не-экспертами в отдаленных районах, и производить объективные сертификаты от третьих сторон. Таким образом, этот вариант является более убедительным, чем когда-либо с удаленной работы становится тенденцией.
Таким образом, протокол здесь продемонстрировал поле идентификации М. chamomilla с помощью портативной системы qPCR. Успешное применение этого метода даст очень точные результаты по ботанической идентификации и поможет ботаническим производителям и поставщикам своевременно и экономически эффективно квалифицировать ботанические материалы.

Практика использования растительных растений для поддержания и улучшения здоровья восходит к тысячам лет. Из-за напряжений на цепочку поставок,вызванную повышенным потребительским спросом 1,неустойчивой практикойуборки урожая и изменением климата 2,ботаническая фальсификация становится растущей проблемой в пищевой и пищевой промышленностидобавок 3. Наличие необъявленных или неправильно идентифицированных ботанических видов может привести к снижению эффективности или даже к проблемам безопасности. Например, черный кохош(Actaea racemosa),используемый для лечения предменструального дискомфорта, может быть заменен недорогими азиатскими видами с ограниченной клинической поддержкой данных дляего эффективности 4. В более серьезном случае, замена Aristolochia fangchi для Стефании terandra в клиническом исследовании для потери веса с использованием китайских трав привело к тяжелой нефротоксичности и почечной недостаточности у некоторыхучастников 5,6. Два разных вида имеют китайское общее название "Fang Ji". Эти случаи подчеркивают необходимость более строгого контроля качества, начиная с идентификациисырья 7,предпочтительно как можно ближе к точке происхождения цепочки поставок, чтобы ресурсы могли эффективно распределяться на материал правильной идентификации.
Для ботанической идентификации можно использовать ряд ортогональных подходов. Традиционно, ботаническая идентификация проводится с помощьюморфологической оценки 8,,9 и химическиханалитических методов10,11,,12,,13. Морфологическая идентификация основана на различиях в макроскопических и микроскопических особенностях растительных материалов, если существуют различия(рисунок 1). Однако отсутствие учебных программ по классической ботанике в последние годы привело к нехваткеспециалистов 14,что делает такой подход нецелесообразным для регулярного контроля качества. Его применение в порошковых ботанических материалах также ограничено. Химические аналитические методы широко используются в фармакопеях и лабораториях, но не идеально подходят для полевых испытаний из-за размера таких инструментов, как высокопроизводительность тонкого слоя хроматографии (HPTLC), высокой производительности жидкой хроматографии (HPLC), и ядерной магнитно-резонансной спектроскопии (NMR) (Рисунок 2), и требования к окружающей среде. В последнее время геномные методы стали альтернативным методом аутентификации и обнаружения замещения ботанических видов и доказали свою эффективность и точное использование. Геномные методы используют высокую точность и специфичность генетической информациив растительных материалах 15,,16,,17,,18,,19. Молекулярно-диагностические инструменты доступны в виде портативных устройств, и часто включают автоматизированные инструменты интерпретации данных, которые снижают барьер для использования технологии, что делает этот подходидеальным для идентификации поля 20,,21,,22,23,24. После того, как метод молекулярного анализа был разработан и проверен25,26,27, он может быть выполнен любым персоналом с базовой молекулярной биологии подготовки. Среди различных портативных инструментов, доступных, в режиме реального времени ПЦР на последовательности ДНК является одним из экономически эффективныхвариантов 28. Сочетание портативного устройства, наряду с индивидуальным и проверенным молекулярным анализом, позволяет проверить ботанические виды и ингредиенты за пределами лаборатории, например, на фермах и складах ботанических материалов, сокращая время и затраты, связанные с традиционными методами.
Цель этого протокола заключается в внедрении метода ботанической идентификации в ситуациях, когда доступ к лабораторному оборудованию и экспертизе ограничен или недоступен с использованием портативной системы qPCR. Метод продемонстрирован на поле ромашки Matricaria (рисунок 3A), широко известный как немецкая ромашка, широко используется для его противовоспалительные и антиоксидантныесвойства 29. Его можно спутать с родственными видами аналогичной внешности или запаха, особенно с родами Chamaemelum, Tanacetumи Chrysanthemum30,,31,,32. Среди родственных видов, Chamaemelum nobile, также известный как римская ромашка, является заметным с сопоставимыми уровнями производства в торговле (Рисунок 3B). Продемонстрированная методика была разработана не только для идентификации целевого ботанического вида M. chamomilla, но идля обнаружения его близкого родственника, C. nobile,на основе специфического усиления последовательностей ДНК.
В этой статье подробно объясняется, как выполнить полевую ботаническую идентификацию M. chamomilla с помощью интеркаляции красителя на основе qPCR и анализа кривой расплава на портативном устройстве. Протокол включает в себя сбор ботанических образцов с поля, удаление ДНК на месте, а также создание реакции ПЦР в режиме реального времени. Для обеспечения обоснованного заключения в качестве положительного контроля используются целевые ботанические M. chamomilla и нецелеприбынные ботанические геномные ДНК C. nobile, предварительно извлеченные из сертифицированных ботанических справочных материалов. Специфика этого метода демонстрируется путем проведения как М. шамомиллы, так и C. nobile идентификационных тестов индивидуально на образцах и контрольных данных. Не-шаблон отрицательный контроль используется для исключения ложноположимых результатов, вызванных загрязнением ПЦР.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Battery</td>
			<td>TNE</td>
			<td>78000mAh</td>
			<td>Provide field power supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bCUBE</td>
			<td>HYRIS</td>
			<td>bCUBE 2.0</td>
			<td>Portable qPCR instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cartridges(16 Well)</td>
			<td>HYRIS</td>
			<td>NA</td>
			<td>Consumables for bCUBE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electric pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>NA</td>
			<td>Handling liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extract-N-AmpTM plant PCR kit</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>XNAP2-1KT</td>
			<td>Plant DNA extraction kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>German chamomile (Matricaria chamomilla L) flower botanical reference materials</td>
			<td>AHP</td>
			<td>2264</td>
			<td>Used as positive control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini dry bath</td>
			<td>Yooning</td>
			<td>MiniH-100L</td>
			<td>For DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>AMBION</td>
			<td>AM9937</td>
			<td>qPCR reaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NA</td>
			<td>qPCR reaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roman chamomile (Chamaemelum nobile) flower botancial reference materials</td>
			<td>ChromaDex</td>
			<td>ASB-00030806-005</td>
			<td>Used as positive control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luna universal qPCR master mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M3003L</td>
			<td>qPCR reaction</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

field identification of matricaria chamomilla using a portable qpcr system

Контроль качества в ботанической продукции начинается с поставок сырья. Традиционно ботаническая идентификация проводится с помощью морфологической оценки и химических аналитических методов. Однако отсутствие наличия ботаников, особенно в последние годы, в сочетании с необходимостью усиления контроля качества для борьбы с нагрузками на цепочку поставок, обусловленной ростом потребительского спроса и изменением климата, требует альтернативных подходов. Цель этого протокола заключается в облегчении идентификации ботанических видов с помощью портативной системы кЗКПЧ на местах или в любых условиях, где доступ к лабораторному оборудованию и экспертизе ограничен. Целевая ДНК усиливается с помощью qPCR на основе красителя, при этом ДНК извлекается из ботанических справочных материалов, выступающей в качестве положительного контроля. Целевая ДНК идентифицируется по ее специфическому усилению и соответствию ее пика плавления положительному контролю. Для обеспечения того, чтобы читатели могли воспроизвести этот протокол, было включено подробное описание шагов и параметров, от практического сбора образцов на местах до извлечения ДНК, усиления ПЦР с последующим толкованием данных. Подготовленные результаты согласуются с традиционными методами лабораторной ботанической идентификации. Протокол прост в работе и рентабельн, что позволяет проводить качественное тестирование сырья как можно ближе к точке происхождения цепочки поставок.

Watch this Scientific Journal Video about Field Identification of Matricaria chamomilla using a Portable qPCR System at JoVE.com

Field Identification of Matricaria chamomilla using a Portable qPCR System

Здесь представлен протокол для полевой идентификации Matricaria chamomilla с использованием портативной системы qPCR. Этот простой в работе протокол идеально подходит как метод подтверждения идентичности ботанического вида в местах, где доступ к лабораторному оборудованию и экспертизе ограничен, таких как фермы и склады.

Полевая идентификация ромашки Matricaria с помощью портативной системы qPCR

Quality control in botanical products begins with the raw material supply. Traditionally, botanical identification is performed through morphological ...

Практика использования растительных растений для улучшения здоровья восходит тысячи лет. В последнее время возросшей спрос в сочетании с неустойчивой практикой уборки урожая и изменением климата сделал все возможное для цепочки поставок. Из-за этого, ботаническая фальсификация становится растущей проблемой, что делает ботаническую идентификацию все более важной частью контроля качества.В идеале идентификация выполняется как можно ближе к источнику, поэтому ресурсы могут быть эффективно распределены на материал правильной идентификации. Существует ряд подходов к ботанической идентификации. Традиционно ботаническая идентификация проводится с помощью морфологической оценки и химических аналитических методов.Морфологическая идентификация основана на различиях в макроскопических и микроскопических особенностях растительных материалов. Тем не менее, он требует хорошо обученный ботаник и его применение к порошкообразным растительным материалам ограничено. Химические аналитические методы широко используются в фармакопеях и лабораториях, но не идеально подходят для полевых испытаний из-за размера приборов и потребностей в окружающей среде.В последнее время геномные методы стали альтернативным методом идентификации ботанических видов из-за высокой точности и специфичности геномной информации в растительных материалах. С помощью молекулярно-диагностических инструментов, доступных в виде портативных устройств, этот подход становится возможным для применения на местах. Цель этого протокола заключается в внедрении метода ботанической идентификации в ситуациях, когда доступ к лабораторному оборудованию и экспертизе ограничен, например, ферма, поставляющей ботанический материал, с использованием портативной системы qPCR.Matricaria ромашки, широко известный как немецкая ромашка, был использован в качестве травяного лекарства для укрепления здоровья на протяжении веков. Чтобы продемонстрировать специфику нынешнего метода, для сравнения включена дифференциация немецкой ромашки от другого широко используемого цветка ромашки, известного как римская ромашка. Процедура идентификации поля продемонстрирована в середине немецкой фермы ромашки.Настройка испытательного полигона в поле с плоской и горизонтальной поверхностью. Определите репрезентативное растение, отражающее характеристики большинства растений в ромашковом цветочном поле. Выберите головку цветка от представительного завода используя стерильные перчатки.Поместите образец в трубку сбора 2,0 миллилитров. Повторите и соберите листовку длиной от 0,5 до 0,7 сантиметра от того же растения. Разогреть инкубатор сухой ванны до 95 градусов по Цельсию.К каждой коллекторной трубке добавьте 100 микролитров раствора экстракции из набора для извлечения ДНК растения. Для лучшей эффективности извлечения ДНК, молоть образец с помощью ткани пестик. Закройте трубку.Убедитесь, что ботаническая ткань покрыта раствором экстракции на протяжении всего процесса экстракции. Поместите трубки коллекции в разогретый инкубатор сухой ванны и инкубировать трубки сбора при 95 градусах по Цельсию в течение 10 минут После 10 минут, возьмите трубки из инкубатора сухой ванны. Добавьте 100 микролитров раствора разбавления из набора для экстракции ДНК и смешайте раствор, несколько раз смахив трубку вверх и вниз.Повторите тот же шаг для извлечения листовок. Встряхните, чтобы смешать раствор дальше. Проблема растений, как правило, не кажется, деградировали после этой обработки.Цвет жидкости может измениться и стать облачным. Настройте условия термоциклирования прибора qPCR в соответствии с таблицей, которая начинается с постоянного шага температуры для первоначальной денатурации, а затем 25 циклов усиления и заканчивается повышением температуры для получения кривой плавления с высоким разрешением. Оттепель qPCR мастер смеси и грунтовки, перечисленные в таблице два при комнатной температуре до использования.План реакции, которые будут загружены в каждой хорошо. Скважины, содержащие положительный контроль с целевыми видами, положительный контроль с нецелеми видами, образцы и отрицательный контроль. В этом примере используются 10 скважин, пять для немецкого теста на идентификацию ромашки и еще пять для римского теста на идентификацию ромашки.Для каждого типа теста на идентификацию видов, один хорошо содержит положительный контроль с ДНК, извлеченной из целевого вида справочного материала, один хорошо содержит положительный контроль с ДНК, извлеченной из не целевых видов справочного материала, две скважины заполнены цветок и лист ДНК образцов, извлеченных из поля, и один хорошо выделяется для отрицательного контроля. Таблица 3 описывает каждый тип хорошо. Подготовьте смесь мастера реакции согласно таблице 4 для каждого теста идентификации ботанических видов.Типичная смесь мастера реакции содержит универсальный qPCR мастер смесь, два раза, вперед и обратного вида конкретных грунтовки, и нуклеазы свободной воды. Тщательно смешанные реакции мастер смесь трубопроводов перед использованием. Поместите картридж реакции ПЦР лицом вверх на плоскую и стабильную поверхность.Загрузите 18 микролитров смеси мастера реакции, настроенной на предыдущем шаге в картриджные скважины в соответствии с скважинами, определенными здесь. Для этой демонстрации, добавить немецкий ромашки идентификации тест реакции мастер смесь в скважины помечены для испытания GC, GCT в скважинах один, три, пять, семь, девять, и римской ромашки идентификации тест реакции мастер смеси в скважины помечены для RC тест, RCT в скважинах два, четыре, шесть, восемь, 10. Передача двух микролитров образцовой ДНК из супернатантов трубок извлечения ДНК и предварительно извлеченного положительного контроля ДНК в картриджные скважины, предварительно загруженные мастер-миксом qPCR.После добавления каждого шаблона ДНК в мастер-микс qPCR, аккуратно смешайте раствор с помощью пипетки. Аккуратно загерметив картридж клейкой пленкой. Загрузите картридж на термоциклинговую камеру и закройте его.Установите инструмент qPCR для запуска. В текущем протоколе интеркалирующий краситель используется для измерения усиления фрагментов мишени в режиме реального времени. Значение Ct определяется как количество циклов, необходимых для того, чтобы флуоресцентный сигнал пересек заранее определенный порог.Значение Ct менее 25 циклов было рассмотрено как положительное усиление. На этом рисунке римский положительный контроль был усилен только в римском тесте на идентификацию ромашки, но не в немецком тесте на идентификацию ромашки. Немецкий положительный контроль ромашки и пробы поля были только усилены в немецком тесте идентификации ромашки, но не в римском тесте идентификации ромашки.Отрицательный контроль не был усилен ни в одном из испытаний. Для дальнейшего подтверждения специфического усиления в положительном контроле и образцах, фракции ПЦР и продуктов из каждой колодец были запущены на 2%agarose гель в лаборатории. Все скважины со значением Ct менее 25 дали ампликонов при ожидаемых размерах, которые отличаются между немецкой ромашкой и римской ромашкой.Остальные полосы движения не показали никакого конкретного продукта усиления, в связи с отсутствием флуоресцентного сигнала для этих скважин, как это наблюдалось в ходе полевых испытаний. После усиления ПЦР анализ кривой плавления проводился с использованием того же программного обеспечения, которое использовалось для мониторинга флуоресцентного сигнала. С повышением температуры двухтысячие ампликации начинают разобщаться, что приводит к снижению интенсивности флуоресценции.Изменения интенсивности флуоресценции были дополнительно преобразованы в кривые пика плавления для дальнейшей дифференциации немецкой ромашки от римской ромашки по их характерным пикам плавления. На этом рисунке пик плавления немецкой ромашки положительного контроля составляет 85,6 градуса по Цельсию и отличается от таяния пика римской ромашки положительным контролем. ПЦР-ампликоны из полевых образцов производят пики плавления вблизи положительного контроля над немецкой ромашкой.Идентификация образца поля определяется на основе специфического усиления и характерной температуры плавления, которая соответствует контролю. В этом примере, как цветок и лист, собранные в поле определены как Matricaria ромашки, немецкая ромашка. Результаты римского теста ромашки для этих двух образцов являются отрицательными.Протокол демонстрирует идентификацию немецкой ромашки в полевых условиях с помощью портативной системы qPCR. Подобные методы мы можем разработать, чтобы расширить портфолио растительных, которые могут быть проверены. Мы надеемся, что это видео обеспечит ценные учебные материалы для ученых, даже не-экспертов для выполнения ботанической идентификации в полевых условиях или в среде с ограниченным лабораторным оборудованием.Тестирование на основе ДНК на местах не только дает очень точные результаты, которые соответствуют лабораторному анализу, но и сокращают время и затраты, связанные с традиционными методами, выполняемыми в лаборатории.

Research

JoVE Journal

Biology

Field Identification of Matricaria chamomilla using a Portable qPCR System

Long-term Imaging Mammalian Cells using Wide-Field Microscopy

Долгосрочные изображений клетках млекопитающих использованием широкого поля микроскопии

Quantitative Real-Time PCR using the Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

Количественный ПЦР в реальном времени использованием Thermo Scientific Solaris КПЦР Пробирной

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and ...

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR (qPCR) Arrays

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR qPCR Arrays

Профилирование Предварительно микро-РНК и микроРНК с использованием количественных ПЦР в реальном времени (КПЦР) Массивы

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower ...

Visualization of Caenorhabditis elegans Cuticular Structures Using the Lipophilic Vital Dye DiI

Visualization of Caenorhabditis elegans Cuticular Structures Using the Lipophilic Vital Dye DiI

Визуализация Caenorhabditis Elegans Кутикулы структур с помощью липофильных Vital краска, DII

The cuticle of C. elegans is a highly resistant structure that surrounds the exterior of the animal1-4. The cuticle not only protects the animal from the ...

Identification of Protein Interacting Partners Using Tandem Affinity Purification

Идентификация белка взаимодействие партнеров, используя тандем аффинной очистки

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein ...

Pyrosequencing for Microbial Identification and Characterization

Пиросеквенирования для идентификации микроорганизмов и характеристика

Pyrosequencing is a versatile technique that facilitates microbial genome sequencing that can be used to identify bacterial species, discriminate ...

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

Обнаружение эфир<em&gt; Кишечная палочка</em&gt; O157: H7 Клетки по PMA-кПЦР

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. ...

A Strategy for Sensitive, Large Scale Quantitative Metabolomics

Стратегия для чувствительной, крупномасштабного Количественные Metabolomics

Metabolite profiling has been a valuable asset in the study of metabolism in health and disease. However, current platforms have different limiting ...

qPCR Is a Sensitive and Rapid Method for Detection of Cytomegaloviral DNA in Formalin-fixed, Paraffin-embedded Biopsy Tissue

КПЦР является чувствительным и быстрый метод для обнаружения цитомегаловирусной ДНК в формалине фиксированной парафин биопсии ткани

It is crucial to identify cytomegalovirus (CMV) infection in the gastrointestinal (GI) tract of immunosuppressed patients, given their greater risk for ...

Identification of Kinase-substrate Pairs Using High Throughput Screening

Идентификация киназы-подложки пар Использование высокопроизводительного скрининга


We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel ...