Name: field identification of matricaria chamomilla using a portable qpcr system
Uploaded: 2020-10-10T12:30:00
Duration: 12 min 8 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Field Identification of Matricaria chamomilla using a Portable qPCR System at JoVE.com

James Shan'a saha video kaydındaki çabaları için teşekkür ederiz. Biz video düzenleme çalışmaları için Jon Byron ve Matthew Semerau teşekkür ederiz. Ansen Luo, Harry Du ve Frank Deng'e test alanının yerini belirlemedeki desteklerinden dolayı teşekkür ederiz. Maria Rubinsky'ye tüm el yazması hakkındaki değerli yorumları için teşekkür ederiz. Kabul edilen tüm kişiler Herbalife International of America, Inc. şirketinin çalışanlarıdır.

1. Örnek toplama
<ol><li>Düz ve yatay bir yüzeye sahip bir test alanı ayarlayın.</li>
	<li>Papatya çiçeği alanındaki bitkilerin çoğunluğunun özelliklerini yansıtan temsili bir bitki tanımlayın(Şekil 4).</li>
	<li>Steril eldiven kullanarak temsili bitki bir çiçek kafası seçin.</li>
	<li>Numuneyi 2,0 mL toplama tüpüne yerleştirin.</li>
	<li>1,3 ila 1,4 adımlarını tekrarlayın ve aynı bitkiden bir broşür (yaklaşık 0,5-0,7 cm uzunluğunda) toplayın. NOT: M. papatya çiçeği ve yaprağı 2.0 mL toplama tüpünün altında oturacak kadar küçüktür. Daha geniş yüzey alanına sahip diğer botanikler için, bir kağıt zımba veya makas (kullanmadan önce% 70 etanol içinde durulanır) test için doku örnekleri izole etmek için kullanılabilir. Birden fazla örnekleme gerektiğinde, farklı numunelerin işlenmesi arasında kağıt zımbaveya makas durulayın.</li>
</ol>2. DNA çıkarma
<ol><li>Kuru banyo kuluçka makinesini 95 °C'ye önceden ısıtın.</li>
	<li>Her toplama tüpüne, bitki DNA ekstraksiyon kitinden 100 μL çıkarma çözeltisi ekleyin (Malzeme Tablosu'ndalistelenmiştir). Daha iyi DNA ekstraksiyon verimliliği için, bir doku pestle kullanarak ekstraksiyon çözeltisi doku örneği eziyet.</li>
	<li>Tüpü kapatın. Botanik doku çıkarma işlemi boyunca ekstraksiyon çözeltisi ile kaplı olduğundan emin olun.</li>
	<li>Toplama tüplerini önceden ısıtılmış kuru banyo kuluçka makinesine yerleştirin ve toplama tüplerini 95 °C'de 10 dakika kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>10 dakika sonra, kuru banyo kuluçka tüpleri dışarı atın.</li>
	<li>Aynı DNA çıkarma kitinden 100 μL seyreltme çözeltisi ekleyin ve çözeltiyi birkaç kez yukarı ve aşağı borulandırarak karıştırın.</li>
	<li>Broşür çıkarma için aynı adımı tekrarlayın.</li>
	<li>Çözeltiyi daha fazla karıştırmak için sallayın. Bitki dokusu genellikle bu tedaviden sonra bozulmuş görünmüyor. Sıvı rengi değişebilir ve bulutlu olabilir. NOT: Seyreltilmiş çözelti hemen devam etmiyorsa oda sıcaklığında bir gecede saklanabilir. Depolamadan önce hücreli enkazı bitki dokusundan çıkarmak gerekli değildir. Tüplerdeki sıvı, pcr amplifikasyonu için DNA şablonlarını tutar.</li>
</ol>3. PCR reaksiyon kurulumu
<ol><li>QPCR alet termobisiklet koşullarını üreticinin özelliklerine göre yapılandırın. PcR termobisiklet profilini ilk denatürasyon için sabit bir sıcaklık adımı ilebaşlayan,ardından 25 döngü amplifikasyon ile başlayan ve yüksek çözünürlüklü bir erime eğrisi elde etmek için sıcaklık rampasıyla sona eren PCR termobisiklet profilini uygulayın.</li>
	<li>QPCR Master Mix ve astarları(Tablo 2)kullanmadan önce oda sıcaklığında eritin.</li>
	<li>Her kuyuya yüklenecek reaksiyonu planlayın: Hedef türlerle pozitif kontrol içeren kuyular, hedef olmayan türlerle pozitif kontrol, örnekler ve negatif kontrol(Şekil 5).<ol>
<li>Bu örnekte, on kuyu kullanılır – Alman papatya tanımlama testi için beş, Roma papatya tanımlama testi için kalan beş kuyu. Her tür tanımlama testi için, bir kuyu hedeflenen türlerin referans materyalinden çıkarılan DNA ile pozitif kontrol içerir, bir kuyu hedeflenmemiş türlerin referans materyalinden çıkarılan DNA ile pozitif kontrol içerir, iki kuyu tarladan çıkarılan çiçek ve yaprak DNA örnekleri ile doldurulur ve bir kuyu negatif kontrol için ayrılmıştır. Tablo 3 her kuyu türünü açıklar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Her botanik tür tanımlama testi için kılavuza göre bir reaksiyon master-mix hazırlayın. Tipik bir reaksiyon master-mix evrensel qPCR Master Mix (2x), ileri ve ters türlere özgü astarlar ve nükleaz içermeyen su içerir. Tablo 4 reaksiyon sistemi kompozisyonu listeler. NOT: Hemen kullanmıyorsanız, qPCR reaksiyon ana karışımını +2 °C ile +8 °C arasında bir soğutucuda veya mini buzdolabında saklayın.</li>
	<li>Kullanmadan önce pipetleme ile reaksiyon ana karışımını iyice karıştırın.</li>
	<li>QPCR kartuşunu düz ve sabit bir yüzeye yüz üstü yerleştirin.</li>
	<li>Adım 3.4'te yapılandırılan reaksiyon master karışımının 18 μL'sini, 3.3'te tanımlanan kuyulara göre kartuş kuyularına yükleyin. Bu gösteri için, GC testi (GCT kuyu1, 3, 5, 7, 9) ve Roma papatya kimlik testi reaksiyon ana karışımı için etiketlenmiş kuyular içine Alman papatya kimlik testi test reaksiyonu ana karışımı ekleyin RC testi için etiketli kuyular içine (RCT kuyu2, 4, 6, 8, 10) (Şekil 5bakınız).</li>
	<li>DNA ekstraksiyon tüplerinin süpernatantından 2 μL'lik örnek DNA'yı ve önceden çıkarılmış DNA pozitif kontrollerini qPCR ana karışımı ile önceden yüklenmiş kartuş kuyularına aktarın. QPCR ana karışımına her DNA şablonu ekledikten sonra, çözeltiyi pipetleme ile hafifçe karıştırın. NOT: DNA çıkarma tüpünden DNA aktarırken yüzen hücresel enkazdan kaçının. Gerekirse supernatant ve hücresel enkaz ayırmak için minicentrifuge kullanın.</li>
	<li>Kartuşunu yapışkan filmle dikkatlice kapatın. Kartuşu termobisiklet odasına yükleyin ve kapatın.</li>
	<li>QPCR aracını çalışacak şekilde ayarlayın.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Smith, T., Gillespie, M., Eckl, V., Knepper, J., Reynolds, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herbal+supplement+sales+in+US+increase+by+9.4%+in+2018.">Herbal supplement sales in US increase by 9.4% in 2018.</a> HerbalGram. 123, 62-73 (2019).</li><li>Israelsen, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+challenge+of+regulation,+globalization+and+climate+change+on+botanicals+and+traditional+medicines:+respecting+tradition+while+embracing+change.">The challenge of regulation, globalization and climate change on botanicals and traditional medicines: respecting tradition while embracing change.</a> Planta Medica. 74 (3), 36 (2008).</li><li>Cardellina, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+and+opportunities+confronting+the+botanical+dietary+supplement+industry.">Challenges and opportunities confronting the botanical dietary supplement industry.</a> Journal of Natural Products. 65 (7), 1073-1084 (2002).</li><li>Foster, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+peripatetic+maze+of+black+cohosh+adulteration:+a+review+of+the+nomenclature,+distribution,+chemistry,+market+status,+analytical+methods+and+safety.">Exploring the peripatetic maze of black cohosh adulteration: a review of the nomenclature, distribution, chemistry, market status, analytical methods and safety.</a> HerbalGram. 98, 32-51 (2013).</li><li>Vanherweghem, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Misuse+of+herbal+remedies:+The+case+of+an+outbreak+of+terminal+renal+failure+in+Belgium+(Chinese+herbs+nephropathy).">Misuse of herbal remedies: The case of an outbreak of terminal renal failure in Belgium (Chinese herbs nephropathy).</a> The Journal of Alternative and Complementary Medicine. 4 (1), 9-13 (1998).</li><li>Vanherweghem, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapidly+progressive+interstitial+renal+fibrosis+in+young+women:+association+with+slimming+regimen+including+Chinese+herbs.">Rapidly progressive interstitial renal fibrosis in young women: association with slimming regimen including Chinese herbs.</a> The Lancet. 341 (8842), 387-391 (1993).</li><li>Khan, I. A., Smillie, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implementing+a+"quality+by+design"+approach+to+assure+the+safety+and+integrity+of+botanical+dietary+supplements.">Implementing a "quality by design" approach to assure the safety and integrity of botanical dietary supplements.</a> Journal of Natural Products. 75 (9), 1665-1673 (2012).</li><li>Applequist, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Identification of Medicinal Plants: A Handbook of the Morphology of Botanicals in Commerce. , (2006).</li><li>Upton, R., Graff, A., Jolliffe, G., L&#228;nger, R., Williamson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> American Herbal Pharmacopoeia: Botanical Pharmacognosy - Microscopic Characterization of Botanical Medicines. , (2016).</li><li>Frommenwiler, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+HPTLC+fingerprinting+for+quality+control+of+an+herbal+drug+-+the+case+of+angelica+gigas+root.">Comprehensive HPTLC fingerprinting for quality control of an herbal drug - the case of angelica gigas root.</a> Planta Medica. 84 (6-7), 465-474 (2018).</li><li>Heyman, H. M., Meyer, J. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMR-based+metabolomics+as+a+quality+control+tool+for+herbal+products.">NMR-based metabolomics as a quality control tool for herbal products.</a> South African Journal of Botany. 82, 21-32 (2012).</li><li>Lazarowych, N. J., Pekos, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+fingerprinting+and+marker+compounds+for+identification+and+standardization+of+botanical+drugs:+strategies+for+applying+pharmaceutical+HPLC+analysis+to+herbal+products.">Use of fingerprinting and marker compounds for identification and standardization of botanical drugs: strategies for applying pharmaceutical HPLC analysis to herbal products.</a> Drug Information Journal. 32 (2), 497-512 (1998).</li><li>Tankeu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperspectral+imaging+and+support+vector+machine:+a+powerful+combination+to+differentiate+black+cohosh+(actaea+racemosa)+from+other+cohosh+species.">Hyperspectral imaging and support vector machine: a powerful combination to differentiate black cohosh (actaea racemosa) from other cohosh species.</a> Planta Medica. 84 (6-7), 407-419 (2018).</li><li>Rodman, J. E., Cody, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+taxonomic+impediment+overcome:+NSF's+Partnerships+for+Enhancing+Expertise+in+Taxonomy+(PEET)+as+a+model.">The taxonomic impediment overcome: NSF's Partnerships for Enhancing Expertise in Taxonomy (PEET) as a model.</a> Systematic Biology. 52 (3), 428-435 (2003).</li><li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+renaissance+in+herbal+medicine+identification:+from+morphology+to+DNA.">A renaissance in herbal medicine identification: from morphology to DNA.</a> Biotechnology Advances. 32 (7), 1237-1244 (2014).</li><li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+DNA+barcoding:+from+gene+to+genome.">Plant DNA barcoding: from gene to genome.</a> Biological Reviews. 90 (1), 157-166 (2015).</li><li>Madesis, P., Ganopoulos, I., Sakaridis, I., Argiriou, A., Tsaftaris, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+of+DNA-based+methods+for+tracing+the+botanical+origin+of+food+products.">Advances of DNA-based methods for tracing the botanical origin of food products.</a> Food Research International. 60, 163-172 (2014).</li><li>Newmaster, S. G., Ragupathy, S., Janovec, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+botanical+renaissance:+state-of-the-art+DNA+bar+coding+facilitates+an+automated+identification+technology+system+for+plants.">A botanical renaissance: state-of-the-art DNA bar coding facilitates an automated identification technology system for plants.</a> International Journal of Computer Applications in Technology. 35 (1), 50-60 (2009).</li><li>Parveen, I., Gafner, S., Techen, N., Murch, S. J., Khan, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+barcoding+for+the+identification+of+botanicals+in+herbal+medicine+and+dietary+supplements:+strengths+and+limitations.">DNA barcoding for the identification of botanicals in herbal medicine and dietary supplements: strengths and limitations.</a> Planta Medica. 82 (14), 1225-1235 (2016).</li><li>Agrawal, N., Hassan, Y. A., Ugaz, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pocket-sized+convective+PCR+thermocycler.">A pocket-sized convective PCR thermocycler.</a> Angewandte Chemie International Edition. 46 (23), 4316-4319 (2007).</li><li>Almassian, D. R., Cockrell, L. M., Nelson, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Portable+nucleic+acid+thermocyclers.">Portable nucleic acid thermocyclers.</a> Chemical Society Reviews. 42 (22), 8769-8798 (2013).</li><li>Ben&#237;tez-P&#225;ez, A., Portune, K. J., Sanz, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Species-level+resolution+of+16S+rRNA+gene+amplicons+sequenced+through+the+MinION+portable+nanopore+sequencer.">Species-level resolution of 16S rRNA gene amplicons sequenced through the MinION portable nanopore sequencer.</a> Gigascience. 5 (1), 4 (2016).</li><li>Emanuel, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+Francisella+tularensis+within+infected+mouse+tissues+by+using+a+hand-held+PCR+thermocycler.">Detection of Francisella tularensis within infected mouse tissues by using a hand-held PCR thermocycler.</a> Journal of Clinical Microbiology. 41 (2), 689-693 (2003).</li><li>Quick, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time,+portable+genome+sequencing+for+Ebola+surveillance.">Real-time, portable genome sequencing for Ebola surveillance.</a> Nature. 530 (7589), 228 (2016).</li><li>Lu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-laboratory+validation+of+a+two-tiered+DNA+barcoding+method+for+raw+botanical+identification.">Single-laboratory validation of a two-tiered DNA barcoding method for raw botanical identification.</a> Journal of AOAC International. 102 (5), 1435-1447 (2019).</li><li>Sgamma, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+barcoding+for+industrial+quality+assurance.">DNA barcoding for industrial quality assurance.</a> Planta Medica. 83 (14-15), 1117-1129 (2017).</li><li>Wallinger, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+plant+identification+using+species-and+group-specific+primers+targeting+chloroplast+DNA.">Rapid plant identification using species-and group-specific primers targeting chloroplast DNA.</a> PLoS One. 7 (1), 29473 (2012).</li><li>Newmaster, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recommendations+for+validation+of+real-time+PCR+methods+for+molecular+diagnostic+identification+of+botanicals.">Recommendations for validation of real-time PCR methods for molecular diagnostic identification of botanicals.</a> Journal of AOAC International. , (2019).</li><li>Singh, O., Khanam, Z., Misra, N., Srivastava, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chamomile+(Matricaria+chamomilla+L.):+an+overview.">Chamomile (Matricaria chamomilla L.): an overview.</a> Pharmacognosy Reviews. 5 (9), 82 (2011).</li><li>Mills, S. Y., Bone, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Essential+Guide+to+Herbal+Safety.">The Essential Guide to Herbal Safety.</a> Elsevier Health Sciences. , 325 (2004).</li><li>Avula, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+determination+of+phenolic+compounds+by+UHPLC-UV-MS+and+use+of+partial+least-square+discriminant+analysis+to+differentiate+chemo-types+of+Chamomile/Chrysanthemum+flower+heads.">Quantitative determination of phenolic compounds by UHPLC-UV-MS and use of partial least-square discriminant analysis to differentiate chemo-types of Chamomile/Chrysanthemum flower heads.</a> Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 88, 278-288 (2014).</li><li>Guzelmeric, E., Vovk, I., Yesilada, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+validation+of+an+HPTLC+method+for+apigenin+7-O-glucoside+in+chamomile+flowers+and+its+application+for+fingerprint+discrimination+of+chamomile-like+materials.">Development and validation of an HPTLC method for apigenin 7-O-glucoside in chamomile flowers and its application for fingerprint discrimination of chamomile-like materials.</a> Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 107, 108-118 (2015).</li><li>Dieffenbach, C. W., Lowe, T. M., Dveksler, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+concepts+for+PCR+primer+design.">General concepts for PCR primer design.</a> Genome Research. 3 (3), 30-37 (1993).</li><li>Untergasser, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primer3Plus,+an+enhanced+web+interface+to+Primer3.">Primer3Plus, an enhanced web interface to Primer3.</a> Nucleic Acids Research. 35, 71-74 (2007).</li><li>Bustin, S., Huggett, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=qPCR+primer+design+revisited.">qPCR primer design revisited.</a> Biomolecular Detection and Quantification. 14, 19-28 (2017).</li><li>Brownie, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+elimination+of+primer-dimer+accumulation+in+PCR.">The elimination of primer-dimer accumulation in PCR.</a> Nucleic Acids Research. 25 (16), 3235-3241 (1997).</li><li>Dwight, Z., Palais, R., Wittwer, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=uMELT:+prediction+of+high-resolution+melting+curves+and+dynamic+melting+profiles+of+PCR+products+in+a+rich+web+application.">uMELT: prediction of high-resolution melting curves and dynamic melting profiles of PCR products in a rich web application.</a> Bioinformatics. 27 (7), 1019-1020 (2011).</li><li>Heikrujam, J., Kishor, R., Mazumder, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemistry+behind+plant+DNA+isolation+protocols.">The chemistry behind plant DNA isolation protocols.</a> Biochemical Analysis Tools - Methods for Bio-Molecules Studies. , (2020).</li><li>Blum-Silva, C. H., Chaves, V. C., Schenkel, E. P., Coelho, G. C., Reginatto, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+leaf+age+on+methylxanthines,+total+phenolic+content,+and+free+radical+scavenging+capacity+of+Ilex+paraguariensis+aqueous+extracts.">The influence of leaf age on methylxanthines, total phenolic content, and free radical scavenging capacity of Ilex paraguariensis aqueous extracts.</a> Revista Brasileira de Farmacognosia. 25 (1), 1-6 (2015).</li><li>Lu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+a+targeted+PCR+method+for+raw+and+processed+botanical+material+identification:+an+example+using+matricaria+chamomilla+(chamomile).">Validation of a targeted PCR method for raw and processed botanical material identification: an example using matricaria chamomilla (chamomile).</a> Journal of AOAC International. 102 (6), 1787-1797 (2019).</li></ol>

Zhengxiu Yang, Zheng Quan, Tiffany Chua, Leo Li, Yanjun Zhang, Silva Babajanian, Tricia Chua, Peter Chang, Gary Swanson, Zhengfei Lu'nun Herbalife International of America, Inc. çalışanları olduğunu belgeliyoruz. Francesco Buongiorno, Isabella Della Noce ve Lorenzo Colombo'nun bu makalede kullanılan taşınabilir qPCR cihazını üreten Hyris Ltd. çalışanları olduğunu belgelendiriyoruz.

Astar tasarımı ve şablon seçimi verimli ve özel bir qPCR amplifikasyon elde etmek için önemli adımlardır. Uygun bir şablon belirledikten sonra, astar tasarım yazılımı genellikle astar uzunluğu, erime sıcaklığı ve GC içeriği33,34gibi tasarım değişkenlerine dayalı astar seçimine yardımcı olmak için kullanılır. Optimizasyon ve doğrulama, PCR reaksiyonunun özgüllüğünü, hassasiyetini ve sağlamlığını sağlamak için tahminbeklenen deneysel koşulları altında gerçekleştirilebilir35. Sub-optimal astar tasarımı astar-dimer oluşumuna neden olabilir, astar etkileşimleri spesifik olmayan ürünler üretmek ise36.
Bu çalışmada kullanılan şablon denetimleri (NTC) hem DNA kontaminasyonu hem de testi etkileyebilecek astar-dimerlerin varlığını kontrol eder. Sonuçlar amplifikasyon göstermedi, hem DNA kontaminasyonu hem de astar-dimerlerin bir sorun olmadığının iyi bir göstergesi. DNA kontaminasyonu ve astar-dimerhiçbir şablon kontrolleri ile erime eğrileri tezahür ve pozitif kontrollerin erime eğrileri ekstra zirveleri olarak. Genellikle, şablondaki AT açısından zengin alt etki alanları düzensiz erimeye neden olmadıkça, pozitif kontrolün erime eğrisinin tek bir tepe içermesi beklenir. Çift zirveleri uMELT yazılımı37kullanarak erime tahlilleri simüle ederek tahmin edilebilir. Bu çalışmada, hedef PCR ürününün varlığını ve kontaminasyon ve astar-dimer eksikliğini doğrulamak için AGAROSE jel üzerinde PCR ürün çalışan altın standart kullanılmıştır.
Botanik malzeme moleküler analizinde önemli bir sorun, botanik DNA çıkarma işleminden sonra kaliteli DNA elde etmektir. Botanik malzemeler ticareti ve sağlık yararları ile ilişkili aktif kimyasal bileşikler için tüketilen. DNA çıkarma sürecinde, bu kimyasal bileşikler de DNA çıkarma çözeltisi içine serbest bırakılacak, potansiyel PCR inhibisyonu neden, pcr amplifikasyon başarısızlıkları ile sonuçlanan. Çeşitli bitki DNA arıtma kitleri organik çözücüler ve sütunlar kullanarak botanik elde edilen kimyasal bileşikleri kaldırmak için geliştirilmiştir38. Ancak, duman başlık ve yüksek hızlı santrifüj bu kitleri yardımcı olmak için gerekli alanında mevcut değildir.
Mevcut protokolde, basitleştirilmiş DNA çıkarma yöntemi ticari bir bitki DNA çıkarma kiti kullanır (ayrıntılar için Malzeme Tablosu'na bakınız). Bu tekrarlanabilir sonuçlar için ortak inhibitör maddeleri nötralize etme yeteneğine sahip ve M. papatya ve C. nobile için tutarlı sonuçlar üretti. Hem M. papatya ve C. nobile çiçek kafaları ve yaprakları belirli erime zirveleri ile PCR amplicons verdi, PCR inhibitörleri varlığı bir endişe olmadığını gösteren. PCR inhibitörleri daha yüksek düzeyde olan diğer tesisler için, orijinal ekstraksiyon DNA yükseltici daha az verimli olabilir. İnhibisyonu azaltmak ve amplifikasyon verimliliğini artırmak için, tüm tesise erişim ile, düşük polisakkarit ve polifenol içeriği ile diğer bitki parçaları da tanımlama amacıyla kullanılabilir. Farklı bitki parçaları sınırlı erişim varsa, genç yaprakları veya yaprakları çiçek başları, genellikle düşük fenolik içeriğe sahip kesilir39, başarı daha iyi bir şans sunabilir. DNA dizileri tüm bitki boyunca tutarlı olduğundan, herhangi bir bitki parçası türlerin kimliğini doğrulamak için kullanılabilir. PCR amplifikasyonu hala yetersiz ise, orijinal DNA özü PCR'den önce daha da seyreltilebilir veya daha gelişmiş laboratuvar arıtma protokolleri kullanılabilir.
PCR analizi için bir diğer sorun dna kontaminasyonu nedeniyle yanlış pozitif sonuçlar, hangi olumsuz veri yorumlanması etkileyebilir. Genellikle aktif temizlik, özel ekipman kullanarak ve belirlenen alanlarda iş kısıtlayan tarafından kontrol edilir. QPCR kullanılarak, tüm PCR analizi kapalı bir sistemde gerçekleştirilebilir, bu da iyi kontrol edilemeyen bir ortamda PCR amplicon kontaminasyonu olasılığını büyük ölçüde azaltır. Ayrıca, çevresel DNA da bir önceki doğrulama çalışmasına göre, bir önceki doğrulama çalışmasına göre, töz özgüllüğü nedeniyle yanlış pozitif göstermemelidir40.
İyileştirme için yer var. Burada sunulan protokolde, hedef parça amplifikasyonu gerçek zamanlı olarak göstermek için ara boya kullanılmıştır. Yöntemin özgüllüğü, M. papatya ve C. nobile amfikonları arasında farklı olan karakteristik erime sıcaklığı ile daha da doğrulanır. Bu nedenle, boya bazlı PCR'nin ara sınıfa yansıtLanması, "Bu bitki türü nedir?" sorusuna verimli bir şekilde cevap verebilir. Ancak, tarladan izole edilmiş tek bir tesis üzerinde botanik tanımlama nın yanı sıra, birçok durumda, depodaki botanik tozlar veya ekstreler de yerinde hızlı kimlik değerlendirmesinden yararlanacaktır. Bu tür malzemeler için "Bu materyalde ne var?", "Aradığım botanik türleri içeriyor mu?", "Kaçınmak istediğim zina ları içeriyor mu?", "Zararlı diğer botanik türler tarafından tamamen veya kısmen mi değiştiriliyor?" gibi ek soruların ele alınması gerekebilir. Farklı qPCR probları, bir reaksiyon sisteminde farklı botaniklerden gelen ampliconları hedef almak için tasarlanmış, aynı zamanda yüksek özgüllük ve verimi korumak için intercalating boya kullanmak yerine. Prob tabanlı qPCR'nin geliştirilmesi ve birden fazla kanal tespiti sunan taşınabilir bir qPCR sisteminin kullanımı, saha testinin amacı için uygun bir test olarak uygulanmasını, daha karmaşık soruları yanıtlamak için botanik malzeme depoları ve dağıtım merkezleri gibi daha geniş bir ortam ayarına genişletebilir. Buna ek olarak, birden fazla prob kullanarak da kullanıcı her reaksiyon sistemi dahilamplifikasyon dahil sağlar, böylece PCR inhibisyonu şüphelenildiğinde daha fazla bilgi kullanılabilir olacaktır.
Burada sunulan protokol, aynı amaçla kullanılan mevcut teknolojilere göre aşağıdaki avantajlara sahiptir. İlk olarak, geleneksel morfolojik ve kimyasal tanımlama yöntemleri için, prosedür ve sonuçları nın uzmanlar tarafından yürütülmesi ve yorumlanması gerekmektedir. qPCR tabanlı tanımlama testleri temel moleküler biyoloji eğitimi almış kişiler tarafından yapılabilir ve daha standart bir şekilde yorumlanabilir. İkinci olarak, normalde laboratuvarda gerçekleştirilen qPCR tabanlı tür tanımlama ve farklılaştırma ile karşılaştırıldığında, taşınabilir bir alet kullanarak alan tanımlama protokolü, yüksek hızlı santrifüj, DNA kalite değerlendirme ekipmanı, floresan dedektörlü termal çevrimci ve özel bir yazılım çalıştıran bilgisayar gibi büyük ayak izine sahip aletler gerektirmez. Böylece DNA tabanlı türlerin tanımlanması herhangi bir ortamda gecikmeden gerçekleştirilebilir. Üçüncü olarak, botanik malzeme aramak küresel bir işlem gerektiren bir görevdir. Bulut hizmetleri ve yapay zekadaki gelişmelerle, taşınabilir bir cihaz laboratuvardaki uzmanlar tarafından geliştirilen ve doğrulanan yöntemleri alabilir, uzak bölgelerde uzman olmayanlar tarafından çalıştırılabilir ve üçüncü taraflardan objektif sertifikalar üretebilir. Bu nedenle, bu seçenek her zamankinden daha uzak çalışma eğilim haline ile daha zorlayıcı.
Özetle, buradaki protokol, taşınabilir bir qPCR sistemi kullanılarak M. papatyanın alan tanımlamasını göstermiştir. Bu tekniğin başarılı bir şekilde uygulanması, botanik tanımlama konusunda son derece doğru sonuçlar üretecek ve botanik üreticilerinin ve tedarikçilerinin botanik malzemelerini zamanında ve uygun maliyetli bir şekilde nitelendirmelerinde yardımcı olacaktır.

Sağlık korumak ve iyileştirmek için botanik kullanma uygulaması binlerce yıl öncesine dayanıyor. Artan tüketicitalebi1 getirdiği tedarik zinciri üzerinde stresler nedeniyle , sürdürülemez hasat uygulamaları ve iklim değişikliği2, botanik zina gıda ve diyet takviyesi sanayi3büyüyen bir endişe haline gelmektedir . Bildirilmemiş veya yanlış tanımlanmış botanik türlerinin varlığı etkinliğin azalmasına, hatta güvenlik sorunlarına yol açabilir. Örneğin, karayılan(Actaea racemosa),premenstrüel rahatsızlık tedavisinde kullanılan, etkinliği için sınırlı klinik veri desteği ile düşük fiyatlı Asya türleri ile değiştirilebilir4. Daha ciddi bir durumda, Çin otlar kullanarak kilo kaybı için bir klinik çalışmada Stephania terandra için Aristolochia fangchi ikame bazı katılımcılarda şiddetli nefrotoksisite ve böbrek yetmezliğine yol açtı5,6. İki farklı tür, Çin'in ortak adı "Fang Ji"yi paylaşıyordu. Bu durumlarda daha sıkı kalite kontrolü için ihtiyaç vurgulamak, hammadde belirlenmesi ile başlayan7, tercihen mümkün olduğunca tedarik zincirinin başlangıç noktasına yakın, böylece kaynaklar verimli bir şekilde doğru kimlik malzeme tahsis edilebilir.
Botanik tanımlama için bir dizi ortogonal yaklaşım kullanılabilir. Geleneksel olarak, botanik tanımlama morfolojik değerlendirme8,9 ve kimyasal analitik yöntemler10,11,,12,13ile gerçekleştirilir. Morfolojik tanımlama, bitki materyallerinin makroskopik ve mikroskobik özelliklerindeki farklılıklara dayanmaktadır (Şekil 1). Ancak, son yıllarda klasik botanik eğitim programlarının eksikliği uzman sıkıntısı neden oldu14, rutin kalite kontrolü için bu yaklaşımı pratik hale. Toz botanik malzemelerde uygulanması da sınırlıdır. Farmakope ve laboratuvarlarda kimyasal analitik yöntemler yaygın olarak kullanılmaktadır, ancak Yüksek Performanslı İnce Tabaka Kromatografisi (HPTLC), Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi (HPLC) ve Nükleer Manyetik Rezonans Spektroskopisi (Şekil2)gibi enstrümanların büyüklüğü nedeniyle saha testleri için ideal değildir. Son zamanlarda, genomik yöntemler botanik türlerin kimlik doğrulama ve ikame algılama için alternatif bir teknik olarak ortaya çıkmıştır ve verimli ve hassas olduğu kanıtlanmıştır. Genomik yöntemler bitki materyallerinde genetik bilginin yüksek sadakat ve özgüllüğünü kullanır15,16,17,18,,19. Moleküler tanı araçları taşınabilir cihazlar şeklinde mevcuttur, ve genellikle teknoloji kullanımı için engeli düşürmek otomatik veri yorumlama araçları içerir, alan tanımlama için ideal bu yaklaşım yapma20,21,22,23,24. Moleküler analiz yöntemi25,26,,27olarak tasarlanmış ve doğrulandıktan sonra, temel moleküler biyoloji eğitimi almış herhangi bir personel tarafından yapılabilir. Mevcut farklı taşınabilir araçlar arasında, DNA dizileri üzerinde gerçek zamanlı PCR maliyet-etkin seçeneklerden biridir28. Taşınabilir bir cihazın birleşimi, özelleştirilmiş ve doğrulanmış moleküler analizle birlikte, laboratuvar dışında, çiftlikler ve botanik malzeme depoları gibi botanik türlerinin ve malzemelerin doğrulanmasına olanak sağlar ve geleneksel yöntemlerle ilişkili zaman ve maliyetleri azaltır.
Bu protokolün amacı, taşınabilir bir qPCR sistemi kullanarak laboratuvar ekipmanı ve uzmanlığına erişimin sınırlı veya kullanılamadığı durumlarda botanik tanımlama yöntemi ni tanıtmaktır. Yöntem Matricaria papatya bir alanda gösterilmiştir (Şekil 3A), yaygın Olarak bilinen Alman papatya, yaygın anti-inflamatuar ve antioksidan özellikleri için kullanılan29. Özellikle Chamaemelumcinsi, Tanacetumve Krizantem30,31,32'den benzer görünüm veya kokunun ilgili türleri ile karıştırılabilir.31 İlgili türler arasında, Chamaemelum nobile, Ayrıca Roma papatya olarak bilinen, ticaret karşılaştırılabilir üretim düzeyleri ile fark edilir biridir (Şekil 3B). Gösterilen yöntem sadece hedef botanik türleri M. papatyatanımlamak için tasarlanmıştır , ama aynı zamanda yakın akrabası tespit, C. nobile, DNA dizilerinin belirli amplifikasyon dayalı.
Bu makalede, taşınabilir bir cihazda intercalating boya tabanlı qPCR ve erime eğrisi analizi kullanarak M. papatya alan botanik tanımlama nasıl gerçekleştirilecektir, ayrıntılı olarak açıklar. Protokol, sahadan botanik numunelerin toplanmasını, yerinde DNA çıkarılmasını ve gerçek zamanlı PCR reaksiyonunun ayarlanmasını içerir. Geçerli bir sonuç sağlamak için, hedef botanik M. papatya ve non-target botanik C. nobile genomik DNA, önceden sertifikalı botanik referans malzemelerden çıkarılan, pozitif kontrol olarak kullanılır. Bu yöntemin özgüllüğü hem M. papatya hem de C. nobile tanımlama testlerinin numuneler ve kontroller üzerinde ayrı ayrı gerçekleştirilmesi ile gösterilmiştir. PCR kontaminasyonundan kaynaklanan yanlış pozitif sonuçları dışlamak için şablon dışı negatif denetim kullanılır.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Battery</td>
			<td>TNE</td>
			<td>78000mAh</td>
			<td>Provide field power supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bCUBE</td>
			<td>HYRIS</td>
			<td>bCUBE 2.0</td>
			<td>Portable qPCR instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cartridges(16 Well)</td>
			<td>HYRIS</td>
			<td>NA</td>
			<td>Consumables for bCUBE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electric pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>NA</td>
			<td>Handling liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extract-N-AmpTM plant PCR kit</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>XNAP2-1KT</td>
			<td>Plant DNA extraction kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>German chamomile (Matricaria chamomilla L) flower botanical reference materials</td>
			<td>AHP</td>
			<td>2264</td>
			<td>Used as positive control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini dry bath</td>
			<td>Yooning</td>
			<td>MiniH-100L</td>
			<td>For DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>AMBION</td>
			<td>AM9937</td>
			<td>qPCR reaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NA</td>
			<td>qPCR reaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roman chamomile (Chamaemelum nobile) flower botancial reference materials</td>
			<td>ChromaDex</td>
			<td>ASB-00030806-005</td>
			<td>Used as positive control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luna universal qPCR master mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M3003L</td>
			<td>qPCR reaction</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

field identification of matricaria chamomilla using a portable qpcr system

Botanik ürünlerde kalite kontrol hammadde temini ile başlar. Geleneksel olarak, botanik tanımlama morfolojik değerlendirme ve kimyasal analitik yöntemlerle gerçekleştirilir. Ancak, özellikle son yıllarda botanikçilerin kullanılabilirliği eksikliği, artan tüketici talebi ve iklim değişikliğinin getirdiği tedarik zinciri üzerindeki streslerle mücadele etmek için kalite kontrolünü artırma ihtiyacı ile birleştiğinde, alternatif yaklaşımlar gerektirmektedir. Bu protokolün amacı, laboratuvar ekipmanı ve uzmanlığına erişimin sınırlı olduğu sahada veya herhangi bir ortamda taşınabilir bir qPCR sistemi kullanarak botanik türlerinin tanımlanmasını kolaylaştırmaktır. Hedef DNA boya bazlı qPCR kullanılarak yükseltilir ve DNA pozitif kontrol görevi görehizmet eden botanik referans malzemelerden elde edilir. Hedef DNA, spesifik amplifikasyon ulabilmekte ve erime tepesini pozitif kontrolle eşleştirerek tanımlanır. Okuyucuların bu protokolü kopyalayabilmesini sağlamak için, uygulamalı alan örnek koleksiyonundan DNA çıkarma, PCR amplifikasyonve ardından veri yorumuna kadar adım ve parametrelerin ayrıntılı bir açıklaması eklenmiştir. Üretilen sonuçlar geleneksel laboratuvar botanik tanımlama yöntemleri ile uyumlu. Protokolün gerçekleştirilmesi kolay ve uygun maliyetlidir ve hammaddeler üzerinde tedarik zincirinin çıkış noktasına mümkün olduğunca yakın kalite testi sağlar.

Bölüm 1'de açıklanan protokolün ardından, 95 °C'de 10 dakika boyunca toplama tüpünün ısı kuluçkasından sonra çiçek başı ve yapraktan botanik DNA'sı süpernatant içine çıkarıldı. Mevcut çalışmada, supernatant hem çiçek hem de yaprak için sarı ve yeşilimsi bir renk gösterdi, doğal bileşiklerçeşitli botanik DNA ile supernatant içine serbest olduğunu belirten(Şekil 6). Güvenilir PCR amplifikasyon daha sonra tüm alan çıkarılan DNA şablonu için triplicate elde edilmiş olsa da, DNA kalite değerlendirmesi referans olarak laboratuvarda yapıldı. Florürler tarafından belirlenen çiçek başı DNA ekstresinin konsantrasyonu 3.69-5.36 ng/μL arasında değişirken, yaprak DNA ekstresinin konsantrasyonu 6.42-9.29 ng/μL arasında değişmektedir. A260/A280 ve A260/A230 çiçek ve yaprak DNA özleri emicilik oranları spektrofotometri ile ölçüldü. Ancak, DNA ve fitokimyasal UV emilim spektrumu arasındaki örtüşme nedeniyle, bu oranlar güvenilirlik ölçüldü (veriler gösterilmedi).
Hedef parçaların gerçek zamanlı olarak amplifikasyonunun izlenmesi için floresan boyanın ara sıra kullanılması. Hem özel astarlar M. papatya ve C. nobile hedef iç transkripsiyonlu spacer 2 (ITS2) bölge, hangi bitki genomu yüzlerce kopya onlarca vardır, 25 PCR amplifikasyon döngüleri papatya türlerinin belirlenmesi için yeterli amplicons oluşturmak için yeterlidir. Şekil7'de, M. papatya tanımlama testinde M. papatya pozitif kontrolü için Ct değeri 25 'ten (GCP_GCT) az iken, 25 amplifikasyon döngüsünden sonra, C. nobile tanımlama testinde aynı kontrolün floresansı tespit eşiğinin altındaydı (GCP_RCT). Öte yandan, 25 döngüden sonra, M. papatya tanımlama testinde C. nobile pozitif kontrolü için floresan algılama eşiğinin (RCP_GCT) altında iken, C. nobile tanımlama testinde aynı kontrol için Ct değeri 25 'ten (RCP_RCT) daha azdı. Kendi tahlillerinde hedef ve hedef olmayan pozitif kontrollerin amplifikasyonu, M. papatya tanımlama testinin özgüllüğünü göstermektedir. Örnek DNA için, alan çiçek kafası ve yaprak DNA ekstresi, M. papatya tanımlama testinde sırasıyla (Sample1(FLOWER)_GCT ve Sample2(LEAF)_GCT) 15.18 ve 19.41 Ct değerleri vermiştir. Bu örneklerin her ikisi de C. nobile tanımlama testinde (Sample1(FLOWER)_RCT ve Sample2(LEAF)_RCT) olarak yükseltilmedi. Her iki numunenin amplifikasyon desenleri M. papatya pozitif kontrolün amplifikasyon deseniile eşleşti. PCR kontaminasyonunneden olduğu yanlış pozitifler olasılığı dışında hem M. papatya hem de C. nobile tanımlama testlerinde (NC_GCT ve NC_RCT) negatif kontroller güçlendirilmedi. Pozitif kontrolve numunelerde spesifik amplifikasyonu doğrulamak için, her kuyudan PCR son ürün fraksiyonları laboratuvarda %2 agarose jel üzerinde çalıştırıldı(Şekil 8). M. papatya tanımlama testi için, her iki saha numunesi de M. papatya pozitif kontrolü ile aynı pozisyonda çalışan ve tahmini boyutu 100 bp'nin biraz üzerinde (teorik boyut 102 bp) amlikon verdi. C. nobile tanımlama testi için, hedef olmayan türler C. nobile pozitif kontrol 50 ve 100 bp arasında bir bant, 65 bp teorik boyutu uygun bir bant verdi. Şeritlerin geri kalanı, saha testlerinde gözlendiği gibi, bu kuyular için floresan sinyal yokluğu ile aynı fikirde olan özel bir amplifikasyon ürünü göstermedi.
PCR amplifikasyonundan sonra, ısıtma sırasında çift iplikli DNA'nın (dsDNA) dissosifikasyon özelliklerini değerlendirmek için bir erime eğrisi analizi yapıldı. Erime eğrisi analizi için son döngü sırasında sıcaklık arttıkça, sıcaklıktaki artışlar çift iplikli amperlerin ayrışmasını neden oldu. Ara floresan boya yavaş yavaş çözeltiiçine salındı, floresan yoğunluğu azalan (Şekil 9A). İlk türev eğrinin çekim noktası, esas olarak DNA parça uzunluğuna ve GC içeriğine bağlı olan erime sıcaklığını (Şekil9B)belirlemek için kullanılmıştır. Ct değerinin erime sıcaklığı ile birleştirilmesi qPCR analizinin özgüllüğünü artırabilir. Bu çalışmada, M. papatya pozitif kontrol PCR amplicon erime sıcaklığı zirve oluştu 85.6 °C (GCP_GCT) ve 79.1 °C (RCP_RCT) de C. nobile pozitif kontrol PCR amplicon erime sıcaklığı zirvesinden farklıydı. Alan çiçeği kafası ve yaprağındaki PCR amplicon sırasıyla 85.2 °C ve 84.8 °C'de erime sıcaklık zirveleri üretti (Sample1(FLOWER)_GCT ve Sample2(LEAF)_GCT). Taşınabilir qPCR sistemi ile ölçülen erime sıcaklığı değişimlerini değerlendirmek için, numune erime sıcaklıklarının M. papatya pozitif kontrolünden (2 °C içinde) elde edilen erime sıcaklığına her zaman yakın olduğunu ve C. nobile pozitif kontrol amperinin erime sıcaklığından çok uzak olduğunu doğrulamak için ek veri noktaları toplanmıştır (Şekil 10). Erime sıcaklık zirveleri bazen diğer kuyularda bildirilmiştir. Ancak, Ct değerleri 25'ten az değildi ve erime sıcaklık zirveleri M. papatya veya C. nobile pozitif kontrolüne yakın değildi (2 °C'den fazla ara).
Özetle, alan M. papatya tanımlama testi Tablo 5'teözetlenen karar kurallarına göre yorumlanabilir. Tüm pozitif kontroller putatif botanik türleri için pozitif test, diğer türler için negatif ve negatif kontroller negatif test ile, her iki alan örnekleri M. papatya değil, C. nobileiçerdiği tespit edildi. Buna ek olarak, alan testi sonuçlarını diğer analitik tekniklerle hizalamak için, alan sonuçları daha önce onaylanmış bir DNA barkodlama yöntemi25 (veriler gösterilmemiştir) ile daha da doğrulandı.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60940/60940fig01.jpg"> Şekil 1: Botanik malzemelerin morfolojik tanımlaması. (A) Hibiscus rosa-sinensis çiçekleri, Curcuma longa kökleri, Malva Sylvestris yaprakları, Rosmarinus officinalis yaprakları, Coriandrum sativum tohumları, Zingiber officinale kökleri. (B) Petroselinum crispum ve Apium graveolens pulları ayırt etmek zordur. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60940/60940fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60940/60940fig02.jpg"> Şekil 2: Botanik malzemelerin kimyasal olarak tanımlanması. (A) HPTLC cihazı ve temsili bir HPTLC kromatogramı. (B) HPLC cihazı ve temsili hplc kromatogramı. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60940/60940fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60940/60940fig03.jpg"> Şekil 3: Matricaria chamomilla ve Chamaemelum nobile alanında. (A) Matricaria papatya, CC BY-SA 3.0 altında Wikipedia uyarlanmıştır, https://en.wikipedia.org/wiki/Matricaria_chamomilla#/media/File:Matricaria_February_2008-1.jpg. (B) Chamaemelum nobile, Wikipedia'dan CC BY-SA 3.0 altında uyarlanmıştır, https://en.wikipedia.org/wiki/Chamomile#/media/File:Chamaemelum_nobile_001.JPG. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60940/60940fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60940/60940fig04.jpg"> Şekil 4: Tarladan M. papatya bitki parçaları toplama. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60940/60940fig04large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60940/60940fig05.jpg"> Şekil 5: Gösterideki test kuyularının düzeni. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60940/60940fig05large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60940/60940fig06.jpg"> Şekil 6: Toplama tüplerinde alan DNA ekstresi. Botanik doku orijinal tüp kalır ve sarımsı DNA ekstresi ile kaplıdır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60940/60940fig06large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60940/60940fig07.jpg"> Şekil 7: PCR ürünlerinin 25 döngü termobisiklet üzerinde birikmesini gösteren floresan çizimi. M. papatya pozitif kontrol ve C. nobile pozitif kontrol, Sırasıyla M. papatya ve C. nobile tanımlama testlerinde 25'ten az Ct değerleri göstermektedir. Tarla çiçeği ve yaprak örnekleri 15.18 ve 19.41 Tomografi değerleri ile M. papatya tanımlama testi ile güçlendirilmiştir. Kuyuların geri kalanı güçlendirilemedi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60940/60940fig07large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60940/60940fig08.jpg"> Şekil 8: Alan PCR amplifikasyon ürünlerinin jel elektroforezi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60940/60940fig08large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60940/60940fig09.jpg"> Şekil 9: Erime sıcaklık analizi. (A) Her kuyudaki floresan sinyali artan sıcaklıkla azalır. (B) PCR ürünlerinin kimliği erime eğrisi analizinde erime sıcaklığının zirvesi ile doğrulandı. Tarla çiçeği ve yaprak örnekleri 85.2 °C ve 84.8 °C'de zirveleri göstermektedir. Bu M. papatya pozitif kontrol tarafından üretilen tepeyakındır. C. nobile pozitif kontrolü 79.1 °C'de bir tepe üretti ve bu da diğer üç örnekten farklıdır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60940/60940fig09large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60940/60940fig10.jpg"> Şekil 10: Erime sıcaklığı pozitif kontrol ve alan örnekleri arasındaki en yüksek değişimdir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60940/60940fig10large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Sahne</td>
			<td>Döngüsü</td>
			<td>Sıcaklık</td>
			<td>Saat</td>
		</tr>
<tr>
<td>Sabit Sıcaklık</td>
			<td>1</td>
			<td>95 °C</td>
			<td>60s</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">Amplifikasyon</td>
			<td rowspan="2">25</td>
			<td>95 °C</td>
			<td>30s</td>
		</tr>
<tr>
<td>60 °C</td>
			<td>30s</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">Erime Eğrisi</td>
			<td rowspan="2">1</td>
			<td>60 °C</td>
			<td rowspan="2">Rampa 0.05 °C/s</td>
		</tr>
<tr>
<td>95 °C</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 1: M. papatya ve C. nobile tanımlama testleri için qPCR termobisiklet koşulları.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Tahlil</td>
			<td>Astar adı</td>
			<td colspan="2">Sıra 5'-3'</td>
			<td>Konum</td>
			<td>Bölge</td>
			<td>Amplicon Boyutu</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">Matricaria recutita</td>
			<td>ZL3</td>
			<td colspan="2">TCGTCGGTCGCAAGGATAAG</td>
			<td>Ileri</td>
			<td rowspan="2">ITS2</td>
			<td rowspan="2">102 bp</td>
		</tr>
<tr>
<td>ZL4</td>
			<td colspan="2">TAAACTCAGCGGGTAGTCCC</td>
			<td>Ters</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">Chamaemelum nobile</td>
			<td>ZL11</td>
			<td colspan="2">TGTCGCACGTTGCTAGGAAGCA</td>
			<td>Ileri</td>
			<td rowspan="2">ITS2</td>
			<td rowspan="2">65 bp</td>
		</tr>
<tr>
<td>ZL12</td>
			<td colspan="2">TCGAAGCGTCATCCTAAGACAAC</td>
			<td>Ters</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 2: M. papatya ve C. nobile tanımlama testleri için astar çiftleri.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>İyi pozisyon</td>
			<td>Peki adı</td>
			<td colspan="2">Açıklama</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>GC_PosCtrl_GC_Test</td>
			<td colspan="2">GC Testi kapsamında Alman papatya pozitif kontrolü</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>GC_PosCtrl_RC_Test</td>
			<td colspan="2">RC Testi altında Alman papatya pozitif kontrolü</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>RC_PosCtrl_GC_Test</td>
			<td colspan="2">GC Testi altında Roma papatya pozitif kontrolü</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>RC_PosCtrl_RC_Test</td>
			<td colspan="2">RC Testi altında Roma papatya pozitif kontrolü</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td>Field_Sample_GC_Test</td>
			<td colspan="2">GC Testi altında yaprak dokusu örneği</td>
		</tr>
<tr>
<td>6</td>
			<td>Field_Sample_RC_Test</td>
			<td colspan="2">RC Testi altında yaprak dokusu örneği</td>
		</tr>
<tr>
<td>7</td>
			<td>Field_Sample_GC_Test</td>
			<td colspan="2">GC Testi altında çiçek dokusu örneği</td>
		</tr>
<tr>
<td>8</td>
			<td>Field_Sample_RC_Test</td>
			<td colspan="2">RC Testi altında çiçek dokusu örneği</td>
		</tr>
<tr>
<td>9</td>
			<td>NegCtrl_GC_Test</td>
			<td colspan="2">GC Testi kapsamında negatif kontrol örneği</td>
		</tr>
<tr>
<td>10</td>
			<td>NegCtrl_RC_Test</td>
			<td colspan="2">RC Testi kapsamında negatif kontrol örneği</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 3: M. papatya ve C. nobile tanımlama testleri için iyi tipler ve açıklamalar.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Reaktif</td>
			<td>GC_Test</td>
			<td>RC_Test</td>
		</tr>
<tr>
<td>Evrensel qPCR Mix*</td>
			<td>10 μL</td>
			<td>10 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>ZL3 astar (10 μM)</td>
			<td>0,4 μL</td>
			<td>Na</td>
		</tr>
<tr>
<td>ZL4 astar (10 μM)</td>
			<td>0,4 μL</td>
			<td>Na</td>
		</tr>
<tr>
<td>ZL11 astar (10 μM)</td>
			<td>Na</td>
			<td>0,4 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>ZL12 astar (10 μM)</td>
			<td>Na</td>
			<td>0,4 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>H2O (Nükleaz içermez)</td>
			<td>7.2 μL</td>
			<td>7.2 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">* Sıcak Başlangıç Taq DNA Polimeraz içerir</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 4: M. papatya ve C. nobile tanımlama testleri için master-mix kompozisyonu.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td rowspan="2">Iyi Adı</td>
			<td rowspan="2">Beklenen Sonuç</td>
			<td>Pozitif Sonuç Kriterleri</td>
			<td>Negatif Sonuç Kriterleri</td>
		</tr>
<tr>
<td>Algılanan / Mevcut</td>
			<td>Algılanmadı / Yok</td>
		</tr>
<tr>
<td>GC_PosCtrl_GC_Test</td>
			<td>Algılandı</td>
			<td>Ct < 25 ve 84 <= Tm <= 86</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>GC_PosCtrl_RC_Test</td>
			<td>Algılanmadı</td>
			<td>-</td>
			<td>25 döngü içinde Ct değeri yok</td>
		</tr>
<tr>
<td>RC_PosCtrl_GC_Test</td>
			<td>Algılanmadı</td>
			<td>-</td>
			<td>25 döngü içinde Ct değeri yok</td>
		</tr>
<tr>
<td>RC_PosCtrl_RC_Test</td>
			<td>Algılandı</td>
			<td>Ct < 25 ve 79 <= Tm <= 81</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>Field_Sample_Leaf_GC_Test</td>
			<td>Mevcut</td>
			<td>Ct < 25 ve 84 <= Tm <= 86</td>
			<td>25 döngü içinde Ct değeri yok</td>
		</tr>
<tr>
<td>Field_Sample_Leaf_RC_Test</td>
			<td>Yok</td>
			<td>-</td>
			<td>25 döngü içinde Ct değeri yok</td>
		</tr>
<tr>
<td>Field_Sample_Flower_GC_Test</td>
			<td>Mevcut</td>
			<td>Ct < 25 ve 84 <= Tm <= 86</td>
			<td>25 döngü içinde Ct değeri yok</td>
		</tr>
<tr>
<td>Field_Sample_Flower_RC_Test</td>
			<td>Yok</td>
			<td>-</td>
			<td>25 döngü içinde Ct değeri yok</td>
		</tr>
<tr>
<td>NegCtrl_GC_Test</td>
			<td>Algılanmadı</td>
			<td>-</td>
			<td>25 döngü içinde Ct değeri yok</td>
		</tr>
<tr>
<td>NegCtrl_RC_Test</td>
			<td>Algılanmadı</td>
			<td>-</td>
			<td>25 döngü içinde Ct değeri yok</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 5: QPCR sonuç yorumu için kurallar.

Watch this Scientific Journal Video about Field Identification of Matricaria chamomilla using a Portable qPCR System at JoVE.com

Field Identification of Matricaria chamomilla using a Portable qPCR System

Burada sunulan taşınabilir bir qPCR sistemi kullanarak Matricaria chamomilla alan tanımlama için bir protokoldür. Bu kolay gerçeklene kadar yapılan protokol, çiftlikler ve depolar gibi laboratuvar ekipmanı ve uzmanlığına erişimin sınırlı olduğu yerlerdeki bir botanik türün kimliğini doğrulamak için ideal bir yöntemdir.

Taşınabilir QPCR Sistemi ile Matricaria chamomilla Alan Tanımlama

Quality control in botanical products begins with the raw material supply. Traditionally, botanical identification is performed through morphological ...

Sağlık durumunu iyileştirmek için botanik kullanma uygulaması binlerce yıl öncesine dayanıyor. Son zamanlarda, artan talep, sürdürülemez hasat uygulamaları ve iklim değişikliği ile birleştiğinde, tedarik zinciri üzerinde bir stres yerleştirdik. Bu nedenle, botanik zina giderek büyüyen bir endişe haline geliyor, botanik kimlik kalite kontrolünün giderek önemli bir parçası haline.İdeal olarak, tanımlama kaynağa mümkün olduğunca yakın gerçekleştirilir, böylece kaynaklar doğru kimlik materyaline verimli bir şekilde tahsis edilebilir. Botanik tanımlama için çeşitli yaklaşımlar vardır. Geleneksel olarak, botanik tanımlama morfolojik değerlendirme ve kimyasal analitik yöntemlerle gerçekleştirilir.Morfolojik tanımlama, bitki malzemelerinin makroskopik ve mikroskobik özelliklerindeki farklılıklara dayanmaktadır. Ancak, iyi eğitimli bir botanikçi gerektirir ve toz botanik malzemelere uygulanması sınırlıdır. Farmakope ve laboratuvarlarda kimyasal analitik yöntemler yaygın olarak kullanılmaktadır, ancak aletlerin boyutu ve çevre gereksinimleri nedeniyle saha testleri için ideal değildir.Son zamanlarda genomik yöntemler, bitki materyallerindeki genomik bilgilerin yüksek sadakati ve özgüllüğü nedeniyle botanik türlerin tanımlanması için alternatif bir teknik olarak ortaya çıkmıştır. Moleküler tanı araçları artık taşınabilir cihazlar şeklinde kullanılabilir ile, bu yaklaşım alan uygulaması için mümkün hale gelir. Bu protokolün amacı, taşınabilir bir qPCR sistemi kullanarak, laboratuvar ekipmanı ve uzmanlığının sınırlı olduğu durumlarda, botanik malzeme sağlayan çiftlik gibi durumlarda botanik tanımlama yöntemi ni tanıtmaktır.Matricaria papatya, yaygın Alman papatya olarak bilinen, yüzyıllardır sağlığı teşvik etmek için bir bitkisel ilaç olarak kullanılmaktadır. Mevcut yöntemin özgüllüğünü göstermek için, Roma papatya olarak bilinen başka bir yaygın olarak kullanılan papatya çiçek Alman papatya farklılaşması, karşılaştırma için dahildir. Alan tanımlama prosedürü bir Alman papatya çiftliğinin ortasında gösterilmiştir.Düz ve yatay bir yüzeye sahip bir test alanı ayarlayın. Papatya çiçek alanında bitkilerin çoğunluğunun özelliklerini yansıtan temsili bir bitki tanımlayın. Steril eldiven kullanarak temsili bitki bir çiçek kafası seçin.Numuneyi 2,0 mililitrelik toplama tüpüne yerleştirin. Aynı bitkiden yaklaşık 0,5 ila 0,7 santimetre uzunluğunda bir broşürü tekrarlayın ve toplayın. Kuru banyo kuluçka makinesini 95 dereceye ısıtın.Her toplama tüpüne, bitki DNA ekstraksiyon kitinden 100 mikrolitre ekstraksiyon çözeltisi ekleyin. Daha iyi DNA ekstraksiyon verimliliği için, bir doku pestisit kullanarak örnek eziyet. Tüpü kapatın.Botanik dokunun ekstraksiyon işlemi boyunca ekstraksiyon çözeltisi ile kaplı olduğundan emin olun. Toplama tüplerini önceden ısıtılmış kuru banyo kuluçka makinesine yerleştirin ve toplama tüplerini 10 dakika boyunca 95 derecede kuluçkaya yatırın, 10 dakika sonra tüpleri kuru banyo kuluçka makinesinden alın. DNA çıkarma kitinden 100 mikrolitre seyreltme çözeltisi ekleyin ve çözeltiyi birkaç kez yukarı ve aşağı borulandırarak karıştırın.Broşür çıkarma için aynı adımı tekrarlayın. Çözeltiyi daha fazla karıştırmak için sallayın. Bitki sorunu genellikle bu tedaviden sonra bozulmuş gibi görünmüyor.Sıvı rengi değişebilir ve bulutlu olabilir. QPCR alet termobisiklet koşullarını, ilk denatürasyon için sabit bir sıcaklık adımı ile başlayan, ardından 25 döngü amplifikasyon ile başlayan ve yüksek çözünürlüklü bir erime eğrisi elde etmek için sıcaklık rampasıyla sona eren tablo bire göre yapılandırın. QPCR ana karışımını ve ikinci tabloda listelenen astarları kullanmadan önce oda sıcaklığında eritin.Her kuyuya yüklenecek reaksiyonu planlayın. Hedef türlerle pozitif kontroller, hedef olmayan türler ile pozitif kontroller, numuneler ve negatif kontroller içeren kuyular. Bu örnekte, 10 kuyu, Beş Alman papatya tanımlama testi ve roma papatya tanımlama testi için başka bir beş kullanılır.Türlerin tanımlama testi her türü için, bir kuyu hedeflenen türler referans malzemeden çıkarılan DNA ile pozitif kontrol içerir, bir kuyu hedeflenmemiş türler referans malzemeden çıkarılan DNA ile pozitif kontrol içerir, iki kuyu alandan çıkarılan çiçek ve yaprak DNA örnekleri ile doldurulur, ve bir kuyu negatif kontrol için ayrılmıştır. Tablo üç her iyi türü açıklar. Her botanik tür tanımlama testi için tablo dört göre bir reaksiyon ana karışımı hazırlayın.Tipik bir reaksiyon ana karışımı evrensel qPCR ana karışımı, iki kez, ileri ve ters türler belirli astarlar ve nükleaz içermeyen su içerir. Kullanmadan önce pipetleme ile reaksiyon ana karışımını iyice karıştırın. PCR reaksiyon kartuşu yüzeyini düz ve sabit bir yüzeye yerleştirin.Burada tanımlanan kuyulara göre kartuş kuyularına bir önceki adımda yapılandırılan reaksiyon ana karışımının 18 mikrolitresini yükleyin. Bu gösteri için, GC testi için etiketlenmiş kuyulara Alman papatya kimlik testi reaksiyonu ana karışımını ekleyin, GCT 1, üç, beş, yedi, dokuz, ve Roma papatya kimlik testi reaksiyon ana karışımı rc testi için etiketlenmiş kuyular içine, RCT kuyuları iki, dört, altı, sekiz, 10. DNA ekstraksiyon tüplerinin süpernatantından iki mikrolitre örnek DNA aktarın ve önceden çıkarılmış DNA pozitif kontrolleri qPCR ana karışımı ile önceden yüklenmiş kartuş kuyularına aktarın.QPCR ana karışımına her DNA şablonu ekledikten sonra, çözeltiyi pipetleme ile hafifçe karıştırın. Kartuşunu yapışkan filmle dikkatlice kapatın. Kartuşu termobisiklet odasına yükleyin ve kapatın.QPCR aracını çalışacak şekilde ayarlayın. Geçerli protokolde, hedef parçaların gerçek zamanlı olarak amplifikasyon ölçmek için intercalating boya kullanılır. Ct değeri, floresan sinyalin önceden tanımlanmış eşiği geçmesi için gereken döngü sayısı olarak tanımlanır.25 döngüden daha küçük bir Ct değeri pozitif amplifikasyon olarak kabul edildi. Bu şekilde, Roma pozitif kontrolü sadece Roma papatya tanımlama testinde güçlendirilmiştir, ancak Alman papatya tanımlama testinde değil. Alman papatya pozitif kontrol ve alan örnekleri sadece Alman papatya tanımlama testinde yükseltildi, ancak Roma papatya tanımlama testinde güçlendirildi.Negatif kontrol her iki testte de yükseltilemedi. Pozitif kontrol ve numunelerde spesifik amplifikasyonu doğrulamak için, her kuyudan PCR ve ürün fraksiyonları laboratuvarda %2 agarose jel üzerinde çalıştırıldı. Ct değeri 25'ten az olan tüm kuyular, Alman papatyası ve Roma papatyası arasında farklılık gösteren beklenen boyutlarda amlikon vermiştir.Şeritlerin geri kalanı, saha testlerinde gözlenen bu kuyular için floresan sinyal yokluğu ile uyum içinde, belirli bir amplifikasyon ürünü gösterdi. PCR amplifikasyonunun ardından floresan sinyali izlemek için kullanılan aynı yazılım kullanılarak bir erime eğrisi analizi yapıldı. Sıcaklığın artmasıyla, çift iplikli amfisler ayrışmaya başlar ve floresan şiddetinin azalmasına neden olur.Floresan yoğunluğu değişiklikleri, Alman papatyasının karakteristik erime zirveleri ile Roma papatyasından daha fazla farklılaşması için erime tepe eğrilerine dönüştürüldü. Bu rakam, Alman papatya pozitif kontrolü erime zirvesi 85.6 santigrat derece ve Roma papatya pozitif kontrolü erime zirvesinden farklıdır. Alan örneklerinden alınan PCR amplicon'lar, Alman papatya pozitif kontrolüne yakın erime zirveleri üretir.Alan numunesinin kimliği, kontrollere uyan spesifik amplifikasyon ve karakteristik erime sıcaklığına göre belirlenir. Bu örnekte, tarlada toplanan hem çiçek hem de yaprak Matricaria chamomilla, Alman papatyası olarak tanımlanmıştır. Bu iki örnek için Roma papatya test sonuçları negatiftir.Protokol, taşınabilir bir qPCR sistemi kullanılarak alman papatyasının sahada tanımlanmasını göstermektedir. Benzer yöntemler test edilebilir botanik portföyünü genişletmek için geliştirebilirsiniz. Bu videonun bilim adamları için değerli eğitim materyalleri sağlayacağını umuyoruz, hatta uzman olmayan kişiler de sahada veya sınırlı laboratuvar ekipmanı olan bir ortamda botanik tanımlama yapmak için.DNA tabanlı alan tanımlama testleri sadece laboratuvar analizine uyan son derece doğru sonuçlar üretmekle kalmamış, aynı zamanda laboratuvarda uygulanan geleneksel yöntemlerle ilişkili zaman ve maliyetleri de azaltır.

Research

JoVE Journal

Biology

Field Identification of Matricaria chamomilla using a Portable qPCR System

Long-term Imaging Mammalian Cells using Wide-Field Microscopy

Geniş Alan Mikroskop kullanarak Uzun vadeli Görüntüleme Memeli Hücreleri

Quantitative Real-Time PCR using the Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

Thermo Scientific Solaris qPCR Testi kullanarak Kantitatif Real-Time PCR

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and ...

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR (qPCR) Arrays

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR qPCR Arrays

Kantitatif Gerçek-zamanlı PCR (qPCR) Diziler kullanarak Pre-mikro RNA&#39;lar ve microRNA, Profilleme

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower ...

Visualization of Caenorhabditis elegans Cuticular Structures Using the Lipophilic Vital Dye DiI

Visualization of Caenorhabditis elegans Cuticular Structures Using the Lipophilic Vital Dye DiI

Görselleştirme Caenorhabditis Elegans Tırnak Yapıları Lipofilik Vital Boya, DII

The cuticle of C. elegans is a highly resistant structure that surrounds the exterior of the animal1-4. The cuticle not only protects the animal from the ...

Identification of Protein Interacting Partners Using Tandem Affinity Purification

Tandem Affinity Arıtma kullanarak Protein etkileşim Ortaklar belirlenmesi

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein ...

Pyrosequencing for Microbial Identification and Characterization

Mikrobiyal Tanımlama ve Karakterizasyonu için Pyrosequencing

Pyrosequencing is a versatile technique that facilitates microbial genome sequencing that can be used to identify bacterial species, discriminate ...

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

Live Algılama<em&gt; Escherichia coli</em&gt; O157: PMA-qPCR H7 Hücreler

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. ...

A Strategy for Sensitive, Large Scale Quantitative Metabolomics

Hassas, Büyük Ölçekli Kantitatif metabolomik için bir strateji

Metabolite profiling has been a valuable asset in the study of metabolism in health and disease. However, current platforms have different limiting ...

qPCR Is a Sensitive and Rapid Method for Detection of Cytomegaloviral DNA in Formalin-fixed, Paraffin-embedded Biopsy Tissue

QPCR Formalinle sabit, Parafin-gömülü Biyopsi Doku sitomegaloviral DNA tespiti için bir Hassas ve Hızlı Yöntem mi

It is crucial to identify cytomegalovirus (CMV) infection in the gastrointestinal (GI) tract of immunosuppressed patients, given their greater risk for ...

Identification of Kinase-substrate Pairs Using High Throughput Screening

Yüksek Verimli Tarama kullanma Kinaz-substrat Çiftlerinin Kimlik


We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel ...