Name: a custom multiphoton microscopy platform for live imaging of mouse cornea and conjunctiva
Uploaded: 2020-05-17T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Custom Multiphoton Microscopy Platform for Live Imaging of Mouse Cornea and Conjunctiva at JoVE.com

نشكر دعم المنحة من وزارة العلوم والتكنولوجيا، تايوان (106-2627-M-002-034، 107-2314-B-182A-089، 108-2628-B-002-023، 108-2628-B-002-023)، مستشفى جامعة تايوان الوطنية (NTUH108-T17) ومستشفى تشانغ جونج التذكاري، تايوان (CMRPG3G1621، CMRPG3G1622، CMRPG3G1623).

وقد اجريت جميع التجارب على الحيوانات وفقا للاجراءات التى وافقت عليها اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوانات التابعة لجامعة تايوان الوطنية ومستشفى تشانغ جونج التذكارى .
1. إعداد المجهر متعدد الصور
<ol><li>بناء نظام يقوم على المجهر تستقيم مع غمر الماء 20x 1.00 NA الهدف (<strong class="x...

<ol>
	<li>DelMonte, D. W., Kim, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+and+physiology+of+the+cornea.">Anatomy and physiology of the cornea.</a> Journal of Cataract &amp; Refractive Surgery. 37 (3), 588-598 (2011).</li><li>Van Buskirk, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+anatomy+of+the+limbus.">The anatomy of the limbus.</a> Eye (London). 3, 101-108 (1989).</li><li>Hodges, R. R., Dartt, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tear+film+mucins:+front+line+defenders+of+the+ocular+surface;+comparison+with+airway+and+gastrointestinal+tract+mucins.">Tear film mucins: front line defenders of the ocular surface; comparison with airway and gastrointestinal tract mucins.</a> Experimental Eye Research. 117, 62-78 (2013).</li><li>Tan, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiphoton+fluorescence+and+second+harmonic+generation+imaging+of+the+structural+alterations+in+keratoconus+ex+vivo.">Multiphoton fluorescence and second harmonic generation imaging of the structural alterations in keratoconus ex vivo.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 47 (12), 5251-5259 (2006).</li><li>Konig, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiphoton+microscopy+in+life+sciences.">Multiphoton microscopy in life sciences.</a> Journal of Microscopy. 200, 83-104 (2000).</li><li>Rompolas, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+coordination+of+stem+cell+commitment+during+epidermal+homeostasis.">Spatiotemporal coordination of stem cell commitment during epidermal homeostasis.</a> Science. 352 (6292), 1471-1474 (2016).</li><li>Park, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-scale+coordination+of+cellular+behaviour+promotes+epidermal+wound+repair+in+live+mice.">Tissue-scale coordination of cellular behaviour promotes epidermal wound repair in live mice.</a> Nature Cell Biology. 19 (2), 155-163 (2017).</li><li>Xin, T., Gonzalez, D., Rompolas, P., Greco, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flexible+fate+determination+ensures+robust+differentiation+in+the+hair+follicle.">Flexible fate determination ensures robust differentiation in the hair follicle.</a> Nature Cell Biology. 20 (12), 1361-1369 (2018).</li><li>Wu, Y. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+multiphoton+microscopic+imaging+platform+for+ocular+surface+imaging.">Intravital multiphoton microscopic imaging platform for ocular surface imaging.</a> Experimental Eye Research. 182, 194-201 (2019).</li><li>Wu, Y. F., Tan, H. Y., Lin, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-Term+Intravital+Imaging+of+the+Cornea,+Skin,+and+Hair+Follicle+by+Multiphoton+Microscope.">Long-Term Intravital Imaging of the Cornea, Skin, and Hair Follicle by Multiphoton Microscope.</a> Methods in Molecular Biology. , (2019).</li><li>Lo, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+Fourier+transform-based+analysis+of+second-harmonic+generation+image+in+keratoconic+cornea.">Fast Fourier transform-based analysis of second-harmonic generation image in keratoconic cornea.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 53 (7), 3501-3507 (2012).</li><li>Tan, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiphoton+fluorescence+and+second+harmonic+generation+microscopy+for+imaging+infectious+keratitis.">Multiphoton fluorescence and second harmonic generation microscopy for imaging infectious keratitis.</a> Journal of Biomedical Optics. 12 (2), 024013 (2007).</li><li>Jester, J. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Four-dimensional+multiphoton+confocal+microscopy:+the+new+frontier+in+cellular+imaging.">Four-dimensional multiphoton confocal microscopy: the new frontier in cellular imaging.</a> Oculur Surface. 2 (1), 10-20 (2004).</li><li>Morishige, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Second-harmonic+imaging+microscopy+of+normal+human+and+keratoconus+cornea.">Second-harmonic imaging microscopy of normal human and keratoconus cornea.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 48 (3), 1087-1094 (2007).</li><li>Hao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+non-linear+optical+(NLO)+imaging+in+live+rabbit+eyes+using+the+Heidelberg+Two-Photon+Laser+Ophthalmoscope.">In vivo non-linear optical (NLO) imaging in live rabbit eyes using the Heidelberg Two-Photon Laser Ophthalmoscope.</a> Experimental Eye Research. 91 (2), 308-314 (2010).</li><li>Chen, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=R26R-GR:+a+Cre-activable+dual+fluorescent+protein+reporter+mouse.">R26R-GR: a Cre-activable dual fluorescent protein reporter mouse.</a> PLoS One. 7 (9), 46171 (2012).</li><li>Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+global+double-fluorescent+Cre+reporter+mouse.">A global double-fluorescent Cre reporter mouse.</a> Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Masihzadeh, O., Lei, T. C., Ammar, D. A., Kahook, M. Y., Gibson, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multiphoton+microscope+platform+for+imaging+the+mouse+eye.">A multiphoton microscope platform for imaging the mouse eye.</a> Molecular Vision. 18, 1840-1848 (2012).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+of+the+cornea+visualized+in+the+living+mouse+using+vital+dyes.">Two-photon imaging of the cornea visualized in the living mouse using vital dyes.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 54 (10), 6526-6536 (2013).</li><li>Lee, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+confocal+microscopy+and+two-photon+microscopy+in+mouse+cornea+in+vivo.">Comparison of confocal microscopy and two-photon microscopy in mouse cornea in vivo.</a> Experimental Eye Research. 132, 101-108 (2015).</li><li>Ehmke, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+nonlinear+imaging+of+corneal+structures+with+special+focus+on+BALB/c+and+streptozotocin-diabetic+Thy1-YFP+mice.">In vivo nonlinear imaging of corneal structures with special focus on BALB/c and streptozotocin-diabetic Thy1-YFP mice.</a> Experimental Eye Research. 146, 137-144 (2016).</li><li>Webster, M. T., Manor, U., Lippincott-Schwartz, J., Fan, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+Imaging+Reveals+Ghost+Fibers+as+Architectural+Units+Guiding+Myogenic+Progenitors+during+Regeneration.">Intravital Imaging Reveals Ghost Fibers as Architectural Units Guiding Myogenic Progenitors during Regeneration.</a> Cell Stem Cell. 18 (2), 243-252 (2016).</li><li>Mesa, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homeostatic+Epidermal+Stem+Cell+Self-Renewal+Is+Driven+by+Local+Differentiation.">Homeostatic Epidermal Stem Cell Self-Renewal Is Driven by Local Differentiation.</a> Cell Stem Cell. 23 (5), 677-686 (2018).</li><li>Goh, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+imaging+of+dendritic+cell+responses+to+sterile+tissue+injury.">Real-time imaging of dendritic cell responses to sterile tissue injury.</a> Journal of Investigative Dermatology. 135 (4), 1181-1184 (2015).</li><li>Kissenpfennig, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+and+function+of+Langerhans+cells+in+vivo:+dermal+dendritic+cells+colonize+lymph+node+areas+distinct+from+slower+migrating+Langerhans+cells.">Dynamics and function of Langerhans cells in vivo: dermal dendritic cells colonize lymph node areas distinct from slower migrating Langerhans cells.</a> Immunity. 22 (5), 643-654 (2005).</li><li>Chow, Z., Mueller, S. N., Deane, J. A., Hickey, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dermal+regulatory+T+cells+display+distinct+migratory+behavior+that+is+modulated+during+adaptive+and+innate+inflammation.">Dermal regulatory T cells display distinct migratory behavior that is modulated during adaptive and innate inflammation.</a> Journal of Immunology. 191 (6), 3049-3056 (2013).</li><li>Dudeck, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mast+cells+are+key+promoters+of+contact+allergy+that+mediate+the+adjuvant+effects+of+haptens.">Mast cells are key promoters of contact allergy that mediate the adjuvant effects of haptens.</a> Immunity. 34 (6), 973-984 (2011).</li></ol>

تم استخدام هذه المنصة التصويرية MPM المبنية خصيصًا مع برنامج تحكم للتصوير داخل الرحم للأعضاء الظهارية للماوس ، بما في ذلك الجلد10، بصيلات الشعر10 وسطح العين9،10 (الشكل 1A). تم استخدام النظام المصنوع خصيصًا لمرونته في تغ?...

تحمي هياكل سطح العين، بما في ذلك القرنية والملتحمة، الأنسجة الأخرى الأعمق من الاضطرابات الخارجية. تعمل القرنية، الجزء الأمامي الشفاف للعين، كعدسة انكسارية لتوجيه الضوء إلى العين وكحاجز وقائي. ظهارة القرنية هي الطبقة الخارجية من القرنية وتتكون من طبقات متميزة من الخلايا السطحية وخلايا الجناح والخلايا القاعدية. يتكون القرنية ستروما من اللامي كولاجينوسي معبأة متطورة جزءا لا يتجزأ من القرنية. إن بطانة القرنية، وهي طبقة واحدة من الخلايا سداسية مسطحة، لها دور مهم في الحفاظ على شفافية القرنية من خلال الحفاظ على السترما القرنية في حالة جفاف نسبي من خلال وظائف الضخ1. ليفوس يشكل الحدود بين القرنية والملتحمة، وهو خزان الخلايا الجذعية الظهارية القرنية2. تساعد الملتحمة الوعائية العالية على تليين العينين عن طريق إنتاج المخاط والدموع3.
تتم دراسة ديناميات الخلايا في هياكل سطح القرنية بشكل تقليدي إما عن طريق التحليل النسيجي أو في زراعة الخلايا في المختبر ، والتي قد لا تحاكي بشكل كاف ديناميات الخلايا الحية. وبالتالي، فإن نهج التصوير الحي غير الغازي يمكن أن يسد هذه الفجوة. نظرا لمزاياها، والتي تشمل دقة عالية، والحد الأدنى من الصور وعمق عمق التصوير، MPM أصبحت طريقة قوية في مجالات مختلفة من البحوث البيولوجية4،5،6،7،8. بالنسبة لتصوير القرنية، توفر MPM معلومات خلوية من الفلورا الذاتية الجوهرية المستمدة من NAD (P)H داخل الخلايا. الجيل التوافقي الثاني (SHG) إشارات المستمدة من نوع غير centrosymmetric أنا ألياف الكولاجين تحت femtosecond ليزر المسح يوفر هياكل السترومال الكولاجين دون إجراءات تلطيخ إضافية9. في السابق، ونحن وغيرها من الجماعات قد استغلت MPM لتصوير القرنيات الحيوانية والبشرية9،10،11،12،13،14،15.
خطوط الماوس المعدلة وراثيا عرض البروتينات الفلورية في مجموعات خلايا محددة وقد استخدمت على نطاق واسع لدراسات مختلفة في بيولوجيا الخلية, بما في ذلك التنمية, الأنسجة التوازن, تجديد الأنسجة, وتولد السرطان. استخدمنا سلالات الماوس المعدلة وراثيا وصفت مع البروتينات الفلورية لفي التصوير في مجال المعلومات الحية من القرنيات9،10، بصيلات الشعر10 والبشرة10 بواسطة MPM. يتم تربيت سلالة الماوس الفلورية المزدوجة مع غشاء الخلية المسمى مع tdTomato ونواة الخلية الموسومة مع EGFP من سلالات الماوس اثنين: R26R-GR (B6؛ 129-gt (روزا) 26Sortm1Ytchn/J،#021847)16 وmT-mG (Gt(ROSA26)ACTB-tdTomato-EGFP،#007676) 17. يحتوي خط الماوس المعدل وراثيا R26R-GR على ثنائية الفلورسنت البروتين مراسل ينبني، بما في ذلك الجينات الانصهار H2B-EGFP ومشري-GPI مرساة مرساة مرساة الجينات الانصهار إشارة، إدراجها في gt (روزا) 26Sor locus. سلالة mT-mG المعدلة وراثيا هي tdTomato غشاء الخلية المستهدفة وGFP الفئران الفلورسنت كري مراسل. قبل إعادة الكومبينيشن Cre، بروتين غشاء الخلية مع tdTomato التعبير المفلور موجود على نطاق واسع في مختلف الخلايا. هذه السلالة الماوس المعدلة وراثيا تمكننا من تصور nuclei-EGFP والغشاء مع tdTomato دون الإثارة Cre. ولدت اثنين من الإناث (R26R-GR+/+) و ذكر واحد (mT-mG+/+)الماوس المعدل وراثيا معا لإنتاج فئران كافية للتجارب. ذريتهم مع R26R-GR+/-mT-mG+/- النمط الجيني، سلالة الفئران الفلورية المزدوجة، استخدمت في هذه الدراسة. بالمقارنة مع واحد الفلورسنت خط الماوس مراسل كما هو موضح سابقا9،10، وهذا مزدوج الفلورسنت المصابيح الماوس سلالة يوفر لنا 50 ٪ تخفيض الحصول على وقت التصوير.
في هذا العمل، نحن وصف بروتوكول تقني مفصل للتصوير في الجسم الحي من سطح العين بطريقة خطوة بخطوة باستخدام منصة التصوير لدينا والفئران المعدلة وراثيا الفلورسنت المزدوج.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>AVIZO Lite software</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Version: 2019.3.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bandpass filters</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF01-434/17 
			FF01-500/24 
			FF01-585/40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirrors</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF495-Di01-25x36 FF580-Di01-25x36</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Galvano</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>GVS002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jade BIO control software</td>
			<td>SouthPort Corporation</td>
			<td>Jade BIO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxybuprocaine hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>O0270000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMT</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>H7422A-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyesthylene Tube</td>
			<td>BECTON DICKINSON</td>
			<td>427401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic mouse holder</td>
			<td>Step Technology Co.,Ltd</td>
			<td>000111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ti: Sapphire laser</td>
			<td>Spectra-Physics</td>
			<td>Mai-Tai DeepSee</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Upright microscopy</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX51WI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vidisic Gel</td>
			<td>Dr. Gerhard Mann Chem-pharm. Fabrik GmbH</td>
			<td>D13581</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zoletil</td>
			<td>Virbac</td>
			<td>VR-2831</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a custom multiphoton microscopy platform for live imaging of mouse cornea and conjunctiva

التحليل النسيجي التقليدي ونظم زراعة الخلايا غير كافية لمحاكاة في الحركية الفسيولوجية والمرضية تماما. أصبح المجهر متعدد الصور (MPM) واحدة من أكثر طرائق التصوير شعبية لدراسة الطب الحيوي في المستويات الخلوية في الجسم الحي، وتشمل مزايا عالية الدقة، اختراق الأنسجة العميقة والحد الأدنى من السمية الضوئية. لقد قمنا بتصميم منصة تصوير MPM مع حامل عين الماوس المخصصة ومرحلة ستيريو لسطح العين التصوير في الجسم الحي. يتيح الماوس ثنائي البروتين الفلوري تصور نواة الخلية وأغشية الخلايا والألياف العصبية والشعيرات الدموية داخل سطح العين. بالإضافة إلى إشارات الفلورس متعددة الصور، واكتساب الجيل التوافقي الثاني (SHG) يسمح في وقت واحد لتوصيف بنية السترومال الكولاجينية. يمكن استخدام هذه المنصة للتصوير داخل الرحم مع تحديد المواقع الدقيقة عبر سطح العين بأكمله، بما في ذلك القرنية والملتحمة.

باستخدام هذه المنصة التصوير الحية، يمكن تصور سطح العين الماوس في المستويات الخلوية. لتصور الخلايا الفردية الفردية في سطح العين، ونحن تستخدم الفئران المعدلة وراثيا الفلورية المزدوجة مع EGFP أعرب في نواة وddTomato أعرب في غشاء الخلية. تم تسليط الضوء على السترما القرنية الغنية بالكولاجين من خلال...

Watch this Scientific Journal Video about A Custom Multiphoton Microscopy Platform for Live Imaging of Mouse Cornea and Conjunctiva at JoVE.com

A Custom Multiphoton Microscopy Platform for Live Imaging of Mouse Cornea and Conjunctiva

هنا هو منصة مجهرية متعددة الصور للتصوير حية سطح العين الماوس. الماوس الفلوري المحورة تمكن من تصور نواة الخلية، أغشية الخلية، والألياف العصبية والشعيرات الدموية داخل سطح العين. توفر إشارات الجيل التوافقي الثاني غير الخطي المشتقة من الهياكل الكولاجينية تصويرًا خاليًا من التسمية لبنيات ال stromal.

مخصص متعدد الصور المجهر منصة للتصوير الحي من القرنية ماوس وConjunctiva

Conventional histological analysis and cell culture systems are insufficient to simulate in vivo physiological and pathological dynamics completely. ...

يستخدم هذا البروتوكول مجهر متعدد التصفية للتصوير الحي للهيكل الكامل لسطح العين الماوس في نموذج الماوس الفلوري المزدوج المعدلة وراثيا. إن الجمع بين منصة مجهرية متعددة الصور مخصصة وفئران ثنائية محورة وراثيا للفلورسنت تمكن من التصور في الوقت الحقيقي لسطح العين وبنيته. لإعداد المجهر متعدد الصور، حدد غمر الماء 20X، 1.00 NA الهدف وتعيين ليزر التيتانيوم الياقوت كمصدر الإثارة على المجهر تستقيم.تعيين الطول الموجي خرج الليزر إلى 880 نانومتر لEGFP و 940 نانومتر ل tdTomato. وتشمل اثنين من المرايا dichroic لفصل SHG EGFP وGFP tdTomato واستخدام 434-17، 510-84 و 585-40 نانومتر تمرير الفرقة المرشحات لفصل الطيفي إشارات EGFP وSdTomato. لإعداد حامل العين ، بعد التأكد من عدم الاستجابة لدواسة منعكس في تخدير 8-12 ماوس من العمر أسبوع ، ضع الماوس على مرحلة المجهر ساخنة وإدراج مسبار مراقبة درجة الحرارة.ضع الماوس في حامل فأر مجسم مخصص وأدخل قضبان الأذن في اللحم السمعي الخارجي. استخدام ثلاث نقاط التثبيت لتأمين حامل الرأس وتطبيق 0.4٪ هيدروكلوريد أوكسيبوكوكاين والمحلول الملحي على سطح العين. تغطية نصائح من زوج من عدد خمسة دومون ملقط مع حلقة أنبوب PE.بعد ثلاث دقائق إجراء تراجع الجفن اليدوي لتأكيد نتوء مقلة العين ووضع بعناية حلقة أنبوب حامل PE على طول هامش الجفن لفضح سطح العين. واستخدام مقبض الباب من حامل لتحقيق الاستقرار في مقلة العين مع ملقط. ثم، تغطية سطح القرنية مع هلام العين مع مؤشر الانكسار من 1.338.بالنسبة للتصوير التسلسلي Z لسطح القرنية، استخدم مصدر ضوء الزئبق لتصوير حقل الاستهداف وفتح برنامج المجهر. حدد مضاعف الصورة المناسبة والمكاسب الرقمية لتصور بنية الخلوية في سطح العين وتعيين الشريحة الأولى والأخيرة للسماح بالحصول على كومة صورة. تعيين دقة الصورة إلى 512 في 512 بكسل و خطوة Z إلى ميكرومتر واحد.ثم انقر فوق ابدأ لجمع Z الصور التسلسلية الحصول على صورة حية واحدة مع 880 نانومتر الإثارة لجمع إشارة EGFP SHG، وصورة حية واحدة في 940 نانمتر الإثارة لجمع إشارة EGFP tdTomato داخل كل منطقة. في جميع أنحاء الصورة، استخدم حامل المرحلة السائرة الآلية لتدوير مقلة العين للسماح بالتصوير عبر سطح القرنية بأكمله. عندما تم الحصول على جميع الصور، قم بتحميل الصور التسلسلية Z في فيجي وحدد البرنامج المساعد Median 3D filter.بعد إزالة الضوضاء الخلفية، حدد حزمة تصفية قناع unsharp فيجي لشحذ الصور وانقر على النقيض سطوع السيارات لتحسين جودة الصور تلقائيا. بعد المعالجة، حفظ الصور كتسلسل صورة تسلسلي وتصدير تسلسل الصورة إلى برنامج إعادة الإعمار 3D المناسبة. في جميع الصور المجهرية متعددة الصور، تقديم إشارات EGFP tdTomato و SHG باللونين الأخضر الزائف والأحمر السماوي على التوالي قبل التقاط صور الهيكل ثلاثي الأبعاد بواسطة لقطة.يسمح المجهر متعدد الصور بالتصور من الجناح السطحي والخلايا القاعدية في ظهارة القرنية للفئران المعدلة وراثيا الفلورية المزدوجة. يمكن تعيين خلايا واحدة من الطبقة القاعدية إلى الطبقة السطحية وكذلك خلايا سطحية واحدة سداسية الشكل. كما كشفت عن ذلك التعبير السيتوبلازمي لإشارة tdTomato ، فإن نظام الغشاء الغني بالبروتين داخل الخلايا ، بما في ذلك جهاز golgi و endoplasmic الشبكية متناثر داخل الخلايا الجناحية.ضمن ستروما collagenous، وترد على شكل ممتاز coratesites من قبل الغشاء استهداف الفلورسنتين EGFP في هذه الفئران. وcoratesites جزءا لا يتجزأ من ستروما الكلية هي أكثر متباعدة فضفاضة من داخل الخلايا البطانية. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أيضا أن يتصور الأعصاب المتفرعة رقيقة داخل ستروما القرنية من قبل غشاء استهداف إشارات tdTomato و monolays الخلايا البطانية القرنية تظهر شكل سداسية متجانسة نسبيا متصلة في نمط العسل.يتكون ظهارة الـ Limbal من طبقة إلى طبقتين من الخلايا الظهارية. كما تمكن السلالة المعدلة وراثياً من الفلورسنت المزدوجة من تصوير الشعيرات الدموية داخل الملتحمة، مما يسهل إعادة بناء العمارة ثلاثية الأبعاد للريش الدموية التي تحدد بطانة الأوعية الدموية. استقرار مقلة العين مع الضغط المعتدل دون إصابة أمر بالغ الأهمية للحصول على صور ذات نوعية جيدة كما ضغط غير كاف أو المفرط يمكن أن يعرض للخطر جودة الصورة.يمكن تعديل هذه المنصة تصوير الصور NVivo للتصور من الهياكل تحت سطح العين ويمكن تطبيقها على الدراسات في الموقع من مختلف الأمراض العيون.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy

تحضير العينة ، والتصوير ، وتحليل بروتوكولات لالميكروسكوب الضوئي سكين الحافة

Major advances in high-throughput, high-resolution, 3D microscopy techniques have enabled the acquisition of large volumes of neuroanatomical data at ...

Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

باستخدام رقائق الموائع الدقيقة للتصوير لايف ودراسة الردود الإصابات في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; يرقات

Live imaging is an important technique for studying cell biological processes, however this can be challenging in live animals. The translucent cuticle of ...

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

مضان تبريد لالقريبة من الأشعة تحت الحمراء Fluorophore-مغلفة Liposomal كأداة لل<em&gt; في فيفو</em&gt; التصوير الضوئي

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous ...

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

قوة الذرية المجهر التصوير وقوة التحليل الطيفي لدعم الدهن طبقات ثنائية

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

Visualizing Angiogenesis by Multiphoton Microscopy In Vivo in Genetically Modified 3D-PLGA/nHAp Scaffold for Calvarial Critical Bone Defect Repair

Visualizing Angiogenesis by Multiphoton Microscopy In Vivo in Genetically Modified 3D-PLGA/nHAp Scaffold for Calvarial Critical Bone Defect Repair

تصور الأوعية بالفحص المجهري مولتيفوتون في فيفو في "الكائنات المعدلة وراثيا" سقالة 3D-بلجا/نهاب كالفاريال إصلاح العيب العظام الحرجة

The reconstruction of critically sized bone defects remains a serious clinical problem because of poor angiogenesis within tissue-engineered scaffolds ...

Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform

Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform

التصوير مورفولوجيا الجذر الشعر شتلات نبات في منصة موائع جزيئية طبقتين

Root hairs increase root surface area for better water uptake and nutrient absorption by the plant. Because they are small in size and often obscured by ...

Fabrication of Custom Agarose Wells for Cell Seeding and Tissue Ring Self-assembly Using 3D-Printed Molds

تلفيق من الآبار المخصصة [اغروس] لبذر الخلية والأنسجة خاتم التجميع الذاتي باستخدام قوالب طباعة 3D

Engineered tissues are being used clinically for tissue repair and replacement, and are being developed as tools for drug screening and human disease ...

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

منصة موائع جزيئية "التصوير الطولي" في ايليجانس كاينورهابديتيس

In the last decade, microfluidic techniques have been applied to study small animals, including the nematode Caenorhabditis elegans, and have proved ...

Visualizing Adhesion Formation in Cells by Means of Advanced Spinning Disk-Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

تصور تشكيل الالتصاق في الخلايا من خلال متقدم الغزل مجهرية Fluorescence انعكاس الداخلية القرص--المجموع

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to ...