Name: a custom multiphoton microscopy platform for live imaging of mouse cornea and conjunctiva
Uploaded: 2020-05-17T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Custom Multiphoton Microscopy Platform for Live Imaging of Mouse Cornea and Conjunctiva at JoVE.com

Vi takker tilskudsstøtte fra Ministeriet for Videnskab og Teknologi, Taiwan (106-2627-M-002-034, 107-2314-B-182A-089, 108-2628-B-002-023, 108-2628-B-002-023), National Taiwan University Hospital (NTUH108-T17) og Chang Gung Memorial Hospital, Taiwan (CMRPG3G1621, CMRPG3G1622, CMRPG3G1623).

Alle dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med procedurer godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) fra National Taiwan University og Chang Gung Memorial Hospital.
1. Opsætning af multifotonmikroskopi
<ol><li>Byg et system baseret på et opretstående mikroskop med vandnedsænkning 20x 1,00 NA mål (Figur 1A).</li>
	<li>Brug Ti: Safir laser (med tunable bølgelængde) som excitation kilde. Laserudgangsbølgelængden indstilles til 88...

<ol>
	<li>DelMonte, D. W., Kim, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+and+physiology+of+the+cornea.">Anatomy and physiology of the cornea.</a> Journal of Cataract &amp; Refractive Surgery. 37 (3), 588-598 (2011).</li><li>Van Buskirk, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+anatomy+of+the+limbus.">The anatomy of the limbus.</a> Eye (London). 3, 101-108 (1989).</li><li>Hodges, R. R., Dartt, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tear+film+mucins:+front+line+defenders+of+the+ocular+surface;+comparison+with+airway+and+gastrointestinal+tract+mucins.">Tear film mucins: front line defenders of the ocular surface; comparison with airway and gastrointestinal tract mucins.</a> Experimental Eye Research. 117, 62-78 (2013).</li><li>Tan, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiphoton+fluorescence+and+second+harmonic+generation+imaging+of+the+structural+alterations+in+keratoconus+ex+vivo.">Multiphoton fluorescence and second harmonic generation imaging of the structural alterations in keratoconus ex vivo.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 47 (12), 5251-5259 (2006).</li><li>Konig, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiphoton+microscopy+in+life+sciences.">Multiphoton microscopy in life sciences.</a> Journal of Microscopy. 200, 83-104 (2000).</li><li>Rompolas, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+coordination+of+stem+cell+commitment+during+epidermal+homeostasis.">Spatiotemporal coordination of stem cell commitment during epidermal homeostasis.</a> Science. 352 (6292), 1471-1474 (2016).</li><li>Park, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-scale+coordination+of+cellular+behaviour+promotes+epidermal+wound+repair+in+live+mice.">Tissue-scale coordination of cellular behaviour promotes epidermal wound repair in live mice.</a> Nature Cell Biology. 19 (2), 155-163 (2017).</li><li>Xin, T., Gonzalez, D., Rompolas, P., Greco, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flexible+fate+determination+ensures+robust+differentiation+in+the+hair+follicle.">Flexible fate determination ensures robust differentiation in the hair follicle.</a> Nature Cell Biology. 20 (12), 1361-1369 (2018).</li><li>Wu, Y. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+multiphoton+microscopic+imaging+platform+for+ocular+surface+imaging.">Intravital multiphoton microscopic imaging platform for ocular surface imaging.</a> Experimental Eye Research. 182, 194-201 (2019).</li><li>Wu, Y. F., Tan, H. Y., Lin, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-Term+Intravital+Imaging+of+the+Cornea,+Skin,+and+Hair+Follicle+by+Multiphoton+Microscope.">Long-Term Intravital Imaging of the Cornea, Skin, and Hair Follicle by Multiphoton Microscope.</a> Methods in Molecular Biology. , (2019).</li><li>Lo, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+Fourier+transform-based+analysis+of+second-harmonic+generation+image+in+keratoconic+cornea.">Fast Fourier transform-based analysis of second-harmonic generation image in keratoconic cornea.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 53 (7), 3501-3507 (2012).</li><li>Tan, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiphoton+fluorescence+and+second+harmonic+generation+microscopy+for+imaging+infectious+keratitis.">Multiphoton fluorescence and second harmonic generation microscopy for imaging infectious keratitis.</a> Journal of Biomedical Optics. 12 (2), 024013 (2007).</li><li>Jester, J. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Four-dimensional+multiphoton+confocal+microscopy:+the+new+frontier+in+cellular+imaging.">Four-dimensional multiphoton confocal microscopy: the new frontier in cellular imaging.</a> Oculur Surface. 2 (1), 10-20 (2004).</li><li>Morishige, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Second-harmonic+imaging+microscopy+of+normal+human+and+keratoconus+cornea.">Second-harmonic imaging microscopy of normal human and keratoconus cornea.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 48 (3), 1087-1094 (2007).</li><li>Hao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+non-linear+optical+(NLO)+imaging+in+live+rabbit+eyes+using+the+Heidelberg+Two-Photon+Laser+Ophthalmoscope.">In vivo non-linear optical (NLO) imaging in live rabbit eyes using the Heidelberg Two-Photon Laser Ophthalmoscope.</a> Experimental Eye Research. 91 (2), 308-314 (2010).</li><li>Chen, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=R26R-GR:+a+Cre-activable+dual+fluorescent+protein+reporter+mouse.">R26R-GR: a Cre-activable dual fluorescent protein reporter mouse.</a> PLoS One. 7 (9), 46171 (2012).</li><li>Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+global+double-fluorescent+Cre+reporter+mouse.">A global double-fluorescent Cre reporter mouse.</a> Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Masihzadeh, O., Lei, T. C., Ammar, D. A., Kahook, M. Y., Gibson, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multiphoton+microscope+platform+for+imaging+the+mouse+eye.">A multiphoton microscope platform for imaging the mouse eye.</a> Molecular Vision. 18, 1840-1848 (2012).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+of+the+cornea+visualized+in+the+living+mouse+using+vital+dyes.">Two-photon imaging of the cornea visualized in the living mouse using vital dyes.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 54 (10), 6526-6536 (2013).</li><li>Lee, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+confocal+microscopy+and+two-photon+microscopy+in+mouse+cornea+in+vivo.">Comparison of confocal microscopy and two-photon microscopy in mouse cornea in vivo.</a> Experimental Eye Research. 132, 101-108 (2015).</li><li>Ehmke, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+nonlinear+imaging+of+corneal+structures+with+special+focus+on+BALB/c+and+streptozotocin-diabetic+Thy1-YFP+mice.">In vivo nonlinear imaging of corneal structures with special focus on BALB/c and streptozotocin-diabetic Thy1-YFP mice.</a> Experimental Eye Research. 146, 137-144 (2016).</li><li>Webster, M. T., Manor, U., Lippincott-Schwartz, J., Fan, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+Imaging+Reveals+Ghost+Fibers+as+Architectural+Units+Guiding+Myogenic+Progenitors+during+Regeneration.">Intravital Imaging Reveals Ghost Fibers as Architectural Units Guiding Myogenic Progenitors during Regeneration.</a> Cell Stem Cell. 18 (2), 243-252 (2016).</li><li>Mesa, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homeostatic+Epidermal+Stem+Cell+Self-Renewal+Is+Driven+by+Local+Differentiation.">Homeostatic Epidermal Stem Cell Self-Renewal Is Driven by Local Differentiation.</a> Cell Stem Cell. 23 (5), 677-686 (2018).</li><li>Goh, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+imaging+of+dendritic+cell+responses+to+sterile+tissue+injury.">Real-time imaging of dendritic cell responses to sterile tissue injury.</a> Journal of Investigative Dermatology. 135 (4), 1181-1184 (2015).</li><li>Kissenpfennig, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+and+function+of+Langerhans+cells+in+vivo:+dermal+dendritic+cells+colonize+lymph+node+areas+distinct+from+slower+migrating+Langerhans+cells.">Dynamics and function of Langerhans cells in vivo: dermal dendritic cells colonize lymph node areas distinct from slower migrating Langerhans cells.</a> Immunity. 22 (5), 643-654 (2005).</li><li>Chow, Z., Mueller, S. N., Deane, J. A., Hickey, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dermal+regulatory+T+cells+display+distinct+migratory+behavior+that+is+modulated+during+adaptive+and+innate+inflammation.">Dermal regulatory T cells display distinct migratory behavior that is modulated during adaptive and innate inflammation.</a> Journal of Immunology. 191 (6), 3049-3056 (2013).</li><li>Dudeck, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mast+cells+are+key+promoters+of+contact+allergy+that+mediate+the+adjuvant+effects+of+haptens.">Mast cells are key promoters of contact allergy that mediate the adjuvant effects of haptens.</a> Immunity. 34 (6), 973-984 (2011).</li></ol>

Denne specialbyggede MPM-billeddannelsesplatform med en kontrolsoftware blev brugt til intravital billeddannelse af museepitelorganer, herunder hud10,hårsækken10 og okulær overflade9,10 (Figur 1A). Det specialbyggede system blev brugt til sin fleksibilitet i at ændre de optiske komponenter til forskellige eksperimenter, siden begyndelsen af vores projekt. Denne billedbehandlingsmeto...

De okulære overfladestrukturer, herunder hornhinden og bindehinden, beskytter andre dybere okulære væv mod eksterne forstyrrelser. Hornhinden, den gennemsigtige forreste del af øjet, fungerer både som en brydningsobjektiv til at lede lys ind i øjet og som en beskyttende barriere. Hornhinde epitel er det yderste lag af hornhinden og består af forskellige lag af overfladiske celler, vingeceller og basalceller. Hornhinde stroma er sammensat af sofistikeret pakket kollagen lamella indlejret med keratocytter. Hornhinde endotel, et enkelt lag af flade sekskantede celler, har en vigtig rolle i at opretholde gennemsigtigheden af hornhinden ved at holde hornhinden stroma i en relativt dehydreret tilstand gennem sin pumpefunktioner1. Limbus danner grænsen mellem hornhinden og bindehinden, og er reservoiret af hornhinde epitel stamceller2. Den stærkt vaskulariserede bindehinde hjælper med at smøre øjnene ved at producere slim og tårer3.
Celledynamik af hornhinden overfladestrukturer er konventionelt undersøgt ved enten histologisk analyse eller in vitro celle kultur, som måske ikke i tilstrækkelig grad simulere in vivo celle dynamik. En ikke-invasiv levende billeddannelse tilgang kan derfor bygge bro over en sådan kløft. På grund af dens fordele, som omfatter høj opløsning, minimal fotoskader og dybere billeddybde, MPM er blevet en kraftfuld modalitet i forskellige områder af biologiskforskning 4,,5,,6,,7,8. Til cornealbilleddannelse giver MPM cellulære oplysninger fra iboende autofluorescens, der stammer fra den intracellulære NAD(P)H. Anden harmoniske generation (SHG) signaler stammer fra den ikke-centrosymmetriske type I kollagen fibre under femtosekald laserscanning giver kollagen strommal strukturer uden yderligere farvning procedurer9. Tidligere har vi og andre grupper udnyttet MPM til billeddannelse af dyre- og humane hornher9,10,,11,,12,,13,14,15.
Transgene muselinjer udviser fluorescerende proteiner i specifikke cellepopulationer har været meget anvendt til forskellige undersøgelser i cellebiologi, herunder udvikling, vævhomostase, vævsregenerering og carcinogenese. Vi brugte transgene musestammer mærket med fluorescerende proteiner til in vivo-billeddannelse af hornhinder9,,10,hårsækkene10 og epidermis10 af MPM. Den dobbelte fluorescerende musestamme med cellemembran mærket med tdTomato og cellekerne mærket med EGFP er avlet fra to musestammer: R26R-GR (B6;129-Gt (ROSA)0tm1Ytchn/J, #021847)16 og mT-mG (Gt(ROSA26)ACTB-tdTomato-EGFP, #007676)17. R26R-GR transgene muselinje indeholder en dobbelt fluorescerende proteinreporter konstruktioner, herunder et H2B-EGFP fusionsgen og mCherry-GPI ankersignalfusionsgen, indsat i Gt (ROSA)26Sor locus. Den mT-mG transgene stamme er en celle membran-målrettet tdTomato og EGFP fluorescerende Cre-reporter mus. Før Kretas rekombination er cellemembranprotein med tdTomato fluorescensudtryk udbredt i forskellige celler. Denne transgene musestamme gør det muligt for os at visualisere kerner-EGFP og membran med tdTomato uden Cre excitation. To hunner (R26R-GR+/+) og en hanmus (mT-mG+/+) blev avlet sammen for at producere tilstrækkeligt med mus til forsøg. Deres afkom med R26R-GR+/-;mT-mG+/- genotype, en dobbelt fluorescerende musstamme, blev anvendt i denne undersøgelse. Sammenlignet med en fluorescerende reporter mus linje som tidligere beskrevet9,10, denne dobbelte fluorescerende reporter mus stamme giver os en 50% reduceret erhvervelse af billeddannelse tid.
I dette arbejde beskriver vi en detaljeret teknisk protokol for in vivo-billeddannelse af den okulære overflade på en trinvis måde ved hjælp af vores billedplatform og dobbelte fluorescerende transgene mus.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>AVIZO Lite software</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Version: 2019.3.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bandpass filters</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF01-434/17 
			FF01-500/24 
			FF01-585/40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirrors</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF495-Di01-25x36 FF580-Di01-25x36</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Galvano</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>GVS002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jade BIO control software</td>
			<td>SouthPort Corporation</td>
			<td>Jade BIO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxybuprocaine hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>O0270000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMT</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>H7422A-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyesthylene Tube</td>
			<td>BECTON DICKINSON</td>
			<td>427401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic mouse holder</td>
			<td>Step Technology Co.,Ltd</td>
			<td>000111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ti: Sapphire laser</td>
			<td>Spectra-Physics</td>
			<td>Mai-Tai DeepSee</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Upright microscopy</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX51WI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vidisic Gel</td>
			<td>Dr. Gerhard Mann Chem-pharm. Fabrik GmbH</td>
			<td>D13581</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zoletil</td>
			<td>Virbac</td>
			<td>VR-2831</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a custom multiphoton microscopy platform for live imaging of mouse cornea and conjunctiva

Konventionelle histologiske analyse- og cellekultursystemer er utilstrækkelige til helt at simulere in vivo-fysiologiske og patologiske dynamikker. Multiphoton mikroskopi (MPM) er blevet en af de mest populære billeddannelse modaliteter for biomedicinsk undersøgelse på cellulære niveauer in vivo, fordele omfatter høj opløsning, dyb væv penetration og minimal fototoksicitet. Vi har designet en MPM-billedplatform med en tilpasset mus øjeholder og en stereotaxic fase til billeddannelse okulær overflade in vivo. Dobbelt fluorescerende protein reporter mus muliggør visualisering af cellekerner, cellemembraner, nervefibre, og kapillærer inden for den okulære overflade. Ud over multiphoton fluorescens signaler, erhverve anden harmoniske generation (SHG) samtidig giver mulighed for karakterisering af kollagen stromale arkitektur. Denne platform kan anvendes til intravital billeddannelse med nøjagtig positionering på tværs af hele den okulære overflade, herunder hornhinde og bindehinde.

Ved hjælp af denne live billedplatform kan musens okulære overflade visualiseres på cellulære niveauer. For at visualisere individuelle enkeltceller i den okulære overflade anvendte vi de dobbelte fluorescerende transgene mus med EGFP udtrykt i kernen og tdTomato udtrykt i cellemembranen. Kollagen-rige hornhinde stroma blev fremhævet af SHG signaler.
I hornhindepitel blev overfladiske celler, vingeceller og basalceller (figur 2) visualiseret. I de dobbelte f...

Watch this Scientific Journal Video about A Custom Multiphoton Microscopy Platform for Live Imaging of Mouse Cornea and Conjunctiva at JoVE.com

A Custom Multiphoton Microscopy Platform for Live Imaging of Mouse Cornea and Conjunctiva

Præsenteret her er en multiphoton mikroskopisk platform for levende mus okulær overflade billeddannelse. Fluorescerende transgene mus muliggør visualisering af cellekerner, cellemembraner, nervefibre og kapillærer inden for den okulære overflade. Ikke-lineære anden harmoniske generation signaler stammer fra kollagen strukturer giver label-fri billeddannelse for stromale arkitekturer.

En brugerdefineret multifoton mikroskopi platform for Live Imaging af mus hornhinde og konjunktiva

Conventional histological analysis and cell culture systems are insufficient to simulate in vivo physiological and pathological dynamics completely. ...

Denne protokol bruger et multifiltermikroskop til levende billeddannelse af hele strukturen af musens okulære overflade i den dobbelte fluorescerende transgene musemodel. Kombinationen af en brugerdefineret multiphoton mikroskopisk platform og dobbelt fluorescerende transgene mus muliggør real-time visualisering af og struktur af den okulære overflade. For at oprette multiphoton mikroskop, skal du vælge vand nedsænkning 20X, 1,00 NA mål og indstille Titanium Sapphire laser som excitation kilde på en opretstående mikroskop.Indstil laseroutputbølgelængden til 880 nanometer for EGFP og 940 nanometer for tdTomato. Medtag to dichroic spejle til adskillelse af SHG EGFP og EGFP tdTomato og brug 434-17, 510-84 og 585-40 nanometer band pass filtre til spektrally adskille SHG EGFP og tdTomato signaler. For at oprette øjet indehaveren, efter at have bekræftet en manglende reaktion på pedal refleks i en bedøvet 8-12 uger gammel mus, skal du placere musen på den opvarmede mikroskop fase og indsætte en temperatur overvågning sonde.Placer musen i en brugerdefineret stereotaxic mus indehaveren og indsæt ørestænger i den eksterne auditive meatus. Brug trepunktsfiksering til at fastgøre hovedholderen og påfør en 0,4% Oxybuprocain hydrochlorid og saltvandsopløsning på okulær overflade. Dæk spidsen af et par nummer fem Dumont-kraftbefædre med PE-rørløkken.Efter tre minutter udføre en manuel øjenlåg tilbagetrækning for at bekræfte øjeæblet fremspring og omhyggeligt placere en PE holder rør loop langs øjenlåget margin til at eksponere den okulære overflade. Og brug knappen af holderen til at stabilisere øjeæblet med snævle. Derefter dække hornhindeoverfladen med en øjengel med et brydningsindeks på 1,338.For Z seriel billedbehandling af hornhinden overflade, skal du bruge en kviksølv lyskilde til billede målretning feltet og åbne mikroskop software. Vælg den relevante fotomultiplikator og digitale gevinster til visualisering af mobilstrukturen på den okulære overflade, og angiv det første og sidste dias for at tillade anskaffelse af en billedstak. Indstil billedopløsningen til 512 gange 512 pixel, og Z-trinnet skal indstilles til ét mikrometer.Klik derefter på start for at indsamle Z serielle billeder erhverve et levende billede med en 880 nanometer excitation for SHG EGFP signal samling, og en levende billede på en 940 nanometer excitation for EGFP tdTomato signal samling inden for hvert område. I hele billedet skal du bruge steppermotoriseret sceneholder til at rotere øjeæblet for at tillade billeddannelse på tværs af hele hornhindens overflade. Når alle billederne er anskaffet, skal du indlæse Z's serielle billeder i Fiji og vælge Median 3D-filterpluginet.Når du har fjernet baggrundsstøjen, skal du vælge den uskarpe maskefilterpakke Fiji for at gøre billederne skarpere og klikke på automatisk lysstyrkekontrast for automatisk at optimere kvaliteten af billederne. Efter behandling skal du gemme billederne som en seriel billedsekvens og eksportere billedsekvensen til et passende 3D-genopbygningsprogram. I alle multiphoton mikroskopi billeder, præsentere EGFP tdTomato og SHG signaler i pseudo grøn, rød og cyan henholdsvis før du optager 3D struktur billeder ved øjebliksbillede.Multiphoton mikroskopi giver mulighed for visualisering af overfladiske Wing og Basal celler i hornhinden epitel af dobbelt fluorescerende transgene mus. Enkelte celler fra det basale lag kan knyttes til det overfladiske lag samt enkelte sekskantede overfladiske celler. Som det viste sig ved det cytoplasmatiske udtryk for tdTomato-signalet, er membranproteinets rige intracellulære veskulære system, herunder golgiapparatet og endoplasmatisk reticulum spredt i vingecellerne.Inden for kollagen stroma, stellate formede coratesites er skitseret af membranen rettet mod EGFP fluorescerende i disse mus. De coratesites indlejret i collegen stroma er mere løst fordelt end inden for endotelceller. Desuden kan tynde forgrening nerver i hornhinden stroma også visualiseres ved membran rettet mod tdTomato signaler og hornhinde endotel celle monolayers demonstrere en relativt homogen sekskantet form forbundet i en honeycombed mønster.Den limbale epitel består af et til to lag af epitelceller. Den dobbelte fluorescerende reporter transgene stamme gør det også muligt at billeddannelse af kapillærer i bindehinden, lette genopbygningen af 3D-arkitekturen af kapillærerne skitserer vaskulære endotel. Stabilisering af øjeæblet med moderat tryk uden skade er afgørende for at erhverve billeder af god kvalitet, da utilstrækkeligt eller for stort tryk kan kompromittere billedkvaliteten.Denne NVivo billedbilledplatform kan ændres til visualisering af strukturer under den okulære overflade og kan anvendes på in-situ undersøgelser af forskellige oftalmologiske sygdomme.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy

Prøvepræparation, Imaging, og Analyse protokoller for knivsæg Scanning Mikroskopi

Major advances in high-throughput, high-resolution, 3D microscopy techniques have enabled the acquisition of large volumes of neuroanatomical data at ...

Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

Brug mikrofluidik Chips til Live Imaging og Undersøgelse af Injury Responses i<em&gt; Drosophila</em&gt; Larver

Live imaging is an important technique for studying cell biological processes, however this can be challenging in live animals. The translucent cuticle of ...

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Fluorescens-quenching af et liposomalt indkapslet Near-infrarøde fluorofor som et værktøj til<em&gt; In Vivo</em&gt; Optisk Imaging

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous ...

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

Atomic force mikroskopi Imaging og Kraft spektroskopi af understøttede lipiddobbeltlag

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

Visualizing Angiogenesis by Multiphoton Microscopy In Vivo in Genetically Modified 3D-PLGA/nHAp Scaffold for Calvarial Critical Bone Defect Repair

Visualizing Angiogenesis by Multiphoton Microscopy In Vivo in Genetically Modified 3D-PLGA/nHAp Scaffold for Calvarial Critical Bone Defect Repair

Visualisere angiogenese af Multiphoton mikroskopi In Vivo i genetisk modificerede 3D-PLGA/nHAp stillads til Calvarial kritiske knogle defekt reparation

The reconstruction of critically sized bone defects remains a serious clinical problem because of poor angiogenesis within tissue-engineered scaffolds ...

Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform

Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform

Imaging rod hår morfologi af Arabidopsis stiklinger i en to-lags mikrofluid Platform

Root hairs increase root surface area for better water uptake and nutrient absorption by the plant. Because they are small in size and often obscured by ...

Fabrication of Custom Agarose Wells for Cell Seeding and Tissue Ring Self-assembly Using 3D-Printed Molds

Fabrikation af brugerdefinerede Agarosen Wells for celle såning og væv Ring samlesæt bruger 3D-trykt forme

Engineered tissues are being used clinically for tissue repair and replacement, and are being developed as tools for drug screening and human disease ...

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

En mikrofluid Platform for langsgående Imaging i Caenorhabditis elegans

In the last decade, microfluidic techniques have been applied to study small animals, including the nematode Caenorhabditis elegans, and have proved ...

Visualizing Adhesion Formation in Cells by Means of Advanced Spinning Disk-Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

Visualisere vedhæftning dannelse i celler ved hjælp af avancerede Spinning Disk-Total interne Reflection Fluorescens mikroskopi

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to ...