Name: a custom multiphoton microscopy platform for live imaging of mouse cornea and conjunctiva
Uploaded: 2020-05-17T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Custom Multiphoton Microscopy Platform for Live Imaging of Mouse Cornea and Conjunctiva at JoVE.com

Wij danken de subsidie van het Ministerie van Wetenschap en Technologie, Taiwan (106-2627-M-002-034, 107-2314-B-182A-089, 108-2628-B-002-023, 108-2628-B-002-023), National Taiwan University Hospital (NTUH108-T17) en Chang Gung Memorial Hospital, Taiwan (CMRP3G1621, CMRPG3G1622, CMRPG3G1623).

Alle dierproeven werden uitgevoerd volgens procedures die zijn goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van de National Taiwan University en Chang Gung Memorial Hospital.
1. Multiphoton microscopie setup
<ol><li>Bouw een systeem op basis van een rechtopstaande microscoop met wateronderdompeling 20x 1,00 NA doelstelling(figuur 1A).</li>
	<li>Gebruik Ti: Sapphire laser (met tunable golflengte) als de excitatiebron. Stel de golflengt...

<ol>
	<li>DelMonte, D. W., Kim, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+and+physiology+of+the+cornea.">Anatomy and physiology of the cornea.</a> Journal of Cataract &amp; Refractive Surgery. 37 (3), 588-598 (2011).</li><li>Van Buskirk, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+anatomy+of+the+limbus.">The anatomy of the limbus.</a> Eye (London). 3, 101-108 (1989).</li><li>Hodges, R. R., Dartt, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tear+film+mucins:+front+line+defenders+of+the+ocular+surface;+comparison+with+airway+and+gastrointestinal+tract+mucins.">Tear film mucins: front line defenders of the ocular surface; comparison with airway and gastrointestinal tract mucins.</a> Experimental Eye Research. 117, 62-78 (2013).</li><li>Tan, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiphoton+fluorescence+and+second+harmonic+generation+imaging+of+the+structural+alterations+in+keratoconus+ex+vivo.">Multiphoton fluorescence and second harmonic generation imaging of the structural alterations in keratoconus ex vivo.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 47 (12), 5251-5259 (2006).</li><li>Konig, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiphoton+microscopy+in+life+sciences.">Multiphoton microscopy in life sciences.</a> Journal of Microscopy. 200, 83-104 (2000).</li><li>Rompolas, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+coordination+of+stem+cell+commitment+during+epidermal+homeostasis.">Spatiotemporal coordination of stem cell commitment during epidermal homeostasis.</a> Science. 352 (6292), 1471-1474 (2016).</li><li>Park, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-scale+coordination+of+cellular+behaviour+promotes+epidermal+wound+repair+in+live+mice.">Tissue-scale coordination of cellular behaviour promotes epidermal wound repair in live mice.</a> Nature Cell Biology. 19 (2), 155-163 (2017).</li><li>Xin, T., Gonzalez, D., Rompolas, P., Greco, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flexible+fate+determination+ensures+robust+differentiation+in+the+hair+follicle.">Flexible fate determination ensures robust differentiation in the hair follicle.</a> Nature Cell Biology. 20 (12), 1361-1369 (2018).</li><li>Wu, Y. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+multiphoton+microscopic+imaging+platform+for+ocular+surface+imaging.">Intravital multiphoton microscopic imaging platform for ocular surface imaging.</a> Experimental Eye Research. 182, 194-201 (2019).</li><li>Wu, Y. F., Tan, H. Y., Lin, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-Term+Intravital+Imaging+of+the+Cornea,+Skin,+and+Hair+Follicle+by+Multiphoton+Microscope.">Long-Term Intravital Imaging of the Cornea, Skin, and Hair Follicle by Multiphoton Microscope.</a> Methods in Molecular Biology. , (2019).</li><li>Lo, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+Fourier+transform-based+analysis+of+second-harmonic+generation+image+in+keratoconic+cornea.">Fast Fourier transform-based analysis of second-harmonic generation image in keratoconic cornea.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 53 (7), 3501-3507 (2012).</li><li>Tan, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiphoton+fluorescence+and+second+harmonic+generation+microscopy+for+imaging+infectious+keratitis.">Multiphoton fluorescence and second harmonic generation microscopy for imaging infectious keratitis.</a> Journal of Biomedical Optics. 12 (2), 024013 (2007).</li><li>Jester, J. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Four-dimensional+multiphoton+confocal+microscopy:+the+new+frontier+in+cellular+imaging.">Four-dimensional multiphoton confocal microscopy: the new frontier in cellular imaging.</a> Oculur Surface. 2 (1), 10-20 (2004).</li><li>Morishige, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Second-harmonic+imaging+microscopy+of+normal+human+and+keratoconus+cornea.">Second-harmonic imaging microscopy of normal human and keratoconus cornea.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 48 (3), 1087-1094 (2007).</li><li>Hao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+non-linear+optical+(NLO)+imaging+in+live+rabbit+eyes+using+the+Heidelberg+Two-Photon+Laser+Ophthalmoscope.">In vivo non-linear optical (NLO) imaging in live rabbit eyes using the Heidelberg Two-Photon Laser Ophthalmoscope.</a> Experimental Eye Research. 91 (2), 308-314 (2010).</li><li>Chen, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=R26R-GR:+a+Cre-activable+dual+fluorescent+protein+reporter+mouse.">R26R-GR: a Cre-activable dual fluorescent protein reporter mouse.</a> PLoS One. 7 (9), 46171 (2012).</li><li>Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+global+double-fluorescent+Cre+reporter+mouse.">A global double-fluorescent Cre reporter mouse.</a> Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Masihzadeh, O., Lei, T. C., Ammar, D. A., Kahook, M. Y., Gibson, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multiphoton+microscope+platform+for+imaging+the+mouse+eye.">A multiphoton microscope platform for imaging the mouse eye.</a> Molecular Vision. 18, 1840-1848 (2012).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+of+the+cornea+visualized+in+the+living+mouse+using+vital+dyes.">Two-photon imaging of the cornea visualized in the living mouse using vital dyes.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 54 (10), 6526-6536 (2013).</li><li>Lee, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+confocal+microscopy+and+two-photon+microscopy+in+mouse+cornea+in+vivo.">Comparison of confocal microscopy and two-photon microscopy in mouse cornea in vivo.</a> Experimental Eye Research. 132, 101-108 (2015).</li><li>Ehmke, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+nonlinear+imaging+of+corneal+structures+with+special+focus+on+BALB/c+and+streptozotocin-diabetic+Thy1-YFP+mice.">In vivo nonlinear imaging of corneal structures with special focus on BALB/c and streptozotocin-diabetic Thy1-YFP mice.</a> Experimental Eye Research. 146, 137-144 (2016).</li><li>Webster, M. T., Manor, U., Lippincott-Schwartz, J., Fan, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+Imaging+Reveals+Ghost+Fibers+as+Architectural+Units+Guiding+Myogenic+Progenitors+during+Regeneration.">Intravital Imaging Reveals Ghost Fibers as Architectural Units Guiding Myogenic Progenitors during Regeneration.</a> Cell Stem Cell. 18 (2), 243-252 (2016).</li><li>Mesa, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homeostatic+Epidermal+Stem+Cell+Self-Renewal+Is+Driven+by+Local+Differentiation.">Homeostatic Epidermal Stem Cell Self-Renewal Is Driven by Local Differentiation.</a> Cell Stem Cell. 23 (5), 677-686 (2018).</li><li>Goh, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+imaging+of+dendritic+cell+responses+to+sterile+tissue+injury.">Real-time imaging of dendritic cell responses to sterile tissue injury.</a> Journal of Investigative Dermatology. 135 (4), 1181-1184 (2015).</li><li>Kissenpfennig, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+and+function+of+Langerhans+cells+in+vivo:+dermal+dendritic+cells+colonize+lymph+node+areas+distinct+from+slower+migrating+Langerhans+cells.">Dynamics and function of Langerhans cells in vivo: dermal dendritic cells colonize lymph node areas distinct from slower migrating Langerhans cells.</a> Immunity. 22 (5), 643-654 (2005).</li><li>Chow, Z., Mueller, S. N., Deane, J. A., Hickey, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dermal+regulatory+T+cells+display+distinct+migratory+behavior+that+is+modulated+during+adaptive+and+innate+inflammation.">Dermal regulatory T cells display distinct migratory behavior that is modulated during adaptive and innate inflammation.</a> Journal of Immunology. 191 (6), 3049-3056 (2013).</li><li>Dudeck, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mast+cells+are+key+promoters+of+contact+allergy+that+mediate+the+adjuvant+effects+of+haptens.">Mast cells are key promoters of contact allergy that mediate the adjuvant effects of haptens.</a> Immunity. 34 (6), 973-984 (2011).</li></ol>

Dit op maat gemaakte MPM imaging platform met een besturingssoftware werd gebruikt voor intravital imaging van muis epitheelorganen, waaronder huid10,haarzakje10 en oculair oppervlak9,10 (Figuur 1A). Het op maat gemaakte systeem werd gebruikt voor zijn flexibiliteit in het veranderen van de optische componenten voor verschillende experimenten, sinds het begin van ons project. Deze beeld...

De oculaire oppervlaktestructuren, waaronder het hoornvlies en het bindvlies, beschermen andere diepere oculaire weefsels tegen externe verstoringen. Het hoornvlies, het transparante voorste deel van het oog, functioneert zowel als een brekingslens voor het richten van licht in het oog als als een beschermende barrière. Corneal epitheel is de buitenste laag van het hoornvlies en bestaat uit verschillende lagen van oppervlakkige cellen, vleugelcellen en basale cellen. Corneal stroma bestaat uit verfijnd verpakt collageen lamellen ingebed met keratocyten. Hoornvlies endotheel, een enkele laag van platte zeshoekige cellen, heeft een belangrijke rol in het behoud van de transparantie van het hoornvlies door het houden van hoornvlies stroma in een relatief uitgedroogde toestand door middel van haar pompen functies1. Limbus vormt de grens tussen het hoornvlies en het bindvlies, en is het reservoir van hoornvlies epitheelstamcellen2. Het sterk vasculaire bindvlies helpt om de ogen te smeren door slijm en tranen te produceren3.
Celdynamica van de hoornvliesoppervlaktestructuren worden conventioneel bestudeerd door histologische analyse of in vitrocelcultuur, die de in vivo celdynamiek mogelijk niet voldoende simuleert. Een niet-invasieve live imaging benadering kan dus de kloof overbruggen. Door de voordelen, waaronder hoge resolutie, minimale fotoschade en diepere beeldvormingsdiepte, is MPM een krachtige modaliteit geworden op diverse gebieden van biologisch onderzoek4,5,6,7,8. Voor hoornvliesbeeldvorming biedt MPM cellulaire informatie uit intrinsieke autofluorescentie afkomstig van de intracellulaire NAD(P)H. Tweede harmonische generatie (SHG) signalen afgeleid van de niet-centrosymmetrische type I collageen vezels onder femtosecond laser scanning biedt collageen stromal structuren zonder extra kleuring procedures9. Voorheen hebben wij en andere groepen MPM uitgebuit voor beeldvorming van dier- en menselijke hoornvliezen9,10,11,12,13,14,15.
Transgene muislijnen die fluorescerende eiwitten vertonen in specifieke celpopulaties zijn op grote schaal gebruikt voor verschillende studies in de celbiologie, waaronder ontwikkeling, weefselhomeostase, weefselregeneratie en carcinogenese. We gebruikten transgene muizenstammen gelabeld met fluorescerende eiwitten voor in vivo beeldvorming van hoornvliezen9,10, haarzakjes10 en opperhuid10 door MPM. De dubbele fluorescerende muisstam met celmembraan gelabeld met tdTomato en celkern gelabeld met EGFP is gefokt uit twee muisstammen: R26R-GR (B6;129-Gt (ROSA)26Sortm1Ytchn/J, #021847)16 en mT-mG (Gt(ROSA26)ACTB-tdTomato-EGFP, #007676)17. R26R-GR transgene muis lijn bevat een dubbele fluorescerende eiwit reporter constructies, met inbegrip van een H2B-EGFP fusie gen en mCherry-GPI anker signaal fusie gen, ingevoegd in de GT (ROSA)26Sor locus. De mT-mG transgene stam is een celmembraan-gerichte tdTomato en EGFP fluorescerende Cre-reporter muizen. Voorafgaand aan Cre recombinatie, celmembraan eiwit met tdTomato fluorescentie expressie is op grote schaal aanwezig in verschillende cellen. Deze transgene muisstam stelt ons in staat om kernen-EGFP en membraan te visualiseren met tdTomato zonder Cre excitatie. Twee vrouwtjes (R26R-GR+/+) en één mannelijke (mT-mG+/+) transgene muis werden samen gekweekt om voldoende muizen te produceren voor experimenten. Hun nakomelingen met R26R-GR+/-;mT-mG+/- genotype, een dubbele fluorescerende muizensoort, werden in deze studie gebruikt. Vergeleken met een fluorescerende reporter muis lijn zoals eerder beschreven9,10, deze dubbele fluorescerende reporter muis stam biedt ons een 50% verminderde verwerving van beeldvorming tijd.
In dit werk beschrijven we een gedetailleerd technisch protocol voor in vivo beeldvorming van het oculaire oppervlak stapsgewijze wijze met behulp van ons imagingplatform en dubbele fluorescerende transgene muizen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>AVIZO Lite software</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Version: 2019.3.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bandpass filters</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF01-434/17 
			FF01-500/24 
			FF01-585/40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirrors</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF495-Di01-25x36 FF580-Di01-25x36</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Galvano</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>GVS002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jade BIO control software</td>
			<td>SouthPort Corporation</td>
			<td>Jade BIO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxybuprocaine hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>O0270000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMT</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>H7422A-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyesthylene Tube</td>
			<td>BECTON DICKINSON</td>
			<td>427401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic mouse holder</td>
			<td>Step Technology Co.,Ltd</td>
			<td>000111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ti: Sapphire laser</td>
			<td>Spectra-Physics</td>
			<td>Mai-Tai DeepSee</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Upright microscopy</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX51WI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vidisic Gel</td>
			<td>Dr. Gerhard Mann Chem-pharm. Fabrik GmbH</td>
			<td>D13581</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zoletil</td>
			<td>Virbac</td>
			<td>VR-2831</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a custom multiphoton microscopy platform for live imaging of mouse cornea and conjunctiva

Conventionele histologische analyse- en celkweeksystemen zijn onvoldoende om in vivo fysiologische en pathologische dynamiek volledig te simuleren. Multiphoton microscopie (MPM) is uitgegroeid tot een van de meest populaire beeldvorming modaliteiten voor biomedische studie op cellulaire niveaus in vivo, voordelen zijn hoge resolutie, diepe weefsel penetratie en minimale fototoxiciteit. We hebben een MPM imaging platform ontworpen met een aangepaste muis ooghouder en een stereotaxic fase voor beeldvorming oculair oppervlak in vivo. Dubbele fluorescerende eiwit reporter muis maakt visualisatie van celkernen, celmembranen, zenuwvezels, en haarvaten binnen het oculaire oppervlak. Naast multifoton fluorescentie signalen, het verwerven van de tweede harmonische generatie (SHG) tegelijkertijd zorgt voor de karakterisering van collageen stromal architectuur. Dit platform kan worden gebruikt voor intravital imaging met nauwkeurige positionering over het gehele oculaire oppervlak, inclusief hoornvlies en bindvlies.

Met behulp van dit live imaging platform kan het muisoculaire oppervlak op cellulair niveau worden gevisualiseerd. Om individuele enkele cellen in het oculaire oppervlak te visualiseren, gebruikten we de dubbele fluorescerende transgene muizen met EGFP uitgedrukt in de kern en tdTomato uitgedrukt in het celmembraan. De collageen-rijke hoornvlies stroma werd benadrukt door SHG signalen.
In hoornvlieseptheel werden oppervlakkige cellen, vleugelcellen en basale cellen(figuur ...

Watch this Scientific Journal Video about A Custom Multiphoton Microscopy Platform for Live Imaging of Mouse Cornea and Conjunctiva at JoVE.com

A Custom Multiphoton Microscopy Platform for Live Imaging of Mouse Cornea and Conjunctiva

Hier gepresenteerd is een multiphoton microscopisch platform voor live muis oculaire oppervlakte beeldvorming. Fluorescerende transgene muis maakt de visualisatie van celkernen, celmembranen, zenuwvezels en haarvaten binnen het oculaire oppervlak mogelijk. Niet-lineaire tweede harmonische generatie signalen afgeleid van collageen structuren bieden label-vrije beeldvorming voor stromal architecturen.

Een custom multiphoton microscopie platform voor live beeldvorming van muis hoornvlies en conjunctiva

Conventional histological analysis and cell culture systems are insufficient to simulate in vivo physiological and pathological dynamics completely. ...

Dit protocol maakt gebruik van een multi-filter microscoop voor live beeldvorming van de gehele structuur van de muis oculaire oppervlak in de dubbele fluorescerende transgene muis model. De combinatie van een aangepaste multifoton microscopisch platform en dubbele fluorescerende transgene muizen maakt de real-time visualisatie van de en de structuur van het oculaire oppervlak. Om de multiphoton microscoop in te stellen, selecteert u de wateronderdompeling 20X, 1.00 NA doelstelling en stel de Titanium Sapphire laser als de excitatiebron op een rechtopstaande microscoop.Stel de golflengte van de laseroutput in op 880 nanometer voor EGFP en 940 nanometer voor tdTomato. Neem twee dichroic spiegels voor de scheiding van SHG EGFP en EGFP tdTomato en gebruik 434-17, 510-84 en 585-40 nanometer bandpass filters om spectraal scheiden de SHG EGFP en tdTomato signalen. Om de ooghouder op te zetten, plaatst u de muis op het verwarmde microscoopstadium en voegt u een temperatuurbewakingssonde in na bevestiging van een gebrek aan reactie op pedaalreflex in een verdoofde 8-12 weken oude muis.Plaats de muis in een aangepaste stereotaxic muishouder en steek oorbalken in de externe auditieve meatus. Gebruik driepuntfixatie om de hoofdhouder te beveiligen en breng een 0,4%Oxybuprocaine Hydrochloride en zoutoplossing aan op het oculaire oppervlak. Bedek de uiteinden van een paar van nummer vijf Dumont tang met de PE buis lus.Na drie minuten een handmatige ooglid intrekking uit te voeren om oogbal uitsteeksel te bevestigen en zorgvuldig plaats een PE houder buis lus langs het ooglid marge om het ooglid oppervlak bloot te leggen. En gebruik de knop van de houder om de oogbol te stabiliseren met de tangen. Bedek vervolgens het hoornvliesoppervlak met een ooggel met een brekingsindex van 1.338.Voor Z seriële beeldvorming van het hoornvliesoppervlak, gebruik een kwiklichtbron om het richtveld in beeld te brengen en de microscoopsoftware te openen. Selecteer de juiste fotomultiplier en digitale winsten voor het visualiseren van de cellulaire structuur in het oculaire oppervlak en stel de eerste en laatste dia in om de aankoop van een afbeeldingsstapel mogelijk te maken. Stel de beeldresolutie in op 512 bij 512 pixels en de Z-stap op één micrometer.Klik vervolgens op start om Z-seriële afbeeldingen te verzamelen die één live-afbeelding verwerven met een 880 nanometer-excitatie voor SHG EGFP-signaalverzameling en één live-beeld bij een excitatie van 940 nanometer voor EGFP tdTomato-signaalverzameling binnen elk gebied. Gebruik de stepper gemotoriseerde podiumhouder om de oogbol te draaien om beeldvorming over het gehele hoornvliesoppervlak mogelijk te maken. Wanneer alle afbeeldingen zijn verkregen, laadt u de Z-seriële afbeeldingen in Fiji en selecteert u de Mediane 3D-filterplug-in.Nadat u het achtergrondgeluid hebt verwijderd, selecteert u het onscherpe filterpakket Fiji om de afbeeldingen te verscherpen en op het contrast van de automatische helderheid te klikken om automatisch de kwaliteit van de afbeeldingen te optimaliseren. Sla na verwerking de afbeeldingen op als een seriële beeldreeks en exporteer de beeldreeks naar een geschikt 3D-reconstructiesoftwareprogramma. In alle multifoton microscopie beelden, presenteren de EGFP tdTomato en SHG signalen in pseudo groen, rood en cyaan respectievelijk voor het vastleggen van de 3D-structuur beelden door momentopname.Multiphoton microscopie maakt de visualisatie van oppervlakkige vleugel- en basale cellen in het hoornvlieseptheel van dubbele fluorescerende transgene muizen mogelijk. Enkele cellen uit de basale laag kunnen worden toegewezen aan de oppervlakkige laag en enkele zeshoekige gevormde oppervlakkige cellen. Zoals blijkt uit de cytoplastische expressie van het tdTomato-signaal, wordt het membraanrijke intracellulaire vesiculaire systeem, inclusief het golgi-apparaat en het endoplasmische reticulum, verspreid in de vleugelcellen.Binnen de collageenachtige stroma worden de stellatische gevormde coratesites geschetst door het membraan gericht op EGFP-fluorescerende stoffen in deze muizen. De in de collegen stroma ingebedde co-locaties zijn losser verdeeld dan in de endotheelcellen. Bovendien kunnen dunne vertakkingszenuwen in de hoornvliesstroma ook worden gevisualiseerd door membraan gericht op tdTomato-signalen en hoornvlies endotheelcelmonopolies tonen een relatief homogene zeshoekige vorm verbonden in een honinggekamd patroon.Het Limbale epitheel bestaat uit één tot twee lagen epitheliale cellen. De dubbele fluorescerende reporter transgene stam maakt ook de beeldvorming van haarvaten binnen het bindvlies, het vergemakkelijken van de reconstructie van de 3D-architectuur van de haarvaten waarin de vasculaire endotheel. Het stabiliseren van de oogbol met matige druk zonder letsel is van cruciaal belang voor het verwerven van beelden van goede kwaliteit, omdat onvoldoende of overmatige druk de beeldkwaliteit in gevaar kan brengen.Dit NVivo beeldbeeldvormingsplatform kan worden aangepast voor visualisatie van structuren onder het oculaire oppervlak en kan worden toegepast op in-situ studies van verschillende oogheelkundige ziekten.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy

Specimen Voorbereiding, Imaging, en Analyse Protocollen voor Knife-edge Scanning Microscopie

Major advances in high-throughput, high-resolution, 3D microscopy techniques have enabled the acquisition of large volumes of neuroanatomical data at ...

Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

Met behulp van Microfluidics Chips voor Live Imaging en Studie van Injury Reacties in<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven

Live imaging is an important technique for studying cell biological processes, however this can be challenging in live animals. The translucent cuticle of ...

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Fluorescentie-blussen van een liposomaal ingekapseld nabij-infrarood Fluorofoor als een instrument voor<em&gt; In Vivo</em&gt; Optical Imaging

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous ...

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

Atomic Force Microscopy Imaging en Force Spectroscopie van Ondersteunde lipidendubbellagen

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

Visualizing Angiogenesis by Multiphoton Microscopy In Vivo in Genetically Modified 3D-PLGA/nHAp Scaffold for Calvarial Critical Bone Defect Repair

Visualizing Angiogenesis by Multiphoton Microscopy In Vivo in Genetically Modified 3D-PLGA/nHAp Scaffold for Calvarial Critical Bone Defect Repair

Visualiseren van angiogenese door Multiphoton microscopie In Vivo in genetisch gemodificeerde 3D-PLGA/nHAp steiger voor Calvarial kritische bot Defect reparatie

The reconstruction of critically sized bone defects remains a serious clinical problem because of poor angiogenesis within tissue-engineered scaffolds ...

Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform

Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform

Beeldvorming van de morfologie van het haar van de wortel van Arabidopsis zaailingen in een twee-laag Microfluidic Platform

Root hairs increase root surface area for better water uptake and nutrient absorption by the plant. Because they are small in size and often obscured by ...

Fabrication of Custom Agarose Wells for Cell Seeding and Tissue Ring Self-assembly Using 3D-Printed Molds

Fabricage van aangepaste Agarose putten voor het zaaien van de cellen en weefsel Ring zelf-assemblage met behulp van 3D-gedrukte mallen

Engineered tissues are being used clinically for tissue repair and replacement, and are being developed as tools for drug screening and human disease ...

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

Een Microfluidic Platform voor het longitudinale beeldvorming in Caenorhabditis elegans

In the last decade, microfluidic techniques have been applied to study small animals, including the nematode Caenorhabditis elegans, and have proved ...

Visualizing Adhesion Formation in Cells by Means of Advanced Spinning Disk-Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

Visualiseren van hechting vorming in cellen door middel van geavanceerde draaiende schijf-totale interne reflectie fluorescentie microscopie

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to ...