Name: a custom multiphoton microscopy platform for live imaging of mouse cornea and conjunctiva
Uploaded: 2020-05-17T14:00:00
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台湾の科学技術省からの助成金支援に感謝します (106-2627-M-002-034, 107-2314-B-182A-089, 108-2628-B-002-023,108-2628-B-002-023),国立台湾大学病院(NTUH108-T17)、台湾チャンガン記念病院(CMRPG3G1621,CMRPG3G3G1622,CMRPG3G1622,CMRPG3G1622,CMRPG3G1623)。

すべての動物実験は、国立台湾大学の施設動物管理使用委員会(IACUC)とチャンガン記念病院によって承認された手順に従って行われました。
1. 多光子顕微鏡のセットアップ
<ol><li>水浸漬20x 1.00 NA目標を持つ直立顕微鏡をベースにしたシステムを構築します(図1A)。</li>
	<li>Ti:サファイアレーザー(調整可能な波長)を励起源として使用してください。EGFP...

<ol>
	<li>DelMonte, D. W., Kim, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+and+physiology+of+the+cornea.">Anatomy and physiology of the cornea.</a> Journal of Cataract &amp; Refractive Surgery. 37 (3), 588-598 (2011).</li><li>Van Buskirk, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+anatomy+of+the+limbus.">The anatomy of the limbus.</a> Eye (London). 3, 101-108 (1989).</li><li>Hodges, R. R., Dartt, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tear+film+mucins:+front+line+defenders+of+the+ocular+surface;+comparison+with+airway+and+gastrointestinal+tract+mucins.">Tear film mucins: front line defenders of the ocular surface; comparison with airway and gastrointestinal tract mucins.</a> Experimental Eye Research. 117, 62-78 (2013).</li><li>Tan, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiphoton+fluorescence+and+second+harmonic+generation+imaging+of+the+structural+alterations+in+keratoconus+ex+vivo.">Multiphoton fluorescence and second harmonic generation imaging of the structural alterations in keratoconus ex vivo.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 47 (12), 5251-5259 (2006).</li><li>Konig, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiphoton+microscopy+in+life+sciences.">Multiphoton microscopy in life sciences.</a> Journal of Microscopy. 200, 83-104 (2000).</li><li>Rompolas, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+coordination+of+stem+cell+commitment+during+epidermal+homeostasis.">Spatiotemporal coordination of stem cell commitment during epidermal homeostasis.</a> Science. 352 (6292), 1471-1474 (2016).</li><li>Park, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-scale+coordination+of+cellular+behaviour+promotes+epidermal+wound+repair+in+live+mice.">Tissue-scale coordination of cellular behaviour promotes epidermal wound repair in live mice.</a> Nature Cell Biology. 19 (2), 155-163 (2017).</li><li>Xin, T., Gonzalez, D., Rompolas, P., Greco, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flexible+fate+determination+ensures+robust+differentiation+in+the+hair+follicle.">Flexible fate determination ensures robust differentiation in the hair follicle.</a> Nature Cell Biology. 20 (12), 1361-1369 (2018).</li><li>Wu, Y. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+multiphoton+microscopic+imaging+platform+for+ocular+surface+imaging.">Intravital multiphoton microscopic imaging platform for ocular surface imaging.</a> Experimental Eye Research. 182, 194-201 (2019).</li><li>Wu, Y. F., Tan, H. Y., Lin, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-Term+Intravital+Imaging+of+the+Cornea,+Skin,+and+Hair+Follicle+by+Multiphoton+Microscope.">Long-Term Intravital Imaging of the Cornea, Skin, and Hair Follicle by Multiphoton Microscope.</a> Methods in Molecular Biology. , (2019).</li><li>Lo, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+Fourier+transform-based+analysis+of+second-harmonic+generation+image+in+keratoconic+cornea.">Fast Fourier transform-based analysis of second-harmonic generation image in keratoconic cornea.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 53 (7), 3501-3507 (2012).</li><li>Tan, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiphoton+fluorescence+and+second+harmonic+generation+microscopy+for+imaging+infectious+keratitis.">Multiphoton fluorescence and second harmonic generation microscopy for imaging infectious keratitis.</a> Journal of Biomedical Optics. 12 (2), 024013 (2007).</li><li>Jester, J. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Four-dimensional+multiphoton+confocal+microscopy:+the+new+frontier+in+cellular+imaging.">Four-dimensional multiphoton confocal microscopy: the new frontier in cellular imaging.</a> Oculur Surface. 2 (1), 10-20 (2004).</li><li>Morishige, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Second-harmonic+imaging+microscopy+of+normal+human+and+keratoconus+cornea.">Second-harmonic imaging microscopy of normal human and keratoconus cornea.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 48 (3), 1087-1094 (2007).</li><li>Hao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+non-linear+optical+(NLO)+imaging+in+live+rabbit+eyes+using+the+Heidelberg+Two-Photon+Laser+Ophthalmoscope.">In vivo non-linear optical (NLO) imaging in live rabbit eyes using the Heidelberg Two-Photon Laser Ophthalmoscope.</a> Experimental Eye Research. 91 (2), 308-314 (2010).</li><li>Chen, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=R26R-GR:+a+Cre-activable+dual+fluorescent+protein+reporter+mouse.">R26R-GR: a Cre-activable dual fluorescent protein reporter mouse.</a> PLoS One. 7 (9), 46171 (2012).</li><li>Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+global+double-fluorescent+Cre+reporter+mouse.">A global double-fluorescent Cre reporter mouse.</a> Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Masihzadeh, O., Lei, T. C., Ammar, D. A., Kahook, M. Y., Gibson, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multiphoton+microscope+platform+for+imaging+the+mouse+eye.">A multiphoton microscope platform for imaging the mouse eye.</a> Molecular Vision. 18, 1840-1848 (2012).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+of+the+cornea+visualized+in+the+living+mouse+using+vital+dyes.">Two-photon imaging of the cornea visualized in the living mouse using vital dyes.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 54 (10), 6526-6536 (2013).</li><li>Lee, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+confocal+microscopy+and+two-photon+microscopy+in+mouse+cornea+in+vivo.">Comparison of confocal microscopy and two-photon microscopy in mouse cornea in vivo.</a> Experimental Eye Research. 132, 101-108 (2015).</li><li>Ehmke, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+nonlinear+imaging+of+corneal+structures+with+special+focus+on+BALB/c+and+streptozotocin-diabetic+Thy1-YFP+mice.">In vivo nonlinear imaging of corneal structures with special focus on BALB/c and streptozotocin-diabetic Thy1-YFP mice.</a> Experimental Eye Research. 146, 137-144 (2016).</li><li>Webster, M. T., Manor, U., Lippincott-Schwartz, J., Fan, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+Imaging+Reveals+Ghost+Fibers+as+Architectural+Units+Guiding+Myogenic+Progenitors+during+Regeneration.">Intravital Imaging Reveals Ghost Fibers as Architectural Units Guiding Myogenic Progenitors during Regeneration.</a> Cell Stem Cell. 18 (2), 243-252 (2016).</li><li>Mesa, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homeostatic+Epidermal+Stem+Cell+Self-Renewal+Is+Driven+by+Local+Differentiation.">Homeostatic Epidermal Stem Cell Self-Renewal Is Driven by Local Differentiation.</a> Cell Stem Cell. 23 (5), 677-686 (2018).</li><li>Goh, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+imaging+of+dendritic+cell+responses+to+sterile+tissue+injury.">Real-time imaging of dendritic cell responses to sterile tissue injury.</a> Journal of Investigative Dermatology. 135 (4), 1181-1184 (2015).</li><li>Kissenpfennig, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+and+function+of+Langerhans+cells+in+vivo:+dermal+dendritic+cells+colonize+lymph+node+areas+distinct+from+slower+migrating+Langerhans+cells.">Dynamics and function of Langerhans cells in vivo: dermal dendritic cells colonize lymph node areas distinct from slower migrating Langerhans cells.</a> Immunity. 22 (5), 643-654 (2005).</li><li>Chow, Z., Mueller, S. N., Deane, J. A., Hickey, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dermal+regulatory+T+cells+display+distinct+migratory+behavior+that+is+modulated+during+adaptive+and+innate+inflammation.">Dermal regulatory T cells display distinct migratory behavior that is modulated during adaptive and innate inflammation.</a> Journal of Immunology. 191 (6), 3049-3056 (2013).</li><li>Dudeck, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mast+cells+are+key+promoters+of+contact+allergy+that+mediate+the+adjuvant+effects+of+haptens.">Mast cells are key promoters of contact allergy that mediate the adjuvant effects of haptens.</a> Immunity. 34 (6), 973-984 (2011).</li></ol>

このカスタム構築されたMPMイメージングプラットフォームは、コントロールソフトウェアを用いて、皮膚10、毛包10および眼表面9、10を含むマウス上皮10器官の生体内イメージングに9使用された(図1A)。10プロジェクトの開始以来、様々な実験のための光学部品を変更する柔軟性のために、カ?...

角膜や結膜を含む眼表面構造は、外部の障害から他のより深い眼組織を保護します。角膜は眼の透明な前部であり、眼に光を向ける屈折レンズとしても、防護壁としても機能する。角膜上皮は角膜の最外層であり、表面細胞、翼細胞および基底細胞の別個の層から成っている。角膜のストロマは、角質細胞を埋め込んだ洗練されたコラーゲン状のラメラで構成されています。角膜内皮は、平らな六角形細胞の単層であり、そのポンプ機能1を通じて比較的脱水状態で角膜間質を保つことによって角膜の透明性を維持する上で重要な役割を有する。リンブスは角膜と結膜との境界を形成し、角膜上皮幹細胞2の貯留部である。高血管化結膜は粘液と涙を作り出すことによって目を潤滑するのに役立つ 3.
角膜表面構造の細胞ダイナミクスは、従来、組織学的解析またはインビトロ細胞培養によって研究されており、in vivo細胞ダイナミクスを十分にシミュレートできない可能性があります。非侵襲的なライブイメージングアプローチは、したがって、そのようなギャップを埋めることができます。高解像度、最小限の光ダメージ、より深いイメージング深さを含むその利点のために、MPMは,生物学的研究4、5、6、7、85,6の多様4な分野で強力なモダリティとなっています。7,8角膜イメージングの場合、MPMは細胞内NAD(P)Hに由来する内在性自己蛍光からの細胞情報を提供する。フェムト秒レーザースキャン下での非中心対称型I型コラーゲン繊維に由来する第2高調波発生(SHG)信号は、追加の染色手順9を伴わないコラーゲン間質構造を提供する。以前は、私たちや他のグループは、動物やヒトの角膜,,99、10、11、12、13、14、1510,11のイメージングのためにMPMを15利用してきました。13,1412
特定の細胞集団に蛍光タンパク質を示すトランスジェニックマウスラインは、細胞生物学において、発達、組織恒常性、組織再生、発がんなど様々な研究に広く用いられている。我々は、角膜99、10、毛包10および表皮10の生体内イメージングに蛍光タンパク質で標識されたトランスジェニックマウス株を10MPMで用いた。TdTomatoとEGFPでタグ付けされた細胞核を有する二重蛍光マウス株は、R26R-GR(B6;129-Gt(ROSA)26Sortm1Ytchn/J、#021847)16および16mT-mG(GT(ROSA26)ACTB-tdTomato-EGFP、#00767617)ACTB-tdTomato-EGFP17R26R-GRトランスジェニックマウスラインは、H2B-EGFP融合遺伝子およびmCherry-GPIアンカーシグナル融合遺伝子を含む二重蛍光タンパク質レポーター構築物を含み、Gt(ROSA)26Sor遺伝子に挿入される。mT-mGトランスジェニック株は、細胞膜標的tdTomatoおよびEGFP蛍光クレレポーターマウスである。Cre組み換えの前に、tdTomato蛍光発現を有する細胞膜タンパク質は、様々な細胞に広く存在している。このトランスジェニックマウス株は、Cre励起なしでtdTomatoで核-EGFPと膜を可視化することを可能にします。2匹の雌(R26R-GR+/+)と1匹の雄(mT-mG+/+)トランスジェニックマウスを共に飼育し、実験に十分なマウスを産生した。R26R-GR +--;mT-mG+/-+/-遺伝子型、二重蛍光マウス株を有する彼らの子孫は、この研究で使用された。+/-前述の99,1010のような1つの蛍光レポーターマウスラインと比較して、この二重蛍光レポーターマウス株は、画像化時間の取得を50%短縮します。
本研究では、イメージングプラットフォームとデュアル蛍光トランスジェニックマウスを用いて、眼表面のインビボイメージングに関する詳細な技術プロトコルを段階的に説明する。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>AVIZO Lite software</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Version: 2019.3.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bandpass filters</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF01-434/17 
			FF01-500/24 
			FF01-585/40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirrors</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF495-Di01-25x36 FF580-Di01-25x36</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Galvano</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>GVS002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jade BIO control software</td>
			<td>SouthPort Corporation</td>
			<td>Jade BIO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxybuprocaine hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>O0270000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMT</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>H7422A-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyesthylene Tube</td>
			<td>BECTON DICKINSON</td>
			<td>427401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic mouse holder</td>
			<td>Step Technology Co.,Ltd</td>
			<td>000111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ti: Sapphire laser</td>
			<td>Spectra-Physics</td>
			<td>Mai-Tai DeepSee</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Upright microscopy</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX51WI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vidisic Gel</td>
			<td>Dr. Gerhard Mann Chem-pharm. Fabrik GmbH</td>
			<td>D13581</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zoletil</td>
			<td>Virbac</td>
			<td>VR-2831</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a custom multiphoton microscopy platform for live imaging of mouse cornea and conjunctiva

従来の組織学的解析および細胞培養システムは、生体内の生理学的および病理学的ダイナミクスを完全にシミュレートするには不十分である。多光子顕微鏡(MPM)は、生体内の細胞レベルでの生物医学的研究のための最も一般的なイメージングモダリティの1つとなっており、利点は、高解像度、深部組織の浸透および最小限の光毒性を含む。私たちは、カスタマイズされたマウスアイホルダーと生体内で眼表面をイメージングするための立体的なステージを備えたMPMイメージングプラットフォームを設計しました。二重蛍光タンパク質レポーターマウスは、細胞核、細胞膜、神経線維、および眼表面内の毛細血管の可視化を可能にします。多光子蛍光シグナルに加えて、第2高調波発生(SHG)を同時に取得することで、コラーゲン間質アーキテクチャの特性解析が可能になります。このプラットフォームは、角膜や結膜を含む眼表面全体にわたって正確な位置を持つ生体内イメージングに使用できます。

このライブイメージングプラットフォームを使用して、マウスの眼表面を細胞レベルで可視化することができる。眼表面の個々の単一細胞を可視化するために、細胞膜に発現する核およびtdTomatoに発現するEGFPを有する二重蛍光トランスジェニックマウスを用いた。コラーゲンが豊富な角膜間質は、SHG信号によって強調された。
角膜上皮において、表在細胞、翼細胞およ?...

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A Custom Multiphoton Microscopy Platform for Live Imaging of Mouse Cornea and Conjunctiva

ここでは、生きたマウス眼球表面イメージング用の多光子顕微鏡プラットフォームを紹介します。蛍光トランスジェニックマウスは、細胞核、細胞膜、神経線維および毛細血管を眼表面内で可視化します。コラーゲン構造に由来する非線形第二高調波生成信号は、間質アーキテクチャにラベルフリーイメージングを提供します。

マウス角膜と結膜のライブイメージングのためのカスタム多光子顕微鏡プラットフォーム

Conventional histological analysis and cell culture systems are insufficient to simulate in vivo physiological and pathological dynamics completely. ...

このプロトコルは、二重蛍光トランスジェニックマウスモデルにおけるマウス眼球表面の構造全体のライブイメージング用マルチフィルター顕微鏡を使用します。カスタムマルチフォトン顕微鏡プラットフォームと二重蛍光トランスジェニックマウスの組み合わせにより、眼表面の構造と構造をリアルタイムで可視化できます。マルチフォトン顕微鏡をセットアップするには、水浸漬20X、1.00 NA目的を選択し、直立顕微鏡上の励起源としてチタンサファイアレーザーを設定します。レーザー出力波長をEGFP用880ナノメートル、tdTomatoの場合は940ナノメートルに設定します。SHG EGFPとEGFP tdTomatoの分離のための2つの二色性ミラーを含み、SHG EGFPおよびtdTomato信号をスペクトル的に分離するために434-17、510-84および585-40ナノメーターのバンドパスフィルターを使用する。眼ホルダーを設置するには、8-12週齢のマウスでペダル反射に対する応答の欠如を確認した後、加熱顕微鏡ステージにマウスを置き、温度監視プローブを挿入します。カスタムステレオタキシックマウスホルダーにマウスを置き、外部聴覚肉にイヤーバーを挿入します。ヘッドホルダーを固定し、0.4%オキシブプロカイン塩酸塩と生理食塩水を眼表面に塗布するために3点固定を使用します。PEチューブループで5番デュモン鉗子のペアの先端をカバーします。3分後に眼球の突起を確認するために手動眼瞼引き込み、眼瞼のマージンに沿ってPEホルダーチューブループを慎重に配置して眼表面を露出させます。そして、鉗子で眼球を安定させるためにホルダーのノブを使用します。その後、角膜表面を1.338の屈折率で目のゲルで覆います。角膜表面のZシリアルイメージングでは、水銀光源を使用してターゲットフィールドを画像化し、顕微鏡ソフトウェアを開きます。眼表面の細胞構造を視覚化するための適切な写真乗数とデジタルゲインを選択し、画像スタックの取得を可能にする最初と最後のスライドを設定します。画像解像度を 512 x 512 ピクセルに設定し、Z ステップを 1 マイクロメートルに設定します。次に、SHG EGFP信号収集用880ナノメートル励起を用いた1つのライブ画像を取得するZシリアル画像を収集し、各領域内のEGFP tdTomato信号コレクション用の940ナノメートルの励起で1つのライブ画像を収集するために、開始をクリックします。画像全体を通して、ステッパー電動ステージホルダーを使用して眼球を回転させ、角膜表面全体をイメージングできるようにします。すべての画像が取得されたら、フィジーにZシリアル画像をロードし、中央値3Dフィルタプラグインを選択します。バックグラウンドノイズを除去した後、鮮明なマスクフィルターパッケージフィジーを選択して画像をシャープにし、自動輝度コントラストをクリックして画像の品質を自動的に最適化します。処理後、イメージをシリアル画像シーケンスとして保存し、適切な3D再構成ソフトウェアプログラムにイメージシーケンスをエクスポートします。マルチフォトン顕微鏡画像の全てにおいて、EGFP tdTomatoとSHG信号をそれぞれ擬似緑、赤、シアンで表示してから、スナップショットで3D構造画像をキャプチャします。多光子顕微鏡検査により、二重蛍光トランスジェニックマウスの角膜上皮における表在翼細胞および基底細胞の可視化が可能となる。基底層からの単一細胞は、単一の六角形の表面細胞と同様に表層にマッピングすることができる。tdTomatoシグナルの細胞質発現によって明らかにされるように、ゴルジ装置および小胞体を含む膜タンパク質は、翼細胞内に散乱される。コラーゲン質間質の中で、星状の同流部位は、これらのマウスのEGFP蛍光を標的とする膜によって概説される。カレッジ間質に埋め込まれたコレートサイトは、内皮細胞内よりも緩やかに間隔が大きい。さらに、角膜間質内の細い分岐神経は、tdTomatoシグナルを標的とする膜によっても可視化され、角膜内皮細胞単層はハニカムパターンで連結された比較的均質な六角形の形状を示す。四肢上皮は上皮細胞の1〜2層から成る。二重蛍光レポータートランスジェニック株はまた、血管内皮を概説する毛細血管の3Dアーキテクチャの再構築を促進する、結膜内の毛細血管のイメージングを可能にする。眼球を損傷のない中程度の圧力で安定させることは、不十分または過度の圧力が画質を損なう可能性があるため、良質の画像を取得するために重要です。このNVivo画像イメージングプラットフォームは、眼表面下の構造の可視化のために変更することができ、様々な眼疾患のin-situ研究に適用することができます。

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy

ナイフエッジスキャン顕微鏡用試料作製、イメージング、および解析プロトコル

Major advances in high-throughput, high-resolution, 3D microscopy techniques have enabled the acquisition of large volumes of neuroanatomical data at ...

Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

における損傷応答のライブイメージングや研究のためのマイクロ流体チップを使用<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;幼虫

Live imaging is an important technique for studying cell biological processes, however this can be challenging in live animals. The translucent cuticle of ...

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

のためのツールと​​してのリポソームカプセル化された近赤外蛍光体の蛍光消光<em&gt;インビボ</em&gt;光学イメージング

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous ...

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

原子間力顕微鏡イメージングおよびサポートされている脂質二重層のフォーススペクトロスコピー

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

Visualizing Angiogenesis by Multiphoton Microscopy In Vivo in Genetically Modified 3D-PLGA/nHAp Scaffold for Calvarial Critical Bone Defect Repair

Visualizing Angiogenesis by Multiphoton Microscopy In Vivo in Genetically Modified 3D-PLGA/nHAp Scaffold for Calvarial Critical Bone Defect Repair

頭蓋骨の重要な骨欠損修復の多光子顕微鏡In Vivo遺伝子組み換え 3 D-PLGA/nHAp 足場による血管新生を可視化

The reconstruction of critically sized bone defects remains a serious clinical problem because of poor angiogenesis within tissue-engineered scaffolds ...

Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform

Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform

二層流体プラットフォームシロイヌナズナ実生の根毛の形態のイメージング

Root hairs increase root surface area for better water uptake and nutrient absorption by the plant. Because they are small in size and often obscured by ...

Fabrication of Custom Agarose Wells for Cell Seeding and Tissue Ring Self-assembly Using 3D-Printed Molds

細胞播種用カスタム Agarose 井戸とティッシュ リング自己組織型の 3 D プリントを使用しての作製

Engineered tissues are being used clinically for tissue repair and replacement, and are being developed as tools for drug screening and human disease ...

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

カエノラブディティス ・ エレガンスにおける縦断的イメージングのためのマイクロ流体プラットフォーム

In the last decade, microfluidic techniques have been applied to study small animals, including the nematode Caenorhabditis elegans, and have proved ...

Visualizing Adhesion Formation in Cells by Means of Advanced Spinning Disk-Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

回転ディスク全内部反射蛍光顕微鏡による細胞の接着の形成の可視化詳細

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to ...