Name: a custom multiphoton microscopy platform for live imaging of mouse cornea and conjunctiva
Uploaded: 2020-05-17T14:00:00
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대만 과학기술부(106-2627-M-002-034, 107-2314-B-182A-089)의 보조금 지원에 감사드립니다. 108-2628-B-002-023, 108-2628-B-002-023), 국립 대만 대학 병원 (NTUH108-T17) 및 창궁 기념 병원, 대만 (CMRPG3G1621, CMRPG3G1622, CMRPG3GG16222, CMRPG3G1622).

모든 동물 실험은 국립 대만 대학과 창궁 기념 병원의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 승인 절차에 따라 수행되었습니다.
1. 다광 현미경 검사법 설정
<ol><li>물 침지 20x 1.00 NA 목표(그림 1A)와직립 현미경을 기반으로 시스템을 구축 합니다.</li>
	<li>Ti 사용: 사파이어 레이저(튜닝 파장 사용)를 흥분 원으로 사용하십시오. EGFP의 경우 880nm, tdTomato의 경...

<ol>
	<li>DelMonte, D. W., Kim, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+and+physiology+of+the+cornea.">Anatomy and physiology of the cornea.</a> Journal of Cataract &amp; Refractive Surgery. 37 (3), 588-598 (2011).</li><li>Van Buskirk, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+anatomy+of+the+limbus.">The anatomy of the limbus.</a> Eye (London). 3, 101-108 (1989).</li><li>Hodges, R. R., Dartt, D. 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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+imaging+of+dendritic+cell+responses+to+sterile+tissue+injury.">Real-time imaging of dendritic cell responses to sterile tissue injury.</a> Journal of Investigative Dermatology. 135 (4), 1181-1184 (2015).</li><li>Kissenpfennig, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+and+function+of+Langerhans+cells+in+vivo:+dermal+dendritic+cells+colonize+lymph+node+areas+distinct+from+slower+migrating+Langerhans+cells.">Dynamics and function of Langerhans cells in vivo: dermal dendritic cells colonize lymph node areas distinct from slower migrating Langerhans cells.</a> Immunity. 22 (5), 643-654 (2005).</li><li>Chow, Z., Mueller, S. N., Deane, J. A., Hickey, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dermal+regulatory+T+cells+display+distinct+migratory+behavior+that+is+modulated+during+adaptive+and+innate+inflammation.">Dermal regulatory T cells display distinct migratory behavior that is modulated during adaptive and innate inflammation.</a> Journal of Immunology. 191 (6), 3049-3056 (2013).</li><li>Dudeck, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mast+cells+are+key+promoters+of+contact+allergy+that+mediate+the+adjuvant+effects+of+haptens.">Mast cells are key promoters of contact allergy that mediate the adjuvant effects of haptens.</a> Immunity. 34 (6), 973-984 (2011).</li></ol>

제어 소프트웨어가 있는 이 맞춤형 MPM 이미징 플랫폼은 피부10,모낭10 및 안구 표면9,,10 (도 1A)을포함한 마우스 상피 기관의 인탈 이미징에 사용되었습니다. 맞춤형 시스템은 프로젝트 시작부터 다양한 실험을 위한 광학 부품을 유연히 변경하는 데 사용되었습니다. 이 이미징 방법론은 상용 MPM ?...

각막과 결막을 포함한 안구 표면 구조는 외부 장애로부터 다른 더 깊은 안구 조직을 보호합니다. 눈의 투명한 전면 부분인 각막은 눈안으로 빛을 지시하고 보호 장벽으로 반응하는 굴절 렌즈로 기능합니다. 각막 상피는 각막의 가장 바깥쪽 층이며 피상 세포, 날개 세포 및 기저 세포의 뚜렷한 층으로 구성됩니다. 각막 스트로마는 정교하게 포장된 콜라주누우스 라멜라에 각질 세포가 내장되어 있습니다. 각막 내피, 평평한 육각 세포의 단일 층은 펌핑 기능1을통해 상대적으로 탈수 된 상태에서 각막 스트로마를 유지함으로써 각막의 투명성을 유지하는 데 중요한 역할을한다. 림푸스는 각막과 결막 사이의 경계를 형성하고, 각막 상피 줄기 세포2의저수지이다. 혈관이 높게 한 결막은 점액과 눈물3을생성하여 눈을 윤활하는 데 도움이됩니다.
각막 표면 구조의 세포 역학은 기존의 조직학적 분석 또는 생체 내 세포 배양에 의해 연구되며, 이는 생체 내 세포 역학을 적절히 시뮬레이션하지 못할 수 있다. 비침습적 라이브 이미징 접근법은 그러한 격차를 해소할 수 있습니다. 고해상도, 최소한의 광손상 및 심층 이미징 깊이를 포함하는 장점으로 인해 MPM은,,4, 5,56,67,8의다양한 생물학적연구에서강력한 양식이되었습니다. 각막 이미징의 경우, MPM은 세포 내 NAD(P)H에서 유래한 본질적인 자동 형광으로부터 세포 정보를 제공합니다. 펨토초 레이저 스캐닝 하에서 비중심형 I 콜라겐 섬유로부터 유래된 제2 고조파 생성(SHG) 신호는 추가 염색 절차 없이 콜라주기누우스 기질 구조를 제공한다9. 이전에는 동물 및 인간 각막9,,,10, 11,12,,13,14,1115의이미징을 위해,MPM을악용했습니다.
특정 세포 집단에서 형광 단백질을 나타내는 형질 전환 마우스 라인은 개발, 조직 항상성, 조직 재생 및 발암 발생을 포함한 세포 생물학의 다양한 연구에 널리 사용되어 왔다. 우리는 각막9,10,모낭 10및표피10MPM에 의하여 생체 내 화상 진찰을10 위한 형광 단백질로 표지된 형질 마우스 균주를 이용했습니다. TdTomato와 EGFP로 태그된 세포막을 가진 이중 형광 마우스 변형은 두 개의 마우스 균주에서 사육됩니다: R26R-GR (B6;129-Gt (ROSA)26Sortm1Ytchn/J,#021847)16 및 mT-mG (Gt(ROSA26)ACTB-t., 1.#007676 1.17 R26R-GR 형질전환 마우스 라인은 H2B-EGFP 융합 유전자 및 mCherry-GPI 앵커 신호 융합 유전자를 포함하는 이중 형광 단백질 리포터 생성을 포함하며, Gt(ROSA)26Sor 궤적에 삽입된다. mT-mG 형질균은 세포막 표적 tdTomato 및 EGFP 형광 크레 리포터 마우스이다. Cre 재조합 전에, tdTomato 형광 발현을 가진 세포막 단백질은 각종 세포에서 널리 존재한다. 이 형질전환 마우스 변형은 우리가 Cre 흥분없이 tdTomato핵-EGFP 및 막을 시각화 할 수 있습니다. 두 암컷 (R26R-GR+/+)및 한 남성 (mT-mG+/+)형질 전환 마우스실험에 대 한 충분 한 마우스를 생산 하기 위해 함께 사육 되었다. R26R-GR+/-;mT-mG+/- 유전자형, 이중 형광 마우스 균주를 가진 그들의 자손은 이 연구에서 사용되었습니다. 앞서설명한9,10,이 이중 형광 기자 마우스 균주는 이전에 설명한 바와 같이 하나의 형광 기자 마우스 라인과 비교하여, 이 이중 형광 기자 마우스 균주는 이미징 시간의 50% 감소 된 취득을 우리에게 제공합니다.
이 작품에서, 우리는 우리의 화상 진찰 플랫폼 및 이중 형광 형질 전환 마우스를 사용하여 단계별로 안구 표면의 생체 내 화상 진찰을 위한 상세한 기술 프로토콜을 기술합니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>AVIZO Lite software</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Version: 2019.3.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bandpass filters</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF01-434/17 
			FF01-500/24 
			FF01-585/40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirrors</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF495-Di01-25x36 FF580-Di01-25x36</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Galvano</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>GVS002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jade BIO control software</td>
			<td>SouthPort Corporation</td>
			<td>Jade BIO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxybuprocaine hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>O0270000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMT</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>H7422A-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyesthylene Tube</td>
			<td>BECTON DICKINSON</td>
			<td>427401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic mouse holder</td>
			<td>Step Technology Co.,Ltd</td>
			<td>000111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ti: Sapphire laser</td>
			<td>Spectra-Physics</td>
			<td>Mai-Tai DeepSee</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Upright microscopy</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX51WI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vidisic Gel</td>
			<td>Dr. Gerhard Mann Chem-pharm. Fabrik GmbH</td>
			<td>D13581</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zoletil</td>
			<td>Virbac</td>
			<td>VR-2831</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a custom multiphoton microscopy platform for live imaging of mouse cornea and conjunctiva

기존의 조직학적 분석 및 세포 배양 시스템은 생체 내 생리학적 및 병리학적 역학을 완전히 시뮬레이션하기에 충분하지 않습니다. 다광 현미경 검사법 (MPM)은 생체 내 세포 수준에서 생물 의학 연구를위한 가장 인기있는 이미징 양식 중 하나가되었으며, 장점은 고해상도, 깊은 조직 침투 및 최소한의 광독성을 포함합니다. 우리는 맞춤형 마우스 눈 홀더와 생체 내 안구 표면을 이미징하기위한 스테레오 탁스 스테이지가있는 MPM 이미징 플랫폼을 설계했습니다. 이중 형광 단백질 리포터 마우스는 안구 표면 내의 세포 핵, 세포막, 신경 섬유 및 모세 혈관의 시각화를 가능하게합니다. 다광형광 신호 외에도 제2 고조파 생성(SHG)을 동시에 획득하면 콜라주기스트롬 아키텍처의 특성화가 가능합니다. 이 플랫폼은 각막과 결막을 포함하여 전체 안구 표면에 정확한 위치가 있는 인트라베이티 이미징에 사용할 수 있습니다.

이 라이브 이미징 플랫폼을 사용하여 마우스 안구 표면은 셀룰러 수준에서 시각화할 수 있습니다. 안구 표면에 개별 단일 세포를 시각화하기 위해, 우리는 세포막에서 발현된 핵 및 tdTomato에서 발현된 EGFP를 가진 이중 형광 형질 형질 형질 성 생쥐를 고용했습니다. 콜라겐이 풍부한 각막 스트로마는 SHG 신호에 의해 강조되었다.
각막 상피에서, 피상 세포, 날개 세포 및 기저<stro...

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A Custom Multiphoton Microscopy Platform for Live Imaging of Mouse Cornea and Conjunctiva

여기에 제시 라이브 마우스 안구 표면 이미징을위한 다광 현미경 플랫폼입니다. 형광 형질 전환 마우스는 안구 표면 내의 세포 핵, 세포 막, 신경 섬유 및 모세 혈관의 시각화를 가능하게합니다. 콜라주 구조에서 파생된 비선형 제2 고조파 생성 신호는 기질 아키텍처에 대한 라벨없는 이미징을 제공합니다.

마우스 각막과 결막의 라이브 이미징을 위한 맞춤형 다광현미경 플랫폼

Conventional histological analysis and cell culture systems are insufficient to simulate in vivo physiological and pathological dynamics completely. ...

이 프로토콜은 이중 형광 형질 전환 마우스 모델에서 마우스 안구 표면의 전체 구조의 라이브 이미징을 위해 다중 필터 현미경을 사용합니다. 사용자 정의 다광 현미경 플랫폼과 이중 형광 형질 전환 마우스의 조합은 안구 표면의 실시간 시각화 및 구조를 가능하게한다. 다광현미경을 설정하려면, 물 침지 20X, 1.00 NA 목표를 선택하고 티타늄 사파이어 레이저를 직립 현미경의 여기원으로 설정합니다.EGFP의 경우 레이저 출력 파장을 880나노미터, tdTomato의 경우 940나노미터로 설정합니다. SHG EGFP 및 EGFP tdTomato분리를 위한 두 개의 이색 거울을 포함하고 434-17, 510-84 및 585-40 나노미터 대역 패스 필터를 사용하여 SHG EGFP 및 tdTomato 신호를 관전적으로 분리한다. 눈 홀더를 설정하려면 마취 된 8-12 주 된 마우스에서 페달 반사에 대한 반응의 부족을 확인한 후 가열 된 현미경 단계에 마우스를 배치하고 온도 모니터링 프로브를 삽입합니다.마우스를 사용자 정의 스테레오탁스 마우스 홀더에 넣고 외부 청각 고기에 이어 바를 삽입합니다. 3점 고정을 사용하여 헤드 홀더를 확보하고 0.4%의 옥시부프로카인 염산염 및 식염수 용액을 안구 표면에 적용합니다. PE 튜브 루프와 숫자 다섯 듀몬트 집게의 쌍의 팁을 커버.3분 후 수동 눈꺼풀 후퇴를 수행하여 눈알 돌출을 확인하고 눈꺼풀 여백을 따라 PE 홀더 튜브 루프를 조심스럽게 배치하여 안구 표면을 노출시합니다. 그리고 홀더의 손잡이를 사용하여 포셉으로 안구를 안정시합니다. 그런 다음 각막 표면을 1.338의 굴절률로 아이 젤로 덮습니다.각막 표면의 Z 직렬 이미징의 경우 수은 광원을 사용하여 타겟팅 필드를 이미지화하고 현미경 소프트웨어를 엽니다. 안구 표면의 셀룰러 구조를 시각화하기 위한 적절한 사진 승수 및 디지털 이득을 선택하고 이미지 스택을 수집할 수 있도록 첫 번째 및 마지막 슬라이드를 설정합니다. 이미지 해상도를 512x 512픽셀로 설정하고 Z 단계를 하나의 마이크로미터로 설정합니다.그런 다음 SHG EGFP 신호 수집을 위한 880나노미터 의 흥분으로 하나의 라이브 이미지를 획득하는 Z 직렬 이미지를 수집하기 시작하고 각 영역 내의 EGFP tdTomato 신호 수집을 위한 940나노미터 의 라이브 이미지를 수집합니다. 이미지 전반에 걸쳐 스테퍼 전동 스테이지 홀더를 사용하여 안구를 회전하여 각막 표면 전체를 이미징할 수 있습니다. 모든 이미지가 획득되면 Z 직렬 이미지를 피지에 로드하고 중앙값 3D 필터 플러그인을 선택합니다.배경 노이즈를 제거한 후, 선명한 마스크 필터 패키지 피지를 선택하여 이미지를 선명하게 하고 자동 밝기 대비를 클릭하여 이미지의 품질을 자동으로 최적화합니다. 처리 후 이미지를 직렬 이미지 시퀀스로 저장하고 이미지 시퀀스를 적절한 3D 재구성 소프트웨어 프로그램으로 내보냅니다. 모든 다광현미경 이미지에서 EGFP tdTomato 및 SHG 신호를 각각 의사 그린, 레드 및 시안으로 제시한 후 스냅샷으로 3D 구조 이미지를 캡처합니다.다광 현미경 검사는 이중 형광 형형 형질 전환 마우스의 각막 상피에서 피상적 날개와 기저 세포의 시각화를 허용합니다. 기저 층에서 단일 셀은 단일 육각형 모양의 피상 세포뿐만 아니라 피상층으로 매핑될 수 있다. tdTomato 신호의 세포질 발현에 의해 드러난 바와 같이, 골기 장치 및 내피성 망상을 포함한 세포 내 혈관 계통이 풍부한 막 단백질이 날개 세포 내에 흩어져 있다.콜라주 기질 내, 스텔레이트 모양의 coratesites는 이 마우스에 있는 EGFP 형광을 표적으로 하는 막에 의해 설명됩니다. 대학 기질에 내장 된 coratesites는 내피 세포 내에서 보다 더 느슨하게 간격. 또한, 각막 스트로마 내의 얇은 분기 신경은 또한 tdTomato 신호를 표적으로 하는 멤브레인에 의해 시각화될 수 있고 각막 내피 세포 단층은 벌집 패턴에 연결된 비교적 균일한 육각형을 나타낸다.림팔 상피는 상피 세포의 1 ~ 2 층으로 구성됩니다. 이중 형광 기자 형질 변형은 또한 결막 내의 모세 혈관의 이미징을 가능하게하여 혈관 내피를 설명하는 모세 혈관의 3D 아키텍처의 재구성을 용이하게합니다. 부상 없이 적당한 압력으로 안구를 안정화하는 것은 부족하거나 과도한 압력이 이미지 품질을 손상시킬 수 있기 때문에 양질의 이미지를 획득하는 데 중요합니다.이 NVivo 화상 이미징 플랫폼은 안구 표면 아래 구조의 시각화를 위해 수정할 수 있으며 다양한 안과 질환의 내부 연구에 적용 될 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy

나이프 - 에지 스캐닝 현미경에 대한 표본 준비, 이미징 및 분석 프로토콜

Major advances in high-throughput, high-resolution, 3D microscopy techniques have enabled the acquisition of large volumes of neuroanatomical data at ...

연구

생체공학

Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

라이브 이미징 및 상해 응답의 연구에 대한 마이크로 유체 칩을 사용<em&gt; 초파리</em&gt; 애벌레

Live imaging is an important technique for studying cell biological processes, however this can be challenging in live animals. The translucent cuticle of ...

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

위한 도구로 리포좀 캡슐화 된 근적외선 형광의 형광 담금질<em&gt; 생체</em&gt; 광학 이미징

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous ...

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

원자 힘 현미경 이미징 및 지원 지질 이중층의 힘 분광학

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

Visualizing Angiogenesis by Multiphoton Microscopy In Vivo in Genetically Modified 3D-PLGA/nHAp Scaffold for Calvarial Critical Bone Defect Repair

Visualizing Angiogenesis by Multiphoton Microscopy In Vivo in Genetically Modified 3D-PLGA/nHAp Scaffold for Calvarial Critical Bone Defect Repair

Calvarial 중요 한 뼈 결함 수리 다 현미경 Vivo에서 유전자 변형 3D-PLGA/nHAp 비 계에 의해 신생 시각화

The reconstruction of critically sized bone defects remains a serious clinical problem because of poor angiogenesis within tissue-engineered scaffolds ...

Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform

Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform

2 층 미세 플랫폼에서 애기 모종의 루트 머리 형태를 이미징

Root hairs increase root surface area for better water uptake and nutrient absorption by the plant. Because they are small in size and often obscured by ...

Fabrication of Custom Agarose Wells for Cell Seeding and Tissue Ring Self-assembly Using 3D-Printed Molds

셀 시드를 위한 사용자 지정 Agarose 우물 및 자기 조립 금형 3D 인쇄를 사용 하 여 조직 반지 제작

Engineered tissues are being used clinically for tissue repair and replacement, and are being developed as tools for drug screening and human disease ...

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

꼬마 선 충 에 경도 이미징을 위한 미세 플랫폼

In the last decade, microfluidic techniques have been applied to study small animals, including the nematode Caenorhabditis elegans, and have proved ...

Visualizing Adhesion Formation in Cells by Means of Advanced Spinning Disk-Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

회전 디스크-총 내부 반사 형광 현미경 검사 법 고급 시각화에 의해 세포 접착 형성

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to ...