Name: a custom multiphoton microscopy platform for live imaging of mouse cornea and conjunctiva
Uploaded: 2020-05-17T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Custom Multiphoton Microscopy Platform for Live Imaging of Mouse Cornea and Conjunctiva at JoVE.com

Vi takker tilskuddsstøtten fra Kunnskapsdepartementet, Taiwan (106-2627-M-002-034, 107-2314-B-182A-089, 108-2628-B-002-023, 108-2628-B-002-023), National Taiwan University Hospital (NTUH108-T17) og Chang Gung Memorial Hospital, Taiwan (CMRPG3G1621, CMRPG3G1622, CMRPG3G1623).

Alle dyreforsøk ble utført i samsvar med prosedyrer godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved National Taiwan University og Chang Gung Memorial Hospital.
1. Oppsett av multikopikopi med flere bilder
<ol><li>Bygg et system basert på et oppreist mikroskop med vannsenking 20x 1,00 NA-mål (figur 1A).</li>
	<li>Bruk Ti: Sapphire laser (med tunable bølgelengde) som eksitasjonskilde. Sett laserutgangslengden på 880 nm for EGFP og 940 nm ...

<ol>
	<li>DelMonte, D. W., Kim, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+and+physiology+of+the+cornea.">Anatomy and physiology of the cornea.</a> Journal of Cataract &amp; Refractive Surgery. 37 (3), 588-598 (2011).</li><li>Van Buskirk, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+anatomy+of+the+limbus.">The anatomy of the limbus.</a> Eye (London). 3, 101-108 (1989).</li><li>Hodges, R. R., Dartt, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tear+film+mucins:+front+line+defenders+of+the+ocular+surface;+comparison+with+airway+and+gastrointestinal+tract+mucins.">Tear film mucins: front line defenders of the ocular surface; comparison with airway and gastrointestinal tract mucins.</a> Experimental Eye Research. 117, 62-78 (2013).</li><li>Tan, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiphoton+fluorescence+and+second+harmonic+generation+imaging+of+the+structural+alterations+in+keratoconus+ex+vivo.">Multiphoton fluorescence and second harmonic generation imaging of the structural alterations in keratoconus ex vivo.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 47 (12), 5251-5259 (2006).</li><li>Konig, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiphoton+microscopy+in+life+sciences.">Multiphoton microscopy in life sciences.</a> Journal of Microscopy. 200, 83-104 (2000).</li><li>Rompolas, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+coordination+of+stem+cell+commitment+during+epidermal+homeostasis.">Spatiotemporal coordination of stem cell commitment during epidermal homeostasis.</a> Science. 352 (6292), 1471-1474 (2016).</li><li>Park, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-scale+coordination+of+cellular+behaviour+promotes+epidermal+wound+repair+in+live+mice.">Tissue-scale coordination of cellular behaviour promotes epidermal wound repair in live mice.</a> Nature Cell Biology. 19 (2), 155-163 (2017).</li><li>Xin, T., Gonzalez, D., Rompolas, P., Greco, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flexible+fate+determination+ensures+robust+differentiation+in+the+hair+follicle.">Flexible fate determination ensures robust differentiation in the hair follicle.</a> Nature Cell Biology. 20 (12), 1361-1369 (2018).</li><li>Wu, Y. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+multiphoton+microscopic+imaging+platform+for+ocular+surface+imaging.">Intravital multiphoton microscopic imaging platform for ocular surface imaging.</a> Experimental Eye Research. 182, 194-201 (2019).</li><li>Wu, Y. F., Tan, H. Y., Lin, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-Term+Intravital+Imaging+of+the+Cornea,+Skin,+and+Hair+Follicle+by+Multiphoton+Microscope.">Long-Term Intravital Imaging of the Cornea, Skin, and Hair Follicle by Multiphoton Microscope.</a> Methods in Molecular Biology. , (2019).</li><li>Lo, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+Fourier+transform-based+analysis+of+second-harmonic+generation+image+in+keratoconic+cornea.">Fast Fourier transform-based analysis of second-harmonic generation image in keratoconic cornea.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 53 (7), 3501-3507 (2012).</li><li>Tan, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiphoton+fluorescence+and+second+harmonic+generation+microscopy+for+imaging+infectious+keratitis.">Multiphoton fluorescence and second harmonic generation microscopy for imaging infectious keratitis.</a> Journal of Biomedical Optics. 12 (2), 024013 (2007).</li><li>Jester, J. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Four-dimensional+multiphoton+confocal+microscopy:+the+new+frontier+in+cellular+imaging.">Four-dimensional multiphoton confocal microscopy: the new frontier in cellular imaging.</a> Oculur Surface. 2 (1), 10-20 (2004).</li><li>Morishige, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Second-harmonic+imaging+microscopy+of+normal+human+and+keratoconus+cornea.">Second-harmonic imaging microscopy of normal human and keratoconus cornea.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 48 (3), 1087-1094 (2007).</li><li>Hao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+non-linear+optical+(NLO)+imaging+in+live+rabbit+eyes+using+the+Heidelberg+Two-Photon+Laser+Ophthalmoscope.">In vivo non-linear optical (NLO) imaging in live rabbit eyes using the Heidelberg Two-Photon Laser Ophthalmoscope.</a> Experimental Eye Research. 91 (2), 308-314 (2010).</li><li>Chen, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=R26R-GR:+a+Cre-activable+dual+fluorescent+protein+reporter+mouse.">R26R-GR: a Cre-activable dual fluorescent protein reporter mouse.</a> PLoS One. 7 (9), 46171 (2012).</li><li>Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+global+double-fluorescent+Cre+reporter+mouse.">A global double-fluorescent Cre reporter mouse.</a> Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Masihzadeh, O., Lei, T. C., Ammar, D. A., Kahook, M. Y., Gibson, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multiphoton+microscope+platform+for+imaging+the+mouse+eye.">A multiphoton microscope platform for imaging the mouse eye.</a> Molecular Vision. 18, 1840-1848 (2012).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+of+the+cornea+visualized+in+the+living+mouse+using+vital+dyes.">Two-photon imaging of the cornea visualized in the living mouse using vital dyes.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 54 (10), 6526-6536 (2013).</li><li>Lee, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+confocal+microscopy+and+two-photon+microscopy+in+mouse+cornea+in+vivo.">Comparison of confocal microscopy and two-photon microscopy in mouse cornea in vivo.</a> Experimental Eye Research. 132, 101-108 (2015).</li><li>Ehmke, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+nonlinear+imaging+of+corneal+structures+with+special+focus+on+BALB/c+and+streptozotocin-diabetic+Thy1-YFP+mice.">In vivo nonlinear imaging of corneal structures with special focus on BALB/c and streptozotocin-diabetic Thy1-YFP mice.</a> Experimental Eye Research. 146, 137-144 (2016).</li><li>Webster, M. T., Manor, U., Lippincott-Schwartz, J., Fan, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+Imaging+Reveals+Ghost+Fibers+as+Architectural+Units+Guiding+Myogenic+Progenitors+during+Regeneration.">Intravital Imaging Reveals Ghost Fibers as Architectural Units Guiding Myogenic Progenitors during Regeneration.</a> Cell Stem Cell. 18 (2), 243-252 (2016).</li><li>Mesa, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homeostatic+Epidermal+Stem+Cell+Self-Renewal+Is+Driven+by+Local+Differentiation.">Homeostatic Epidermal Stem Cell Self-Renewal Is Driven by Local Differentiation.</a> Cell Stem Cell. 23 (5), 677-686 (2018).</li><li>Goh, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+imaging+of+dendritic+cell+responses+to+sterile+tissue+injury.">Real-time imaging of dendritic cell responses to sterile tissue injury.</a> Journal of Investigative Dermatology. 135 (4), 1181-1184 (2015).</li><li>Kissenpfennig, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+and+function+of+Langerhans+cells+in+vivo:+dermal+dendritic+cells+colonize+lymph+node+areas+distinct+from+slower+migrating+Langerhans+cells.">Dynamics and function of Langerhans cells in vivo: dermal dendritic cells colonize lymph node areas distinct from slower migrating Langerhans cells.</a> Immunity. 22 (5), 643-654 (2005).</li><li>Chow, Z., Mueller, S. N., Deane, J. A., Hickey, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dermal+regulatory+T+cells+display+distinct+migratory+behavior+that+is+modulated+during+adaptive+and+innate+inflammation.">Dermal regulatory T cells display distinct migratory behavior that is modulated during adaptive and innate inflammation.</a> Journal of Immunology. 191 (6), 3049-3056 (2013).</li><li>Dudeck, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mast+cells+are+key+promoters+of+contact+allergy+that+mediate+the+adjuvant+effects+of+haptens.">Mast cells are key promoters of contact allergy that mediate the adjuvant effects of haptens.</a> Immunity. 34 (6), 973-984 (2011).</li></ol>

Denne spesialbygde MPM-bildeplattformen med en kontrollprogramvare ble brukt til intravital avbildning av museepitelorganer, inkludert hud10,hårsekken10 og okulær overflate9,,10 (figur 1A). Det spesialbygde systemet ble brukt for sin fleksibilitet i å endre de optiske komponentene for ulike eksperimenter, siden begynnelsen av prosjektet vårt. Denne bildemetodikken er allsidig for ko...

Okulære overflatestrukturer, inkludert hornhinnen og conjunctiva, beskytter andre dypere okulære vev mot ytre forstyrrelser. Hornhinnen, den gjennomsiktige fremre delen av øyet, fungerer både som en brytningslinse for å lede lys inn i øyet og som en beskyttende barriere. Hornhinnen epitel er det ytterste laget av hornhinnen og består av forskjellige lag av overfladiske celler, vingeceller og basalceller. Hornhinnen stroma består av sofistikert pakket kollagen lameller innebygd med keratocytter. Hornhinnen endotel, et enkelt lag med flate sekskantede celler, har en viktig rolle i å opprettholde gjennomsiktigheten av hornhinnen ved å holde hornhinnen stroma i en relativt dehydrert tilstand gjennom sine pumpefunksjoner1. Limbus danner grensen mellom hornhinnen og conjunctiva, og er reservoaret av hornhinne epitel stamceller2. Den svært vaskulariserte conjunctiva bidrar til å smøre øynene ved å produsere slim og tårer3.
Celledynamikken i hornhinnens overflatestrukturer studeres konvensjonelt av enten histologisk analyse eller in vitro cellekultur, som kanskje ikke simulerer in vivocelledynamikken tilstrekkelig. En ikke-invasiv levende bildetilnærming kan derfor bygge bro over slike gap. På grunn av fordelene, som inkluderer høy oppløsning, minimal fotodamage og dypere bildedybde, har MPM blitt en kraftig modalitet i ulike områder av biologiskforskning 4,,5,,6,,7,,8. For hornhinnens bildebehandling gir MPM cellulær informasjon fra iboende autofluorescence avledet fra intracellulær NAD(P)H. Andre harmoniske generasjon (SHG) signaler avledet fra ikke-centrosymmetrisk type I kollagen fibre under femtosecond laser skanning gir kollagen stromal strukturer uten ekstra farging prosedyrer9. Tidligere har vi og andre grupper utnyttet MPM for avbildning av dyr og menneskelige hornhinnen9,10,11,12,13,14,15.
Transgene muselinjer som viser fluorescerende proteiner i bestemte cellepopulasjoner har blitt mye brukt til ulike studier i cellebiologi, inkludert utvikling, vevshjemostase, vevregenerering og karsinogenese. Vi brukte transgene musestammer merket med fluorescerende proteiner for in vivo avbildning av hornhinnen9,,10,hårsekkene10 og epidermis10 av MPM. Den doble fluorescerende musstammen med cellemembran merket med tdTomato og cellekjerne merket med EGFP er avlet fra to musestammer: R26R-GR (B6;129-Gt (ROSA)26Sortm1Ytchn/J, #021847)16 og mT-mG (Gt(ROSA26)ACTB-tdTomato-EGFP, #007676)17. R26R-GR transgen muselinje inneholder en dobbel fluorescerende protein reporter konstruksjoner, inkludert en H2B-EGFP fusjon gen og mCherry-GPI anker signal fusjon genet, satt inn i Gt (ROSA) 26Sor locus. MT-mG transgen stamme er en celle membran-målrettet tdTomato og EGFP fluorescerende Cre-reporter mus. Før Cre rekombinasjon er cellemembranprotein med tdTomato fluorescensuttrykk allment tilstede i ulike celler. Denne transgene musestammen gjør det mulig for oss å visualisere kjerner-EGFP og membran med tdTomato uten Cre-eksitasjon. To hunner (R26R-GR+/+) og en hann (mT-mG+/+) transgen mus ble avlet sammen for å produsere tilstrekkelige mus til eksperimenter. Deres avkom med R26R-GR+/-;mT-mG+/- genotype, en dobbel fluorescerende musstamme, ble brukt i denne studien. Sammenlignet med en fluorescerende reporter muselinje som tidligerebeskrevet 9,10, gir denne doble fluorescerende reportermusstammen oss en 50% redusert erverving av bildetid.
I dette arbeidet beskriver vi en detaljert teknisk protokoll for in vivo-avbildning av den okulære overflaten på en trinnvis måte ved hjelp av vår bildeplattform og doble fluorescerende transgene mus.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>AVIZO Lite software</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Version: 2019.3.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bandpass filters</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF01-434/17 
			FF01-500/24 
			FF01-585/40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirrors</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF495-Di01-25x36 FF580-Di01-25x36</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Galvano</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>GVS002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jade BIO control software</td>
			<td>SouthPort Corporation</td>
			<td>Jade BIO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxybuprocaine hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>O0270000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMT</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>H7422A-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyesthylene Tube</td>
			<td>BECTON DICKINSON</td>
			<td>427401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic mouse holder</td>
			<td>Step Technology Co.,Ltd</td>
			<td>000111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ti: Sapphire laser</td>
			<td>Spectra-Physics</td>
			<td>Mai-Tai DeepSee</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Upright microscopy</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX51WI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vidisic Gel</td>
			<td>Dr. Gerhard Mann Chem-pharm. Fabrik GmbH</td>
			<td>D13581</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zoletil</td>
			<td>Virbac</td>
			<td>VR-2831</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a custom multiphoton microscopy platform for live imaging of mouse cornea and conjunctiva

Konvensjonell histologisk analyse og cellekultursystemer er utilstrekkelige til å simulere in vivo fysiologisk og patologisk dynamikk helt. Multiphoton mikroskopi (MPM) har blitt en av de mest populære bildemodaliteter for biomedisinsk studie på cellulære nivåer in vivo, fordeler inkluderer høy oppløsning, dyp vev penetrasjon og minimal fototoksisitet. Vi har designet en MPM bildeplattform med en tilpasset museøyeholder og et stereotoksisk stadium for avbildning av okulær overflate in vivo. Dual fluorescerende protein reporter mus muliggjør visualisering av cellekjerner, cellemembraner, nervefibre og kapillærer innenfor den okulære overflaten. I tillegg til multiphoton fluorescens signaler, anskaffe andre harmonisk generasjon (SHG) samtidig tillater karakterisering av kollagen stromal arkitektur. Denne plattformen kan brukes for intravital avbildning med nøyaktig posisjonering over hele okulær overflate, inkludert hornhinnen og conjunctiva.

Ved hjelp av denne levende bildeplattformen kan musens okulære overflate visualiseres på mobilnivå. For å visualisere individuelle enkeltceller i okulær overflate, brukte vi de doble fluorescerende transgene musene med EGFP uttrykt i kjernen og tdTomato uttrykt i cellemembranen. Kollagen-rik hornhinnen stroma ble fremhevet av SHG signaler.
I hornhinnenpitel ble overfladiske celler, vingeceller og basalceller (figur 2) visualisert. I de doble fluorescerende tr...

Watch this Scientific Journal Video about A Custom Multiphoton Microscopy Platform for Live Imaging of Mouse Cornea and Conjunctiva at JoVE.com

A Custom Multiphoton Microscopy Platform for Live Imaging of Mouse Cornea and Conjunctiva

Presentert her er en multiphoton mikroskopisk plattform for levende mus okulær overflateavbildning. Fluorescerende transgen mus muliggjør visualisering av cellekjerner, cellemembraner, nervefibre og kapillærer innenfor den okulære overflaten. Ikke-lineære andre harmoniske generasjonssignaler avledet fra kollagenstrukturer gir etikettfri bildebehandling for stromal arkitekturer.

En tilpasset multiphoton mikroskopi plattform for live imaging av mus cornea og conjunctiva

Conventional histological analysis and cell culture systems are insufficient to simulate in vivo physiological and pathological dynamics completely. ...

Denne protokollen bruker et multifiltermikroskop for levende avbildning av hele strukturen av musen okulær overflate i den doble fluorescerende transgene musemodellen. Kombinasjonen av en tilpasset multiphoton mikroskopisk plattform og doble fluorescerende transgene mus muliggjør sanntidsvisualisering av og strukturen til den okulære overflaten. Hvis du vil konfigurere multifotografoskopet, velger du vannsenking 20X, 1,00 NA-målet og setter Titanium Sapphire-laseren som eksitasjonskilde på et oppreist mikroskop.Sett laserutgangsbølgelengden til 880 nanometer for EGFP og 940 nanometer for tdTomato. Inkluder to dichroic speil for separasjon av SHG EGFP og EGFP tdTomato og bruk 434-17, 510-84 og 585-40 nanometers bånd pass filtre for å ses skille SHG EGFP og tdTomato signaler. For å sette opp øyeholderen, etter å ha bekreftet mangel på respons på pedalrefleks i en bedøvet 8-12 uker gammel mus, plasser musen på det oppvarmede mikroskopstadiet og sett inn en temperaturovervåkingssonde.Plasser musen i en tilpasset stereotaksisk museholder og sett ørestenger inn i den eksterne auditive meatus. Bruk trepunktsfiksering for å feste hodeholderen og påfør en 0,4% Oxybuprocaine Hydrochloride og saltvannsløsning på okulær overflate. Dekk tuppene til et par nummer fem Dumont tang med PE tube loop.Etter tre minutter utfører du en manuell tilbaketrekking av øyelokk for å bekrefte øyeeplets fremspring og plasser forsiktig en PE holderrørssløyfe langs øyelokkmarginen for å eksponere den okulære overflaten. Og bruk knotten på holderen til å stabilisere øyebollet med tangene. Dekk deretter hornhinnens overflate med en øyegel med en brytningsindeks på 1,338.For Z serielt bildebehandling av hornhinnen overflaten, bruk en kvikksølv lyskilde for å bilde målretting feltet og åpne mikroskop programvare. Velg riktig bildemultiplikator og digitale gevinster for å visualisere cellestrukturen i den okulære overflaten og angi det første og siste lysbildet for å tillate innhenting av en bildestakk. Sett bildeoppløsningen til 512 med 512 piksler og Z-trinnet til ett mikrometer.Deretter klikker du begynne å samle Z seriebilder anskaffe ett levende bilde med en 880 nanometer eksitasjon for SHG EGFP signal samling, og ett levende bilde på en 940 nanometer excitation for EGFP tdTomato signal samling innenfor hvert område. Gjennom hele bildet bruker du steppermotorisert sceneholder til å rotere øyeeplet for å tillate avbildning over hele hornhinnens overflate. Når alle bildene er anskaffet, laster du Z-seriebildene til Fiji og velger Plugin-modulen Median 3D-filter.Når du har fjernet bakgrunnsstøyen, velger du den uskarpe maskefilterpakken Fiji for å skjerpe bildene og klikke på automatisk lysstyrkekontrast for å optimalisere kvaliteten på bildene automatisk. Etter behandling lagrer du bildene som en seriell bildesekvens og eksporterer bildesekvensen til et passende 3D-rekonstruksjonsprogram. I alle multiphoton mikroskopi bilder, presentere EGFP tdTomato og SHG signaler i pseudo grønn, rød, og cyan henholdsvis før du tar 3D-struktur bilder ved øyeblikksbilde.Multiphoton mikroskopi tillater visualisering av overfladiske Wing og Basal celler i hornhinnen epitel av doble fluorescerende transgene mus. Enkeltceller fra basallaget kan kartlegges til det overfladiske laget, samt enkelt sekskantede formede overfladiske celler. Som avslørt av det cytoplasmatiske uttrykket av tdTomato-signalet, er membranproteinrike intracellulære vesikulære systemet, inkludert golgiapparatet og endoplasmatisk retikuulum spredt i vingecellene.Innenfor kollagenøs stroma er de stellateformede koratsittene skissert av membranen rettet mot EGFP-fluorescerende i disse musene. Koratittene som er innebygd i collegen stroma er mer løst fordelt enn i endotelcellene. I tillegg kan tynne forgreningsnerver i hornhinnen stroma også visualiseres ved membran rettet mot tdTomato-signaler og hornhinne endotelcellemonolag viser en relativt homogen sekskantet form forbundet i et honeycombed mønster.Limbal epitel består av ett til to lag epitelceller. Den doble fluorescerende reportertransgene belastningen muliggjør også avbildning av kapillærer i conjunctiva, noe som letter rekonstruksjonen av kapillærenes 3D-arkitektur som skisserer vaskulær endotelet. Stabilisering av øyeeplet med moderat trykk uten skade er avgjørende for å skaffe bilder av god kvalitet, da utilstrekkelig eller overdrevent trykk kan kompromittere bildekvaliteten.Denne NVivo bildebildeplattformen kan endres for visualisering av strukturer under okulær overflate og kan brukes på in-situ studier av ulike oftalmiske sykdommer.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy

Prøven Forberedelse, Imaging, og analyse protokoller for Knife-edge Scanning Mikroskopi

Major advances in high-throughput, high-resolution, 3D microscopy techniques have enabled the acquisition of large volumes of neuroanatomical data at ...

Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

Bruke Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses i<em&gt; Drosophila</em&gt; Larver

Live imaging is an important technique for studying cell biological processes, however this can be challenging in live animals. The translucent cuticle of ...

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Fluorescens-slukking av en Liposomalinnkapslet Nær-infrarød fluoroforen som et verktøy for<em&gt; I Vivo</em&gt; Optisk Imaging

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous ...

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

Atomic Force Microscopy Imaging and Force spektroskopi av Supported lipidbilag

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

Visualizing Angiogenesis by Multiphoton Microscopy In Vivo in Genetically Modified 3D-PLGA/nHAp Scaffold for Calvarial Critical Bone Defect Repair

Visualizing Angiogenesis by Multiphoton Microscopy In Vivo in Genetically Modified 3D-PLGA/nHAp Scaffold for Calvarial Critical Bone Defect Repair

Visualisere angiogenese av Multiphoton mikroskopi I Vivo i genmodifiserte 3D-PLGA/nHAp stillaset Calvarial kritisk bein defekt reparasjon

The reconstruction of critically sized bone defects remains a serious clinical problem because of poor angiogenesis within tissue-engineered scaffolds ...

Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform

Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform

Imaging roten håret morfologi av Arabidopsis frøplanter i en to-lags Microfluidic plattform

Root hairs increase root surface area for better water uptake and nutrient absorption by the plant. Because they are small in size and often obscured by ...

Fabrication of Custom Agarose Wells for Cell Seeding and Tissue Ring Self-assembly Using 3D-Printed Molds

Fabrikasjon av egendefinerte Agarose for celle såing og vev Ring selvstendig montering med 3D-trykt muggsopp

Engineered tissues are being used clinically for tissue repair and replacement, and are being developed as tools for drug screening and human disease ...

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

En Microfluidic plattform for langsgående Imaging i Caenorhabditis elegans

In the last decade, microfluidic techniques have been applied to study small animals, including the nematode Caenorhabditis elegans, and have proved ...

Visualizing Adhesion Formation in Cells by Means of Advanced Spinning Disk-Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

Visualisere vedheft formasjon i celler ved hjelp av avansert spinner disken totalt interne refleksjon fluorescens mikroskopi

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to ...