Name: a custom multiphoton microscopy platform for live imaging of mouse cornea and conjunctiva
Uploaded: 2020-05-17T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Custom Multiphoton Microscopy Platform for Live Imaging of Mouse Cornea and Conjunctiva at JoVE.com

Agradecemos o apoio do Ministério da Ciência e Tecnologia, Taiwan (106-2627-M-002-034, 107-2314-B-182A-089, 108-2628-B-002-023, 108-2628-B-002-023), National Taiwan University Hospital (NTUH108-T17) e Chang Gung Memorial Hospital, Taiwan (CMRPG3G1621, CMRPG3G1622, CMRPG3G1623).

Todos os experimentos em animais foram realizados de acordo com os procedimentos aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade Nacional de Taiwan e do Chang Gung Memorial Hospital.
1. Configuração de microscopia multifotônica
<ol><li>Construa um sistema baseado em um microscópio vertical com imersão de água 20x 1.00 NA objetivo(Figura 1A).</li>
	<li>Use Ti: Laser de safira (com comprimento de onda tunable) como f...

<ol>
	<li>DelMonte, D. W., Kim, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+and+physiology+of+the+cornea.">Anatomy and physiology of the cornea.</a> Journal of Cataract &amp; Refractive Surgery. 37 (3), 588-598 (2011).</li><li>Van Buskirk, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+anatomy+of+the+limbus.">The anatomy of the limbus.</a> Eye (London). 3, 101-108 (1989).</li><li>Hodges, R. R., Dartt, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tear+film+mucins:+front+line+defenders+of+the+ocular+surface;+comparison+with+airway+and+gastrointestinal+tract+mucins.">Tear film mucins: front line defenders of the ocular surface; comparison with airway and gastrointestinal tract mucins.</a> Experimental Eye Research. 117, 62-78 (2013).</li><li>Tan, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiphoton+fluorescence+and+second+harmonic+generation+imaging+of+the+structural+alterations+in+keratoconus+ex+vivo.">Multiphoton fluorescence and second harmonic generation imaging of the structural alterations in keratoconus ex vivo.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 47 (12), 5251-5259 (2006).</li><li>Konig, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiphoton+microscopy+in+life+sciences.">Multiphoton microscopy in life sciences.</a> Journal of Microscopy. 200, 83-104 (2000).</li><li>Rompolas, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+coordination+of+stem+cell+commitment+during+epidermal+homeostasis.">Spatiotemporal coordination of stem cell commitment during epidermal homeostasis.</a> Science. 352 (6292), 1471-1474 (2016).</li><li>Park, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-scale+coordination+of+cellular+behaviour+promotes+epidermal+wound+repair+in+live+mice.">Tissue-scale coordination of cellular behaviour promotes epidermal wound repair in live mice.</a> Nature Cell Biology. 19 (2), 155-163 (2017).</li><li>Xin, T., Gonzalez, D., Rompolas, P., Greco, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flexible+fate+determination+ensures+robust+differentiation+in+the+hair+follicle.">Flexible fate determination ensures robust differentiation in the hair follicle.</a> Nature Cell Biology. 20 (12), 1361-1369 (2018).</li><li>Wu, Y. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+multiphoton+microscopic+imaging+platform+for+ocular+surface+imaging.">Intravital multiphoton microscopic imaging platform for ocular surface imaging.</a> Experimental Eye Research. 182, 194-201 (2019).</li><li>Wu, Y. F., Tan, H. Y., Lin, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-Term+Intravital+Imaging+of+the+Cornea,+Skin,+and+Hair+Follicle+by+Multiphoton+Microscope.">Long-Term Intravital Imaging of the Cornea, Skin, and Hair Follicle by Multiphoton Microscope.</a> Methods in Molecular Biology. , (2019).</li><li>Lo, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+Fourier+transform-based+analysis+of+second-harmonic+generation+image+in+keratoconic+cornea.">Fast Fourier transform-based analysis of second-harmonic generation image in keratoconic cornea.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 53 (7), 3501-3507 (2012).</li><li>Tan, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiphoton+fluorescence+and+second+harmonic+generation+microscopy+for+imaging+infectious+keratitis.">Multiphoton fluorescence and second harmonic generation microscopy for imaging infectious keratitis.</a> Journal of Biomedical Optics. 12 (2), 024013 (2007).</li><li>Jester, J. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Four-dimensional+multiphoton+confocal+microscopy:+the+new+frontier+in+cellular+imaging.">Four-dimensional multiphoton confocal microscopy: the new frontier in cellular imaging.</a> Oculur Surface. 2 (1), 10-20 (2004).</li><li>Morishige, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Second-harmonic+imaging+microscopy+of+normal+human+and+keratoconus+cornea.">Second-harmonic imaging microscopy of normal human and keratoconus cornea.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 48 (3), 1087-1094 (2007).</li><li>Hao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+non-linear+optical+(NLO)+imaging+in+live+rabbit+eyes+using+the+Heidelberg+Two-Photon+Laser+Ophthalmoscope.">In vivo non-linear optical (NLO) imaging in live rabbit eyes using the Heidelberg Two-Photon Laser Ophthalmoscope.</a> Experimental Eye Research. 91 (2), 308-314 (2010).</li><li>Chen, Y. 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D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+global+double-fluorescent+Cre+reporter+mouse.">A global double-fluorescent Cre reporter mouse.</a> Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Masihzadeh, O., Lei, T. C., Ammar, D. A., Kahook, M. Y., Gibson, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multiphoton+microscope+platform+for+imaging+the+mouse+eye.">A multiphoton microscope platform for imaging the mouse eye.</a> Molecular Vision. 18, 1840-1848 (2012).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+of+the+cornea+visualized+in+the+living+mouse+using+vital+dyes.">Two-photon imaging of the cornea visualized in the living mouse using vital dyes.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 54 (10), 6526-6536 (2013).</li><li>Lee, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+confocal+microscopy+and+two-photon+microscopy+in+mouse+cornea+in+vivo.">Comparison of confocal microscopy and two-photon microscopy in mouse cornea in vivo.</a> Experimental Eye Research. 132, 101-108 (2015).</li><li>Ehmke, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+nonlinear+imaging+of+corneal+structures+with+special+focus+on+BALB/c+and+streptozotocin-diabetic+Thy1-YFP+mice.">In vivo nonlinear imaging of corneal structures with special focus on BALB/c and streptozotocin-diabetic Thy1-YFP mice.</a> Experimental Eye Research. 146, 137-144 (2016).</li><li>Webster, M. T., Manor, U., Lippincott-Schwartz, J., Fan, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+Imaging+Reveals+Ghost+Fibers+as+Architectural+Units+Guiding+Myogenic+Progenitors+during+Regeneration.">Intravital Imaging Reveals Ghost Fibers as Architectural Units Guiding Myogenic Progenitors during Regeneration.</a> Cell Stem Cell. 18 (2), 243-252 (2016).</li><li>Mesa, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homeostatic+Epidermal+Stem+Cell+Self-Renewal+Is+Driven+by+Local+Differentiation.">Homeostatic Epidermal Stem Cell Self-Renewal Is Driven by Local Differentiation.</a> Cell Stem Cell. 23 (5), 677-686 (2018).</li><li>Goh, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+imaging+of+dendritic+cell+responses+to+sterile+tissue+injury.">Real-time imaging of dendritic cell responses to sterile tissue injury.</a> Journal of Investigative Dermatology. 135 (4), 1181-1184 (2015).</li><li>Kissenpfennig, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+and+function+of+Langerhans+cells+in+vivo:+dermal+dendritic+cells+colonize+lymph+node+areas+distinct+from+slower+migrating+Langerhans+cells.">Dynamics and function of Langerhans cells in vivo: dermal dendritic cells colonize lymph node areas distinct from slower migrating Langerhans cells.</a> Immunity. 22 (5), 643-654 (2005).</li><li>Chow, Z., Mueller, S. N., Deane, J. A., Hickey, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dermal+regulatory+T+cells+display+distinct+migratory+behavior+that+is+modulated+during+adaptive+and+innate+inflammation.">Dermal regulatory T cells display distinct migratory behavior that is modulated during adaptive and innate inflammation.</a> Journal of Immunology. 191 (6), 3049-3056 (2013).</li><li>Dudeck, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mast+cells+are+key+promoters+of+contact+allergy+that+mediate+the+adjuvant+effects+of+haptens.">Mast cells are key promoters of contact allergy that mediate the adjuvant effects of haptens.</a> Immunity. 34 (6), 973-984 (2011).</li></ol>

Esta plataforma de imagem MPM personalizada com um software de controle foi usada para imagens intravitais de órgãos epiteliais de camundongos, incluindo pele10,folículo piloso10 e superfície ocular9,,10 (Figura 1A). O sistema personalizado foi usado por sua flexibilidade na alteração dos componentes ópticos para vários experimentos, desde o início do nosso projeto. Essa metodo...

As estruturas superficiais oculares, incluindo a córnea e a conjuntiva, protegem outros tecidos oculares mais profundos de distúrbios externos. A córnea, a parte frontal transparente do olho, funciona tanto como uma lente refrativa para direcionar a luz para o olho quanto como uma barreira protetora. O epitélio corneo é a camada mais externa da córnea e consiste em camadas distintas de células superficiais, células de asa e células basais. O estroma corneal é composto de lamellae colagenosa sofisticadamente embalada embutida com ceratocitos. O endotélio corneo, uma única camada de células hexagonais planas, tem um papel importante na manutenção da transparência da córnea, mantendo o estroma córnea em um estado relativamente desidratado através de suas funções de bombeamento1. Limbus forma a borda entre a córnea e a conjuntiva, e é o reservatório de células-tronco epiteliais da córnea2. A conjuntiva altamente vascularizada ajuda a lubrificar os olhos produzindo muco e lágrimas3.
A dinâmica celular das estruturas da superfície córnea é convencionalmente estudada pela análise histológica ou pela cultura celular in vitro, o que pode não simular adequadamente a dinâmica celular in vivo. Uma abordagem de imagem ao vivo não invasiva pode, portanto, preencher tal lacuna. Devido às suas vantagens, que incluem alta resolução, fotodamagem mínima e profundidade de imagem mais profunda, o MPM tornou-se uma modalidade poderosa em diversas áreas de pesquisa biológica4,,5,,6,,7,,8. Para imagens córneas, o MPM fornece informações celulares da autofluorescência intrínseca derivada do NAD intracelular(P)H). Sinais de segunda geração harmônica (SHG) derivados das fibras de colágeno tipo I não centrosimétricas sob a varredura a laser femtosegundo fornecem estruturas estromais colágenos sem procedimentos adicionais de coloração9. Anteriormente, nós e outros grupos exploramos MPM para imagens de córneas animais e humanas9,,10,,11,12,,13,,14,,15.
Linhas de camundongos transgênicos que exibem proteínas fluorescentes em populações de células específicas têm sido amplamente utilizadas para vários estudos em biologia celular, incluindo desenvolvimento, homeostase tecidual, regeneração tecidual e carcinogênese. Foram utilizadas cepas de camundongos transgênicos rotuladas com proteínas fluorescentes para imagem in vivo de córneas9,,10, folículos capilares10 e epiderme10 por MPM. A cepa de camundongo fluorescente duplo com membrana celular rotulada com tdTomato e núcleo celular marcado com EGFP é criada a partir de duas cepas de camundongos: R26R-GR (B6;129-Gt (ROSA)26Sortm1Ytchn/J, #021847)16 e mT-mG (Gt(ROSA26)ACTB-tdTomato-EGFP, #007676)17. A linha de camundongos transgênicos R26R-GR contém uma dupla proteína fluorescente, incluindo um gene de fusão H2B-EGFP e um gene de fusão de sinal de âncora mCherry-GPI, inserido no lócus gt (ROSA)26Sor. A cepa transgênica mT-mG é um tdTomato de membrana celular e ratos cre-repórter fluorescentes EGFP. Antes da recombinação da Cre, a proteína da membrana celular com expressão de fluorescência tdTomato está amplamente presente em várias células. Esta cepa de camundongos transgênicos nos permite visualizar núcleos-EGFP e membrana com tdTomato sem excitação cre. Duas fêmeas (R26R-GR+/+) e um macho (mT-mG+/+) foram criadas juntas para produzir camundongos suficientes para experimentos. Sua prole com R26R-GR+/-;mT-mG+/- genótipo, uma cepa de camundongos fluorescentes duplos, foi utilizada neste estudo. Comparado com uma linha de mouse de repórter fluorescente como descrito anteriormente9,10, esta cepa de mouse repórter fluorescente duplo nos fornece uma redução de 50% do tempo de imagem.
Neste trabalho, descrevemos um protocolo técnico detalhado para imagens in vivo da superfície ocular de forma passo a passo usando nossa plataforma de imagem e camundongos transgênicos fluorescentes duplos.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>AVIZO Lite software</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Version: 2019.3.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bandpass filters</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF01-434/17 
			FF01-500/24 
			FF01-585/40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirrors</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF495-Di01-25x36 FF580-Di01-25x36</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Galvano</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>GVS002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jade BIO control software</td>
			<td>SouthPort Corporation</td>
			<td>Jade BIO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxybuprocaine hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>O0270000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMT</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>H7422A-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyesthylene Tube</td>
			<td>BECTON DICKINSON</td>
			<td>427401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic mouse holder</td>
			<td>Step Technology Co.,Ltd</td>
			<td>000111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ti: Sapphire laser</td>
			<td>Spectra-Physics</td>
			<td>Mai-Tai DeepSee</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Upright microscopy</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX51WI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vidisic Gel</td>
			<td>Dr. Gerhard Mann Chem-pharm. Fabrik GmbH</td>
			<td>D13581</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zoletil</td>
			<td>Virbac</td>
			<td>VR-2831</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a custom multiphoton microscopy platform for live imaging of mouse cornea and conjunctiva

A análise histológica convencional e os sistemas de cultura celular são insuficientes para simular completamente a dinâmica fisiológica e patológica in vivo. A microscopia multifotônica (MPM) tornou-se uma das modalidades de imagem mais populares para estudo biomédico em níveis celulares in vivo, as vantagens incluem alta resolução, penetração de tecido profundo e fototoxicidade mínima. Projetamos uma plataforma de imagem MPM com suporte para olhos de mouse personalizado e um estágio estereotaxico para imagem de superfície ocular in vivo. O rato repórter de proteína fluorescente dupla permite a visualização de núcleos celulares, membranas celulares, fibras nervosas e capilares dentro da superfície ocular. Além dos sinais de fluorescência multifotônica, a aquisição de segunda geração harmônica (SHG) permite simultaneamente a caracterização da arquitetura estromal colágena. Esta plataforma pode ser empregada para imagens intravitais com posicionamento preciso em toda a superfície ocular, incluindo córnea e conjuntiva.

Usando esta plataforma de imagem ao vivo, a superfície ocular do mouse pode ser visualizada em níveis celulares. Para visualizar células individuais únicas na superfície ocular, empregamos os camundongos transgênicos fluorescentes duplos com EGFP expressos no núcleo e tdTomato expressos na membrana celular. O estroma córnea rico em colágeno foi destacado por sinais shg.
No epitélio córnea, foram visualizadas células superficiais, células de asa e células basais (<strong class="xf...

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A Custom Multiphoton Microscopy Platform for Live Imaging of Mouse Cornea and Conjunctiva

Apresentada aqui é uma plataforma microscópica multifotípica para imagens de superfície ocular de rato vivo. O camundongo transgênico fluorescente permite a visualização de núcleos celulares, membranas celulares, fibras nervosas e capilares dentro da superfície ocular. Sinais de segunda geração harmônica não lineares derivados de estruturas colágenas fornecem imagens sem rótulos para arquiteturas estromais.

Uma plataforma personalizada de microscopia multifotn para imagens ao vivo de córnea de rato e conjuntiva

Conventional histological analysis and cell culture systems are insufficient to simulate in vivo physiological and pathological dynamics completely. ...

Este protocolo usa um microscópio multi-filtro para imagens ao vivo de toda a estrutura da superfície ocular do rato no modelo de camundongo transgênico fluorescente duplo. A combinação de uma plataforma microscópica multifotográfica personalizada e camundongos transgênicos fluorescentes duplos permite a visualização em tempo real da e estrutura da superfície ocular. Para configurar o microscópio multifotônio, selecione a imersão de água 20X, 1,00 NA objetivo e definir o laser de safira de titânio como a fonte de excitação em um microscópio vertical.Defina o comprimento de onda de saída do laser para 880 nanômetros para EGFP e 940 nanômetros para tdTomato. Inclua dois espelhosdicâmicos para a separação de shg egfp tdTomato e use 434-17, 510-84 e 585-40 filtros de passagem de banda para separar espectralmente os sinais SHG EGFP e tdTomato. Para configurar o suporte dos olhos, depois de confirmar a falta de resposta ao reflexo do pedal em um rato anestotista de 8 a 12 semanas, coloque o mouse no estágio do microscópio aquecido e insira uma sonda de monitoramento de temperatura.Coloque o mouse em um suporte de mouse esteretaxic personalizado e insira barras de ouvido no meatus auditivo externo. Use fixação de três pontos para fixar o suporte da cabeça e aplique uma solução de cloridrato de oxybuprocaina de 0,4% oxybuprocaine e solução salina à superfície ocular. Cubra as pontas de um par de fórceps Dumont número cinco com o laço do tubo PE.Após três minutos, realize uma retração manual das pálpebras para confirmar a saliência do globo ocular e coloque cuidadosamente um laço do tubo do suporte de PE ao longo da margem das pálpebras para expor a superfície ocular. E use o botão do suporte para estabilizar o globo ocular com os fórceps. Em seguida, cubra a superfície da córnea com um gel ocular com um índice refrativo de 1.338.Para imagens seriais Z da superfície córnea, use uma fonte de luz de mercúrio para fotografar o campo de alvo e abrir o software do microscópio. Selecione o multiplicador de fotos apropriado e os ganhos digitais para visualizar a estrutura celular na superfície ocular e defina o primeiro e último slide para permitir a aquisição de uma pilha de imagens. Defina a resolução da imagem para 512 por 512 pixels e a etapa Z para um micrômetro.Em seguida, clique em começar a coletar imagens seriais Z adquirindo uma imagem ao vivo com uma excitação de 880 nanômetros para a coleta de sinal SHG EGFP e uma imagem ao vivo em uma excitação de 940 nanômetros para a coleta de sinal EGFP tdTomato dentro de cada área. Ao longo da imagem, use o suporte de estágio motorizado do stepper para girar o globo ocular para permitir imagens em toda a superfície córnea. Quando todas as imagens tiverem sido adquiridas, carregue as imagens de série Z em Fiji e selecione o plugin de filtro 3D mediano.Depois de remover o ruído de fundo, selecione o pacote de filtro de máscara não-har Fiji para afiar as imagens e clicar em contraste automático de brilho para otimizar automaticamente a qualidade das imagens. Após o processamento, salve as imagens como uma sequência de imagens serial e exporte a sequência de imagens para um programa de software de reconstrução 3D apropriado. Em todas as imagens de microscopia multifotúr, apresente os sinais EGFP tdTomato e SHG em pseudo verde, vermelho e ciano, respectivamente, antes de capturar as imagens da estrutura 3D por instantâneo.A microscopia multifotônio permite a visualização de células superficiais de Asa e Basal no epitélio córnea de camundongos transgênicos fluorescentes duplos. Células únicas da camada basal podem ser mapeadas para a camada superficial, bem como células superficiais em forma hexagonal única. Como revelado pela expressão citoplasmática do sinal tdTomato, o rico sistema vesicular intracelular da proteína da membrana, incluindo o aparelho golgi e o ânticulo endoplasmático está espalhado dentro das células das asas.Dentro do estroma colágeno, os coratesites em forma de stellate são delineados pela membrana que tem como alvo fluorescentes EGFP nesses camundongos. Os coratesites embutidos no estroma universitário são mais espaçados do que dentro das células endoteliais. Além disso, nervos finos de ramificação dentro do estroma córnea também podem ser visualizados por membrana direcionada a sinais tdTomato e moncaminhas de células endoteliais da córnea demonstram uma forma hexagonal relativamente homogênea conectada em um padrão de favo de mel.O epitélio limbal consiste de uma a duas camadas de células epiteliais. A cepa transgênica de repórter fluorescente dupla também permite a imagem de capilares dentro da conjuntiva, facilitando a reconstrução da arquitetura 3D dos capilares delineando o endotélio vascular. Estabilizar o globo ocular com pressão moderada sem ferimentos é fundamental para a aquisição de imagens de boa qualidade, pois pressão insuficiente ou excessiva pode comprometer a qualidade da imagem.Esta plataforma de imagem NVivo pode ser modificada para visualização de estruturas abaixo da superfície ocular e pode ser aplicada a estudos in situ de várias doenças oftálmicas.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy

Preparação de amostras, Imaging, and Analysis Protocolos para Faca de ponta microscopia de varredura

Major advances in high-throughput, high-resolution, 3D microscopy techniques have enabled the acquisition of large volumes of neuroanatomical data at ...

Bioengenharia

Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

O uso de chips microfluídicos para Imagens ao vivo e estudo das respostas Lesão em<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvas

Live imaging is an important technique for studying cell biological processes, however this can be challenging in live animals. The translucent cuticle of ...

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Fluorescência-têmpera de um Fluoróforo encapsulado em lipossomas Near-infrared como ferramenta para<em&gt; In Vivo</em&gt; Imageamento óptico

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous ...

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

Projeção de imagem atômica e força Espectroscopia de Bicamadas Lipídicas suportados

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

Visualizing Angiogenesis by Multiphoton Microscopy In Vivo in Genetically Modified 3D-PLGA/nHAp Scaffold for Calvarial Critical Bone Defect Repair

Visualizing Angiogenesis by Multiphoton Microscopy In Vivo in Genetically Modified 3D-PLGA/nHAp Scaffold for Calvarial Critical Bone Defect Repair

Visualizando a angiogênese por Multiphoton microscopia In Vivo no andaime de 3D-PLGA/nhập geneticamente modificado para raspagem crítico reparo de defeito ósseo

The reconstruction of critically sized bone defects remains a serious clinical problem because of poor angiogenesis within tissue-engineered scaffolds ...

Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform

Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform

A raiz do cabelo morfologia de plântulas de Arabidopsis em uma plataforma Microfluidic de duas camadas de imagem

Root hairs increase root surface area for better water uptake and nutrient absorption by the plant. Because they are small in size and often obscured by ...

Fabrication of Custom Agarose Wells for Cell Seeding and Tissue Ring Self-assembly Using 3D-Printed Molds

Fabricação de poços de Agarose personalizado para a propagação de células e tecido anel Self-assembly usando moldes 3D-impresso

Engineered tissues are being used clinically for tissue repair and replacement, and are being developed as tools for drug screening and human disease ...

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

Uma plataforma Microfluidic para Imaging Longitudinal em Caenorhabditis elegans

In the last decade, microfluidic techniques have been applied to study small animals, including the nematode Caenorhabditis elegans, and have proved ...

Visualizing Adhesion Formation in Cells by Means of Advanced Spinning Disk-Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

Visualizando a formação de adesão em células por meio de avançados girando a reflexão interna Total disco microscopia de fluorescência

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to ...