Name: a custom multiphoton microscopy platform for live imaging of mouse cornea and conjunctiva
Uploaded: 2020-05-17T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Custom Multiphoton Microscopy Platform for Live Imaging of Mouse Cornea and Conjunctiva at JoVE.com

Vi tackar bidragsstödet från ministeriet för vetenskap och teknik, Taiwan (106-2627-M-002-034, 107-2314-B-182A-089, 108-2628-B-002-023, 108-2628-B-002-023), National Taiwan University Hospital (NTUH108-T17) och Chang Gung Memorial Hospital, Taiwan (CMRPG3G1621, CMRPG3G1622, CMRPG3G1623).

Alla djurförsök utfördes i enlighet med förfaranden som godkänts av den institutionella Animal Care and Use Committee (IACUC) vid National Taiwan University och Chang Gung Memorial Hospital.
1. Multiphoton mikroskopi setup
<ol><li>Bygg ett system som bygger på ett upprätt mikroskop med vatten nedsänkning 20x 1,00 NA mål (Figur 1A).</li>
	<li>Använd Ti: Sapphire laser (med avstämbar våglängd) som excitation källa. Ställ in laserutgångsvåglängden...

<ol>
	<li>DelMonte, D. W., Kim, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+and+physiology+of+the+cornea.">Anatomy and physiology of the cornea.</a> Journal of Cataract &amp; Refractive Surgery. 37 (3), 588-598 (2011).</li><li>Van Buskirk, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+anatomy+of+the+limbus.">The anatomy of the limbus.</a> Eye (London). 3, 101-108 (1989).</li><li>Hodges, R. R., Dartt, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tear+film+mucins:+front+line+defenders+of+the+ocular+surface;+comparison+with+airway+and+gastrointestinal+tract+mucins.">Tear film mucins: front line defenders of the ocular surface; comparison with airway and gastrointestinal tract mucins.</a> Experimental Eye Research. 117, 62-78 (2013).</li><li>Tan, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiphoton+fluorescence+and+second+harmonic+generation+imaging+of+the+structural+alterations+in+keratoconus+ex+vivo.">Multiphoton fluorescence and second harmonic generation imaging of the structural alterations in keratoconus ex vivo.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 47 (12), 5251-5259 (2006).</li><li>Konig, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiphoton+microscopy+in+life+sciences.">Multiphoton microscopy in life sciences.</a> Journal of Microscopy. 200, 83-104 (2000).</li><li>Rompolas, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+coordination+of+stem+cell+commitment+during+epidermal+homeostasis.">Spatiotemporal coordination of stem cell commitment during epidermal homeostasis.</a> Science. 352 (6292), 1471-1474 (2016).</li><li>Park, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-scale+coordination+of+cellular+behaviour+promotes+epidermal+wound+repair+in+live+mice.">Tissue-scale coordination of cellular behaviour promotes epidermal wound repair in live mice.</a> Nature Cell Biology. 19 (2), 155-163 (2017).</li><li>Xin, T., Gonzalez, D., Rompolas, P., Greco, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flexible+fate+determination+ensures+robust+differentiation+in+the+hair+follicle.">Flexible fate determination ensures robust differentiation in the hair follicle.</a> Nature Cell Biology. 20 (12), 1361-1369 (2018).</li><li>Wu, Y. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+multiphoton+microscopic+imaging+platform+for+ocular+surface+imaging.">Intravital multiphoton microscopic imaging platform for ocular surface imaging.</a> Experimental Eye Research. 182, 194-201 (2019).</li><li>Wu, Y. F., Tan, H. Y., Lin, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-Term+Intravital+Imaging+of+the+Cornea,+Skin,+and+Hair+Follicle+by+Multiphoton+Microscope.">Long-Term Intravital Imaging of the Cornea, Skin, and Hair Follicle by Multiphoton Microscope.</a> Methods in Molecular Biology. , (2019).</li><li>Lo, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+Fourier+transform-based+analysis+of+second-harmonic+generation+image+in+keratoconic+cornea.">Fast Fourier transform-based analysis of second-harmonic generation image in keratoconic cornea.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 53 (7), 3501-3507 (2012).</li><li>Tan, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiphoton+fluorescence+and+second+harmonic+generation+microscopy+for+imaging+infectious+keratitis.">Multiphoton fluorescence and second harmonic generation microscopy for imaging infectious keratitis.</a> Journal of Biomedical Optics. 12 (2), 024013 (2007).</li><li>Jester, J. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Four-dimensional+multiphoton+confocal+microscopy:+the+new+frontier+in+cellular+imaging.">Four-dimensional multiphoton confocal microscopy: the new frontier in cellular imaging.</a> Oculur Surface. 2 (1), 10-20 (2004).</li><li>Morishige, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Second-harmonic+imaging+microscopy+of+normal+human+and+keratoconus+cornea.">Second-harmonic imaging microscopy of normal human and keratoconus cornea.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 48 (3), 1087-1094 (2007).</li><li>Hao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+non-linear+optical+(NLO)+imaging+in+live+rabbit+eyes+using+the+Heidelberg+Two-Photon+Laser+Ophthalmoscope.">In vivo non-linear optical (NLO) imaging in live rabbit eyes using the Heidelberg Two-Photon Laser Ophthalmoscope.</a> Experimental Eye Research. 91 (2), 308-314 (2010).</li><li>Chen, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=R26R-GR:+a+Cre-activable+dual+fluorescent+protein+reporter+mouse.">R26R-GR: a Cre-activable dual fluorescent protein reporter mouse.</a> PLoS One. 7 (9), 46171 (2012).</li><li>Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+global+double-fluorescent+Cre+reporter+mouse.">A global double-fluorescent Cre reporter mouse.</a> Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Masihzadeh, O., Lei, T. C., Ammar, D. A., Kahook, M. Y., Gibson, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multiphoton+microscope+platform+for+imaging+the+mouse+eye.">A multiphoton microscope platform for imaging the mouse eye.</a> Molecular Vision. 18, 1840-1848 (2012).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+of+the+cornea+visualized+in+the+living+mouse+using+vital+dyes.">Two-photon imaging of the cornea visualized in the living mouse using vital dyes.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 54 (10), 6526-6536 (2013).</li><li>Lee, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+confocal+microscopy+and+two-photon+microscopy+in+mouse+cornea+in+vivo.">Comparison of confocal microscopy and two-photon microscopy in mouse cornea in vivo.</a> Experimental Eye Research. 132, 101-108 (2015).</li><li>Ehmke, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+nonlinear+imaging+of+corneal+structures+with+special+focus+on+BALB/c+and+streptozotocin-diabetic+Thy1-YFP+mice.">In vivo nonlinear imaging of corneal structures with special focus on BALB/c and streptozotocin-diabetic Thy1-YFP mice.</a> Experimental Eye Research. 146, 137-144 (2016).</li><li>Webster, M. T., Manor, U., Lippincott-Schwartz, J., Fan, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+Imaging+Reveals+Ghost+Fibers+as+Architectural+Units+Guiding+Myogenic+Progenitors+during+Regeneration.">Intravital Imaging Reveals Ghost Fibers as Architectural Units Guiding Myogenic Progenitors during Regeneration.</a> Cell Stem Cell. 18 (2), 243-252 (2016).</li><li>Mesa, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homeostatic+Epidermal+Stem+Cell+Self-Renewal+Is+Driven+by+Local+Differentiation.">Homeostatic Epidermal Stem Cell Self-Renewal Is Driven by Local Differentiation.</a> Cell Stem Cell. 23 (5), 677-686 (2018).</li><li>Goh, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+imaging+of+dendritic+cell+responses+to+sterile+tissue+injury.">Real-time imaging of dendritic cell responses to sterile tissue injury.</a> Journal of Investigative Dermatology. 135 (4), 1181-1184 (2015).</li><li>Kissenpfennig, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+and+function+of+Langerhans+cells+in+vivo:+dermal+dendritic+cells+colonize+lymph+node+areas+distinct+from+slower+migrating+Langerhans+cells.">Dynamics and function of Langerhans cells in vivo: dermal dendritic cells colonize lymph node areas distinct from slower migrating Langerhans cells.</a> Immunity. 22 (5), 643-654 (2005).</li><li>Chow, Z., Mueller, S. N., Deane, J. A., Hickey, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dermal+regulatory+T+cells+display+distinct+migratory+behavior+that+is+modulated+during+adaptive+and+innate+inflammation.">Dermal regulatory T cells display distinct migratory behavior that is modulated during adaptive and innate inflammation.</a> Journal of Immunology. 191 (6), 3049-3056 (2013).</li><li>Dudeck, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mast+cells+are+key+promoters+of+contact+allergy+that+mediate+the+adjuvant+effects+of+haptens.">Mast cells are key promoters of contact allergy that mediate the adjuvant effects of haptens.</a> Immunity. 34 (6), 973-984 (2011).</li></ol>

Denna specialbyggda MPM imaging plattform med en kontroll programvara användes för intravital avbildning av mus epitelial organ, inklusive huden10, hårsäcken10 och okulär yta9,10 (Figur 1A). Det specialbyggda systemet användes för sin flexibilitet i att ändra de optiska komponenterna för olika experiment, sedan början av vårt projekt. Denna bildmetodik är mångsidig för kom...

De okulär ytstrukturer, inklusive hornhinnan och bindhinnan, skyddar andra djupare okulär vävnader från yttre störningar. Hornhinnan, den genomskinliga främre delen av ögat, fungerar både som en brytningslins för att rikta ljus in i ögat och som en skyddande barriär. Hornhinnans epitel är det yttersta lagret av hornhinnan och består av distinkta lager av ytliga celler, vingceller och basala celler. Hornhinnans stroma består av sofistikerat packade kollagenhlamlas inbäddade med keratocyter. Hornhinnans endotel, ett enda lager av platta sexkantiga celler, har en viktig roll i att upprätthålla insynen i hornhinnan genom att hålla hornhinnans stroma i ett relativt uttorkad stat genom sin pumpfunktioner1. Limbus bildar gränsen mellan hornhinnan och bindhinnan, och är reservoaren av hornhinnans epitelceller2. Den starkt vascularized bindhinna hjälper till att smörja ögonen genom att producera slem och tårar3.
Celldynamiken i hornhinnans ytstrukturer studeras konventionellt genom antingen histologisk analys eller in vitro-cellkultur, som kanske inte på ett tillfredsställande sätt simulerar in vivo-celldynamiken. En icke-invasiv levande bildbehandling strategi kan därför överbrygga en sådan klyfta. På grund av dess fördelar, som inkluderar hög upplösning, minimal fotoskador och djupare bildframställning djup, MPM har blivit en kraftfull modalitet i olika områden av biologisk forskning4,5,6,7,8. För hornhinnans bildbehandling, MPM ger cellulär information från inneboende autofluorescens som härrör från den intracellulära NAD(P)H. Andra harmoniska generationens (SHG) signaler som härrör från den icke-centrosymmetriska typ I kollagen fibrer under femtosecond laserscanning ger kollagen stromal strukturer utan ytterligare färgning förfaranden9. Tidigare har vi och andra grupper utnyttjat MPM för bildframställning av djur- och människoklinner9,10,11,12,13,14,15.
Transgena muslinjer som uppvisar fluorescerande proteiner i specifika cellpopulationer har använts i stor utsträckning för olika studier inom cellbiologi, inklusive utveckling, vävnadshomeostas, vävnadsregenerering och carcinogenes. Vi använde transgen mus stammar märkta med fluorescerande proteiner för in vivo bildframställning av hornhinnor9,10, hårsäckar10 och epidermis10 av MPM. Den dubbla fluorescerande musstammen med cellmembranet märkt med tdTomato och cellkärna märkta med EGFP är uppfödd från två musstammar: R26R-GR (B6;129-Gt (ROSA)26Sortm1Ytchn/J, #021847)16 och mT-mG (Gt(ROSA26)ACTB-tdTomato-EGFP, #007676)17. R26R-GR transgen mus linje innehåller en dubbel fluorescerande protein reporter konstruktioner, inklusive en H2B-EGFP fusion gen och mCherry-GPI ankare signal fusion gen, införas i Gt (ROSA)26Sor locus. Den transgena stammen mT-mG är en cellmembran-riktad tdTomato och EGFP fluorescerande Cre-reporter möss. Före Cre rekombination är cellmembranprotein med tdTomato fluorescensuttryck allmänt närvarande i olika celler. Denna transgena musstam gör det möjligt för oss att visualisera atomkärnor-EGFP och membran med tdTomato utan Cre-excitation. Två honor (R26R-GR+/+) och en hane (mT-mG+/+) var transgen mus uppfödda tillsammans för att producera tillräckliga möss för experiment. Deras avkomma med R26R-GR+/-;mT-mG+/- genotyp, en dubbel fluorescerande möss stam, användes i denna studie. Jämfört med en fluorescerande reporter muslinje som tidigare beskrivits9,10, denna dubbla fluorescerande reporter mus stam ger oss en 50% minskad förvärvning av bildtagning tid.
I detta arbete beskriver vi ett detaljerat tekniskt protokoll för in vivo-avbildning av okulär ytan i ett steg-för-steg-sätt med hjälp av vår bildframställning plattform och dubbla fluorescerande transgena möss.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>AVIZO Lite software</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Version: 2019.3.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bandpass filters</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF01-434/17 
			FF01-500/24 
			FF01-585/40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirrors</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF495-Di01-25x36 FF580-Di01-25x36</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Galvano</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>GVS002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jade BIO control software</td>
			<td>SouthPort Corporation</td>
			<td>Jade BIO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxybuprocaine hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>O0270000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMT</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>H7422A-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyesthylene Tube</td>
			<td>BECTON DICKINSON</td>
			<td>427401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic mouse holder</td>
			<td>Step Technology Co.,Ltd</td>
			<td>000111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ti: Sapphire laser</td>
			<td>Spectra-Physics</td>
			<td>Mai-Tai DeepSee</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Upright microscopy</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX51WI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vidisic Gel</td>
			<td>Dr. Gerhard Mann Chem-pharm. Fabrik GmbH</td>
			<td>D13581</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zoletil</td>
			<td>Virbac</td>
			<td>VR-2831</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a custom multiphoton microscopy platform for live imaging of mouse cornea and conjunctiva

Konventionella histologiska analys och cellodling system är otillräckliga för att simulera in vivo fysiologiska och patologiska dynamik helt. Multiphoton mikroskopi (MPM) har blivit en av de mest populära bildframställning modaliteter för biomedicinsk studie på cellulära nivåer in vivo, fördelar inkluderar hög upplösning, djup vävnad penetration och minimal fototoxicitet. Vi har utformat en MPM imaging plattform med en anpassad mus öga hållare och en stereotaxic skede för bildbehandling okulär yta in vivo. Dual fluorescerande protein reporter mus möjliggör visualisering av cellkärnor, cellmembran, nervfibrer, och kapillärer inom okulär yta. Förutom multifoton fluorescens signaler, förvärva andra harmoniska generationen (SHG) samtidigt möjliggör karakterisering av kollagenös stromal arkitektur. Denna plattform kan användas för intravital avbildning med noggrann positionering över hela okulär yta, inklusive hornhinna och bindhinna.

Med hjälp av denna live imaging plattform, musen okulär yta kan visualiseras på cellulära nivåer. För att visualisera enskilda enstaka celler i okulär yta, vi anställda de dubbla fluorescerande transgena möss med EGFP uttryckt i kärnan och tdTomato uttryckt i cellmembranet. Den kollagen-rika hornhinnan stroma belystes av SHG signaler.
I hornhinneepitelet visualiserades ytliga celler, vingceller och basala celler ( figur2). I de dubbla fluorescerande tran...

Watch this Scientific Journal Video about A Custom Multiphoton Microscopy Platform for Live Imaging of Mouse Cornea and Conjunctiva at JoVE.com

A Custom Multiphoton Microscopy Platform for Live Imaging of Mouse Cornea and Conjunctiva

Presenteras här är en multiphoton mikroskopisk plattform för levande mus okulär yta imaging. Fluorescerande transgen mus möjliggör visualisering av cellkärnor, cellmembran, nervfibrer och kapillärer inom den okulära ytan. Icke-linjära andra harmoniska generationen signaler som härrör från kollagenous strukturer ger etikett-fri bildbehandling för stromal arkitekturer.

En anpassad Multiphoton Mikroskopi plattform för Live Imaging av Mus Hornhinna och Bindhinna

Conventional histological analysis and cell culture systems are insufficient to simulate in vivo physiological and pathological dynamics completely. ...

Detta protokoll använder ett multi-filter mikroskop för levande avbildning av hela strukturen av mus okulär yta i den dubbla fluorescerande transgena musmodellen. Kombinationen av en anpassad multifoton mikroskopisk plattform och dubbla fluorescerande transgena möss möjliggör realtid visualisering av och struktur okulär yta. För att ställa in multifotonmikroskopet väljer du vattenbadningen 20X, 1.00 NA-målsättningen och sätter Titansaplinlasern som excitationskälla på ett upprätt mikroskop.Ställ in laserutgångsvåglängden till 880 nanometer för EGFP och 940 nanometer för tdTomato. Inkludera två dichroic speglar för separation av SHG EGFP och EGFP tdTomato och använda 434-17, 510-84 och 585-40 nanometer bandpassfilter för att spektralt separera SHG EGFP och tdTomato signaler. För att ställa in ögonhållaren, efter att ha bekräftat en brist på svar på pedalreflex i en sövd 8-12 veckor gammal mus, placera musen på den uppvärmda mikroskopet skede och infoga en temperatur övervakning sond.Placera musen i en anpassad stereotaxisk mushållare och sätt i öronstänger i den externa hörselköttet. Använd tre punktfixering för att säkra huvudhållaren och applicera en 0,4%Oxybuprokain Hydroklorid och saltlösning på okulärytan. Täck spetsarna på ett par nummer fem Dumont-forceps med PE-rörslingan.Efter tre minuter utföra en manuell ögonlocket upprullning för att bekräfta ögongloben utsprång och försiktigt placera en PE innehavaren röret slinga längs ögonlocket marginalen för att exponera okulär yta. Och använd knoppen av hållaren för att stabilisera ögongloben med tentarna. Sedan, täcka hornhinnans yta med ett öga gel med ett brytningsindex på 1,338.För Z-seriebilder av hornhinneytan, använd en kvicksilverljuskälla för att avbilda målfältet och öppna mikroskopmjukvaran. Välj lämplig fotomultiplikator och digitala vinster för visualisering av cellstruktur i den okulär yta och ställa in den första och sista bilden för att tillåta förvärv av en bildstapel. Ställ in bildupplösningen på 512 med 512 pixlar och Z-steget till en mikrometer.Klicka sedan på Start för att samla in Z-seriebilder som skaffar en livebild med en 880 nanometerexcitation för SHG EGFP-signalsamling, och en livebild vid en 940 nanometerexcitation för EGFP tdTomato-signalinsamling inom varje område. Under hela bilden, använd stege motoriserade steghållare för att rotera ögongloben för att möjliggöra bildbehandling över hela hornhinnans yta. När alla bilder har förvärvats, ladda Z-seriens bilder i Fiji och välj Median 3D-filter plugin.När du har tagit bort bakgrundsbruset väljer du filterpaketet för oskarp mask Fiji för att skärpa bilderna och klicka på automatisk ljusstyrka kontrast för att automatiskt optimera kvaliteten på bilderna. Efter bearbetning, spara bilderna som en seriell bildsekvens och exportera bildsekvensen i en lämplig 3D återuppbyggnadsprogram. I alla multiphoton mikroskopi bilder, presentera EGFP tdTomato och SHG signaler i pseudo grön, röd och cyan respektive innan fånga 3D-struktur bilder genom ögonblicksbild.Multiphoton mikroskopi möjliggör visualisering av ytliga Wing och Basala celler i hornhinnans epitel av dubbla fluorescerande transgena möss. Enstaka celler från basalskiktet kan mappas till det ytliga skiktet samt enstaka sexkantiga formade ytliga celler. Som avslöjas av cytoplasmatiska uttryck för tdTomato signalen, är membranet protein rika intracellulära vesicular systemet, inklusive golgi apparaten och endoplasmic reticulum utspridda inom vingcellerna.Inom kollagen stroma, stellate formade coratesites beskrivs av membranet inriktning EGFP lysrör i dessa möss. De coratesites inbäddade i collegen stroma är mer löst fördelade än inom endotelceller. Dessutom kan tunna förgrenande nerver inom hornhinnan stroma också visualiseras genom membran inriktning tdTomato signaler och hornhinnans endotel cell monolayers visa en relativt homogent sexkantiga formen ansluten i ett honeycombed mönster.Limbalepitelet består av ett till två lager epitelceller. Den dubbla fluorescerande reportern transgen stam möjliggör också avbildning av kapillärer inom bindhinnan, vilket underlättar återuppbyggnaden av 3D-arkitekturen i kapillärerna som beskriver det vaskulära endotelet. Stabilisera ögongloben med måttligt tryck utan skada är avgörande för att förvärva god kvalitet bilder som otillräcklig eller överdriven tryck kan äventyra bildkvaliteten.Denna NVivo bild imaging plattform kan ändras för visualisering av strukturer under den okulära ytan och kan tillämpas på in-situ studier av olika oftalmiska sjukdomar.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy

Provberedning, Imaging och analysprotokoll för knivsegg Scanning Mikroskopi

Major advances in high-throughput, high-resolution, 3D microscopy techniques have enabled the acquisition of large volumes of neuroanatomical data at ...

Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

Att använda Mikrofluidik Chips för Live avbildning och studier av Skade svar i<em&gt; Drosophila</em&gt; Larver

Live imaging is an important technique for studying cell biological processes, however this can be challenging in live animals. The translucent cuticle of ...

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Fluorescens-släckning av en Liposomal-inkapslad Nära-infraröd fluoroforen som ett verktyg för<em&gt; In Vivo</em&gt; Optisk avbildning

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous ...

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

Atomic Force Microscopy Imaging och Force-spektra enligt stöds lipiddubbelskikt

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

Visualizing Angiogenesis by Multiphoton Microscopy In Vivo in Genetically Modified 3D-PLGA/nHAp Scaffold for Calvarial Critical Bone Defect Repair

Visualizing Angiogenesis by Multiphoton Microscopy In Vivo in Genetically Modified 3D-PLGA/nHAp Scaffold for Calvarial Critical Bone Defect Repair

Visualisera angiogenes av Multiphoton mikroskopi In Vivo i genetiskt modifierade 3D-PLGA/nHAp byggnadsställning för Calvarial kritiska ben defekt reparation

The reconstruction of critically sized bone defects remains a serious clinical problem because of poor angiogenesis within tissue-engineered scaffolds ...

Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform

Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform

Imaging rotahåret morfologi av Arabidopsis plantor i en två-lagers mikroflödessystem plattform

Root hairs increase root surface area for better water uptake and nutrient absorption by the plant. Because they are small in size and often obscured by ...

Fabrication of Custom Agarose Wells for Cell Seeding and Tissue Ring Self-assembly Using 3D-Printed Molds

Tillverkning av anpassade agaros brunnar för Cell sådd och vävnad Ring självmontering med 3D-tryckt formar

Engineered tissues are being used clinically for tissue repair and replacement, and are being developed as tools for drug screening and human disease ...

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

En mikroflödessystem plattform för längsgående Imaging i Caenorhabditis elegans

In the last decade, microfluidic techniques have been applied to study small animals, including the nematode Caenorhabditis elegans, and have proved ...

Visualizing Adhesion Formation in Cells by Means of Advanced Spinning Disk-Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

Visualisera vidhäftning bildandet i celler med hjälp av avancerade Spinning Disk-totalt inre reflektion fluorescensmikroskopi

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to ...