Name: using a chemical biopsy for graft quality assessment
Uploaded: 2020-06-17T13:30:00
Duration: 5 min
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using a Chemical Biopsy for Graft Quality Assessment at JoVE.com

وقد تم دعم الدراسة من قبل منحة Opus UMO-2017/27/B/NZ5/01013 من المركز الوطني للعلوم. ويود المؤلفون أن يعترفون بميليبور سيجما، وهي شركة تجارية من شركة ميرك كغا، دارمشتات، ألمانيا لتوفير أجهزة SPME. تعمل شركة ميرك في مجال علوم الحياة في الولايات المتحدة وكندا. أيضا ، والكتاب يريدون أن أشكر الحرارة فيشر العلمية للوصول إلى Q - Exactive التركيز على مطياف الكتلة المدارية. ويود المؤلفون أن يشكروا الدكتورة ألكسندرا وودرسكا-جاسينسكا وموظفي قسم زراعة الأعضاء والجراحة العامة في بيدغوستس على مساعدتهم الكريمة في المشروع. BB تريد أن تشكر البروفيسور جانوش باوليسزين على فرصة جمع العينات في مستشفى تورنتو العام خلال إقامتها في جامعة واترلو.

تلقت جميع الحيوانات رعاية إنسانية وفقاً لـ مبادئ العناية بالحيوان المختبري التي صاغتها الجمعية الوطنية للبحوث الطبية ودليل رعاية المختبرات الصادر عن المعهد الوطني للصحة، أونتاريو، كندا. وافقت لجنة العناية بالحيوان التابعة لمعهد تورنتو للبحوث العامة على جميع الدراسات. تمت الموافقة على البحث المعني بالمواضيع البشرية من قبل لجنة أخلاقيات البيولوجيا في كوليجيوم ميديكوم في جامعة Bydgoszcz Nicolaus Copernicus في تورون.
ملاحظة: الحصول على موافقة من المجالس الأخلاقية المناسبة. تذكر أن ترتدي دائما قفازات السلامة. لا تلمس مرحلة الاستخراج من تحقيقات SPME. ويوصى باستخدام قارورة الزجاج المعطلة لتحليلات الدهون.
1- إعداد تحقيقات
<ol><li>إعداد مسابير سبائك التيتانيوم والنيكل (طول 40 مم؛ 0.2 مم قطر) المغلفة مع 7 مم مزيج وضع ماصة. يعتمد عدد المسابير على النقاط الزمنية المستهدفة أثناء الإجراء بأكمله وعدد النسخ المتماثلة (يوصى بـ 3 في كل نقطة زمنية). ملاحظة: يمكن تعديل طول ونوع مرحلة الاستخراج على أساس طريقة الدراسة، قطبية الأيض، ومصفوفة العينة.</li>
	<li>إعداد خليط التنظيف تتألف من 2:1 الكلوروفورم: الميثانول (v/v). Pipet 1.0 مل من الحل لكل 2.0 مل قارورة زجاجية ووضع مسبار واحد، اخترقت سابقا من خلال الغطاء، في كل قارورة. ملاحظة: قبل الاستخدام، تنظيف جميع المسابير لإزالة الجسيمات الملوثة.</li>
	<li>وضع قارورة على المحرض وتعيين سرعة الانفعالات في 1200 دورة في الدقيقة. بعد 45 دقيقة، ووقف الجهاز وشطف الطلاء مع LC-MS من المياه الصف.</li>
	<li>كما يجب أن تخضع الطلاء خطوة مسبقة لتنشيطها، وإعداد خليط الشروط المسبقة تتألف من 1:1 الميثانول: الماء (v/v). Pipet 1.0 مل من الحل لكل 2.0 مل قارورة زجاجية ووضع مسبار واحد، اخترقت سابقا من خلال الغطاء، في كل قارورة.</li>
	<li>وضع قوارير على المحرض دوامة وتعيين سرعة الانفعالات في 1200 دورة في الدقيقة.</li>
	<li>بعد 60 دقيقة، ووقف المحرض وشطف الطلاء مع LC-MS الصف المياه.</li>
	<li>تعقيم تحقيقات وفقا لبروتوكول التعقيم المعدات الجراحية القياسية.</li>
</ol>2. استخراج
<ol><li>فتح حزمة معقم الحق قبل أخذ العينات لضمان بيئة معقمة.</li>
	<li>إدراج مسبارين مباشرة في قشرة الكلى لمدة 10 دقائق في كل نقطة زمنية. يجب أن يغطي كامل طول الطلاء من قبل مصفوفة الأنسجة؛ مطلوب أي زاوية محددة، ولكن CA. عادة ما يستخدم 90 غم. ملاحظة: يتبع الإجراء الطبي بأكمله بروتوكولات قياسية في مؤسسة معينة. ولا يُنظر في أي تعديل فيما يتعلق بأخذ عينات من SPME. ويشمل الإجراء النقاط الزمنية الست التالية لأخذ العينات: أ) قبل استئصال الكلى، في الجسم الحي من المانحة؛ ب) ه) بعد 1 ح، 3 ح، 5 ح، 7 ح من ضخ الكلى، والكيفو السابق في غرفة الجهاز؛ و) بعد إعادة ضخ، في الجسم الحي من المتلقي.</li>
	<li>سحب المسابير عن طريق سحبه من الأنسجة ومن ثم شطف الطلاء مع LC-MS درجة المياه لمسح أي الدم المتبقية من سطح الطلاء. شطف بعيدا عن موقع الجراحة، وعلى الفور بعد إزالة المسابير.</li>
</ol>3- النقل والتخزين
<ol><li>ضع المسابير في قارورة منفصلة واغلقها.</li>
	<li>ضع قوارير في صندوق الستايروفوم المليء بالجليد الجاف أو النيتروجين السائل للنقل.</li>
	<li>تخزين العينات في الثلاجة (-80 درجة مئوية)، أو البدء على الفور في الخطوة desorption.</li>
</ol>4. Desorption
<ol><li>إعداد حلول desorption تتألف من 80:20 الأسيتونيتريل: الماء (الخامس / الخامس) لتحليل المستقلبوم، و 1:1 ايزوبروبانول: الميثانول (الخامس / الخامس) لتحليل الدهون.</li>
	<li>Pipet 100 μL من الحل لإدراج وضعت في 2.0 مل قنينات المسمى ومكان مسبار واحد، اخترقت سابقا من خلال الغطاء، في كل قارورة.</li>
	<li>وضع قارورة على المحرض دوامة وتعيين سرعة الانفعالات في 1200 دورة في الدقيقة لمدة 120 دقيقة.</li>
	<li>إزالة مسابير من قارورة. مقتطفات تم الحصول عليها جاهزة الآن للتحليل الفعال.</li>
</ol>5. تحليل LC-MS
<ol><li>ضع قوارير تحتوي على مقتطفات في الاختزال التلقائي لنظام LC-MS. ملاحظة: تم استخدام الكروماتوغرافيا السائلة (RP، HILIC) إلى جانب قياس الطيف الكتلي عالي الدقة ومحلل كتلة المدار لهذه الدراسة. بالنسبة لمعلمات التحليل المستقلبومي، انتقل إلى الخطوة 5.2. بالنسبة لمعلمات تحليل الدهون، انتقل إلى الخطوة 5.6.</li>
	<li>استخدم عمود خماسي الفيورفينيل (PFP) (2.1 مم × 100 مم، 3 ميكرومتر) لفصل الطور المعكوس.<ol>
<li>تعيين معدل التدفق إلى 300 ميكرولتر/ دقيقة، وcutosampler ودرجات حرارة العمود إلى 4 درجة مئوية و 25 درجة مئوية، على التوالي.</li>
		<li>إعداد مراحل متحركة وفقا لنسب التالية: المرحلة المتنقلة A: الماء: حمض فورميك (99.9:0.1، v/v)، والمرحلة المتنقلة B: الأسيتونيتريل: حمض فورميك (99.9:0.1، v/v). تعيين تدفق المرحلة المتنقلة وفقا للمعلمات التالية: بدء تدفق المرحلة المتنقلة (0-3 دقيقة): 100٪ A متبوعا بتدرج خطي إلى 10٪ A (3-25 دقيقة)، وتنتهي مع تدفق isocratic من 10٪ A حتى 34 دقيقة، تليها 6 دقائق من العمود إعادة التوازن الوقت.</li>
	</ol>
</li>
	<li>لفصل هيلك، استخدم عمود HILIC (2.0 مم × 100 مم، 3 ميكرومتر، 200A). تعيين معدل التدفق إلى 400 ميكرولتر / دقيقة.<ol>
<li>إعداد مراحل المحمول وفقا لنسب التالية: المرحلة المتنقلة A: acetonitrile: الأمونيوم خلات العازلة (9:1، v/ الخامس، تركيز الملح الفعال 20 mM)، المرحلة المتنقلة B: acetonitrile: الأمونيوم خلات العازلة (1:1، الخامس / الخامس، تركيز الملح الفعال 20 mM).</li>
		<li>تعيين تدفق المرحلة المتنقلة وفقا للمعلمات التالية: بدء تدفق المرحلة المتنقلة (0-3 دقيقة) في 100٪ A، وعقد لمدة 3.0 دقيقة ثم المنحدر إلى 100٪ B في غضون 5 دقائق. عقد مع 100٪ B حتى 12 دقيقة، تليها 8 دقيقة من العمود إعادة التوازن الوقت.</li>
	</ol>
</li>
	<li>تعيين نطاق المسح الضوئي إلى 85-1000 م / z. تعيين HESI المعلمات مصدر أيون في وضع المؤينة الإيجابية إلى: رذاذ الجهد 1500 V، ودرجة حرارة الشعيرات الدموية 300 درجة مئوية، غاطد الغاز 40 a.u.، aux معدل تدفق الغاز 15 a.u.، درجة حرارة سخان المسبار 300 درجة مئوية، S-عدسة RF مستوى 55٪ .</li>
	<li>تشغيل عينات QC تتألف من 10 ميكرولتر من كل عينة تحليلها (بانتظام، كل عينات 10-12) لرصد أداء الصك.</li>
	<li>لفصل الطور المعكوس، استخدم عمود C18 (2.1 مم × 75 مم، 3.5 ميكرومتر).<ol>
<li>تعيين معدل التدفق إلى 200 ميكرولتر / دقيقة، وcutosampler ودرجات حرارة العمود إلى 4 درجة مئوية و 55 درجة مئوية، على التوالي. إعداد مراحل المحمول وفقا لنسب التالية: المرحلة المتنقلة A: H2O:MeOH (60:40، v/v)، 10 mM خلات الأمونيوم و 1 mM حمض الخليك؛ المرحلة المتنقلة B: IPA: MeOH (90:10، v/v)، 10 mM خلات الأمونيوم و 1 mM حمض الخليك.</li>
		<li>تعيين تدفق المرحلة المتنقلة وفقا للالمعلمات التالية: 0-1 دقيقة (20٪ B)، 1-1.5 دقيقة (20-50٪ B)، 1.5-7.5 دقيقة (50-70٪ B)، 7.5 5-13 دقيقة (70-95٪ B)، 13-17 دقيقة (95٪ B)، 17-17.1 دقيقة (95-20٪ B)، 17.1-23 دقيقة (20٪).</li>
	</ol>
</li>
	<li>لفصل HILIC، استخدم عمود HILIC (100 × 2.1 مم، 3 ميكرومتر).<ol>
<li>تعيين معدل التدفق إلى 400 ميكرولتر / دقيقة، وcsampler وأعمدة درجات الحرارة إلى 4 °C و 40 °C على التوالي.</li>
		<li>إعداد مراحل متنقلة وفقاً للنسب التالية: المرحلة المتنقلة ألف: شبكة الاتصالات المتنقلة (ACN)؛ المرحلة (أ) من النظام؛ المرحلة (أ) من النظام. المرحلة المتنقلة B: 5 mM خلات الأمونيوم في الماء. تعيين تدفق المرحلة المتنقلة وفقا للالمعلمات التالية: 0-2 دقيقة (96٪ B)، 2-15 دقيقة (96-80٪ B)، 15-15.1 دقيقة (80-96٪ B)، 15.1-21 دقيقة (96٪ B).</li>
	</ol>
</li>
	<li>تعيين HESI المعلمات مصدر أيونات في وضع المؤينة الإيجابية لرش الجهد 3500 فولت، ودرجة الحرارة الشعرية 275 درجة مئوية، غماد الغاز 20 a.u.، aux معدل تدفق الغاز 10 a.u.، درجة حرارة سخان المسبار 300 درجة مئوية، S-عدسة RF مستوى 55٪ .</li>
	<li>تشغيل عينات QC تتألف من 10 ميكرولتر من كل عينة تحليلها (كل عينات 10-12) لرصد أداء الصك.</li>
	<li>إجراء عملية الحصول على البيانات في البرامج المتوافقة مع الأداة.</li>
</ol>6 - تحليل البيانات
<ol><li>إجراء معالجة البيانات، وتحديد المفترض، والتحليل الإحصائي مع استخدام البرامج المخصصة لتحليل المستقلب غير المستهدفة والدهون. ملاحظة: يمكن الحصول على تحليل المكونات الرئيسية (PCA) ومربع شعيرات مخططات لتصور بنية البيانات.</li>
</ol>

<ol>
	<li>. Organ Procurement and Transplantation Network Available from: <a target="_blank" href="https://optn.transplant.hrsa.gov">https://optn.transplant.hrsa.gov</a> (2019)</li><li>Branger, P., Undine, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Annual Report 2018/Eurotransplant International Foundation. , (2018).</li><li>Dare, A. J., Pettigrew, G. J., Saeb-Parsy, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preoperative+assessment+of+the+deceased-donor+kidney:+From+macroscopic+appearance+to+molecular+biomarkers.">Preoperative assessment of the deceased-donor kidney: From macroscopic appearance to molecular biomarkers.</a> Transplantation. 97, 797-807 (2014).</li><li>Mueller, T. F., Solez, K., Mas, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+kidney+organ+quality+and+prediction+of+outcome+at+time+of+transplantation.">Assessment of kidney organ quality and prediction of outcome at time of transplantation.</a> Seminars in Immunopathology. 33, 185-199 (2011).</li><li>Xu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipidomics+comparing+DCD+and+DBD+liver+allografts+uncovers+lysophospholipids+elevated+in+recipients+undergoing+early+allograft+dysfunction.">Lipidomics comparing DCD and DBD liver allografts uncovers lysophospholipids elevated in recipients undergoing early allograft dysfunction.</a> Scientific Reports. 5, 1-10 (2015).</li><li>Rao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+lipid+changes+in+acute+kidney+injury+using+SWATH+lipidomics+coupled+with+MALDI+tissue+imaging.">Early lipid changes in acute kidney injury using SWATH lipidomics coupled with MALDI tissue imaging.</a> American Journal of Physiology - Renal Physiology. 310, 1136-1147 (2016).</li><li>Wishart, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolomics:+The+principles+and+potential+applications+to+transplantation.">Metabolomics: The principles and potential applications to transplantation.</a> American Journal of Transplantation. 5, 2814-2820 (2005).</li><li>Kim, S. J., Kim, S. H., Kim, J. H., Hwang, S., Yoo, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+metabolomics+in+biomedical+research.">Understanding metabolomics in biomedical research.</a> Endocrinology and Metabolism. 31, 7-16 (2016).</li><li>Bojko, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solid+phase+microextraction+fills+the+gap+in+tissue+sampling+protocols.">Solid phase microextraction fills the gap in tissue sampling protocols.</a> Analytica Chimica Acta. 803, 75-81 (2013).</li><li>Filipiak, W., Bojko, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SPME+in+clinical,+pharmaceutical,+and+biotechnological+research+-+How+far+are+we+from+daily+practice.">SPME in clinical, pharmaceutical, and biotechnological research - How far are we from daily practice.</a> TrAC - Trends in Analytical Chemistry. , 115-213 (2019).</li><li>Bojko, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+invasive+in+vivo+tissue+sampling+for+monitoring+biomarkers+and+drugs+during+surgery.">Low invasive in vivo tissue sampling for monitoring biomarkers and drugs during surgery.</a> Laboratory Investigation. 94, 586-594 (2014).</li><li>Ahmad, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biopsy+of+the+transplanted+kidney.">Biopsy of the transplanted kidney.</a> Seminars in Interventional Radiology. 21, 275-281 (2004).</li><li>Plattner, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complications+and+adequacy+of+transplant+kidney+biopsies:+A+comparison+of+techniques.">Complications and adequacy of transplant kidney biopsies: A comparison of techniques.</a> Journal of Vascular Access. 19, 291-296 (2018).</li><li>Tapia-Canelas, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complications+associated+with+renal+graft+biopsy+in+transplant+patients.">Complications associated with renal graft biopsy in transplant patients.</a> Nefrologia. 34, 115-119 (2014).</li><li>Afshinnia, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipidomics+and+Biomarker+Discovery+in+Kidney+Disease.">Lipidomics and Biomarker Discovery in Kidney Disease.</a> Seminars in Nephrology. 38, 127-141 (2018).</li><li>Zhao, Y. Y., Vaziri, N. D., Lin, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipidomics:+New+insight+into+kidney+disease.">Lipidomics: New insight into kidney disease.</a> Advances in Clinical Chemistry. 68, 153-175 (2015).</li><li>Kaminski, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+Consumption+by+Warm+Ischemia-Injured+Porcine+Kidneys+in+Hypothermic+Static+and+Machine+Preservation.">Oxygen Consumption by Warm Ischemia-Injured Porcine Kidneys in Hypothermic Static and Machine Preservation.</a> Journal of Surgical Research. 242, 78-86 (2019).</li><li>Wijermars, L. G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+postreperfusion+metabolic+recovery+directly+associates+with+incident+delayed+graft+function.">Defective postreperfusion metabolic recovery directly associates with incident delayed graft function.</a> Kidney International. 90, 181-191 (2016).</li><li>Huang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteo-metabolomics+reveals+compensation+between+ischemic+and+non-injured+contralateral+kidneys+after+reperfusion.">Proteo-metabolomics reveals compensation between ischemic and non-injured contralateral kidneys after reperfusion.</a> Scientific Reports. 8, 1-12 (2018).</li><li>Solati, Z., Edel, A. L., Shang, Y., Karmin, O., Ravandi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidized+phosphatidylcholines+are+produced+in+renal+ischemia+reperfusion+injury.">Oxidized phosphatidylcholines are produced in renal ischemia reperfusion injury.</a> PLoS One. 13, 1-24 (2018).</li><li>Wishart, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolomics+in+monitoring+kidney+transplants.">Metabolomics in monitoring kidney transplants.</a> Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 15, 637-642 (2006).</li><li>Abbiss, H., Maker, G. L., Trengove, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolomics+approaches+for+the+diagnosis+and+understanding+of+kidney+diseases.">Metabolomics approaches for the diagnosis and understanding of kidney diseases.</a> Metabolites. 9, (2019).</li><li>Zhang, Z. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolomics+insights+into+chronic+kidney+disease+and+modulatory+effect+of+rhubarb+against+tubulointerstitial+fibrosis.">Metabolomics insights into chronic kidney disease and modulatory effect of rhubarb against tubulointerstitial fibrosis.</a> Scientific Reports. 5, 1-17 (2015).</li><li>Looby, N. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solid+phase+microextraction+coupled+to+mass+spectrometry:+Via+a+microfluidic+open+interface+for+rapid+therapeutic+drug+monitoring.">Solid phase microextraction coupled to mass spectrometry: Via a microfluidic open interface for rapid therapeutic drug monitoring.</a> Analyst. 144, 3721-3728 (2019).</li><li>G&#243;mez-R&#237;os, G. A., Tascon, M., Pawliszyn, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coated+blade+spray:+Shifting+the+paradigm+of+direct+sample+introduction+to+MS.">Coated blade spray: Shifting the paradigm of direct sample introduction to MS.</a> Bioanalysis. 10, 257-271 (2018).</li></ol>

ويود المؤلفون أن يعترفوا بميليبورسيغما (ميرك كغا، دارمشتات، ألمانيا) لتوفيرهما أجهزة SPME و"ثيرمو فيشر" العلمية للوصول إلى مطياف الكتلة Q-Exactive Focus Orbitrap.

لا يزال تقييم جودة الأعضاء يمثل تحديًا كبيرًا للأطباء ، الذين يجب عليهم اتخاذ قرارات مستنيرة سريعة بشأن ما إذا كان جهاز معين قابلًا للزرع أو ما إذا كان يجب التخلص منه. يمكن أن تؤثر عوامل متعددة، مثل عمر المتبرع، ومدة نقص التروية، والالتهابات والعمليات الالتهابية، على نتيجة الكسب غير المشروع على المدى الطويل. في حين تم تطوير أساليب متنوعة حتى الآن لتشخيص وظيفة allograft الكلى، التفتيش الهدولوجي لا يزال المعيار الذهبي في هذه المسألة3،4،12. على الرغم من أن إجراء الخزعة يمكن أن تسفر عن معلومات هامة بشأن الأمراض المانحة الموجودة من قبل والتغيرات في الأوعية الدموية, أنها ليست خالية من العيوب. ولا تزال أخطاء أخذ العينات المرتبطة بتباين الخوادم البينية وأخذ عينات من الكبيبات غير الكافية للحصول على معلومات شاملة بشأن وظيفة الأعضاء تشكل شواغل نموذجية في هذا الصدد. وعلاوة على ذلك، إعداد عينة يجلب بعض القضايا مثل تقييم غير مكتمل من الكسب غير المشروع في حالة المقاطع المجمدة، وتمديد الوقت لإجراء قسم البارافين. ومع ذلك، فإن زيادة خطر النزيف، والتي قد تظهر بشكل حاد مثل المنظار المجهري أو الجسيم في البيلة الدموية، هي المضاعفات الرئيسية التي تهدد الحياة المرتبطة بإجراء الخزعة. لهذا السبب، عدد الخزعات المسموح بها محدودة للغاية في إجراءات زرع، وهو عامل يعوق التقاط التغيرات الديناميكية وتحليلات السلاسل الزمنية عبر هذه الطريقة12،13،14. ويجب أن تُزن فوائد التحليل النسيجي مع المخاطر المرتبطة بالمنهجية. قيمة النتائج النسيجية لا جدال فيها ، لكنها لا تفسر الآليات الجزيئية للانحرافات.
تعد "نواتج الأيض" و"دهونوم" أصغر المجالات في الأسرة العلمية "omics". يتم تعريف المجموعة الكاملة من الأيضات والدهون البشرية المنخفضة (<1,200 Da) المتصلة داخل شبكة التمثيل الغذائي بأنها مستقلب بشري. يظل الجينوم ثابتاً نسبياً طوال حياته، مع تعديلات طفيفة ناجمة عن الطفرات التي تحدث بشكل غير متكرر. المستقلب هو نتاج التعبير الجيني، الذي حساس للغاية للتغيرات في جميع العمليات البيولوجية، فضلا عن العوامل البيئية. الطبيعة الديناميكية من المستقلبات والدهون يجعلها مؤشرات مثالية من حالة الجهاز الحالي7,8,15,16. طريقة SPME المقترحة في البروتوكول المذكور أعلاه تمكن من الكشف عن التغيرات التي تحدث في الجهاز أثناء الحفاظ عليه، بدءا من إزالة الأعضاء من جسم المتبرع حتى إعادة الهيكلة في المتلقي. يوفر القطر الصغير للمسبار (~ 200 ميكرومتر) الحد الأدنى من الغازية ويسمح بأخذ عدة عينات من نفس الجهاز دون التسبب في أي ضرر للأنسجة. إجراء الدراسات باستخدام الكلى، باعتبارها العضو الأكثر زرعا في كثير من الأحيان، ويسمح لفهم أفضل وتوصيف إضافي للمسارات الأيضية المسؤولة عن انخفاض نوعية ووظيفة الطعوم. ومن المؤكد أن إمكانية مراقبة التعديلات بمرور الوقت هي ميزة هامة لهذه التقنية بالمقارنة مع الطرق التقليدية الغازية مثل الخزعة. وحدد التحليل المقدم حالياً تركيزات معدلة لمجموعات مختلفة من الدهون والايض، وخاصة من الأحماض الأمينية الأساسية، البيورينات، النوكليوسيدات البيورينية، والجلسرينفوسفوليدس. هذه النتائج متسقة مع تقارير تحليل الأنسجة السابقة5,6,17,18,19,20. حتى الآن، فإن غالبية التقارير العلمية التي تستخدم نواتج الأيض أو الدهون لتفسير العمليات التي تحفز المضاعفات بعد زرع أو إقفار/إعادة حقنة (IRI) الظواهر تقتصر على تحليل21بيوفلوريدات،22،23.
كل تطبيق سريري يتطلب تحسين بروتوكول أخذ العينات لضمان أن أداء الطريقة التحليلية يلبي المعايير المتوقعة. وفي هذا الصدد، تتمثل الفائدة من استخدام هذا النظام في إمكانية تعديل الظروف لمختلف التصاميم التجريبية. مجموعة متنوعة من مراحل الاستخراج يمكن الوصول إليها يوفر مجموعة واسعة من المستقلبات المستخرجة مع الاستقطابات المتنوعة. وفي الوقت نفسه، يمكن اعتبار هذا تقييداً للطريقة نظراً لأن كل مواد ماصة توفر انتقائية تجاه سمات محددة ولا تستخرج جميع المركبات الموجودة في مصفوفة العينات. وتجدر الإشارة إلى أن الطلاء SPME استخراج فقط عن طريق الجزيئات الحرة، وببساطة لا تتفاعل مع جزء من التحليلات ملزمة. التوافق الحيوي للطلاء لا يدخل سمية للأنسجة مع تقييد استخراج جزيئات كبيرة مثل البروتينات; ونتيجة لذلك، فإن العمليات الأنزيمية تكبح بالفعل في مرحلة جمع العينات ويقل إلى أدنى حد وجود القطع الأثرية، مما يمثل ميزة كبيرة على طرق أخذ العينات البديلة. يؤثر طول الطلاء على كفاءة الاستخراج (أي أن طول الطلاء يحدد مساحة السطح وحجم مرحلة الاستخراج) ؛ وبالتالي، الطلاء أطول تسفر عن استرداد أعلى. من ناحية أخرى، تمكن الطلاءات الأقصر من تحقيق دقة مكانية أعلى. للحصول على نتائج موثوقة ، من المهم غمر المسبار إلى نفس العمق الدقيق لقشرة الكلى. يسبب الإدراج العميق جدًا خطر دخول النخاع الكلوي. الوقت من الاستخراج هو أيضا يتناسب مع كفاءة الاستخراج. ولذلك، اختيار وقت الاستخراج الأمثل هي واحدة من الخطوات الأكثر أهمية في تطوير الأسلوب SPME. توفر دقة قياس الوقت أعلى تكرار. في التطبيقات البيولوجية مثل تلك التي تمت مناقشتها ، هناك دائما حل وسط بين حساسية وتكرار البروتوكول التحليلي والقيود المفروضة على الإجراء الطبي. في حين أن استخراج التوازن يوفر أعلى حساسية، لأسباب تتعلق بالسلامة، غالبا ما تستخدم ظروف ما قبل التوازن في مثل هذه التطبيقات، كما ينبغي أن لا يؤثر وقت الاستخراج على المدة الإجمالية للجراحة. يتم تحديد كفاءة desorption من قبل الوقت من العملية وتكوين المذيبات desorption، والتي ينبغي أن تكون متوافقة مع المرحلة المتنقلة المستخدمة للفصل الكروماتوغرافي9،10،11.
أحد المتطلبات الرئيسية للأجهزة التشخيصية المستخدمة في التقييمات الجراحية الداخلية هو وقت التحليل. وتبذل محاولات الحالية لتطوير أداة سريعة لفي استخراج في الجسم الحي SPME مقرونة مباشرة إلى مطياف الشامل عبر واجهة مفتوحة microfluidic (وزارة الداخلية)24 أو رذاذ شفرة المغلفة (سي بي اس)25. ومن شأن هذه النهوج أن تتيح الكشف عن النتائج التحليلية في الوقت الحقيقي أو القريب من الوقت الحقيقي. استخدام هذه الأساليب لتحليل ما قبل التدخل من الملامح الأيضية والدهونية يمكن أن تعزز عملية صنع القرار أثناء عمليات زرع، مما يتيح أفضل نهج شخصي ممكن والاستجابة السريعة في حالة فشل الجهاز.
على سبيل الاقتطاف، يفترض أن البروتوكول المقترح سيمكن من الحصول على كامل الملامح الأيضية والدهونية من الطعوم الكلى، والتي بدورها من شأنها أن توفر تقييما شاملا لجودة الجهاز وتوصيف العمليات المسؤولة عن إصابة الإقفار الإقفاري. وتشمل حداثة المشروع استخدام الجر المجهري المتين (SPME)، الذي يقدم عينات منخفضة التوغل من النظم الحية، بالاقتران مع واحدة من أكثر التكنولوجيات ابتكارا المتاحة لتحليل المستقلب وعلم الدهون (على سبيل المثال، مطياف الكتلة ذات الدقة العالية في Orbitrap). يجمع SPME بين جمع العينات واستخراجها وإرواءها في خطوة واحدة، مما يجعلها أداة مثالية للتحليل السريع. ومن المتوقع أن يساعد هذا البروتوكول على الإجابة على الأسئلة المتعلقة بما هي ظروف ما قبل زرع الكلى المسؤولة عن تأخر وظيفة الأعضاء أو الخلل الوظيفي بعد زرعها، وكذلك عن كيفية تأثير بروتوكول الحفاظ على الكسب غير المشروع على الكيمياء الحيوية للجهاز. وهذه المعرفة لن يكون لها تأثير كبير على الوقاية من المضاعفات المحتملة المتعلقة بزرع الأعضاء فحسب، بل قد تساعد أيضاً في تحسين بروتوكولات حفظ الكسب غير المشروع الحالية، مما يقلل من فقدان أنسجة زرع الأعضاء القابلة للحياة وكذلك فقدان الحياة. وسيفتح الحل المقترح الباب أمام إجراء المزيد من الفحوصات في هذا المجال، بما في ذلك التحقق من المؤشرات البيولوجية المحتملة المحددة وتحسين النتائج العلاجية في مجال زراعة الأعضاء.

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/t/60946/using-a-chemical-biopsy-for-graft-quality-assessment">Using a Chemical Biopsy for Graft Quality Assessment</a>. One of the affiliations was&#160;updated.
The third affiliation was&#160;updated from:
Department of Transplantation and General Surgery, University Hospital, University of Nicolaus Copernicus Torun&#34;
to:
Department of Transplantology and General Surgery, Collegium Medicum in Bydgoszcz, Antoni Jurasz University Hospital No. 1 in Bydgoszcz, Nicolaus Copernicus University in Torun, Bydgoszcz, Poland

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/t/60946/using-a-chemical-biopsy-for-graft-quality-assessment">Using a Chemical Biopsy for Graft Quality Assessment</a>. One of the affiliations was&#160;updated.

Erratum: Using a Chemical Biopsy for Graft Quality Assessment

وفقًا لشبكة مشتريات الأعضاء وزرعها في الولايات المتحدة، كان هناك 94,756 مريضًا ينتظرون عمليات زرع الكلى في الولايات المتحدة في عام 2019. بينما في أوروبا في عام 2018، كان هذا العدد 10,791. كل عشر دقائق، يتم إضافة شخص ما إلى قائمة انتظار زرع الأعضاء الوطنية في الولايات المتحدة، ويقدر أن 20 شخصا يموتون كل يوم في انتظار زرع1،2. زرع الكلى هو علاج منقذ للحياة لعدد كبير من الأشخاص الذين يعانون من خلل كلوي في نهاية المرحلة في جميع أنحاء العالم. ويرتبط هذا الإجراء مع زيادة معدل البقاء على قيد الحياة ونوعية الحياة أعلى بالمقارنة مع غسيل الكلى التقليدي.
ومع ذلك، تواجه عملية زرع الأعضاء العديد من المشاكل الخطيرة، مثل نقص الأعضاء أو عدم وجود أدوات فعالة لتقييم جودة الأعضاء. وتقتصر البروتوكولات القياسية على فحص المظهر العياني أو خزعة الأنسجة الغازية ، والتي لا توفر معلومات شاملة بشأن جودة الكسب غير المشروع. في حين أن التقييم البصري يسمح لتحديد الأورام المرئية للعين ، وتشوهات التشريحية ، أو الأضرار الجسيمة التي لحقت بالطعوم ، فإن هذا النهج ذاتي للغاية ، ويختلف في فعاليته وفقًا لتجربة المراقبين. الخزعة، من ناحية أخرى، يمكن أن توفر معلومات قيمة بشأن الاضطرابات الكلوية الموجودة من قبل، وبالتالي يعتبر وسيلة من القيم الموضوعية والمبينة في تحديد نتائج الكسب غير المشروع. ومع ذلك, إجراء خزعة ليست خالية من العيوب; هناك خطر حدوث مضاعفات محتملة مثل النزيف و 4-5 ساعات إضافية من إعداد العينة مطلوبة ، مما يطيل بشكل كبير من وقت نقص التروية البارد. ولذلك ، وخاصة في أوروبا ، واستخدام تحليل الأنسجة المباشرة يقتصر على توسيع نطاق المعايير المانحين (ECD) والمتبرعين بعد الوفاة في الدورة الدموية (DCD)3،4.
وقد تم مؤخرا الاعتراف بالمت المستقلبومومات والكائنات الدهنية كنهوج واعدة لتحقيق فهم أفضل للتغيرات في المسارات الكيميائية الحيوية التي تحدث أثناء الحفاظ على الأعضاء. يمكّن التنميط الأيضي والدهني من رصد الاستجابات الفورية للنظام إلى التغيرات البيئية المفاجئة المتعلقة بإزالة الأعضاء مع عواقب لاحقة: نقص التروية، الإجهاد التأكسي، أو الاستجابات الالتهابية5،,6،,7،,8. الكلى هو الجهاز الذي يرتبط إلى حد كبير مع عمليات التمثيل الغذائي، وبالتالي قياسات الأيض وتركيزات الدهون قد تسمح بتحديد المؤشرات البيولوجية جودة الجهاز المحتملة وتمكين التنبؤات أفضل من نتائج الكسب غير المشروع.
وبالنظر إلى التعقيدات والقيود المذكورة أعلاه المرتبطة بأساليب تقييم جودة الأعضاء الحالية، هناك حاجة إلى حل تشخيصي أقل توغلاً لتقييم جودة الأعضاء السريع والمعقد. وتتوافق الطور الصلبة الدقيقة (SPME) مع هذه المتطلبات كأسلوب تحليلي طفيف التوغل الذي يتيح تغطية مجموعة واسعة من الأيض والدهون. وتستند هذه التقنية على إدخال رقيقة (~ 200 ميكرومتر), مواكب بيولوجيا, التيتانيوم والنيكل سبائك التحقيق مغطاة مع مرحلة استخراج انتقائي في الجهاز فحص لفترة قصيرة. وينبغي التأكيد على أن SPME يمنع استخراج البروتين، وبالتالي تمكين تثبيط الأيض بالفعل في مرحلة جمع العينات، والتي هي ميزة كبيرة على الطرق البديلة. وعلاوة على ذلك، فإن تصغير الجهاز يسمح لتنفيذ التحليلات المتكررة والمتزامنة من هياكل قليلة من الجهاز9،10،11.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>5330010050</td>
			<td>Mobile phase additive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Alchem</td>
			<td>696-34967-4X2.5L</td>
			<td>HPLC solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium acetate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>5330040050</td>
			<td>Mobile phase additive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BENCHMIXER XL MULTI-TUBE VORTEXER</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>BV1010</td>
			<td>Vortex mixer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caps</td>
			<td>Perlan Technologies</td>
			<td>5183-2076</td>
			<td>Blue scrw tp, pre-slit PTFE/Si spta, 100PK</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1024441000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Discovery HS F5 Supelguard Cartridge, 3 &#956;m, L &#215; I.D. 2 cm &#215; 2.1 mm</td>
			<td>Merck</td>
			<td>567570-U</td>
			<td>HPLC guard column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Discovery HS F5, 2.1 mm x 100 mm, 3 &#956;m</td>
			<td>Merck</td>
			<td>567502-U</td>
			<td>HPLC column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid</td>
			<td>Alchem</td>
			<td>497-94318-50ML</td>
			<td>Mobile phase additive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass vials</td>
			<td>Perlan Technologies</td>
			<td>5182-0714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HILIC Luna 3 &#956;m, 200A, 100 x 2.0 mm</td>
			<td>Shim-Pol</td>
			<td>PHX-00D-4449-B0</td>
			<td>HPLC column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HILIC SecurityGuard Cartridge, 3 &#956;m, 4 x 2.0 mm</td>
			<td>Shim-Pol</td>
			<td>PHX-AJ0-8328</td>
			<td>HPLC guard column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Alchem</td>
			<td>231-AL03262500</td>
			<td>HPLC solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Alchem</td>
			<td>696-34966-4X2.5L</td>
			<td>HPLC solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nano-pure water</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1037281002</td>
			<td>HPLC solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q Exactive Focus hybrid quadrupole-Orbitrap MS</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Q Exactive Focus</td>
			<td>Mass Spectrometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SeQuant ZIC-cHILIC 3&#181;m,100&#197; 100 x 2.1 mm</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1506570001</td>
			<td>HPLC column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SeQuant ZIC-HILIC Guard Kit 20 x 2.1 mm</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1504360001</td>
			<td>HPLC guard column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPME LC fiber probes, mixed mode</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>prototype fibers</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltiMate 3000 HPLC systems</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>UltiMate 3000</td>
			<td>HPLC system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vial inserts (deactivated)</td>
			<td>Perlan Technologies</td>
			<td>5181-8872</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XSelect CSH C18 3.5&#956;m 2.1x75mm</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186005644</td>
			<td>HPLC column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XSelect CSH C18 VanGuard Cartridge 3.5&#956;m, 2.1x5mm</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186007811</td>
			<td>HPLC guard column</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using a chemical biopsy for graft quality assessment

تعد زراعة الكلى علاجاً منقذاً للحياة لعدد كبير من الأشخاص الذين يعانون من خلل كلوي في المرحلة النهائية في جميع أنحاء العالم. ويرتبط هذا الإجراء مع زيادة معدل البقاء على قيد الحياة ونوعية أكبر من حياة المريض بالمقارنة مع غسيل الكلى التقليدي. للأسف، يعاني زرع من نقص في أساليب موثوقة لتقييم جودة الأعضاء. وتقتصر تقنيات التشخيص القياسية على فحص المظهر العياني أو خزعة الأنسجة الغازية، والتي لا توفر معلومات شاملة عن الكسب غير المشروع. يهدف البروتوكول المقترح إلى إدخال الطور الصلب microextraction (SPME) كوسيلة تحليلية مثالية للتحليل الشامل للاستقلابات و الدهون لجميع المركبات الجزيئية المنخفضة الموجودة في الكلى المخصصة للزراعة. صغر حجم المسبار SPME يتيح أداء خزعة كيميائية، مما يتيح استخراج الأيض مباشرة من الجهاز دون أي جمع الأنسجة. الحد الأدنى من الغازية من الطريقة يسمح تنفيذ تحليلات متعددة مع مرور الوقت: مباشرة بعد حصاد الأعضاء، أثناء الحفاظ عليها، ومباشرة بعد إعادة تنظيم الجسم في المتلقي. ومن المفترض أن الجمع بين هذه الطريقة الجديدة لأخذ العينات مع مطياف كتلة عالية الاستبانة سوف يسمح للتمييز من مجموعة من المركبات المميزة التي يمكن أن تكون بمثابة علامات بيولوجية على نوعية الكسب غير المشروع ومؤشرات التنمية المحتملة لخلل الجهاز.

تم إجراء عملية جمع العينات وفقًا لطريقة SPME الموضحة أعلاه، باستخدام مسابير مغلفة بمرحلة استخراج 7 مم مختلطة. وقد أجريت أخذ العينات مباشرة من أنسجة الكسب غير المشروع (في الجسم الحي قبل زرع)، و vivo السابقين في غرفة الكلى بعد 1 ح، 3 ح، 5 ح، و 7 ح من القذف، وفي الجسم الحي بعد revascularization في المتلقي. أجريت تحليلات مستقلوومية ودهومية غير مستهدفة باستخدام الكروماتوغرافيا السائلة (RP، HILIC) إلى جانب قياس الطيف الكتلي عالي الدقة، مع تعيين محلل الكتلة في وضع التأين الإيجابي. 11 - ولتقييم نوعية البيانات وتحقيق رؤى عامة بشأن النتائج، خضعت البيانات لتحليل المكونات الرئيسية. كما هو مبين في الشكل 1، شكلت عينات QC كتلة ضيقة ، مما يؤكد جودة التحليلات. المجموعات المدروسة تظهر فصل جيد نسبيا، مما يسمح للتصور من الاختلافات في ملفات تعريف التمثيل الغذائي والدهون قبل وبعد، وكذلك أثناء تخبط الأعضاء (الشكل 2). يسمح أخذ العينات SPME التنميط الأيضي للجهاز مع مرور الوقت. إن قطع شعيرات الصندوق من نواتج الأيض المختارة تعمل على تجسيد التعديلات في مستويات المستقلب طوال التجربة(الشكل 3). يتم عرض مجموعة واسعة من الميزات المستخرجة المنفصلة على كل من أعمدة RP و HILIC في الشكل 4.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60946/60946fig01.jpg"> الشكل 1: تحليل المكونات الرئيسية التي تبين تجميع عينات مراقبة الجودة لتحليلات الطور المعكوس المستقلب (A)، HILIC (B) ومرحلة عكس الدهون (C)، HILIC (D). مراقبة الجودة ضرورية في تحليل غير موجه لرصد أي تغييرات محتملة تُستحث نتيجة عدم الاستقرار. مجموعة ضيقة من عينات مراقبة الجودة تضمن أن جميع التغيرات التي لوحظت هي من أصل بيولوجي. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60946/60946fig1v2large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60946/60946fig02.jpg"> الشكل 2: تحليل المكونات الرئيسية الذي يبين الاختلافات الأيضية (A) والدهينية (باء) بين نقاط أخذ العينات. التنميط غير المستهدفة للكلى مع SPME-LC-HRMS تمكن من مراقبة الاختلافات الكيميائية الحيوية في الأجهزة في الخطوات اللاحقة من الحفاظ عليها. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60946/60946fig2v2large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60946/60946fig03.jpg"> الشكل 3: قطع شعيرات صناديق لمركبات مختارة تظهر تغيرات في نواتج الأيض (ألف وباء) والدهون (جيم و دال) خلال فترة الزراعة حول الأرض. بعد اختيار وتحديد المركبات التمييزية مربع خفقان المؤامرات تمكن من رصد التغيرات في مستويات هذه المركبات في الخطوات اللاحقة من البروتوكول ومقارنة مستويات الأيض في الأجهزة التي تخضع لبروتوكولات الحفاظ على مختلف أو حصادها من مختلف الجهات المانحة مثل المتبرعين ضربات القلب أو المتبرعين بعد الوفاة القلبية. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60946/60946fig3v2large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60946/60946fig04.jpg"> الشكل 4: خريطة الأيونات (م/ع مقابل وقت الاحتفاظ) للمعالم التي تم الحصول عليها بواسطة تحليل LC-MS مع (A) عكس المرحلة و (B) فصل HILIC. ويمكن من هذه المؤامرة لتقدير العدد الإجمالي للميزات التي تم الحصول عليها من خلال البروتوكول المقترح (من الاستخراج إلى الكشف) وتقييم التغطية التحليلية على أساس القطبية. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60946/60946fig4v2large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Using a Chemical Biopsy for Graft Quality Assessment at JoVE.com

Using a Chemical Biopsy for Graft Quality Assessment

ويعرض البروتوكول استخدام نهج الخزعة الكيميائية متبوعاً بتحليل مستقلب شامل ودهونومي لتقييم جودة ترقيع الكلى المخصصة للزرع.

استخدام خزعة كيميائية لتقييم جودة الكسب غير المشروع

Kidney transplantation is a life-saving treatment for a large number of people with end-stage renal dysfunction worldwide. The procedure is associated ...

خزعة كيميائية هو حل تشخيصي جديد في زرع الأعضاء لتقييم جودة الكسب غير المشروع سريعة ومعقدة. ولا توجد حالياً طرق أخرى متاحة لأساليب الغازية المنخفضة التي تمكّن من إجراء مثل هذا التحليل. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي إمكانية رصد تعديلات أنسجة الكسب غير المشروع مع مرور الوقت من الحفاظ بسبب بساطة وانخفاض الغازية من تحقيقات SPME.القطر الصغير للمسبار ومجموعة كبيرة ومتنوعة من الطلاءات التي يمكن التوافق بيولوجيا تجعل هذه الطريقة مناسبة لتحليل الأعضاء المزروعة وقابلة للتطبيق في البحوث الطبية مثل تحليل الورم. عند محاولة هذه التقنية لأول مرة الانتباه إلى التفاصيل وتوقيت خطوات معينة لأن أخطاء صغيرة قد تؤثر بشدة على النتائج. البروتوكول بسيط، ولكن من الأسهل فهم وأداء بعد العرض التوضيحي المرئي.ابدأ بإعداد خليط من الميثانول والماء يتكون من واحد إلى واحد. Pipette ملليلتر واحد من الحل في كل قارورة الزجاج ملليلتر ووضع مسبار واحد في كل قارورة. تهيج قوارير على المحرض دوامة في 1200 دورة في الدقيقة لمدة ساعة واحدة.ثم شطف المسابير مع LCMS الصف المياه وتعقيمها وفقا لبروتوكول التعقيم الجراحية القياسية أو في قسم معالجة معقمة. عندما تكون جاهزة لاستخراج العينة، فتح التعبئة والتغليف العقيمة وإدراج اثنين من مسابير مباشرة في قشرة الكلية لمدة 10 دقيقة لكل نقطة زمنية، مع التأكد من أن كامل طول الطلاء مغطى بمصفوفة الأنسجة. تأكد من تتبع وقت أخذ العينات لكل مسبار.سحب التحقيق عن طريق سحبه من الأنسجة وشطف على الفور طلاء مع LCMS الصف المياه لإزالة أي دم المتبقية التأكد من شطف بعيدا عن موقع الجراحة. لنقل المسابير، ضعها في قارورة منفصلة وإغلاقها. ثم ضع القنينات في صندوق مليء بالثلج الجاف أو النيتروجين السائل.تخزين العينات في درجة مئوية سلبية 80 أو المضي قدما على الفور مع desorption. إعداد حل إزالة الامتصاص تتألف من الأسيتونيتريل والماء لتحليل المستقلب وآخر يتكون من ايزوبروبانول والميثانول لتحليل الدهون. إضافة 100 ميكرولترات من الحل لإدراج في اثنين من المليلتر المسمى قارورة ووضع مسبار واحد في كل قارورة تهيج قارورة في 1200 دورة في الدقيقة لمدة ساعتين ثم إزالة المسابير من قارورة والمضي قدما مع تحليل LCMS.واستُخدم الكروماتوغرافيا السائلة إلى جانب قياس الطيف الكتلي العالي الاستبانة لإجراء تحليل مستقلبومومي وغير موجه. وخضعت البيانات لتحليل المكونات الرئيسية لتقييم الجودة التي تُبدي رؤى عامة بشأن النتائج. وشكلت عينات مراقبة الجودة مجموعة ضيقة تؤكد جودة التحليل.أظهرت المجموعات المدروسة فصلًا جيدًا نسبيًا ، مما سمح بالتصور للاختلافات في ملفات تعريف التمثيل الغذائي والدهون قبل وبعد الزراعة وكذلك أثناء تخبط الأعضاء. تم فصل مجموعة واسعة من الميزات المستخرجة على كل من الأعمدة الطورية المعكوسة وأعمدة الكروماتوغرافيا السائلة. وقد أظهرت مستويات التعديلات والاستقلاب في جميع أنحاء التجربة مع قطع شعيرات مربع من الأيضات المختارة.عند تنفيذ هذا الإجراء، نضع في اعتبارنا عدم تجانس الأجهزة. ضع المسبار في الموقع المطلوب حافظ على وقت أخذ العينات متطابقًا في جميع النقاط الزمنية ، وتأمين الألياف بشكل صحيح بعد أخذ العينات. ويمكن قياس المؤشرات البيولوجية المكتشفة مع SPME كميا باستخدام طريقة الاستخراج هذه مقرونة بـ MSMS أو LCMS أو أجهزة تحليلية أخرى.وعلاوة على ذلك، بما أنه لا يتم استهلاك أي عينة، يمكن إجراء تحليل روتيني مثل الخزعة. ويمكن تكييف هذه الطريقة لتحليل الأنسجة الأخرى المستقلبوموم والدهون دون ضرورة ل المعالجة المسبقة للعينة. بالنسبة لمناقعات محددة.ويمكن استخدام الطلاءات الأخرى لزيادة الانتقائية والحساسية للمقال.

Research

JoVE Journal

Medicine

Mouse Models for Graft Arteriosclerosis

نماذج الماوس لتصلب الشرايين الكسب غير المشروع

Graft arteriosclerois (GA),  also called allograft vasculopathy, is a pathologic lesion that develops over  months to years in transplanted organs ...

Human Skeletal Muscle Biopsy Procedures Using the Modified Bergstr&#246;m Technique

Human Skeletal Muscle Biopsy Procedures Using the Modified BergstrÃƒÆ’Ã‚Â¶m Technique

الهيكل العظمي إجراءات خزعة العضلات البشرية باستخدام تقنية التعديل بيرجستروم

The percutaneous biopsy technique enables researchers and clinicians to collect skeletal muscle tissue samples. The technique is safe and highly ...

Substernal Thyroid Biopsy Using Endobronchial Ultrasound-guided Transbronchial Needle Aspiration

تحت القص خزعة الغدة الدرقية عن طريق الموجات فوق الصوتية داخل القصبة الموجهة إبرة الرشف

Substernal thyroid goiter (STG) represents about 5.8% of all mediastinal lesions1. There is a wide variation in the published incidence rates due to the ...

Isolation and Immortalization of Patient-derived Cell Lines from Muscle Biopsy for Disease Modeling

العزلة وتخليد خطوط الخلايا المشتقة من المريض من خزعة العضلات لمرض النمذجة

The generation of patient-specific cell lines represents an invaluable tool for diagnostic or translational research, and these cells can be collected ...

Preparation and Respirometric Assessment of Mitochondria Isolated from Skeletal Muscle Tissue Obtained by Percutaneous Needle Biopsy

تقييم إعداد وRespirometric من الميتوكوندريا المعزولة من الأنسجة العضلية الهيكلية التي تحصل عليها عن طريق الجلد إبرة الخزعة

Respirometric profiling of isolated mitochondria is commonly used to investigate electron transport chain function. We describe a method for obtaining ...

Human Vastus Lateralis Skeletal Muscle Biopsy Using the Weil-Blakesley Conchotome

Human Vastus Lateralis Skeletal Muscle Biopsy Using the Weil-Blakesley Conchotome

الانسان<em&gt; المتسعة الوحشية</em&gt; الهيكل العظمي خزعة العضلات باستخدام ويل Blakesley مبضع المحارات

Percutaneous muscle biopsy using the Weil-Blakesley conchotome is well established in both clinical and research practice. It is a safe, effective and ...

Vein Interposition Model: A Suitable Model to Study Bypass Graft Patency

الوريد الإعتراض نموذج: نموذج مناسب لدراسة الالتفافية الكسب غير المشروع الإنفتاح

Bypass grafting is an established treatment method for coronary artery disease. Graft patency continues to be the Achilles heel of saphenous vein grafts. ...

A Technique for Subcutaneous Abdominal Adipose Tissue Biopsy via a Non-diathermy Method

تقنية للأنسجة الدهنية تحت الجلد للبطن خزعة عبر أسلوب غير النافذة

Adipose tissue biopsies offer tissue samples that, upon analysis, may provide insightful overviews of mechanisms relating to metabolism and disease. To ...

Synergizing Antegrade Endoscopic with Bridging Vein Harvesting for Improvement of Great Saphenous Vein Graft Quality from the Lower Leg

التازر بالتنظير الوريدي مع تجميع الوريد لتحسين جوده طعم الوريد الكبير من الساق السفلي

Antegrade endoscopic harvesting of autografts for bypass grafting may be an optimal strategy addressing excellent graft quality and reduced post-operative ...

A Rodent Model of The Ross Operation: Syngeneic Pulmonary Artery Graft Implantation in A Systemic Position

نموذج القوارض لعملية روس: زرع الطعم الشرياني الرئوي المتلازمين في وضع نظامي

The Ross operation for aortic valve disease has regained new interest due to its outstanding long-term results. Nonetheless, when employed as freestanding ...