Name: using a chemical biopsy for graft quality assessment
Uploaded: 2020-06-17T13:30:00
Duration: 5 min
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L’étude a été soutenue par la subvention Opus UMO-2017/27/B/NZ5/01013 du Centre national des sciences. Les auteurs tiennent à remercier MilliporeSigma, une entreprise de Merck KGaA, Darmstadt, Allemagne, pour la fourniture d’appareils SPME. L’entreprise de sciences de la vie de Merck fonctionne sous le nom de MilliporeSigma aux États-Unis et au Canada. En outre, les auteurs tiennent à remercier Thermo Fisher Scientific pour l’accès au spectromètre de masse Q-Exactive Focus orbitrap. Les auteurs tiennent à remercier la Dre Aleksandra Woderska-Jasińska et le personnel du Département de transplantation et de chirurgie générale de Bydgoszcz pour leur aimable assistance dans le projet. BB tient à remercier le professeur Janusz Pawliszyn pour l’occasion de prélever des échantillons à l’Hôpital général de Toronto pendant son séjour à l’Université de Waterloo.

Tous les animaux ont reçu des soins sans cruauté conformément aux « Principes des soins aux animaux de laboratoire » formulés par la Société nationale de recherche médicale et le « Guide pour les soins aux animaux de laboratoire » publié par l’Institut national de la santé, Ontario, Canada. Le Comité des soins aux animaux de l’Institut de recherche général de Toronto a approuvé toutes les études. La recherche portait sur des sujets humains a été approuvée par le Comité bioéthique du Collegium Medicum à l’Université Bydgoszcz Nicolaus Copernicus à Torun.
REMARQUE : Obtenir l’approbation des conseils d’éthique appropriés. N’oubliez pas de toujours porter des gants de sécurité. Ne touchez pas à la phase d’extraction des sondes SPME. L’utilisation de flacons de verre désactivé est recommandée pour les analyses lipidomiques.
1. Préparation des sondes
<ol><li>Préparer des sondes en alliage titane-nickel (longueur 40 mm; 0,2 mm de diamètre) recouvertes de sorbent en mode mélange de 7 mm. Le nombre de sondes dépend des points de temps ciblés pendant toute la procédure et du nombre de répliques (3 est recommandé par point de temps). REMARQUE : La longueur et le type de phase d’extraction peuvent être ajustés en fonction du mode d’étude, de la polarité des métabolites et de la matrice de l’échantillon.</li>
	<li>Préparer un mélange de nettoyage composé de 2:1 chloroforme:méthanol (v/v). Pipet 1.0 mL de la solution à chaque flacon de verre de 2,0 mL et placer une sonde, précédemment percé à travers le bouchon, dans chaque flacon. REMARQUE : Avant d’utiliser, nettoyez toutes les sondes pour éliminer les particules contaminantes.</li>
	<li>Placez les flacons sur l’agitateur et réglez la vitesse d’agitation à 1 200 tr/min. Après 45 min, arrêtez l’appareil et rincez les revêtements à l’eau de qualité LC-MS.</li>
	<li>Comme les revêtements doivent subir une étape préalable pour les activer, préparer un mélange préconditionnant composé de 1:1 méthanol:eau (v/v). Pipet 1.0 mL de la solution à chaque flacon de verre de 2,0 mL et placer une sonde, précédemment percé à travers le bouchon, dans chaque flacon.</li>
	<li>Placez les flacons sur l’agitateur vortex et réglez la vitesse d’agitation à 1 200 tr/min.</li>
	<li>Après 60 min, arrêtez l’agitateur et rincez les revêtements à l’eau de qualité LC-MS.</li>
	<li>Stériliser les sondes selon le protocole standard de stérilisation de l’équipement chirurgical.</li>
</ol>2. Extraction
<ol><li>Ouvrez l’emballage stérile juste avant l’échantillonnage pour assurer un environnement stérile.</li>
	<li>Insérez deux sondes directement dans le cortex rénal pendant 10 min à chaque point de temps. Toute la longueur du revêtement doit être couverte par la matrice tissulaire; aucun angle spécifique n’est requis, mais vers 90 deg est habituellement utilisé. REMARQUE : L’ensemble de la procédure médicale suit les protocoles standard s’essoipant dans l’établissement donné. Aucune modification concernant l’échantillonnage spme n’est envisagée. La procédure comprend les six points de temps d’échantillonnage suivants: a) avant la résection rénale, in vivo du donneur; b)-e) après 1 h, 3 h, 5 h, 7 h de perfusion rénale, ex vivo dans la chambre d’organe; f) après reperfusion, in vivo du destinataire.</li>
	<li>Rétractez les sondes en la tirant du tissu, puis rincez les revêtements à l’eau de qualité LC-MS pour dégager tout sang restant de la surface du revêtement. Rincer loin du site chirurgical, et immédiatement après le retrait des sondes.</li>
</ol>3. Transport et stockage
<ol><li>Placez les sondes dans des flacons séparés et fermez-les.</li>
	<li>Placer les flacons dans une boîte en polystyrène remplie de glace sèche ou dans de l’azote liquide pour le transport.</li>
	<li>Conserver les échantillons dans un congélateur (-80 °C) ou commencer immédiatement l’étape de désorption.</li>
</ol>4. Désorption
<ol><li>Préparer des solutions de désorption composées de 80:20 acétonitrille:eau (v/v) pour l’analyse métabolomique, et 1:1 isopropanol:méthanol (v/v) pour l’analyse lipidomique.</li>
	<li>Pipet 100 μL de la solution pour les inserts placés dans 2,0 mL flacons étiquetés et placer une sonde, précédemment percé à travers le bouchon, dans chaque flacon.</li>
	<li>Placez les flacons sur l’agitateur vortex et réglez la vitesse d’agitation à 1 200 tr/min pendant 120 min.</li>
	<li>Retirez les sondes des flacons. Les extraits obtenus sont maintenant prêts pour l’analyse instrumentale.</li>
</ol>5. Analyse LC-MS
<ol><li>Placez des flacons contenant des extraits dans l’autosampler du système LC-MS. NOTE : La chromatographie liquide (RP, HILIC) couplée à la spectrométrie de masse à haute résolution et à un analyseur de masse d’orbitrap ont été employées pour cette étude. Pour les paramètres d’analyse métabolomique, passez à l’étape 5.2. Pour les paramètres d’analyse lipidomique, passez à l’étape 5.6.</li>
	<li>Utiliser une colonne de pentafluorophényle (PFP) (2,1 mm x 100 mm, 3 μm) pour la séparation de phase inversée.<ol>
<li>Réglez le débit à 300 μL/min, et les températures de l’autosampler et de la colonne à 4 °C et 25 °C, respectivement.</li>
		<li>Préparer les phases mobiles selon les proportions suivantes : phase mobile A : eau : acide formique (99.9:0.1, v/v), et phase mobile B : acétonitriale : acide formique (99,9:0,1, v/v). Réglez le flux de phase mobile selon les paramètres suivants : débit de phase mobile de démarrage (0-3 min) : 100% A suivi d’un gradient linéaire à 10% A (3-25 min), se terminant par un débit isocratique de 10% A jusqu’à 34 min, suivi de 6 min de temps de rééquilibrage de colonne.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pour la séparation HILIC, utiliser une colonne HILIC (2,0 mm x 100 mm, 3 μm, 200A). Réglez le débit à 400 μL/min.<ol>
<li>Préparer les phases mobiles selon les proportions suivantes : phase mobile A : tampon d’acétonitrille :acétate d’ammonium (9:1, v/v, concentration effective de sel 20 mM), phase mobile B : tampon d’acétonitrille:ammonium acétate (1:1, v/v, concentration effective de sel 20 mM).</li>
		<li>Réglez le flux de phase mobile selon les paramètres suivants : démarrage du débit de phase mobile (0-3 min) à 100% A, tenir pendant 3,0 min, puis rampe à 100% B dans les 5 min. Tenir avec 100% B jusqu’à 12 min, suivi de 8 min de temps de rééquilibrage de la colonne.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Définissez la plage d’analyse à 85-1000 m/z. Définir les paramètres de source d’ions HESI en mode ionisation positive sur : tension de pulvérisation 1 500 V, température capillaire 300 °C, gaz de gaine 40 a.u., débit au gaz 15 a.u., température de chauffage de sonde 300 °C, niveau rf de S-Lens 55%.</li>
	<li>Exécutez des échantillons qc composés de 10 μL de chaque échantillon analysé (régulièrement, tous les échantillons de 10 à 12) pour surveiller les performances des instruments.</li>
	<li>Pour la séparation de phase inversée, utiliser une colonne C18 (2,1 mm x 75 mm, 3,5 μm).<ol>
<li>Réglez le débit à 200 μL/min, et les températures de l’autosampler et de la colonne à 4 °C et 55 °C, respectivement. Préparer les phases mobiles selon les proportions suivantes : phase mobile A : H2O:MeOH (60:40, v/v), 10 mM d’acétate d’ammonium et 1 mM d’acide acétique; phase mobile B: IPA:MeOH (90:10, v/v), 10 mM amomonium acétate et 1 mM acide acétique.</li>
		<li>Définir le flux de phase mobile selon les paramètres suivants : 0-1 min (20% B), 1-1,5 min (20-50% B), 1,5-7,5 min (50-70% B), 7,7 5-13 min (70-95% B), 13-17 min (95% B), 17-17,1 min (95-20% B), 17,1-23 min (20%).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pour la séparation HILIC, utiliser une colonne HILIC (100 x 2,1 mm, 3 μm).<ol>
<li>Réglez le débit à 400 μL/min, et les températures de l’autosampler et de la colonne à 4 °C et 40 °C, respectivement.</li>
		<li>Préparer les phases mobiles selon les proportions suivantes : phase mobile A : ACN; phase mobile B : acétate d’ammonium de 5 mM dans l’eau. Définir le débit de phase mobile selon les paramètres suivants : 0-2 min (96% B), 2-15 min (96-80% B), 15-15,1 min (80-96% B), 15.1-21 min (96% B).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Définir les paramètres de source d’ions HESI en mode d’ionisation positive pour pulvériser la tension 3 500 V, la température capillaire 275 °C, le gaz de gaine 20 a.u., le débit au gaz 10 a.u., la température de chauffage de la sonde 300 °C, le niveau RF de S-Lens 55%.</li>
	<li>Exécuter des échantillons qc composés de 10 μL de chaque échantillon analysé (tous les 10-12 échantillons) pour surveiller les performances des instruments.</li>
	<li>Effectuer l’acquisition de données dans un logiciel compatible avec l’instrument.</li>
</ol>6. Analyse des données
<ol><li>Effectuer le traitement des données, l’identification putative et l’analyse statistique avec l’utilisation de logiciels dédiés à l’analyse métabolomique et lipidomique non ciblée. REMARQUE : On peut obtenir l’analyse des composants principaux (PCA) et les parcelles de moustache de boîte pour visualiser la structure des données.</li>
</ol>

<ol>
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Les auteurs tiennent à remercier MilliporeSigma (Merck KGaA, Darmstadt, Allemagne) d’avoir fourni des dispositifs SPME et Thermo Fisher Scientific pour l’accès au spectromètre de masse Q-Exactive Focus Orbitrap.

L’évaluation de la qualité des organes demeure un grand défi pour les médecins, qui doivent prendre rapidement des décisions éclairées quant à savoir si un organe donné est viable pour la transplantation ou s’il doit être jeté. Plusieurs facteurs, tels que l’âge du donneur, la durée de l’ischémie, les infections et les processus inflammatoires, peuvent affecter les résultats à long terme de greffe. Bien que diverses méthodes aient été développées à ce jour pour diagnostiquer la fonction d’allogreffe rénale, l’inspection histopathologique reste l’étalon-or dans cette matière3,4,12. Bien que la procédure de biopsie puisse fournir des informations significatives concernant la maladie préexistante de donneur et les changements vasculaires, elle n’est pas exempte de défauts. Les erreurs d’échantillonnage associées à la variabilité interobservateur et à l’échantillonnage de glomeruli insuffisants pour obtenir des renseignements complets sur la fonction des organes demeurent des préoccupations typiques à cet égard. En outre, la préparation des spécimens apporte quelques problèmes tels qu’une évaluation incomplète de la greffe en cas de sections congelées, et l’extension du temps de procédure pour la section de paraffine. Cependant, le risque accru d’hémorragie, qui peut sembler aigu comme hématurie microscopique ou brute, est la complication mortelle majeure liée à la procédure de biopsie. Pour cette raison, le nombre de biopsies admissibles est strictement limité dans les procédures de transplantation, un facteur qui entrave la capture des changements dynamiques et des analyses des séries temporelles via cette méthode12,13,14. Les avantages d’une analyse histologique doivent être évalués par rapport aux risques associés à la méthodologie. La valeur des résultats histologiques est incontestable, mais elles n’expliquent pas les mécanismes moléculaires des aberrations.
La métabolomique et la lipidomique sont les plus jeunes domaines de la famille scientifique des « -omics ». L’ensemble complet de métabolites et de lipides humains faibles (<1,200 Da) connectés au sein d’un réseau métabolique est défini comme un métabolome humain. Le génome reste relativement constant tout au long de sa vie, avec de légères modifications causées par des mutations se produisant rarement. Le métabolome est le produit de l’expression génique, qui est très sensible aux changements dans tous les processus biologiques ainsi que les facteurs environnementaux. La nature dynamique des métabolites et des lipides en fait des indicateurs parfaits de l’état actuel des organes7,8,15,16. La méthode SPME proposée dans le protocole susmentionné permet de détecter les changements qui se produisent dans l’organe pendant sa conservation, à partir de l’ablation des organes du corps du donneur jusqu’à la revascularisation chez le receveur. Le petit diamètre de la sonde (~200 μm) fournit une invasivité minimale et permet plusieurs échantillonnages à partir du même organe sans causer de dommages au tissu. La réalisation d’études à l’aide de rein, comme l’organe le plus fréquemment transplanté, permet une meilleure compréhension et une caractérisation plus poussée des voies métaboliques responsables de la baisse de la qualité et de la fonction des greffes. La possibilité de surveiller les modifications au fil du temps est certainement un avantage important de la technique par rapport aux méthodes invasives conventionnelles telles que la biopsie. L’analyse actuellement présentée a identifié des concentrations altérées de divers groupes de lipides et de métabolites, en particulier des acides aminés essentiels, des purines, des nucléosides purinés, et des glycérophospholipides. Ces résultats sont compatibles avec les rapports précédents d’analyse tissulaire5,6,17,18,19,20. À ce jour, la majorité des rapports scientifiques utilisant des métabolomiques ou des lipidomiques pour expliquer les processus induisant des complications après la transplantation ou les dommages d’ischémie/reperfusion (IRI) ont été limités à l’analyse des biofluides21,22,23.
Chaque application clinique nécessite l’optimisation du protocole d’échantillonnage pour s’assurer que la performance de la méthode analytique répond aux critères attendus. À cet égard, l’avantage de l’utilisation de SPME est la possibilité d’ajuster les conditions pour diverses conceptions expérimentales. La variété des phases d’extraction accessibles offre un large spectre de métabolites extraits avec des polarités diversifiées. En même temps, cela pourrait être considéré comme une limitation de la méthode en raison du fait que chaque sorbent fournit la sélectivité vers des caractéristiques spécifiques et n’extrait pas tous les composés présents dans la matrice de l’échantillon. Il convient de noter que les revêtements SPME ne s’extraient que par l’intermédiaire de molécules libres, et n’interagissent tout simplement pas avec une fraction liée de l’analyte. La biocompatibilité des revêtements n’introduit pas de toxicité dans le tissu tout en limitant l’extraction de grandes molécules telles que les protéines; par conséquent, les processus enzymatiques sont déjà inhibés au stade de la collecte des échantillons et la présence d’artefacts est réduite au minimum, ce qui constitue un grand avantage par rapport aux méthodes d’échantillonnage alternatives. La longueur du revêtement influe sur l’efficacité de l’extraction (c.-à-d. que la longueur du revêtement désigne la surface et le volume de la phase d’extraction); ainsi, les revêtements plus longs produisent des recouvrements plus élevés. D’autre part, des revêtements plus courts permettent une résolution spatiale plus élevée. Pour des résultats fiables, il est crucial de submerger la sonde à la même profondeur exacte du cortex rénal. L’insertion trop profonde entraîne le risque d’entrer dans la médulla rénale. Le temps de l’extraction est également proportionnel à l’efficacité d’extraction. Par conséquent, la sélection du temps d’extraction optimal est l’une des étapes les plus critiques dans le développement de la méthode SPME. La précision de la mesure du temps fournit la plus grande répétabilité. Dans les applications biologiques telles que celle discutée, il y a toujours un compromis entre la sensibilité et la répétabilité du protocole analytique et les restrictions de la procédure médicale. Bien que l’extraction d’équilibre offre la sensibilité la plus élevée, pour des raisons de sécurité, les conditions prééquilibres sont souvent utilisées dans de telles applications, car le temps d’extraction ne devrait pas affecter la durée totale de la chirurgie. L’efficacité de la désorption est déterminée par le moment du processus et la composition du solvant de désorption, qui doit être compatible avec la phase mobile utilisée pour la séparation chromatographique9,10,11.
L’une des principales exigences pour l’instrumentation diagnostique utilisée pour les évaluations intra-chirurgicales est le temps d’analyse. Des tentatives actuelles sont en cours pour développer un outil rapide pour l’extraction in vivo SPME couplé directement à un spectromètre de masse via l’interface ouverte microfluidique (MOI)24 ou spray de lame enduite (CBS)25. De telles approches permettraient de divulguer les résultats analytiques en temps réel ou proche. L’utilisation de telles méthodes pour les analyses pré-intervention des profils métaboliques et lipidomiques pourrait améliorer le processus de prise de décision pendant les procédures de transplantation, permettant la meilleure approche personnalisée possible et une réponse rapide en cas de défaillance des organes.
En résumé, on suppose que le protocole proposé permettra d’atteindre des profils métaboliques et lipidomiques complets des greffes rénales, ce qui fournirait à son tour une évaluation complète de la qualité des organes et de la caractérisation des processus responsables des lésions de l’ischémie-reperfusion. La nouveauté du projet comprend l’utilisation de la microextraction en phase solide (SPME), offrant un faible échantillonnage invasif des systèmes vivants, en combinaison avec l’une des technologies les plus innovantes disponibles pour l’analyse métabolomique et lipidomique (par exemple, le spectromètre de masse à haute résolution Orbitrap). SPME combine la collecte d’échantillons, l’extraction et l’extinction des métabolites en une seule étape, ce qui en fait un outil idéal pour une analyse rapide. On s’attend à ce que ce protocole aide à répondre aux questions liées aux conditions pré-transplantation du rein sont responsables de la fonction retardée d’organe ou de ses dysfonctionnements après la transplantation, aussi bien que de la façon dont le protocole de conservation de greffe influence la biochimie de l’organe. Ces connaissances auraient non seulement un impact significatif sur la prévention des complications possibles liées à la transplantation, mais pourraient aider à améliorer les protocoles actuels de conservation des greffes, minimisant la perte de tissu de greffe viable ainsi que la perte de vie. La solution proposée ouvrira la porte à d’autres recherches dans ce domaine, y compris la validation de biomarqueurs potentiels spécifiques et l’amélioration des résultats thérapeutiques en transplantologie.

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The third affiliation was&#160;updated from:
Department of Transplantation and General Surgery, University Hospital, University of Nicolaus Copernicus Torun&#34;
to:
Department of Transplantology and General Surgery, Collegium Medicum in Bydgoszcz, Antoni Jurasz University Hospital No. 1 in Bydgoszcz, Nicolaus Copernicus University in Torun, Bydgoszcz, Poland

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Erratum: Using a Chemical Biopsy for Graft Quality Assessment

Selon le Réseau d’approvisionnement et de transplantation d’organes des États-Unis, 94 756 patients attendaient une greffe de rein aux États-Unis en 2019; en 2018, ce nombre était de 10 791. Toutes les dix minutes, quelqu’un est ajouté à la liste d’attente nationale de transplantation aux États-Unis, et on estime que 20 personnes meurent chaque jour en attendant une greffe1,2. La transplantation rénale est un traitement salvateur pour un grand nombre de personnes souffrant d’un dysfonctionnement rénal en phase terminale dans le monde entier. La procédure est associée à un taux de survie accru et à une meilleure qualité de vie par rapport à la dialyse conventionnelle.
Cependant, la transplantation est confrontée à de nombreux problèmes graves, tels que la pénurie d’organes ou le manque d’outils efficaces pour l’évaluation de la qualité des organes. Les protocoles standard sont limités à l’inspection de l’apparence macroscopique ou à la biopsie invasive des tissus, qui ne fournissent pas d’informations complètes sur la qualité de la greffe. Alors qu’une évaluation visuelle permet d’identifier des tumeurs visibles à l’œil, des anomalies anatomiques, ou des dommages importants aux greffes, cette approche est très subjective, variant dans son efficacité selon l’expérience des observateurs. La biopsie, d’autre part, peut fournir des informations précieuses concernant les désordres rénaux préexistants, et est donc considérée comme une méthode de valeur objective et probante dans la détermination des résultats de greffe. Cependant, la procédure de biopsie n’est pas exempte de défauts; il y a le risque de complications potentielles telles que des saignements et un supplément de 4-5 heures de préparation d’échantillon est nécessaire, ce qui prolonge considérablement le temps ischémique froid. Par conséquent, en particulier en Europe, l’utilisation de l’analyse directe des tissus est limitée aux critères élargis donneurs (ECD) et donneurs après la mort circulatoire (DCD)3,4.
La métabolomique et la lipidomique ont récemment été reconnues comme des approches prometteuses pour mieux comprendre les changements dans les voies biochimiques qui se produisent pendant la préservation des organes. Le profilage métabolomique et lipidoïque permet de surveiller les réponses immédiates du système aux changements environnementaux soudains liés à l’ablation des organes avec des conséquences ultérieures : ischémie, stress oxydatif ou réponses inflammatoires5,6,7,8. Le rein est un organe qui est largement associé aux processus métaboliques, donc les mesures des métabolites et des concentrations de lipides peuvent permettre l’identification des biomarqueurs potentiels de qualité d’organe et permettre de meilleures prédictions des résultats de greffe.
Compte tenu des complications et des limitations ci-dessus associées aux méthodes actuelles d’évaluation de la qualité des organes, une solution diagnostique moins invasive est nécessaire pour une évaluation rapide et complexe de la qualité des organes. La microextraction en phase solide (SPME) est conforme à ces exigences en tant que méthode analytique minimalement invasive qui permet la couverture d’un large éventail de métabolites et de lipides. La technique est basée sur l’insertion d’une mince (~200 μm), biocompatible, sonde en alliage titane-nickel recouverte d’une phase d’extraction sélective dans l’organe examiné pendant une courte période. Il convient de souligner que spme empêche l’extraction des protéines, et permet donc l’inhibition du métabolisme déjà au stade de la collecte des échantillons, ce qui est un avantage significatif sur les méthodes alternatives. En outre, la miniaturisation du dispositif permet l’exécution d’analyses répétitives et simultanées de quelques structures de l’organe9,10,11.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>5330010050</td>
			<td>Mobile phase additive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Alchem</td>
			<td>696-34967-4X2.5L</td>
			<td>HPLC solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium acetate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>5330040050</td>
			<td>Mobile phase additive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BENCHMIXER XL MULTI-TUBE VORTEXER</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>BV1010</td>
			<td>Vortex mixer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caps</td>
			<td>Perlan Technologies</td>
			<td>5183-2076</td>
			<td>Blue scrw tp, pre-slit PTFE/Si spta, 100PK</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1024441000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Discovery HS F5 Supelguard Cartridge, 3 &#956;m, L &#215; I.D. 2 cm &#215; 2.1 mm</td>
			<td>Merck</td>
			<td>567570-U</td>
			<td>HPLC guard column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Discovery HS F5, 2.1 mm x 100 mm, 3 &#956;m</td>
			<td>Merck</td>
			<td>567502-U</td>
			<td>HPLC column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid</td>
			<td>Alchem</td>
			<td>497-94318-50ML</td>
			<td>Mobile phase additive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass vials</td>
			<td>Perlan Technologies</td>
			<td>5182-0714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HILIC Luna 3 &#956;m, 200A, 100 x 2.0 mm</td>
			<td>Shim-Pol</td>
			<td>PHX-00D-4449-B0</td>
			<td>HPLC column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HILIC SecurityGuard Cartridge, 3 &#956;m, 4 x 2.0 mm</td>
			<td>Shim-Pol</td>
			<td>PHX-AJ0-8328</td>
			<td>HPLC guard column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Alchem</td>
			<td>231-AL03262500</td>
			<td>HPLC solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Alchem</td>
			<td>696-34966-4X2.5L</td>
			<td>HPLC solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nano-pure water</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1037281002</td>
			<td>HPLC solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q Exactive Focus hybrid quadrupole-Orbitrap MS</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Q Exactive Focus</td>
			<td>Mass Spectrometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SeQuant ZIC-cHILIC 3&#181;m,100&#197; 100 x 2.1 mm</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1506570001</td>
			<td>HPLC column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SeQuant ZIC-HILIC Guard Kit 20 x 2.1 mm</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1504360001</td>
			<td>HPLC guard column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPME LC fiber probes, mixed mode</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>prototype fibers</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltiMate 3000 HPLC systems</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>UltiMate 3000</td>
			<td>HPLC system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vial inserts (deactivated)</td>
			<td>Perlan Technologies</td>
			<td>5181-8872</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XSelect CSH C18 3.5&#956;m 2.1x75mm</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186005644</td>
			<td>HPLC column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XSelect CSH C18 VanGuard Cartridge 3.5&#956;m, 2.1x5mm</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186007811</td>
			<td>HPLC guard column</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using a chemical biopsy for graft quality assessment

La transplantation rénale est un traitement salvateur pour un grand nombre de personnes atteintes d’un dysfonctionnement rénal en phase terminale dans le monde entier. La procédure est associée à un taux de survie accru et à une meilleure qualité de vie du patient par rapport à la dialyse conventionnelle. Malheureusement, la transplantologie souffre d’un manque de méthodes fiables pour l’évaluation de la qualité des organes. Les techniques de diagnostic standard sont limitées à l’inspection de l’apparence macroscopique ou à la biopsie invasive des tissus, qui ne fournissent pas d’informations complètes sur la greffe. Le protocole proposé vise à introduire la microextraction en phase solide (SPME) comme méthode d’analyse idéale pour l’analyse métabolomique complète et lipidomique de tous les composés moléculaires faibles présents dans les reins alloués à la transplantation. La petite taille de la sonde SPME permet la performance d’une biopsie chimique, qui permet l’extraction de métabolites directement à partir de l’organe sans aucune collecte de tissus. L’invasivité minimale de la méthode permet l’exécution de multiples analyses au fil du temps : directement après la récolte des organes, lors de sa conservation, et immédiatement après la revascularisation au corps du receveur. On suppose que la combinaison de cette nouvelle méthode d’échantillonnage avec un spectromètre de masse à haute résolution permettra de discriminer un ensemble de composés caractéristiques qui pourraient servir de marqueurs biologiques de la qualité de la greffe et des indicateurs du développement possible du dysfonctionnement des organes.

La collecte d’échantillons a été effectuée selon la méthode SPME décrite ci-dessus, à l’aide de sondes recouvertes d’une phase d’extraction en mode mixte de 7 mm. L’échantillonnage a été effectué directement à partir du tissu de greffe (in vivo avant la transplantation), ex vivo dans la chambre de rein après 1 h, 3 h, 5 h, et 7 h de perfusion, et in vivo après revascularisation dans le destinataire. Des analyses métabolomiques et lipidémiques non ciblées ont été effectuées avec l’utilisation de la chromatographie liquide (RP, HILIC) couplée à une spectrométrie de masse à haute résolution, avec l’analyseur de masse placé en mode ionisation positive. Afin d’évaluer la qualité des données et d’obtenir des informations générales sur les résultats, les données ont été soumises à l’analyse des composants principaux (APC). Comme le montre la figure 1,les échantillons de QC ont formé un groupe serré, confirmant la qualité des analyses. Les groupes étudiés présentent une séparation relativement bonne, permettant la visualisation des différences dans les profils métaboliques et lipidémiques avant et après la transplantation, ainsi que pendant la perfusion d’organes (figure 2). L’échantillonnage de SPME permet le profilage métabolique de l’organe au fil du temps. Les parcelles de moustaches de certaines métabolites servent à illustrer les altérations des niveaux de métabolites tout au long del’expérience( figure 3 ). Le large spectre des entités extraites séparées sur les colonnes RP et HILIC est indiqué à la figure 4.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60946/60946fig01.jpg"> Figure 1 : Analyse principale des composants montrant le regroupement d’échantillons de contrôle de la qualité pour les analyses métabolomiques en phase inversée (A), HILIC (B) et lipidomique (C), HILIC (D). Le contrôle de la qualité est nécessaire dans l’analyse non ciblée pour surveiller les changements possibles induits par l’instabilité instrumentale. Un groupe serré d’échantillons qc assure que tous les changements observés sont d’origine biologique. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60946/60946fig1v2large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60946/60946fig02.jpg"> Figure 2 : Analyse principale des composants montrant des différences métabolomiques (A) et lipidomiques (B) entre des points d’échantillonnage particuliers. Le profilage non ciblé du rein avec SPME-LC-HRMS permet d’observer les différences biochimiques dans les organes à des étapes ultérieures de leur conservation. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60946/60946fig2v2large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60946/60946fig03.jpg"> Figure 3 : Parcelles de moustaches de composés sélectionnés présentant des altérations des métabolites (A, B) et des lipides (C, D) pendant la période péritransplante. Après la sélection et l’identification des parcelles de boîte-moustache de composés discriminants permet de surveiller les changements dans les niveaux de ces composés aux étapes ultérieures du protocole et de comparer les niveaux de métabolites dans les organes soumis à différents protocoles de conservation ou récoltés auprès de différents donneurs, par exemple les donneurs ou les donneurs de battement cardiaque après la mort cardiaque. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60946/60946fig3v2large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60946/60946fig04.jpg"> Figure 4 : Carte des ions (m/z par rapport au temps de rétention) des caractéristiques obtenues par analyse LC-MS avec (A) phase inversée et (B) séparation HILIC. La parcelle permet d’estimer le nombre total de caractéristiques obtenues avec le protocole proposé (de l’extraction à la détection) et d’évaluer la couverture analytique en fonction de la polarité. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60946/60946fig4v2large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>

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Using a Chemical Biopsy for Graft Quality Assessment

Le protocole présente l’utilisation de l’approche de biopsie chimique suivie d’une analyse métabolomique et lipidomique complète pour l’évaluation de la qualité des greffes rénales attribuées à la transplantation.

Utilisation d’une biopsie chimique pour l’évaluation de la qualité de la greffe

Kidney transplantation is a life-saving treatment for a large number of people with end-stage renal dysfunction worldwide. The procedure is associated ...

La biopsie chimique est une nouvelle solution diagnostique dans la transplantation d’organe pour l’évaluation rapide et complexe de qualité de greffe. À l’heure actuelle, il n’existe pas d’autres méthodes peu invasives qui permettent une telle analyse. Le principal avantage de cette technique est la possibilité de surveiller les modifications des tissus greffés au fil du temps de conservation en raison de la simplicité et de la faible invasivité des sondes SPME.Le petit diamètre de la sonde et une grande variété de revêtements biocompatibles rendent cette méthode appropriée pour l’analyse des organes transplantés et applicable dans la recherche médicale telle que l’analyse tumorale. Lorsque vous essayez cette technique pour la première fois prêter attention aux détails et le calendrier des étapes particulières parce que de petites erreurs peuvent fortement influencer les résultats. Le protocole est simple, mais il est plus facile à comprendre et à exécuter après la démonstration visuelle.Commencez par préparer un mélange de condition préalable composé d’un à un méthanol et d’eau. Pipette un millilitre de la solution dans chaque flacon de verre de deux millilitres et placer une sonde dans chaque flacon. Agiter les flacons sur un agitateur vortex à 1200 RPM pendant une heure.Rincez ensuite les sondes à l’eau de qualité LCMS et stérilisez-les selon le protocole de stérilisation chirurgicale standard ou dans le département de traitement stérile. Lorsque vous êtes prêt à extraire l’échantillon, ouvrez l’emballage stérile et insérez deux sondes directement dans le cortex rénal pendant 10 minutes par point de temps, en vous assurant que toute la longueur du revêtement est couverte par la matrice tissulaire. Assurez-vous de garder une trace de l’heure de l’échantillonnage pour chaque sonde.Rétractez la sonde en la retirant du tissu et rincez immédiatement le revêtement avec de l’eau de qualité LCMS pour enlever le sang restant en s’assurant de rincer loin du site chirurgical. Pour transporter les sondes, placez-les dans des flacons séparés et fermez-les. Placez ensuite les flacons dans une boîte remplie de glace sèche ou d’azote liquide.Conservez les échantillons à 80 degrés Celsius négatifs ou procédez immédiatement à la désorption. Préparer une solution de désorption composée d’acétyl et d’eau pour l’analyse métabolomique et une autre composée d’isopropanol et de méthanol pour l’analyse lipidomique. Ajouter 100 microlitres de la solution aux insertions dans les flacons étiquetés de deux millilitres et placer une sonde dans chaque flacon agiter les flacons à 1200 RPM pendant deux heures, puis retirer les sondes des flacons et procéder à l’analyse LCMS.La chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse à haute résolution a été employée pour effectuer l’analyse métabolomique et lipidomique non ciblé. Les données ont fait l’objet d’une analyse des principaux éléments afin d’évaluer la qualité et d’obtenir des renseignements généraux sur les résultats. Les échantillons de contrôle de la qualité formaient un cluster serré confirmant la qualité de l’analyse.Les groupes étudiés ont montré la séparation relativement bonne, permettant la visualisation des différences dans les profils métaboliques et lipidomiques avant et après la transplantation aussi bien que pendant la perfusion d’organe. Un large spectre de dispositifs extraits a été séparé sur la phase inversée et les colonnes liquides de chromatographie. Des modifications et des niveaux de métabolite tout au long de l’expérience ont été démontrés avec des parcelles de moustaches boîte des métabolites sélectionnés.Lors de l’exécution de cette procédure, gardez à l’esprit l’hétérogénéité des organes. Placez la sonde à l’endroit désiré gardez le temps de l’échantillonnage identique à tous les points de temps, et fixez la fibre correctement après l’échantillonnage. Les biomarqueurs découverts avec spme peuvent être quantifiés à l’aide de cette méthode d’extraction couplée à MSMS, LCMS ou d’autres instruments analytiques.De plus, comme aucun échantillon n’est consommé, une analyse de routine comme une biopsie peut être effectuée. La méthode peut être adaptée pour d’autres analyses métabolomiques et lipidomiques de tissu sans nécessité pour le prétraitement d’échantillon. Pour des métabolites spécifiques.D’autres revêtements peuvent être utilisés pour augmenter la sélectivité et la sensibilité de l’essai.

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