Name: using a chemical biopsy for graft quality assessment
Uploaded: 2020-06-17T13:30:00
Duration: 5 min
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using a Chemical Biopsy for Graft Quality Assessment at JoVE.com

המחקר נתמך על ידי מענק אופוס UMO-2017/27/B/NZ5/01013 ממרכז המדע הלאומי. המחברים רוצים להכיר MilliporeSigma, עסק של Merck KGaA, דרמשטט, גרמניה לאספקת מכשירי SPME. עסקי מדעי החיים של מרק פועלים כמיליפור סיגמה בארה"ב ובקנדה. כמו כן, המחברים רוצים להודות לתרמו פישר סיינטיפיק על הגישה לספקטרומטר מסה של Q-Exactive Focus. המחברים רוצים להודות ד"ר אלכסנדרה Woderska-Jasińska ואנשי המחלקה להשתלות ו Surgery כללי ב Bydgoszcz על עזרתם האדיבבפרויקט. BB רוצה להודות לפרופ' יאנוס פוליזמן על ההזדמנות של איסוף דגימות בבית החולים הכללי של טורונטו במהלך שהותה באוניברסיטת ווטרלו.

כל בעלי החיים קיבלו טיפול הוומני בהתאם ל'עקרונות הטיפול בבעלי חיים במעבדה', שנוסחו על ידי האגודה הלאומית למחקר רפואי ו'המדריך לטיפול בחיות מעבדה', שפורסם על ידי המכון הלאומי לבריאות, אונטריו, קנדה. ועדת הטיפול בבעלי חיים של מכון המחקר הכללי של טורונטו אישרה את כל המחקרים. המחקר כלל נושאים אנושיים אושר על ידי הוועדה הביואתית בקולגיום מדיקום באוניברסיטת בידגוז'ץ' ניקולאוס קופרניקוס בטוריון.
הערה: קבל אישור מלוחות אתיים מתאימים. זכור תמיד ללבוש כפפות בטיחות. אל תיגע בשלב החילוץ של בדיקות SPME. השימוש בקבוקונים זכוכית מנוטרלים מומלץ לניתוחים ליפידומיים.
1. הכנת גששים
<ol><li>הכן בדיקות סגסוגת טיטניום ניקל (אורך 40 מ"מ; קוטר 0.2 מ"מ) מצופה סורבנט במצב ערבוב של 7 מ"מ. מספר הבדיקות תלוי בנקודות הזמן המיועדות במהלך ההליך כולו ובמספר השכפולים (3 מומלץ לכל נקודת זמן). הערה: ניתן להתאים את האורך והסוג של שלב החילוץ בהתבסס על מצב המחקר, הקוטביות של מטבוליטים ומטריצת הדגימה.</li>
	<li>להכין תערובת ניקוי המורכבת 2:1 כלורופורם:מתנול (v /v). Pipet 1.0 מ"ל של הפתרון לכל בקבוקון זכוכית 2.0 מ"ל ולהניח בדיקה אחת, בעבר פירסינג דרך הכובע, בכל בקבוקון. הערה: לפני השימוש, נקה את כל הגששים כדי להסיר חלקיקים מזהמים.</li>
	<li>שים את הבקבוקונים על המסית וקבעו את מהירות התסיסה ל-1,200 סל"ד. לאחר 45 דקות, הפסק את ההתקן ושטוף את הציפויים במים באיכות LC-MS.</li>
	<li>כמו ציפויים חייבים לעבור שלב תנאי מראש כדי להפעיל אותם, להכין תערובת תנאי מראש מורכב 1:1 מתנול:מים (v / v). Pipet 1.0 מ"ל של הפתרון לכל בקבוקון זכוכית 2.0 מ"ל ולהניח בדיקה אחת, בעבר פירסינג דרך הכובע, בכל בקבוקון.</li>
	<li>שים את הבקבוקונים על מסית המערבולת וקבעו את מהירות התסיסה ל-1,200 סל"ד.</li>
	<li>לאחר 60 דקות, עצרו את המסית ושטו את הציפויים במים באיכות LC-MS.</li>
	<li>לחטא גששים על פי פרוטוקול עיקור ציוד כירורגי סטנדרטי.</li>
</ol>2. חילוץ
<ol><li>פתח את החבילה הסטרילית ממש לפני הדגימה כדי להבטיח סביבה סטרילית.</li>
	<li>הכנס שתי בדיקות ישירות לתוך קליפת הכליה במשך 10 דקות בכל נקודת זמן. כל אורך הציפוי חייב להיות מכוסה על ידי מטריצת הרקמות; אין צורך בזווית ספציפית, אך בדרך כלל נעשה שימוש ב- 90 deg. הערה: ההליך הרפואי כולו פועל על פי פרוטוקולים סטנדרטיים במוסד נתון. לא נשקל שינוי בנוגע לדגימת SPME. ההליך כולל את שש נקודות זמן הדגימה הבאות: א) לפני ניתוח כליה, ב-vivo מהתורם; ב)-ה) לאחר שעה אחת, 3 שעות, 5 שעות, 7 שעות של עירוי כליה, אקס ויו בתא איברים; ו) לאחר התברה מחדש, ב vivo מן הנמען.</li>
	<li>משוך את הגששים על ידי משיכתו מהרקמות ולאחר מכן לשטוף ציפויים עם מים כיתה LC-MS כדי לנקות את כל הדם שנותר מפני השטח ציפוי. לשטוף הרחק מהאתר הכירורגי, ומיד לאחר הסרת הגששים.</li>
</ol>3. תחבורה ואחסון
<ol><li>מניחים גששים בקבוקונים נפרדים וסוגרים אותם.</li>
	<li>מניחים בקבוקונים בקופסת קלקר מלאה בקרח יבש או בחנקן נוזלי להובלה.</li>
	<li>אחסן דגימות במקפיא (-80°C), או החל באופן מיידי בשלב ההסתה.</li>
</ol>4. דסת-ספיגה
<ol><li>הכן פתרונות desorption מורכב 80:20 acetonitrile:water (v/v) לניתוח מטבולומי, ו 1:1 isopropanol:מתנול (v / v) לניתוח ליפידומי.</li>
	<li>Pipet 100 μL של הפתרון להכנסות ממוקם לתוך בקבוקונים 2.0 מ"ל מסומן ולהניח בדיקה אחת, בעבר פירסינג דרך הכובע, בכל בקבוקון.</li>
	<li>מניחים את הבקבוקונים על מסית המערבולת והגדירו את מהירות התסיסה על 1,200 סל"ד למשך 120 דקות.</li>
	<li>הסר גששים מהתנונים. תמציות שהושגו מוכנות כעת לניתוח אינסטרומנטלי.</li>
</ol>5. ניתוח LC-MS
<ol><li>מקם בקבוקונים המכילים תמציות בהמסאמפלר האוטומטי של מערכת LC-MS. הערה: כרומטוגרפיה נוזלית (RP, HILIC) יחד עם ספקטרומטריה מסה ברזולוציה גבוהה ומנתח מסה orbitrap שימשו למחקר זה. לקבלת פרמטרים של ניתוח מטבולומי, עבור לשלב 5.2. לקבלת פרמטרים לניתוח ליפידומי, עבור לשלב 5.6.</li>
	<li>השתמש בעמודת pentafluorophenyl (PFP) (2.1 מ"מ x 100 מ"מ, 3 μm) להפרדת פאזה הפוכה.<ol>
<li>הגדר את קצב הזרימה ל- 300 μL/min, וטמפרטורות של שאמפלר אוטומטי ועמודות ל- 4°C ו- 25°C, בהתאמה.</li>
		<li>הכן שלבים ניידים לפי הפרופורציות הבאות: שלב א' נייד: מים:חומצה פרמית (99.9:0.1, v/v) ושלב ב' נייד: חומצה אצטוניטרית:חומצה פרמית (99.9:0.1, v/v). הגדר את זרימת שלב הנייד לפי הפרמטרים הבאים: התחלת זרימת שלב נייד (0-3 דקות): 100% A ואחריו מעבר צבע ליניארי ל- 10% A (3-25 דקות), סיום עם זרימה איסטוקרטית של 10% A עד 34 דקות, ולאחר מכן 6 דקות של זמן שיווי משקל מחדש של עמודה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>להפרדת HILIC, השתמש בעמודה HILIC (2.0 מ"מ x 100 מ"מ, 3 μm, 200A). הגדר את קצב הזרימה ל- 400 μL/min.<ol>
<li>הכנת שלבים ניידים לפי הפרופורציות הבאות: שלב א': אצטוניטריל:אמניום אצטט מאגר (9:1, v/v, ריכוז מלח יעיל 20 מ"מ), נייד שלב ב': אצטוניטריל:אמניום אצטט מאגר (1:1, v/v, ריכוז מלח יעיל 20 מ"ר).</li>
		<li>הגדר את זרימת שלב הנייד בהתאם לפרמטרים הבאים: הפעלת זרימת שלב נייד (0-3 דקות) ב- 100% A, החזק למשך 3.0 דקות ולאחר מכן רמפה ל- 100% B בתוך 5 דקות. החזק עם 100% B עד 12 דקות, ואחריו 8 דקות של זמן שיווי משקל מחדש של עמודה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הגדר את טווח הסריקה ל- 85-1000 מ"ל/z. הגדר את פרמטרי מקור היונים HESI במצב ניוון חיובי ל: מתח ספריי 1,500 V, טמפרטורת נימי 300 °C, גז נדן 40 a.u., aux גז זרימת קצב 15 a.u., טמפרטורת דוד בדיקה 300 °C, S-עדשה RF רמה 55%.</li>
	<li>הפעל דגימות QC המורכבות מ-10 μL של כל מדגם מנותח (באופן קבוע, כל 10-12 דגימות) כדי לפקח על ביצועי המכשיר.</li>
	<li>להפרדת פאזה הפוכה, השתמש בעמודת C18 (2.1 מ"מ x 75 מ"מ, 3.5 μm).<ol>
<li>הגדר את קצב הזרימה ל- 200 μL/min, וטמפרטורות של שאמפלר אוטומטי ועמודות ל- 4°C ו- 55°C, בהתאמה. הכן שלבים ניידים לפי הפרופורציות הבאות: שלב A נייד: H2O:MeOH (60:40, v/v), 10 mM אמוניום אצטט וחומצה אצטית 1 mM; נייד שלב ב': IPA:MeOH (90:10, v/v), 10 mM אמוניום אצטט ו 1 mM חומצה אצטית.</li>
		<li>הגדר את זרימת שלב הנייד לפי הפרמטרים הבאים: 0-1 דקות (20% B), 1-1.5 דקות (20-50% B), 1.5-7.5 דקות (50-70% B), 7.5 דקות 5-13 דקות (70-95% B), 13-17 דקות (95% B), 17-17.1 דקות (95-20% B), 17.1-23 דקות (20%).</li>
	</ol>
</li>
	<li>עבור הפרדת HILIC, השתמש בעמודת HILIC (100 x 2.1 מ"מ, 3 μm).<ol>
<li>הגדר את קצב הזרימה ל- 400 μL/min, וטמפרטורות של מדל אוטומטי ועמודות ל- 4°C ו- 40°C, בהתאמה.</li>
		<li>הכן שלבים ניידים בהתאם לפרופורציות הבאות: שלב A: ACN נייד; נייד שלב ב': 5 mM אמוניום אצטט במים. הגדר את זרימת שלב הנייד לפי הפרמטרים הבאים: 0-2 דקות (96% B), 2-15 דקות (96-80% B), 15-15.1 דקות (80-96% B), 15.1-21 דקות (96% B).</li>
	</ol>
</li>
	<li>הגדר פרמטרים מקור יון HESI במצב ניוון חיובי לרסס מתח 3,500 V, טמפרטורת נימי 275 °C, גז נדן 20 a.u., קצב זרימת גז aux 10 a.u., טמפרטורת דוד בדיקה 300 °C, S-עדשה RF רמה 55%.</li>
	<li>הפעל דגימות QC המורכבות מ-10 μL של כל מדגם מנותח (כל 10-12 דגימות) כדי לפקח על ביצועי המכשיר.</li>
	<li>בצע רכישת נתונים בתוכנה התואמת לכלי.</li>
</ol>6. ניתוח נתונים
<ol><li>בצע עיבוד נתונים, זיהוי putative, וניתוח סטטיסטי באמצעות תוכנה המוקדשת מטבולומיקה לא מנוי וניתוח lipidomics. הערה: ניתן להשיג ניתוח רכיבים עיקריים (PCA) ומזימות שפם קופסאות כדי להמחות את מבנה הנתונים.</li>
</ol>

<ol>
	<li>. Organ Procurement and Transplantation Network Available from: <a target="_blank" href="https://optn.transplant.hrsa.gov">https://optn.transplant.hrsa.gov</a> (2019)</li><li>Branger, P., Undine, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Annual Report 2018/Eurotransplant International Foundation. , (2018).</li><li>Dare, A. J., Pettigrew, G. J., Saeb-Parsy, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preoperative+assessment+of+the+deceased-donor+kidney:+From+macroscopic+appearance+to+molecular+biomarkers.">Preoperative assessment of the deceased-donor kidney: From macroscopic appearance to molecular biomarkers.</a> Transplantation. 97, 797-807 (2014).</li><li>Mueller, T. F., Solez, K., Mas, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+kidney+organ+quality+and+prediction+of+outcome+at+time+of+transplantation.">Assessment of kidney organ quality and prediction of outcome at time of transplantation.</a> Seminars in Immunopathology. 33, 185-199 (2011).</li><li>Xu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipidomics+comparing+DCD+and+DBD+liver+allografts+uncovers+lysophospholipids+elevated+in+recipients+undergoing+early+allograft+dysfunction.">Lipidomics comparing DCD and DBD liver allografts uncovers lysophospholipids elevated in recipients undergoing early allograft dysfunction.</a> Scientific Reports. 5, 1-10 (2015).</li><li>Rao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+lipid+changes+in+acute+kidney+injury+using+SWATH+lipidomics+coupled+with+MALDI+tissue+imaging.">Early lipid changes in acute kidney injury using SWATH lipidomics coupled with MALDI tissue imaging.</a> American Journal of Physiology - Renal Physiology. 310, 1136-1147 (2016).</li><li>Wishart, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolomics:+The+principles+and+potential+applications+to+transplantation.">Metabolomics: The principles and potential applications to transplantation.</a> American Journal of Transplantation. 5, 2814-2820 (2005).</li><li>Kim, S. J., Kim, S. H., Kim, J. H., Hwang, S., Yoo, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+metabolomics+in+biomedical+research.">Understanding metabolomics in biomedical research.</a> Endocrinology and Metabolism. 31, 7-16 (2016).</li><li>Bojko, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solid+phase+microextraction+fills+the+gap+in+tissue+sampling+protocols.">Solid phase microextraction fills the gap in tissue sampling protocols.</a> Analytica Chimica Acta. 803, 75-81 (2013).</li><li>Filipiak, W., Bojko, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SPME+in+clinical,+pharmaceutical,+and+biotechnological+research+-+How+far+are+we+from+daily+practice.">SPME in clinical, pharmaceutical, and biotechnological research - How far are we from daily practice.</a> TrAC - Trends in Analytical Chemistry. , 115-213 (2019).</li><li>Bojko, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+invasive+in+vivo+tissue+sampling+for+monitoring+biomarkers+and+drugs+during+surgery.">Low invasive in vivo tissue sampling for monitoring biomarkers and drugs during surgery.</a> Laboratory Investigation. 94, 586-594 (2014).</li><li>Ahmad, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biopsy+of+the+transplanted+kidney.">Biopsy of the transplanted kidney.</a> Seminars in Interventional Radiology. 21, 275-281 (2004).</li><li>Plattner, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complications+and+adequacy+of+transplant+kidney+biopsies:+A+comparison+of+techniques.">Complications and adequacy of transplant kidney biopsies: A comparison of techniques.</a> Journal of Vascular Access. 19, 291-296 (2018).</li><li>Tapia-Canelas, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complications+associated+with+renal+graft+biopsy+in+transplant+patients.">Complications associated with renal graft biopsy in transplant patients.</a> Nefrologia. 34, 115-119 (2014).</li><li>Afshinnia, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipidomics+and+Biomarker+Discovery+in+Kidney+Disease.">Lipidomics and Biomarker Discovery in Kidney Disease.</a> Seminars in Nephrology. 38, 127-141 (2018).</li><li>Zhao, Y. Y., Vaziri, N. D., Lin, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipidomics:+New+insight+into+kidney+disease.">Lipidomics: New insight into kidney disease.</a> Advances in Clinical Chemistry. 68, 153-175 (2015).</li><li>Kaminski, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+Consumption+by+Warm+Ischemia-Injured+Porcine+Kidneys+in+Hypothermic+Static+and+Machine+Preservation.">Oxygen Consumption by Warm Ischemia-Injured Porcine Kidneys in Hypothermic Static and Machine Preservation.</a> Journal of Surgical Research. 242, 78-86 (2019).</li><li>Wijermars, L. G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+postreperfusion+metabolic+recovery+directly+associates+with+incident+delayed+graft+function.">Defective postreperfusion metabolic recovery directly associates with incident delayed graft function.</a> Kidney International. 90, 181-191 (2016).</li><li>Huang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteo-metabolomics+reveals+compensation+between+ischemic+and+non-injured+contralateral+kidneys+after+reperfusion.">Proteo-metabolomics reveals compensation between ischemic and non-injured contralateral kidneys after reperfusion.</a> Scientific Reports. 8, 1-12 (2018).</li><li>Solati, Z., Edel, A. L., Shang, Y., Karmin, O., Ravandi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidized+phosphatidylcholines+are+produced+in+renal+ischemia+reperfusion+injury.">Oxidized phosphatidylcholines are produced in renal ischemia reperfusion injury.</a> PLoS One. 13, 1-24 (2018).</li><li>Wishart, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolomics+in+monitoring+kidney+transplants.">Metabolomics in monitoring kidney transplants.</a> Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 15, 637-642 (2006).</li><li>Abbiss, H., Maker, G. L., Trengove, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolomics+approaches+for+the+diagnosis+and+understanding+of+kidney+diseases.">Metabolomics approaches for the diagnosis and understanding of kidney diseases.</a> Metabolites. 9, (2019).</li><li>Zhang, Z. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolomics+insights+into+chronic+kidney+disease+and+modulatory+effect+of+rhubarb+against+tubulointerstitial+fibrosis.">Metabolomics insights into chronic kidney disease and modulatory effect of rhubarb against tubulointerstitial fibrosis.</a> Scientific Reports. 5, 1-17 (2015).</li><li>Looby, N. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solid+phase+microextraction+coupled+to+mass+spectrometry:+Via+a+microfluidic+open+interface+for+rapid+therapeutic+drug+monitoring.">Solid phase microextraction coupled to mass spectrometry: Via a microfluidic open interface for rapid therapeutic drug monitoring.</a> Analyst. 144, 3721-3728 (2019).</li><li>G&#243;mez-R&#237;os, G. A., Tascon, M., Pawliszyn, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coated+blade+spray:+Shifting+the+paradigm+of+direct+sample+introduction+to+MS.">Coated blade spray: Shifting the paradigm of direct sample introduction to MS.</a> Bioanalysis. 10, 257-271 (2018).</li></ol>

המחברים רוצים להכיר MilliporeSigma (מרק KGaA, דרמשטט, גרמניה) לאספקת מכשירי SPME תרמו פישר מדעי לגישה ספקטרומטר מסה Q-Exactive Focus Orbitrap.

הערכת איכות האיברים נותרה אתגר גדול עבור רופאים, שחייבים לקבל החלטות מושכלות מהירות לגבי האם איבר נתון הוא בר קיימא להשתלה או אם יש להשליך אותו. גורמים רבים, כגון גיל התורם, משך האיסכמיה, זיהומים ותהליכים דלקתיים, יכולים להשפיע על התוצאה השתל לטווח ארוך. בעוד שיטות מגוונות פותחו עד כה כדי לאבחן תפקוד allograft כליה, בדיקה היסטופתולוגית נשאר תקן הזהבבעניין זה 3,,4,,12. למרות הליך הביופסיה יכול להניב מידע משמעותי לגבי מחלת תורם קיימת מראש ושינויים בכלי הדם, זה לא ללא פגמים. שגיאות דגימה הקשורות השתנות interobserver ותמדה של glomeruli מספיק למידע מקיף לגבי תפקוד איברים להישאר חששות אופייניים בהקשר זה. יתר על כן, הכנת דגימה מביאה כמה בעיות כגון אודם לא שלם של השתל במקרה של חלקים קפואים, והארכת זמן הליך עבור פרפין קטעים. עם זאת, הסיכון המוגבר לדימום, אשר עשוי להיראות באופן חריף כמו hematuria מיקרוסקופי או ברוטו, הוא הסיבוך מסכן חיים העיקרי הקשורים הליך הביופסיה. מסיבה זו, מספר הביופסיות הניתנות מוגבל אך ורק בהליכי השתלה, גורם הפוגע בלכידת שינויים דינמיים וניתוחי סדרות זמןבשיטה זו 12,13,14. היתרונות של ניתוח היסטולוגי יש לשקול נגד הסיכונים הקשורים המתודולוגיה. הערך של ממצאים היסטולוגיים הוא ללא עוררין, אבל הם לא מסבירים את המנגנונים המולקולריים של ההתפכחות.
מטבולומיקה וליפידומיקה הם התחומים הצעירים ביותר של המשפחה המדעית "-omics". הסט המלא של מטבוליטים ושומנים אנושיים מולקולריים נמוכים (<1,200 Da) ושומנים המחוברים בתוך רשת מטבולית מוגדר כמטבולום אנושי. הגנום נשאר קבוע יחסית לאורך כל חייו, עם שינויים קלים הנגרמים על ידי מוטציות המתרחשות לעתים רחוקות. חילוף החומרים הוא תוצר של ביטוי גנים, אשר רגיש מאוד לשינויים בכל התהליכים הביולוגיים, כמו גם גורמים סביבתיים. האופי הדינמי של מטבוליטים ושומנים הופך אותם אינדיקטורים מושלמים שלמצב איבר הנוכחי 7,,8,,15,,16. שיטת SPME המוצעת בפרוטוקול הנ"ל מאפשרת זיהוי של שינויים המתרחשים באיבר במהלך שימורו, החל מהסרת איברים מגופו של התורם ועד לשיפוץ אצל המטופל. הקוטר הקטן של הגשוש (~ 200 μm) מספק פולשניות מינימלית ומאפשר מספר דגימות מאותו איבר מבלי לגרום נזק לרקמות. ביצוע מחקרים באמצעות כליה, כמו האיבר המושתל בתדירות הגבוהה ביותר, מאפשר הבנה טובה יותר ואפיון נוסף של המסלולים חילוף החומרים האחראים לירידה באיכות ותפקוד של שתלים. האפשרות של ניטור שינויים לאורך זמן בהחלט הוא יתרון חשוב של הטכניקה לעומת שיטות פולשניות קונבנציונליות כגון ביופסיה. הניתוח שהוצג כעת זיהה ריכוזים משתנים של קבוצות שונות של שומנים ומטבוליטים, במיוחד של חומצות אמינו חיוניות, purines, נוקלאוזידים purine, ו גליצרופוספוליפידים. תוצאות אלה עולות בקנה אחד עם דוחות ניתוחרקמות קודמים 5,6,17,18,19,20. עד כה, רוב הדיווחים המדעיים ניצול מטבולומיקה או lipidomics כדי להסביר תהליכים המביאים סיבוכים לאחר השתלה או איסכמיה / פגיעה reperfusion (IRI) תופעות הוגבלו לניתוח של נוזליםביולוגיים 21,22,23.
כל יישום קליני דורש אופטימיזציה של פרוטוקול הדגימה כדי להבטיח שביצועי השיטה האנליטית עומדים בקריטריונים הצפויים. בהקשר זה, היתרון של ניצול SPME היא האפשרות של התאמת תנאים עבור עיצובים ניסיוניים שונים. מגוון שלבי החילוץ הנגישים מספק קשת רחבה של מטבוליטים שחולצו עם קוטביות מגוונת. במקביל, הדבר עשוי להיחשב כמגבלה של השיטה בשל העובדה שכל סורבנט מספק תסכולת כלפי תכונות ספציפיות ואינו לחלץ את כל התרכובות הנוכחיות במטריצת הדגימה. יש לצוין כי ציפויי SPME לחלץ רק באמצעות מולקולות חינם, ופשוט לא אינטראקציה עם שבר מאוגד של analyte. תאימות ביולוגית של הציפויים אינה מציגה רעילות לרקמה תוך ריסון החילוץ של מולקולות גדולות כגון חלבונים; כתוצאה מכך, התהליכים האנזימטיים מעוכבים כבר בשלב של איסוף מדגם והנוכחות של חפצים ממוזערת, וזה יתרון גדול על פני שיטות דגימה חלופיות. אורך הציפוי משפיע על יעילות החילוץ (כלומר, אורך הציפוי מייעד את שטח הפנים ואת נפח שלב החילוץ); לכן, ציפויים ארוכים יותר מניבים התאוששות גבוהה יותר. מצד שני, ציפויים קצרים יותר מאפשרים רזולוציה מרחבית גבוהה יותר. לקבלת תוצאות אמינות, זה חיוני להשיג את הגשוש בדיוק באותו עומק של קליפת הכליה. הכנסה עמוקה מדי גורמת לסיכון של כניסה מדיולה הכליה. זמן החילוץ הוא גם פרופורציונלי ליעילות החילוץ. לכן, בחירת זמן חילוץ אופטימלי הוא אחד השלבים הקריטיים ביותר בפיתוח שיטת SPME. הדיוק של מדידת הזמן מספק את יכולת החזור הגבוהה ביותר. ביישומים ביולוגיים כמו זה שנדון, תמיד קיימת פשרה בין הרגישות והחזרה של הפרוטוקול האנליטי לבין ההגבלות של ההליך הרפואי. בעוד חילוץ שיווי משקל מספק את הרגישות הגבוהה ביותר, מטעמי בטיחות, תנאים טרום שיווי משקל משמשים לעתים קרובות ביישומים כאלה, כמו זמן החילוץ לא צריך להשפיע על משך הזמן הכולל של הניתוח. יעילות ההסתננות נקבעת לפי זמן התהליך והרכב ממס ההסתה, שאמור להיות תואם לשלב הנייד המשמש להפרדהכרומטוגרפית 9,,10,,11.
אחת הדרישות העיקריות עבור מכשור אבחון המשמש להערכות פנים כירורגיות היא זמן הניתוח. הניסיונות הנוכחיים נעשות לפתח כלי מהיר עבור חילוץ VIVO SPME בשילוב ישיר ספקטרומטר מסה באמצעות ממשק פתוח מיקרופלויד (MOI)24 או ספריי להב מצופה (CBS)25. גישות כאלה יאפשרו גילוי של תוצאות אנליטיות בזמן אמת או קרוב לזמן אמת. השימוש בשיטות כאלה לניתוחי התערבות מוקדמת של פרופילים מטבוליים וליפידומיים יכול לשפר את תהליך קבלת ההחלטות במהלך הליכי ההשתלה, ולאפשר את הגישה המותאמת אישית הטובה ביותר האפשרית ותגובה מהירה במקרה של כשל איברים.
כסיכום, הוא שיער כי הפרוטוקול המוצע יאפשר השגת פרופילים מטבוליים וליפידומיים מלאים של שתלי כליות, אשר בתורו יספק הערכה מקיפה של איכות האיברים ואפיון של התהליכים האחראים על פגיעה איסכמיה-reperfusion. החידוש של הפרויקט כולל ניצול של מיקרו-אקסטרציה בשלב מוצק (SPME), המציע דגימה פולשנית נמוכה של מערכות חיים, בשילוב עם אחת הטכנולוגיות החדשניות ביותר הזמינות לניתוח מטבולומיקה ולליפידומיקה (לדוגמה, ספקטרומטר מסה ברזולוציה גבוהה Orbitrap). SPME משלב איסוף דגימה, חילוץ, והתרוות של מטבוליטים בשלב אחד, ולכן מה שהופך אותו לכלי מושלם לניתוח מהיר. זה צפוי כי פרוטוקול זה יעזור לענות על שאלות הקשורות אילו תנאי טרום השתלה של הכליה אחראים לתפקוד איברים מושהה או תפקוד לקוי שלה לאחר ההשתלה, כמו גם איך פרוטוקול שימור השתל משפיע על הביוכימיה של האיבר. ידע כזה לא רק תהיה השפעה משמעותית על מניעת סיבוכים אפשריים הקשורים להשתלה, אבל עשוי לעזור לשפר את פרוטוקולי שימור השתל הנוכחי, מזעור אובדן של רקמת השתלה בת קיימא, כמו גם אובדן חיים. הפתרון המוצע יפתח את הדלת לחקירות נוספות בתחום זה, לרבות אימות סמנים ביולוגיים פוטנציאליים ספציפיים ושיפור התוצאות הטיפוליות בהשתלות.

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/t/60946/using-a-chemical-biopsy-for-graft-quality-assessment">Using a Chemical Biopsy for Graft Quality Assessment</a>. One of the affiliations was&#160;updated.
The third affiliation was&#160;updated from:
Department of Transplantation and General Surgery, University Hospital, University of Nicolaus Copernicus Torun&#34;
to:
Department of Transplantology and General Surgery, Collegium Medicum in Bydgoszcz, Antoni Jurasz University Hospital No. 1 in Bydgoszcz, Nicolaus Copernicus University in Torun, Bydgoszcz, Poland

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/t/60946/using-a-chemical-biopsy-for-graft-quality-assessment">Using a Chemical Biopsy for Graft Quality Assessment</a>. One of the affiliations was&#160;updated.

Erratum: Using a Chemical Biopsy for Graft Quality Assessment

לפי רשת רכש האיברים וההשתלות של ארה"ב, ב-2019 היו 94,756 חולים שחיכו להשתלת כליה בארה"ב; בעוד באירופה ב-2018 המספר הזה היה 10,791. כל עשר דקות, מישהו מתווסף לרשימת ההמתנה הלאומית להשתלה בארה"ב, וההערכה היא כי 20 אנשים מתים בכל יוםבהמתנה להשתלה 1,,2. השתלת כליה היא טיפול מציל חיים עבור מספר גדול של אנשים הסובלים מתפקוד לקוי של כליות בשלב הסופי ברחבי העולם. ההליך מזוהה עם שיעור הישרדות מוגבר ואיכות חיים גבוהה יותר בהשוואה לדיאליזה קונבנציונלית.
עם זאת, השתלה מתמודדת עם בעיות חמורות רבות, כגון מחסור באיברים או היעדר כלים יעילים להערכת איכות איברים. הפרוטוקולים הסטנדרטיים מוגבלים לבדיקת מראה מאקרוסקופי או לביופסיה פולשנית של רקמות, שאינן מספקות מידע מקיף בנוגע לאיכות השתל. בעוד הערכות חזותיות מאפשר זיהוי של גידולים גלויים לעין, חריגות אנטומיות, או נזק נרחב לשתלים, גישה זו היא סובייקטיבית מאוד, משתנה ביעילותה על פי הניסיון של הצופים. ביופסיה, לעומת זאת, יכולה לספק מידע רב ערך בנוגע להפרעות כליות קיימות מראש, ולכן נחשבת לשיטה של ערך אובייקטיבי ומובע בקביעת תוצאות השתל. עם זאת, הליך הביופסיה אינו חופשי מפגמים; נכון לכך, נכון לסיבוכים פוטנציאליים כגון דימום ו-4-5 שעות נוספות של הכנת מדגם, מה שמאריך משמעותית את זמן האיסכמי הקר. לכן, במיוחד באירופה, השימוש בניתוח רקמות ישיר מוגבל לתורמים קריטריונים מורחבים (ECD) ותורמים לאחר מוות במחזור הדם (DCD)3,,4.
מטבולומיקה וליפידומיקה הוכרו לאחרונה כגישות מבטיחות להשגת הבנה טובה יותר של השינויים במסלולים ביוכימיים המתרחשים במהלך שימור איברים. פרופיל מטבולומי וליפידומי מאפשר ניטור של תגובות מיידיות של המערכת לשינויים סביבתיים פתאומיים הקשורים להסרת איברים עם ההשלכות הבאות: איסכמיה, סטרס חמצוני, או תגובותדלקתיות 5,6,7,8. הכליה היא איבר הקשור במידה רבה עם תהליכים מטבוליים, ולכן מדידות של מטבוליטים וריכוזי שומנים עשויים לאפשר זיהוי של סמנים ביולוגיים באיכות איברים פוטנציאליים ולאפשר תחזיות טובות יותר של תוצאת השתל.
בהתחשב בסיבוכים ובמגבלות הנ"ל הקשורים לשיטות הערכת איכות האיברים הנוכחיות, נדרש פתרון אבחון פחות פולשני להערכת איכות איברים מהירה ומורכבת. מיקרו-extraction שלב מוצק (SPME) עומד בדרישות אלה כשיטה אנליטית פולשנית המאפשרת כיסוי של קשת רחבה של מטבוליטים ושומנים. הטכניקה מבוססת על החדרה של דק (~ 200 μm), תואם ביולוגית, טיטניום ניקל סגסוגת בדיקה מכוסה עם שלב חילוץ סלקטיבי לתוך האיבר שנבדק לזמן קצר. יש להדגיש כי SPME מונעת הפקת חלבון, ולכן מאפשרת עיכוב חילוף החומרים כבר בשלב של איסוף מדגם, שהוא יתרון משמעותי על פני שיטות חלופיות. יתר על כן, מזעור המכשיר מאפשר ביצוע של ניתוחים חוזרים בו זמנית של מבנים מעטים שלהאיבר 9,10,11.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>5330010050</td>
			<td>Mobile phase additive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Alchem</td>
			<td>696-34967-4X2.5L</td>
			<td>HPLC solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium acetate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>5330040050</td>
			<td>Mobile phase additive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BENCHMIXER XL MULTI-TUBE VORTEXER</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>BV1010</td>
			<td>Vortex mixer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caps</td>
			<td>Perlan Technologies</td>
			<td>5183-2076</td>
			<td>Blue scrw tp, pre-slit PTFE/Si spta, 100PK</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1024441000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Discovery HS F5 Supelguard Cartridge, 3 &#956;m, L &#215; I.D. 2 cm &#215; 2.1 mm</td>
			<td>Merck</td>
			<td>567570-U</td>
			<td>HPLC guard column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Discovery HS F5, 2.1 mm x 100 mm, 3 &#956;m</td>
			<td>Merck</td>
			<td>567502-U</td>
			<td>HPLC column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid</td>
			<td>Alchem</td>
			<td>497-94318-50ML</td>
			<td>Mobile phase additive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass vials</td>
			<td>Perlan Technologies</td>
			<td>5182-0714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HILIC Luna 3 &#956;m, 200A, 100 x 2.0 mm</td>
			<td>Shim-Pol</td>
			<td>PHX-00D-4449-B0</td>
			<td>HPLC column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HILIC SecurityGuard Cartridge, 3 &#956;m, 4 x 2.0 mm</td>
			<td>Shim-Pol</td>
			<td>PHX-AJ0-8328</td>
			<td>HPLC guard column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Alchem</td>
			<td>231-AL03262500</td>
			<td>HPLC solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Alchem</td>
			<td>696-34966-4X2.5L</td>
			<td>HPLC solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nano-pure water</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1037281002</td>
			<td>HPLC solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q Exactive Focus hybrid quadrupole-Orbitrap MS</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Q Exactive Focus</td>
			<td>Mass Spectrometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SeQuant ZIC-cHILIC 3&#181;m,100&#197; 100 x 2.1 mm</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1506570001</td>
			<td>HPLC column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SeQuant ZIC-HILIC Guard Kit 20 x 2.1 mm</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1504360001</td>
			<td>HPLC guard column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPME LC fiber probes, mixed mode</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>prototype fibers</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltiMate 3000 HPLC systems</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>UltiMate 3000</td>
			<td>HPLC system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vial inserts (deactivated)</td>
			<td>Perlan Technologies</td>
			<td>5181-8872</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XSelect CSH C18 3.5&#956;m 2.1x75mm</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186005644</td>
			<td>HPLC column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XSelect CSH C18 VanGuard Cartridge 3.5&#956;m, 2.1x5mm</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186007811</td>
			<td>HPLC guard column</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using a chemical biopsy for graft quality assessment

השתלת כליה היא טיפול מציל חיים עבור מספר גדול של אנשים עם תפקוד לקוי של כליות בשלב הסופי ברחבי העולם. ההליך קשור שיעור הישרדות מוגבר ואיכות גבוהה יותר של חייו של המטופל בהשוואה לדיאליזה קונבנציונלית. למרבה הצער, השתלות סובלות מחוסר שיטות אמינות להערכת איכות איברים. טכניקות אבחון סטנדרטיות מוגבלות לבדיקת מראה מאקרוסקופי או ביופסיה פולשנית של רקמות, שאינן מספקות מידע מקיף על השתל. הפרוטוקול המוצע נועד להציג מיקרו-extraction שלב מוצק (SPME) כשיטה אנליטית אידיאלית עבור מטבולומיקה מקיפה וניתוח ליפידמי של כל התרכובות המולקולריות הנמוכות הנוכחיות בכליות שהוקצו להשתלה. הגודל הקטן של הגשוש SPME מאפשר ביצועים של ביופסיה כימית, המאפשרת חילוץ של מטבוליטים ישירות מהאיבר ללא כל איסוף רקמות. הפולשניות המינימלית של השיטה מאפשרת ביצוע של מספר ניתוחים לאורך זמן: מיד לאחר קצירת איברים, במהלך שימורה, ומיד לאחר ההתרה מחדש בגוף המטופל. הוא שיער כי השילוב של שיטת דגימה רומן זה עם ספקטרומטר מסה ברזולוציה גבוהה יאפשר אפליה של קבוצה של תרכובות אופייניות שיכול לשמש סמנים ביולוגיים של איכות שתל ואינדיקטורים של התפתחות אפשרית של תפקוד לקוי של איברים.

איסוף לדוגמה בוצע על פי שיטת SPME המתוארת לעיל, באמצעות בדיקות מצופה בשלב חילוץ 7 מ"מ במצב מעורב. הדגימה נערכה ישירות מרקמות השתל (ב vivo לפני ההשתלה), ex vivo בתא כליות לאחר 1 שעות, 3 שעות, 5 שעות, ו 7 שעות של עירוי, ו ב vivo לאחר revascularization במקבל. ניתוחים מטבולומיים וליפידומיים לא מרוסקים בוצעו עם שימוש כרומטוגרפיה נוזלית (RP, HILIC) יחד עם ספקטרומטריה מסה ברזולוציה גבוהה, עם מנתח המסה להגדיר במצב יוניזציה חיובית. כדי להעריך את איכות הנתונים ולהשיג תובנות כלליות לגבי התוצאות, הנתונים היו נתונים לניתוח רכיבים עיקריים (PCA). כפי שמצג באות 1, דגימות QC יצרו אשכול הדוק, המאשר את איכות הניתוחים. הקבוצות הנחקרות מציגות הפרדה טובה יחסית, המאפשרת הדמיה של הבדלים בפרופילים מטבוליים וליפידמיים לפני ואחרי ההשתלה, כמו גם במהלך עירויאיברים (איור 2). דגימת SPME מאפשרת פרופיל חילוף חומרים של האיבר לאורך זמן. חלקות שפם תיבת של מטבוליטים נבחרים משמשים כדי להדגים שינויים ברמות מטבוליט לאורך כל הניסוי (איור 3). הספקטרום הרחב של תכונות שחולצו המופרדות הן בעמודות RP והן בעמודות HILIC מוצג באיון 4.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60946/60946fig01.jpg"> איור 1: ניתוח רכיבים עיקריים המציג קיבוץ באשכולות של דגימות בקרת איכות עבור ניתוחים של שלב מטבולומי הפוך (A), HILIC (B) וליפידומי הפוך-שלב (C), HILIC (D). בקרת האיכות נחוצה בניתוח לא מיואף כדי לעקוב אחר כל שינוי אפשרי הנגרם על ידי חוסר יציבות אינסטרומנטלית. אשכול הדוק של דגימות QC מבטיח כי כל השינויים שנצפו הם ממוצא ביולוגי. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60946/60946fig1v2large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60946/60946fig02.jpg"> איור 2: ניתוח רכיבים עיקריים המציג הבדלים מטבולומיים (A) ולפידומי (B) בין נקודות דגימה מסוימות. פרופיל לא מפולצ של כליה עם SPME-LC-HRMS מאפשר לבחון הבדלים ביוכימיים באיברים בשלבים הבאים של שימורם. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60946/60946fig2v2large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60946/60946fig03.jpg"> איור 3: חלקות של תרכובות נבחרות המציגות שינויים במטבוליטים (A, B) ושומנים (C, D) במהלך תקופת ההשתילה. לאחר בחירה וזיהוי של תרכובות מפלות תיבת-שפם חלקות מאפשר לעקוב אחר שינויים ברמות של תרכובות אלה בשלבים הבאים של הפרוטוקול ולהשוות את רמות מטבוליטים באיברים נתון פרוטוקולי שימור שונים או נקטפו מתורמים שונים למשל לב פועם תורמים או תורמים לאחר מוות לב. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60946/60946fig3v2large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60946/60946fig04.jpg"> איור 4: מפת יון (m/z לעומת זמן שמירה) של תכונות שהושגו על-ידי ניתוח LC-MS עם (A) הפרדת HILIC הפוכה ו- (ב). העלילה מאפשרת להעריך את המספר הכולל של תכונות שהושגו עם הפרוטוקול המוצע (מחילוץ לזיהוי) ולהעריך כיסוי אנליטי בהתבסס על הקוטביות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60946/60946fig4v2large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Using a Chemical Biopsy for Graft Quality Assessment at JoVE.com

Using a Chemical Biopsy for Graft Quality Assessment

הפרוטוקול מציג ניצול של הגישה הביופסיה הכימית ואחריו ניתוח מטבולומי וליפידומי מקיף להערכת איכות של שתלי כליות שהוקצו להשתלה.

שימוש בביופסיה כימית להערכת איכות השתל

Kidney transplantation is a life-saving treatment for a large number of people with end-stage renal dysfunction worldwide. The procedure is associated ...

ביופסיה כימית היא פתרון אבחון חדש בהשתלת איברים להערכת איכות השתל מהירה ומורכבת. נכון לעכשיו, אין שיטות פולשניות נמוכות אחרות הזמינות המאפשרות ניתוח כזה. היתרון העיקרי של טכניקה זו היא האפשרות של ניטור שינויים ברקמת השתל לאורך זמן של שימור בשל הפשטות ואת פולשנות נמוכה של בדיקות SPME.הקוטר הקטן של הגשוש ומגוון גדול של ציפויים תואמי ביולוגית הופכים שיטה זו כמתאימה לניתוח איברים מושתלים וישימה במחקר רפואי כגון ניתוח גידולים. כאשר מנסים טכניקה זו בפעם הראשונה לשים לב לפרטים ותזמון של צעדים מסוימים, כי טעויות קטנות עשויות להשפיע במידה רבה על התוצאות. הפרוטוקול הוא פשוט, אבל קל יותר להבין ולבצע לאחר הדגמה חזותית.התחל על ידי הכנת תערובת תנאי מוקדם המורכב אחד אחד מתנול ומים. פיפטה מיליליטר אחד של הפתרון לתוך כל בקבוקון זכוכית שני מיליליטר ולמקום בדיקה אחת בכל בקבוקון. להתסיס את הבקבוקונים על מסית מערבולת ב 1200 סל"ד במשך שעה אחת.לאחר מכן לשטוף את הבדיקות עם מים כיתה LCMS ולעקר אותם על פי פרוטוקול עיקור כירורגי סטנדרטי או במחלקת עיבוד סטרילי. כאשר מוכן לחלץ את המדגם, לפתוח את האריזה סטרילית ולהכניס שתי בדיקות ישירות לתוך קליפת המוח של הכליה במשך 10 דקות בכל נקודת זמן, לוודא כי כל אורך הציפוי מכוסה על ידי מטריצת הרקמה. הקפד לעקוב אחר זמן הדגימה עבור כל בדיקה.לסגת בדיקה על ידי משיכת אותו מן הרקמה מיד לשטוף את הציפוי עם מים כיתה LCMS כדי להסיר את כל הדם שנותר לוודא לשטוף הרחק מהאתר הכירורגי. כדי להעביר את הבדיקות, למקם אותם בקבוקונים נפרדים ולסגור אותם. לאחר מכן מניחים את הבקבוקונים בקופסה מלאה בקרח יבש או חנקן נוזלי.לאחסן את הדגימות ב 80 מעלות צלזיוס שלילי או מיד להמשיך עם desorption. הכן פתרון desorption מורכב אצטוניטריל ומים לניתוח מטבולומי ועוד מורכב isopropanol ומתנול לניתוח ליפידומי. הוסף 100 microliters של הפתרון כדי להוסיף את שני מיליליטר שכותרתו בקבוקונים ולמקם בדיקה אחת בכל בקבוקון להתסיס את הבקבוקונים ב 1200 סל"ד במשך שעתיים ולאחר מכן להסיר את הבדיקות מן הבקבוקונים ולהמשיך עם ניתוח LCMS.כרומטוגרפיה נוזלית יחד עם ספקטרומטריית מסה ברזולוציה גבוהה שימשה לביצוע ניתוח מטבולומי וליפידמי ללא מים. הנתונים היו נתונים לניתוח רכיבים עיקריים כדי להעריך איכות לבדר תובנות כלליות לגבי התוצאות. דגימות בקרת האיכות יצרו אשכול הדוק המאשר את איכות הניתוח.הקבוצות הנחקרות הציגו הפרדה טובה יחסית, המאפשרת הדמיה של הבדלים בפרופילים מטבוליים וליפידומיים לפני ואחרי ההשתלה, כמו גם במהלך חיסון איברים. קשת רחבה של תכונות שחולצו הופרדו הן בעמודות כרומטוגרפיה הפוכות והן בעמודות כרומטוגרפיה נוזליות. שינויים ורמות מטבוליט לאורך הניסוי הוכחו עם חלקות שפם תיבת של מטבוליטים שנבחרו.בעת ביצוע הליך זה, יש לזכור את ההטרוגניות של האיברים. מניחים את החללית במיקום הרצוי לשמור על זמן הדגימה זהה בכל נקודות הזמן, ולאבטח את הסיב כראוי לאחר הדגימה. סמנים ביולוגיים שהתגלו עם SPME ניתן לכמת באמצעות שיטת מיצוי זו יחד עם MSMS, LCMS או מכשור אנליטי אחר.יתר על כן, מאז אין מדגם נצרך, ניתוח שגרתי כגון ביופסיה יכול להתבצע. השיטה יכולה להיות מותאמת עבור מטבולומיקת רקמות אחרות וניתוח ליפידומיה ללא צורך טיפול מקדים מדגם. עבור מטבוליטים ספציפיים.ציפויים אחרים יכולים לשמש להגברת הבחירה והרגישות של המאמר.

Research

JoVE Journal

Medicine

Mouse Models for Graft Arteriosclerosis

מודלים עכבר לטרשת עורקים שתל

Graft arteriosclerois (GA),  also called allograft vasculopathy, is a pathologic lesion that develops over  months to years in transplanted organs ...

Human Skeletal Muscle Biopsy Procedures Using the Modified Bergstr&#246;m Technique

Human Skeletal Muscle Biopsy Procedures Using the Modified BergstrÃƒÆ’Ã‚Â¶m Technique

נהלי ביופסיה של שריר שלד אנושי באמצעות טכניקת Bergstrom השתנה

The percutaneous biopsy technique enables researchers and clinicians to collect skeletal muscle tissue samples. The technique is safe and highly ...

Substernal Thyroid Biopsy Using Endobronchial Ultrasound-guided Transbronchial Needle Aspiration

Substernal בלוטת התריס הביופסיה באמצעות מחט Transbronchial איפה מודרכת אולטראסאונד Endobronchial

Substernal thyroid goiter (STG) represents about 5.8% of all mediastinal lesions1. There is a wide variation in the published incidence rates due to the ...

Isolation and Immortalization of Patient-derived Cell Lines from Muscle Biopsy for Disease Modeling

בידוד והנצחה של שורות תאים שמקורם בחולה מביופסיה של שריר למחל דוגמנות

The generation of patient-specific cell lines represents an invaluable tool for diagnostic or translational research, and these cells can be collected ...

Preparation and Respirometric Assessment of Mitochondria Isolated from Skeletal Muscle Tissue Obtained by Percutaneous Needle Biopsy

ההכנה וRespirometric הערכה של המיטוכונדריה מבודדת מרקמת שריר שלד מתקבלת על ידי Percutaneous מחט ביופסיה

Respirometric profiling of isolated mitochondria is commonly used to investigate electron transport chain function. We describe a method for obtaining ...

Human Vastus Lateralis Skeletal Muscle Biopsy Using the Weil-Blakesley Conchotome

Human Vastus Lateralis Skeletal Muscle Biopsy Using the Weil-Blakesley Conchotome

בן אנוש<em&gt; Vastus lateralis</em&gt; ביופסיה בשרירי השלד שימוש וייל-בלייסלי Conchotome

Percutaneous muscle biopsy using the Weil-Blakesley conchotome is well established in both clinical and research practice. It is a safe, effective and ...

Vein Interposition Model: A Suitable Model to Study Bypass Graft Patency

וריד ביון דגם: מודל מתאים ללמוד patency מעקף

Bypass grafting is an established treatment method for coronary artery disease. Graft patency continues to be the Achilles heel of saphenous vein grafts. ...

A Technique for Subcutaneous Abdominal Adipose Tissue Biopsy via a Non-diathermy Method

שיטה לביופסיה רקמת השומן התת עורית בטן באמצעות שיטה בלתי-diathermy

Adipose tissue biopsies offer tissue samples that, upon analysis, may provide insightful overviews of mechanisms relating to metabolism and disease. To ...

Synergizing Antegrade Endoscopic with Bridging Vein Harvesting for Improvement of Great Saphenous Vein Graft Quality from the Lower Leg

סינגיזינג אנדוסקופי עם קציר וריד לשיפור איכות השתל וריד הגדול מהרגל התחתונה

Antegrade endoscopic harvesting of autografts for bypass grafting may be an optimal strategy addressing excellent graft quality and reduced post-operative ...

A Rodent Model of The Ross Operation: Syngeneic Pulmonary Artery Graft Implantation in A Systemic Position

מודל מכרסמים של פעולת רוס: השתלת שתל עורק ריאות סינגני במיקום מערכתי

The Ross operation for aortic valve disease has regained new interest due to its outstanding long-term results. Nonetheless, when employed as freestanding ...