Name: using a chemical biopsy for graft quality assessment
Uploaded: 2020-06-17T13:30:00
Duration: 5 min
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この研究は、国立科学センターからの助成金Opus UMO-2017/27/B/NZ5/01013によって支えられた。著者らは、SPMEデバイスを提供するためのメルクKGaA、ダルムシュタット、ドイツのビジネスであるMilliporeSigmaを認めたいと考えています。メルクのライフサイエンス事業は、米国とカナダでミリポアシグマとして事業を展開しています。また、著者らは、Q-Exactive Focus軌道質量分析計へのアクセスに対するサーモフィッシャーサイエンティフィックに感謝したいと考えている。著者らは、アレクサンドラ・ウォデルスカ・ヤシンスカ博士とビドゴシュチの移植・一般外科の職員に対し、このプロジェクトにおける彼らの親切な支援に感謝したいと考えています。BBは、ウォータールー大学滞在中にトロント総合病院でサンプルコレクションを行った機会を得たヤヌシュ・パウリシン教授に感謝したいと考えています。

すべての動物は、カナダのオンタリオ州国立衛生研究所が発表した全米医学研究所と「実験動物のケアガイド」によって策定された「実験動物ケアの原則」に従って人道的ケアを受けました。トロント総合研究所の動物ケア委員会は、すべての研究を承認しました.研究は、人間の被験者は、Torunのビドゴシュチニコラウスコペルニクス大学のコレギウムメディクムの生物倫理委員会によって承認されました.
注: 適切な倫理委員会から承認を得る。常に安全手袋を着用することを忘れないでください。SPMEプローブの抽出段階には触れないでください。非アクティブ化ガラスバイアルの使用は、リピドミック分析に推奨されます。
1. プローブの準備
<ol><li>7 mm の混合モードの吸着剤でコーティングされたチタンニッケル合金プローブ(長さ 40 mm、直径 0.2 mm)を準備します。プローブの数は、手順全体の間に対象となる時間ポイントとレプリケートの回数によって異なります (3 は、時間ポイントあたりに推奨されます)。 注: 抽出フェーズの長さとタイプは、研究のモード、代謝物の極性、およびサンプルマトリックスに基づいて調整できます。</li>
	<li>2:1 クロロホルム:メタノール (v/v) で構成される洗浄混合物を準備します。各2.0 mLガラスバイアルに溶液の1.0mLをピペットし、各バイアルにキャップを通して突き刺さった1つのプローブを配置する。 注:使用前に、汚染粒子を除去するためにすべてのプローブを清掃してください。</li>
	<li>バイアルを攪拌機に置き、攪拌速度を1,200 rpmに設定します。45分後、装置を停止し、LC-MS等級水でコーティングをすすきます。</li>
	<li>コーティングは、それらを活性化するために事前調整ステップを受ける必要がありますので、1:1メタノール:水(v /v)で構成される事前調整混合物を準備します。各2.0 mLガラスバイアルに溶液の1.0mLをピペットし、各バイアルにキャップを通して突き刺さった1つのプローブを配置する。</li>
	<li>バイアルをボルテックス攪拌機に置き、攪拌速度を1,200 rpmに設定します。</li>
	<li>60分後、攪拌機を停止し、LC-MSグレードの水でコーティングをすすきます。</li>
	<li>標準的な外科装置の殺菌の議定書に従って調査を殺菌する。</li>
</ol>2. 抽出
<ol><li>滅菌環境を確保するために、サンプリングの直前に滅菌パッケージを開きます。</li>
	<li>各時点で10分間、腎臓皮質に直接2つのプローブを挿入します。コーティングの全長は、組織マトリックスで覆われなければなりません。特定の角度は必要ありませんが、ca. 90 degは通常使用されます。 注:医療処置全体は、所定の機関の標準プロトコルに従います。SPME サンプリングに関する変更は考慮されません。この手順には、次の 6 つのサンプリング タイム ポイントが含まれます。 a) 腎臓切除の前に, ドナーから生体内; b)-e)1時間後、3時間、5時間、7時間の腎臓灌流、臓器室でのex vivo; f)再灌流後、レシピエントから生体内で。</li>
	<li>プローブを組織から引き出して引き込み、LC-MSグレードの水でコーティングをリンスし、コーティング表面から残りの血液を取り除きます。手術部位から離れ、プローブを除去した直後に洗い流す。</li>
</ol>3. 輸送と保管
<ol><li>プローブを別々のバイアルに入れ、閉じます。</li>
	<li>バイアルをドライアイスで満たされた発泡スチロールボックスに入れるか、液体窒素に入れ、輸送します。</li>
	<li>サンプルを冷凍庫(-80°C)に保存するか、すぐに脱着工程を開始します。</li>
</ol>4. 脱着
<ol><li>メタボロミック分析用の80:20アセトニトリル:水(v/v)、リピドミック分析用のイソプロパノール:メタノール(v/v)で構成される脱離液を準備します。</li>
	<li>2.0 mLに入れてバイアルにラベル付けされた1つのプローブを挿入し、以前にキャップを貫通したプローブを各バイアルに入れる溶液のパイプ100 μL。</li>
	<li>バイアルをボルテックス攪拌機に置き、120分間1,200 rpmで攪拌速度を設定します。</li>
	<li>バイアルからプローブを取り外します。得られた抽出物は、インストゥルメンタル分析の準備が整いました。</li>
</ol>5. LC-MS分析
<ol><li>LC-MSシステムのオートサンプラーに抽出物を含むバイアルを配置します。 注: この研究では、液体クロマトグラフィー(RP、HILIC)と高解像度質量分析と軌道質量分析計を組み合わせたものが使用されました。メタボロミック解析パラメータの場合は、ステップ 5.2 に進みます。リピソミック分析パラメータについては、ステップ5.6に進みます。</li>
	<li>逆相分離にはペンタフルオロフェニル(PFP)カラム(2.1mm x 100 mm、3 μm)を使用します。<ol>
<li>流量を300μL/minに、オートサンプラーとカラム温度をそれぞれ4°Cと25°Cに設定します。</li>
		<li>次の割合に従って移動相を準備します: 移動相 A: 水:ギ酸:ギ酸 (99.9:0.1, v/v), および移動相 B: アセトニトリル: ギ酸 (99.9:0.1, v/v).移動相流を次のパラメータに従って設定します:移動相流を開始する(0-3分):100%Aに続いて線形勾配を10%A(3-25分)、34分まで10%Aのアイソクラティックフローで終わり、続いてカラムの再平衡時間の6分を続ける。</li>
	</ol>
</li>
	<li>HILIC 分離の場合は、HILIC カラム(2.0 mm x 100 mm、3 μm、200A)を使用してください。流量を400 μL/minに設定します。<ol>
<li>次の割合に従って移動相を準備する:移動相A:アセトニトリル:酢酸アンモニウム緩衝液(9:1、v/v、有効塩濃度20mM)、移動相B:アセトニトリル:酢酸アンモニウム緩衝液(1:1、v/v、有効塩濃度20mM)。</li>
		<li>移動相流量を100%Aで開始し、3.0分保持してから5分以内に100%Bにランプを設定します。100%Bで12分まで保持し、続いてカラムの再平衡時間を8分保持します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>スキャン範囲を 85~1000 m/z に設定します。正イオン化モードでHESIイオン源パラメータを設定:スプレー電圧1,500 V、キャピラリー温度300°C、シースガス40 a.u.、auxガス流量15 au、プローブヒーター温度300°C、S-Lens RFレベル55%。</li>
	<li>分析された各サンプル(定期的に、10-12サンプルごと)の10 μLからなるQCサンプルを実行して、計測器の性能を監視します。</li>
	<li>逆相分離の場合は、C18カラム(2.1 mm x 75 mm、3.5 μm)を使用してください。<ol>
<li>流量を200μL/minに、オートサンプラーとカラム温度をそれぞれ4°Cと55°Cに設定します。次の割合に従って移動相を準備する: 移動相 A: H2O:MeOH (60:40, v/v), 10 mM酢酸アンモニウムおよび1 mM酢酸;移動相B:IPA:MeOH(90:10、v/v)、10 mM酢酸アンモニウムおよび1 mM酢酸。</li>
		<li>次のパラメータに従って移動相流を設定する:0-1分(20%B)、1-1.5分(20-50%B)、1.5-7.5分(50-70%B)、7.5-7- 13分(70-95%B)、13-17分(95%B)、17-17.1分(95-20%B)、17.1-23分(20%)。</li>
	</ol>
</li>
	<li>HILIC 分離の場合は、HILIC カラム(100 x 2.1 mm、3 μm)を使用します。<ol>
<li>流量を400μL/minに、オートサンプラーとカラム温度をそれぞれ4°Cと40°Cに設定します。</li>
		<li>次の割合に従って移動相を準備します: 移動相 A: ACN;移動相B:水中の酢酸アンモニウム5m。次のパラメータに従って移動相流を設定します:0-2分(96%B)、2-15分(96-80%B)、15-15.1分(80-96%B)、15.1-21分(96%B)。</li>
	</ol>
</li>
	<li>HESIイオン源パラメータをプラスイオン化モードで設定して、電圧3,500V、キャピラリー温度275°C、シースガス20 a.u、auxガス流量10、プローブヒーター温度300°C、S-Lens RFレベル55%に設定します。</li>
	<li>分析された各サンプル(10~12サンプルごと)の10μLからなるQCサンプルを実行して、計測器の性能を監視します。</li>
	<li>計測器と互換性のあるソフトウェアでデータ収集を行います。</li>
</ol>6. データ分析
<ol><li>非標的メタボロミクスおよびリピドミクス分析専用ソフトウェアを使用して、データ処理、推定識別、統計分析を実行します。 注: 主成分分析 (PCA) と箱ひげ図を取得して、データ構造を視覚化することができます。</li>
</ol>

<ol>
	<li>. Organ Procurement and Transplantation Network Available from: <a target="_blank" href="https://optn.transplant.hrsa.gov">https://optn.transplant.hrsa.gov</a> (2019)</li><li>Branger, P., Undine, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Annual Report 2018/Eurotransplant International Foundation. , (2018).</li><li>Dare, A. J., Pettigrew, G. J., Saeb-Parsy, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preoperative+assessment+of+the+deceased-donor+kidney:+From+macroscopic+appearance+to+molecular+biomarkers.">Preoperative assessment of the deceased-donor kidney: From macroscopic appearance to molecular biomarkers.</a> Transplantation. 97, 797-807 (2014).</li><li>Mueller, T. 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著者らは、SpMEデバイスを提供したミリポアシグマ(メルクKGaA、ダルムシュタット、ドイツ)とサーモフィッシャーサイエンティフィックによるQ-Exactive Focus Orbitrap質量分析計へのアクセスを認めたい。

臓器の質の評価は、特定の臓器が移植に実行可能であるかどうか、またはそれを廃棄しなければならないかどうかについて迅速な情報に基づいた意思決定を行わなければならない医師にとって依然として大きな課題です。ドナーの年齢、虚血の持続時間、感染症および炎症過程などの複数の要因が、長期的な移植片の結果に影響を与える可能性があります。腎臓同種移植機能を診断するためにこれまでにさまざまな方法が開発されてきたが、組織病理学的検査はその問題33、4、124,のゴールドスタンダードであり続けている。生検の手順は、既存のドナー病および血管変化に関する重要な情報を得ることができるが、欠陥がない。臓器機能に関する包括的な情報に対する不十分な糸球体の不十分な観察者間変動およびサンプリングに関連するサンプリング誤差は、この点で典型的な懸念事項のままである。さらに、検体調製は、凍結切片の場合の移植片の不完全な評価、およびパラフィン切片の手順時間の延長などのいくつかの問題をもたらす。しかし、微視的または総血尿として急性に現れる出血のリスクの増加は、生検手順に関連する主要な生命を脅かす合併症である。このため、許容生検の数は移植手順において厳密に制限されており、この方法12、13、14,13,14を介して動的変化および時系列解析のキャプチャを妨げる要因である。組織学的分析の利点は、方法論に関連するリスクと比較検討する必要があります。組織学的知見の価値は論じられませんが、収差の分子メカニズムを説明していません。
メタボロミクスとリピドミクスは、科学ファミリーの最も若い領域です。代謝ネットワーク内で結合された低分子(<1,200 Da)のヒト代謝産物および脂質の完全なセットは、ヒトメタボロームとして定義されます。ゲノムは生涯を通じて比較的一定であり、突然変異によって引き起こされるわずかな改変はまれである。メタボロムは、すべての生物学的プロセスの変化と環境要因に非常に敏感な遺伝子発現の産物です。代謝物と脂質の動的性質は、現在の臓器状態77、8、15、168,15,16の完璧な指標になります。上記のプロトコルで提案されたSPME法は、ドナーの体内からの臓器除去からレシピエントの再血管化まで、その保存中に臓器内で起こる変化の検出を可能にする。プローブの小径(約200μm)は、侵襲性を最小限に抑え、組織に損傷を与えることなく、同じ臓器から数回のサンプリングを可能にします。最も頻繁に移植される臓器として腎臓を用いた研究を行うことで、移植片の質と機能を低下させる代謝経路をよりよく理解し、さらなる特徴付けが可能になる。時間の経過に関する変更を監視する可能性は、バイオプシーなどの従来の侵襲的方法と比較して、この技術の重要な利点です。現在発表されている分析では、脂質および代謝産物の様々なグループ、特に必須アミノ酸、プリン、ヌクレオシド、グリセロリン脂質の変化した濃度を同定した。これらの結果は、以前の組織分析レポート5,6,17,,18,19,20と一致しています。現在までに、メタボロミクスまたはリピドミクスを利用して、移植後の合併症を誘発する過程を説明する科学的報告の大半、または虚血/再灌流傷害(IRI)現象は、生体流体21、22、2322,23の解析に限定されてきた。21
各臨床アプリケーションは、分析方法の性能が期待される基準を満たしていることを確認するために、サンプリングプロトコルの最適化を必要とします。この点に関して、SPMEを利用する利点は、様々な実験計画の条件を調整する可能性である。さまざまなアクセス可能な抽出段階は、多様な極性を有する抽出された代謝産物の広いスペクトルを提供する。同時に、これは、各吸着剤が特定の特徴に対して選択性を提供し、サンプルマトリックスに存在するすべての化合物を抽出しないことにより、方法の制限と考えられる可能性があります。SPMEコーティングは、遊離分子を介してのみ抽出し、単に検体の結合された分画と相互作用しないことに留意すべきである。コーティングの生体適合性は、タンパク質などの大きな分子の抽出を抑制しながら、組織に毒性を導入しません。その結果、酵素プロセスはサンプル収集の段階で既に阻害され、アーティファクトの存在は最小限に抑え、代替サンプリング方法よりも大きな利点です。コーティングの長さは、抽出の効率に影響を与えます(すなわち、コーティングの長さは、表面積と抽出相体積を指定します)。したがって、長いコーティングはより高い回収をもたらす。一方、短いコーティングは、より高い空間分解能を可能にします。信頼性の高い結果を得るためには、プローブを腎臓皮質の全く同じ深さに沈下することが重要です。挿入が深すぎると、腎臓髄質に入るリスクが生じます。抽出の時間も抽出効率に比例する。したがって、最適な抽出時間の選択は、SPME法開発における最も重要なステップの1つです。時間測定の正確さは最も高い反復性を提供する。議論されたような生物学的用途では、分析プロトコルの感度と再現性と医療処置の制限との間には常に妥協点がある。平衡抽出は最高の感度を提供するが、安全上の理由から、抽出時間が手術の全期間に影響を及ぼさないはずなため、平衡状態が多くそのような用途で使用される。脱着の効率は、脱離溶媒のプロセスと組成の時間とによって決定され、クロマトグラフィー分離99、10、1110,に使用される移動相と互換性があるはずである。11
手術内評価に使用される診断機器の主要な要件の1つは、分析の時間です。現在、マイクロ流体開放界面(MOI)24またはコーティングされたブレードスプレー(CBS)25を介して質量分析計に直接結合したin vivo SPME抽出のための迅速なツールを開発25する試みがなされている。このようなアプローチは、分析結果を実際のリアルタイムまたはリアルタイムに近づけて開示することを可能にします。このような代謝およびリピドミックプロファイルの介入前分析のための方法の使用は、移植手順中の意思決定プロセスを強化し、臓器不全の場合に可能な限り最良のパーソナライズされたアプローチと迅速な応答を可能にする可能性がある。
要約すると、提案されたプロトコルは、腎臓移植片の完全な代謝および脂質学的プロファイルの達成を可能にし、その結果、虚血再灌流傷害を引き起こすプロセスの臓器の質と特徴付けの包括的な評価を提供すると仮定される。このプロジェクトの新しい技術には、メタボロミクスおよびリピドミクス分析に利用できる最も革新的な技術(例えば、Orbitrap高解像度質量分析計)と組み合わせて、低侵襲的な生体サンプリングを提供する固相微小抽出(SPME)の利用が含まれます。SPMEは、サンプルの収集、抽出、および代謝物の焼入れを一歩で組み合わせることで、迅速な分析に最適なツールです。このプロトコルは、腎臓の移植前の状態が移植後の臓器機能の遅延やその機能不全の原因であるもの、ならびに移植片保存プロトコルが臓器の生化学にどのような影響を与えるかに関する質問に答えるのに役立つと予想される。このような知識は、移植に関連する合併症の予防に大きな影響を与えるだけでなく、現在の移植片保存プロトコルを改善するのに役立ち、実行可能な移植組織の喪失と生命の喪失を最小限に抑える可能性があります。提案された解決策は、特定の潜在的なバイオマーカーの検証および移植学における治療結果の改善を含む、この分野におけるさらなる調査への扉を開く。

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The third affiliation was&#160;updated from:
Department of Transplantation and General Surgery, University Hospital, University of Nicolaus Copernicus Torun&#34;
to:
Department of Transplantology and General Surgery, Collegium Medicum in Bydgoszcz, Antoni Jurasz University Hospital No. 1 in Bydgoszcz, Nicolaus Copernicus University in Torun, Bydgoszcz, Poland

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/t/60946/using-a-chemical-biopsy-for-graft-quality-assessment">Using a Chemical Biopsy for Graft Quality Assessment</a>. One of the affiliations was&#160;updated.

Erratum: Using a Chemical Biopsy for Graft Quality Assessment

米国の臓器調達・移植ネットワークによると、2019年に米国で腎臓移植を待っている患者は94,756人でした。2018年のヨーロッパでは、その数は10,791でした。10分ごとに、米国の全国移植待ちリストに誰かが加え、1,22の移植を待って毎日20人が死亡すると推定されています。腎臓移植は、世界中で末期腎機能障害に苦しむ多くの人々にとって救命処置です。この手順は、従来の透析と比較して生存率の増加と生活の質の向上に関連付けられている。
しかし、移植は臓器不足や臓器の質評価のための効果的なツールの欠如など、多くの深刻な問題に直面しています。標準的なプロトコルは、移植片の品質に関する包括的な情報を提供しない巨視的外観検査または侵襲的組織生検に限定されています。視覚的評価は、眼に見える腫瘍、解剖学的異常、または移植片への広範な損傷を同定することを可能にするが、このアプローチは非常に主観的であり、観察者の経験に応じて有効性が異なる。一方、生検は、既存の腎障害に関する貴重な情報を提供することができ、したがって、移植片の結果を決定する際に客観的かつ証明された価値の方法であると考えられる。しかし、生検の手順には欠陥がありません。出血などの潜在的な合併症のリスクがあり、さらに4〜5時間のサンプル調製が必要であり、寒い虚血時間を大幅に延長します。したがって、特に欧州では、直接組織分析の使用は、循環死後のドナー(ECD)およびドナー(DCD)3,4の拡張基準に3,4限定される。
メタボロミクスとリピドミクスは、臓器保存中に生化学的経路の変化をよりよく理解するための有望なアプローチとして最近認識されています。メタボロミックおよびリピドミックプロファイリングは、その後の結果、臓器除去に関連する突然の環境変化に対するシステムの即時応答のモニタリングを可能にする:虚血、酸化ストレス、または炎症反応55、6、7、8。6,7,8腎臓は、代謝プロセスに大きく関連する器官であり、したがって、代謝産物および脂質濃度の測定は、潜在的な臓器質バイオマーカーの同定を可能にし、移植片の結果のより良い予測を可能にするかもしれない。
現在の臓器の質評価方法に関連する上記の合併症と制限を考えると、迅速かつ複雑な臓器質評価のためには、より侵襲性の低い診断ソリューションが必要です。固相微小抽出(SPME)は、代謝産物および脂質の広いスペクトルの範囲を可能にする低侵襲分析方法として、これらの要件に準拠しています。この技術は、短時間の間、検査された器官に選択的な抽出段階で覆われた、薄い(〜200 μm)、生体適合性のチタンニッケル合金プローブの挿入に基づいています。SPMEはタンパク質の抽出を妨げ、サンプル採取の段階で既に代謝抑制を可能にし、代替方法よりも大きな利点であることを強調すべきである。さらに、装置の小型化は器官99、10、1110,11の少数の構造の反復および同時分析の実行を可能にする。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>5330010050</td>
			<td>Mobile phase additive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Alchem</td>
			<td>696-34967-4X2.5L</td>
			<td>HPLC solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium acetate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>5330040050</td>
			<td>Mobile phase additive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BENCHMIXER XL MULTI-TUBE VORTEXER</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>BV1010</td>
			<td>Vortex mixer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caps</td>
			<td>Perlan Technologies</td>
			<td>5183-2076</td>
			<td>Blue scrw tp, pre-slit PTFE/Si spta, 100PK</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1024441000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Discovery HS F5 Supelguard Cartridge, 3 &#956;m, L &#215; I.D. 2 cm &#215; 2.1 mm</td>
			<td>Merck</td>
			<td>567570-U</td>
			<td>HPLC guard column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Discovery HS F5, 2.1 mm x 100 mm, 3 &#956;m</td>
			<td>Merck</td>
			<td>567502-U</td>
			<td>HPLC column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid</td>
			<td>Alchem</td>
			<td>497-94318-50ML</td>
			<td>Mobile phase additive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass vials</td>
			<td>Perlan Technologies</td>
			<td>5182-0714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HILIC Luna 3 &#956;m, 200A, 100 x 2.0 mm</td>
			<td>Shim-Pol</td>
			<td>PHX-00D-4449-B0</td>
			<td>HPLC column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HILIC SecurityGuard Cartridge, 3 &#956;m, 4 x 2.0 mm</td>
			<td>Shim-Pol</td>
			<td>PHX-AJ0-8328</td>
			<td>HPLC guard column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Alchem</td>
			<td>231-AL03262500</td>
			<td>HPLC solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Alchem</td>
			<td>696-34966-4X2.5L</td>
			<td>HPLC solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nano-pure water</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1037281002</td>
			<td>HPLC solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q Exactive Focus hybrid quadrupole-Orbitrap MS</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Q Exactive Focus</td>
			<td>Mass Spectrometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SeQuant ZIC-cHILIC 3&#181;m,100&#197; 100 x 2.1 mm</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1506570001</td>
			<td>HPLC column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SeQuant ZIC-HILIC Guard Kit 20 x 2.1 mm</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1504360001</td>
			<td>HPLC guard column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPME LC fiber probes, mixed mode</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>prototype fibers</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltiMate 3000 HPLC systems</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>UltiMate 3000</td>
			<td>HPLC system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vial inserts (deactivated)</td>
			<td>Perlan Technologies</td>
			<td>5181-8872</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XSelect CSH C18 3.5&#956;m 2.1x75mm</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186005644</td>
			<td>HPLC column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XSelect CSH C18 VanGuard Cartridge 3.5&#956;m, 2.1x5mm</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186007811</td>
			<td>HPLC guard column</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using a chemical biopsy for graft quality assessment

腎臓移植は、世界中の末期腎機能障害を持つ多数の人々にとって救命処置です。この手順は、従来の透析と比較して、生存率の増加と患者の寿命の質の向上に関連付けられている。残念ながら、移植学は臓器の質評価のための信頼できる方法の欠如に苦しんでいます。標準的な診断技術は、移植片に関する包括的な情報を提供しない巨視的外観検査または侵襲的組織生検に限定される。提案されたプロトコルは、移植のために割り当てられた腎臓に存在するすべての低分子化合物の包括的なメタボロミクスおよびリピソミクス分析のための理想的な分析方法として固相微小抽出(SPME)を導入することを目的としている。SPMEプローブの小さなサイズは、任意の組織の収集なしで臓器から直接代謝産物の抽出を可能にする化学生検の性能を可能にする。この方法の最小侵襲性は、臓器収穫直後、保存中、およびレシピエントの身体での血管新生直後の、時間の経過とともに複数の分析を実行することを可能にする。この新しいサンプリング法と高解像度の質量分析計の組み合わせにより、移植片の品質の生物学的マーカーや臓器機能障害の発症の可能性を示す指標となる一連の特徴的な化合物の識別が可能になると仮定されています。

サンプル採取は、上記したSPME法に従って行い、7mm混合モード抽出フェーズで被覆されたプローブを用いた。サンプリングは、移植片組織(移植前に生体内)から直接行われ、1時間後に腎臓室でex vivo、3h、5h、および7時間の灌流、およびレシピエントで再血管化した後に生体内で行った。非標的性メタボロミックおよびリピドミック解析は、液体クロマトグラフィー(RP、HILIC)を使用して高分解能質量分析法を用いて行い、質量分析装置を正イオン化モードに設定した。データ品質を評価し、結果に関する一般的な洞察を得るために、データは主成分分析(PCA)に供された。 図1に示すように、QCサンプルは密なクラスタを形成し、分析の質を確認した。研究したグループは比較的良好な分離を示し、移植前後、ならびに臓器灌流中の代謝およびリピドミックプロファイルの差異の可視化を可能にする(図2)。SPMEサンプリングは、時間の経過とともに臓器の代謝プロファイリングを可能にする。選択した代謝産物の箱ひげ図は、実験を通して代謝産物レベルの変化を例示するのに役立つ(図3)。RP と HILIC の両方の列で分離された抽出された特徴の広いスペクトルを 図 4に示します。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60946/60946fig01.jpg"> 図1:メタボロミック逆相(A)、HILIC(B)およびリピドミック逆相(C)、HILIC(D)分析のための品質管理サンプルのクラスタリングを示す主成分分析。インストゥルメンタル不安定性によって起こりうる変化を監視するために、非ターゲット分析では品質管理が必要です。QCサンプルの緊密なクラスターは、観察されたすべての変化が生物学的起源であることを保証します。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60946/60946fig1v2large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60946/60946fig02.jpg"> 図2:特定のサンプリングポイント間のメタボロミック(A)とリピドミック(B)の違いを示す主成分分析。SPME-LC-HRMSを用いた腎臓の非標的プロファイリングは、その保存の後続のステップで臓器の生化学的な違いを観察することを可能にする。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60946/60946fig2v2large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60946/60946fig03.jpg"> 図3:回植期の代謝産物(A、B)および脂質(C,D)の変化を示す選択化合物のボックスウィスカープロット。同定化合物の選択および同定後、ボックスウィスカープロットは、プロトコルの後続のステップでこれらの化合物のレベルの変化を監視し、異なる保存プロトコルを受けた器官の代謝産物レベルを比較したり、心臓死後に心臓拍動ドナーまたはドナーなどの異なるドナーまたはドナーから採取することを可能にする。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60946/60946fig3v2large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60946/60946fig04.jpg"> 図 4: (A) 逆相と (B) HILIC 分離を使用した LC-MS 解析によって得られた特徴のイオンマップ (m/z と保持時間)このプロットは、提案されたプロトコル(抽出から検出まで)で得られた特徴の総数を推定し、極性に基づいて分析対象範囲を評価することを可能にする。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60946/60946fig4v2large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>

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Using a Chemical Biopsy for Graft Quality Assessment

このプロトコルは、化学生検アプローチの利用を示し、移植のために割り当てられた腎臓移植片の品質評価のための包括的なメタボロミックおよびリピドミック分析を行う。

移植質評価のための化学バイオプシーの使用

Kidney transplantation is a life-saving treatment for a large number of people with end-stage renal dysfunction worldwide. The procedure is associated ...

化学バイオプシーは、迅速かつ複雑な移植片の品質評価のための臓器移植における新しい診断ソリューションです。現在、このような分析を可能にする他の低侵襲的な方法はありません。この技術の主な利点は、SPMEプローブの簡便性および低侵襲性による保存の時間をかけて移植片組織の修飾を監視する可能性である。プローブの小径と多種多様な生体適合性コーティングにより、移植臓器の分析に適しており、腫瘍解析などの医学研究に応用できます。このテクニックを初めて試すとき、小さな間違いが結果に大きく影響する可能性があるため、特定のステップの詳細とタイミングに注意を払ってください。プロトコルはシンプルですが、視覚的なデモンストレーションの後に理解し、実行する方が簡単です。まず、1対1のメタノールと水で構成されたプレコンディショニング混合物を準備します。各2ミリリットルガラスバイアルに溶液のピペット1ミリリットル、各バイアルに1プローブを配置します。1200 RPMで1時間、渦の攪拌機でバイアルを攪拌します。次に、LCMSグレードの水でプローブをすすいで、標準的な外科滅菌プロトコルまたは滅菌処理部門に従って滅菌します。サンプルを抽出する準備ができたら、滅菌包装を開き、2つのプローブを1つの時点あたり10分間腎臓皮質に直接挿入し、コーティングの全長が組織マトリックスで覆われていることを確認します。各プローブのサンプリング時間を必ず追跡してください。プローブを組織から引き出して引き込み、すぐにLCMSグレードの水でコーティングを洗い流し、残りの血液を取り除き、外科現場から洗い流してください。プローブを搬送するには、別々のバイアルに入れて閉じます。その後、バイアルをドライアイスまたは液体窒素で満たされた箱に入れます。サンプルをマイナス80°Cで保存するか、すぐに脱着を進めます。メタボロミック分析用のアセトニトリルと水からなる脱離液と、リピドミック分析用イソプロパノールとメタノールから構成される別の脱離溶液を調製します。100マイクロリットルの溶液を加えて、2ミリリットルのバイアルに挿入し、バイアルを1200 RPMで1200 RPMで2時間攪拌して各バイアルにプローブを2時間置き、バイアルからプローブを取り出し、LCMS分析を進めます。液体クロマトグラフィーと高分解能質量分析法を組み合わせることで、非標的性メタボロミックおよびリピドミック解析を行った。データは、結果に関する一般的な洞察を楽しませる品質を評価するために、主要なコンポーネント分析を受けました。品質管理サンプルは、分析の品質を確認するタイトなクラスターを形成しました。研究対象グループは比較的良好な分離を示し、移植前後および臓器灌流中の代謝およびリピドミックプロファイルの違いを可視化することを可能にした。抽出された特徴の広いスペクトルは、逆相と液体クロマトグラフィーカラムの両方で分離された。実験全体を通して変化と代謝産物のレベルは、選択された代謝産物の箱ひげ図で実証された。この手順を実行する際には、臓器の不均一性を念頭に置いてください。プローブを希望の場所に配置すると、すべての時間ポイントでサンプリング時間が同じに保たれ、サンプリング後にファイバを適切に固定します。SPMEで発見されたバイオマーカーは、MSMS、LCMSまたは他の分析機器に結合されたこの抽出方法を使用して定量化することができる。また、試料が消費されないので、生検などのルーチン分析が行える。この方法は、サンプル前処理を必要とせずに、他の組織メタボロミクスおよびリピドミクス分析に適合させることができる。特定の代謝物の場合。他のコーティングは、エッセイの選択性と感度を高めるために使用することができます。

Research

JoVE Journal

Medicine

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