Name: traction force microscopy to study b lymphocyte activation
Uploaded: 2020-07-23T14:45:00
Duration: 9 min 28 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Traction Force Microscopy to Study B Lymphocyte Activation at JoVE.com

Авторы благодарят М. Болджер-Манро за критическое чтение и признают Nikon Imaging Center@CNRS-InstitutCurie и PICT-IBiSA, Институт Кюри, Париж, член Франции-BioImaging национальной исследовательской инфраструктуры, за поддержку в приобретении изображений и Кюри животных фонда. PP была поддержана CNRS. АК и JP были поддержаны Париж Декарт PhD стипендий и Ecole Doctorale FIRE-Программа Беттанкур. Этот проект финансировался за счет грантов PP (ANR-10-JCJC-1504-Immuphy) и AMLD (ANR-PoLyBex-12-BSV3-0014-001, ERC-Strapacemi-GA 243103).

<ol>
	<li>Yuseff, M. -. I., Pierobon, P., Reversat, A., Lennon-Dum&#233;nil, A. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+B+cells+capture,+process+and+present+antigens:+a+crucial+role+for+cell+polarity.">How B cells capture, process and present antigens: a crucial role for cell polarity.</a> Nature Reviews. Immunology. 13 (7), 475-486 (2013).</li><li>Spillane, K. M., Tolar, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+cell+antigen+extraction+is+regulated+by+physical+properties+of+antigen-presenting+cells.">B cell antigen extraction is regulated by physical properties of antigen-presenting cells.</a> The Journal of Cell Biology. 216 (1), 217-230 (2017).</li><li>Shaheen, S., Wan, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrate+stiffness+governs+the+initiation+of+B+cell+activation+by+the+concerted+signaling+of+PKC&#946;+and+focal+adhesion+kinase.">Substrate stiffness governs the initiation of B cell activation by the concerted signaling of PKC&#946; and focal adhesion kinase.</a> eLife. 6, (2017).</li><li>Natkanski, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+cells+use+mechanical+energy+to+discriminate+antigen+affinities.">B cells use mechanical energy to discriminate antigen affinities.</a> Science. 340 (6140), 1587-1590 (2013).</li><li>Wan, Z., Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+activation+of+IgM-+or+isotype-switched+IgG-+and+IgE-BCR+exhibits+distinct+mechanical+force+sensitivity+and+threshold.">The activation of IgM- or isotype-switched IgG- and IgE-BCR exhibits distinct mechanical force sensitivity and threshold.</a> eLife. 4, (2015).</li><li>Kumari, A., Pineau, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actomyosin-driven+force+patterning+controls+endocytosis+at+the+immune+synapse.">Actomyosin-driven force patterning controls endocytosis at the immune synapse.</a> Nature Communications. 10 (1), 2870 (2019).</li><li>Dembo, M., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stresses+at+the+cell-to-substrate+interface+during+locomotion+of+fibroblasts.">Stresses at the cell-to-substrate interface during locomotion of fibroblasts.</a> Biophysical Journal. 76 (4), 2307-2316 (1999).</li><li>Sabass, B., Gardel, M. L., Waterman, C. M., Schwarz, U. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+traction+force+microscopy+based+on+experimental+and+computational+advances.">High resolution traction force microscopy based on experimental and computational advances.</a> Biophysical Journal. 94 (1), 207-220 (2008).</li><li>Schwarz, U. S., Soin&#233;, J. R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+force+microscopy+on+soft+elastic+substrates:+A+guide+to+recent+computational+advances.">Traction force microscopy on soft elastic substrates: A guide to recent computational advances.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1853 (11), 3095-3104 (2015).</li><li>Colin-York, H., Shrestha, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-Resolved+Traction+Force+Microscopy+(STFM).">Super-Resolved Traction Force Microscopy (STFM).</a> Nano Letters. 16 (4), 2633-2638 (2016).</li><li>Stubb, A., Laine, R. F., Guzm&#225;n, C., Henriques, R., Jacquemet, G., Ivaska, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluctuation-Based+Super-Resolution+Traction+Force+Microscopy.">Fluctuation-Based Super-Resolution Traction Force Microscopy.</a> BioRxiv. , (2019).</li><li>Gutierrez, E., Tkachenko, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+refractive+index+silicone+gels+for+simultaneous+total+internal+reflection+fluorescence+and+traction+force+microscopy+of+adherent+cells.">High refractive index silicone gels for simultaneous total internal reflection fluorescence and traction force microscopy of adherent cells.</a> Plos One. 6 (9), 23807 (2011).</li><li>Bergert, M., Lendenmann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+reference+free+traction+force+microscopy.">Confocal reference free traction force microscopy.</a> Nature Communications. 7, 12814 (2016).</li><li>Schoen, I., Hu, W., Klotzsch, E., Vogel, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+cellular+traction+forces+by+micropillar+arrays:+contribution+of+substrate+warping+to+pillar+deflection.">Probing cellular traction forces by micropillar arrays: contribution of substrate warping to pillar deflection.</a> Nano Letters. 10 (5), 1823-1830 (2010).</li><li>Colin-York, H., Fritzsche, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+future+of+traction+force+microscopy.">The future of traction force microscopy.</a> Current Opinion in Biomedical Engineering. 5, 1-5 (2018).</li><li>Feng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanosensing+drives+acuity+of+&#945;&#946;+T-cell+recognition.">Mechanosensing drives acuity of &#945;&#946; T-cell recognition.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (39), 8204-8213 (2017).</li><li>Spillane, K. M., Tolar, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA-Based+Probes+for+Measuring+Mechanical+Forces+in+Cell-Cell+Contacts:+Application+to+B+Cell+Antigen+Extraction+from+Immune+Synapses.">DNA-Based Probes for Measuring Mechanical Forces in Cell-Cell Contacts: Application to B Cell Antigen Extraction from Immune Synapses.</a> Methods in Molecular Biology. 1707, 69-80 (2018).</li><li>Stabley, D. R., Jurchenko, C., Marshall, S. S., Salaita, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+mechanical+tension+across+membrane+receptors+with+a+fluorescent+sensor.">Visualizing mechanical tension across membrane receptors with a fluorescent sensor.</a> Nature Methods. 9 (1), 64-67 (2011).</li><li>Merkel, R., Nassoy, P., Leung, A., Ritchie, K., Evans, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energy+landscapes+of+receptor-ligand+bonds+explored+with+dynamic+force+spectroscopy.">Energy landscapes of receptor-ligand bonds explored with dynamic force spectroscopy.</a> Nature. 397 (6714), 50-53 (1999).</li><li>Hinterdorfer, P., Dufr&#234;ne, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+localization+of+single+molecular+recognition+events+using+atomic+force+microscopy.">Detection and localization of single molecular recognition events using atomic force microscopy.</a> Nature Methods. 3 (5), 347-355 (2006).</li><li>Sawicka, A., Babataheri, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropipette+force+probe+to+quantify+single-cell+force+generation:+application+to+T-cell+activation.">Micropipette force probe to quantify single-cell force generation: application to T-cell activation.</a> Molecular Biology of the Cell. 28 (23), 3229-3239 (2017).</li><li>Desprat, N., Guiroy, A., Asnacios, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microplates-based+rheometer+for+a+single+living+cell.">Microplates-based rheometer for a single living cell.</a> Review of Scientific Instruments. 77 (5), 055111 (2006).</li><li>Labernadie, A., Bouissou, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protrusion+force+microscopy+reveals+oscillatory+force+generation+and+mechanosensing+activity+of+human+macrophage+podosomes.">Protrusion force microscopy reveals oscillatory force generation and mechanosensing activity of human macrophage podosomes.</a> Nature Communications. 5, 5343 (2014).</li><li>Bouissou, A., Proag, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protrusion+force+microscopy:+A+method+to+quantify+forces+developed+by+cell+protrusions.">Protrusion force microscopy: A method to quantify forces developed by cell protrusions.</a> Journal of Visualized Experiments. (136), 57636 (2018).</li><li>Kronenberg, N. M., Liehm, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+imaging+of+cellular+forces+with+high+precision+by+elastic+resonator+interference+stress+microscopy.">Long-term imaging of cellular forces with high precision by elastic resonator interference stress microscopy.</a> Nature Cell Biology. 19 (7), 864-872 (2017).</li><li>Basu, R., Whitlock, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytotoxic+T+cells+use+mechanical+force+to+potentiate+target+cell+killing.">Cytotoxic T cells use mechanical force to potentiate target cell killing.</a> Cell. 165 (1), 100-110 (2016).</li><li>Bufi, N., Saitakis, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Primary+Immune+Cells+Exhibit+Distinct+Mechanical+Properties+that+Are+Modified+by+Inflammation.">Human Primary Immune Cells Exhibit Distinct Mechanical Properties that Are Modified by Inflammation.</a> Biophysical Journal. 108 (9), 2181-2190 (2015).</li><li>Goodnow, C. C., Crosbie, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+immunoglobulin+expression+and+functional+silencing+of+self-reactive+B+lymphocytes+in+transgenic+mice.">Altered immunoglobulin expression and functional silencing of self-reactive B lymphocytes in transgenic mice.</a> Nature. 334 (6184), 676-682 (1988).</li><li>Butler, J. P., Toli&#263;-N&#248;rrelykke, I. M., Fabry, B., Fredberg, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+fields,+moments,+and+strain+energy+that+cells+exert+on+their+surroundings.">Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings.</a> American Journal of Physiology. Cell Physiology. 282 (3), 595-605 (2002).</li><li>. MBPPlab/TFM_v1: Software for Time dependent Traction Force Microscopy Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/MBPPlab/TFM_v1">https://github.com/MBPPlab/TFM_v1</a> (2019)</li><li>Tseng, Q., Duchemin-Pelletier, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+organization+of+the+extracellular+matrix+regulates+cell-cell+junction+positioning.">Spatial organization of the extracellular matrix regulates cell-cell junction positioning.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (5), 1506-1511 (2012).</li><li>. ImageJ plugins by Qingzong TSENG Available from: <a target="_blank" href="https://sites.google.com/site/qingzongtseng/">https://sites.google.com/site/qingzongtseng/</a> (2019)</li><li>Plotnikov, S. V., Sabass, B., Schwarz, U. S., Waterman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+traction+force+microscopy.">High-resolution traction force microscopy.</a> Methods in Cell Biology. 123, 367-394 (2014).</li><li>Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Wang, J., Lin, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+the+origin,+dynamics,+and+function+of+traction+force+in+B+cell+activation.">Profiling the origin, dynamics, and function of traction force in B cell activation.</a> Science Signaling. 11 (542), (2018).</li><li>Hui, K. L., Balagopalan, L., Samelson, L. E., Upadhyaya, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoskeletal+forces+during+signaling+activation+in+Jurkat+T-cells.">Cytoskeletal forces during signaling activation in Jurkat T-cells.</a> Molecular Biology of the Cell. 26 (4), 685-695 (2015).</li><li>Bashour, K. T., Gondarenko, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD28+and+CD3+have+complementary+roles+in+T-cell+traction+forces.">CD28 and CD3 have complementary roles in T-cell traction forces.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (6), 2241-2246 (2014).</li><li>Gardel, M. L., Sabass, B., Ji, L., Danuser, G., Schwarz, U. S., Waterman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+stress+in+focal+adhesions+correlates+biphasically+with+actin+retrograde+flow+speed.">Traction stress in focal adhesions correlates biphasically with actin retrograde flow speed.</a> The Journal of Cell Biology. 183 (6), 999-1005 (2008).</li><li>Stricker, J., Sabass, B., Schwarz, U. S., Gardel, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+traction+force+microscopy+for+micron-sized+focal+adhesions.">Optimization of traction force microscopy for micron-sized focal adhesions.</a> Journal of Physics. Condensed Matter. 22 (19), 194104 (2010).</li></ol>

Авторов нечего раскрывать.

Описанный здесь метод TFM позволяет систематически изучать активные механические возможности В-клеток. В контексте В-клеток это связано со способностью извлекать и интернализировать антиген. По сравнению с другими методами TFM, представленный здесь протокол прост и довольно воспроизводим: жесткость, измеряемая отступом стеклянной микросферы и использованием модели Hertz, составляет от 400 до 600 па. Подобные протоколы успешно используются не только дляВ-клеток 35, но и дляТ-клеток 36. По сравнению с нанопиллярами (также используемымидля Т-лимфоцитов 37)он обеспечивает плоскую однородную поверхность, поэтому результаты легче интерпретировать, так как взаимодействие геля в основном ограничено, чтобы быть касательным к поверхности.
Протокол, который мы описали, дает доступ к spatiotemporal динамике сил, оказываемых клетками В на антиген-представляя субстраты. На пространственном уровне это дает информацию о локализации сил, а в сочетании с флуоресцентной микроскопией позволяет экспериментатору соотносить локальные силы с наличием конкретных молекул (т.е. компонентов цитоскелета или каскада сигнализации BCR). На временном уровне можно интегрировать количество (например, общую энергию или общий стресс), чтобы обеспечить одно значение за точку времени и уменьшить шум. Это позволяет вовремя заслеировать эволюцию силы тяги (рост и плато) и наличие пульсирующих узоров.
Критические экспериментальные аспекты анализа описаны следующим образом. i) Плотность клеток: для проведения правильного анализа клетки должны быть достаточно разделены. Мы считаем, что клетка является анализируемой, если вокруг нее имеется пустая область собственного размера. ii) Трансмиссионные изображения: рекомендуется собрать по крайней мере трансмиссионные изображения клеток во время эксперимента, которые будут использоваться в качестве маски в анализе. iii) Количество бусин на изображении: мы предлагаем анализировать только изображения, где количество бусинок в синапсе составляет от 30 до 200 (т.е. 1-8 бусин/мк2). Более низкая плотность не позволяет обеспечить адекватную реконструкцию перемещения карт. Высокая плотность бисера делает отслеживание отдельных частиц ненадежным. iv) количество бусин должно быть постоянным во время эксперимента; однако колебания могут возникать из-за небольшой изменчивости условий визуализации (особенно в бисере, которые находятся слишком близко друг к другу). Фокус дрейф, если происходит, должны быть исправлены и проблемные кадры должны быть отброшены. v) качество геля: следует отказаться от гелей со слишком большим количеством трещин, изменчивости в распределении бисера или слишком толстых гелей. vi) В зависимости от типа клетки, после повторных воздействий, клетки в поздних точках времени (nogt;300 кадров) могут страдать от фототоксических эффектов. Целесообразно запустить программу на маске, лишенной клеток, в качестве «базовой линии», которую можно сравнить с данными. Это обеспечивает величину уровня шума исключительно из-за экспериментальных условий.
Гели, используемые для измерения силы тяги в классической адгезии позволяют для исследования процессов, которые происходят на фокусной адгезии (актин потоков и набора сигнальных молекул) - точки, гдесилы применяются 38,39. Тем не менее, силы в синапсе не применяются через фокусные спайки. Spatiotemporal картина генерации силы на B-клеток иммунной синапзы не было количественно исследовано с помощью этого метода до недавнего времени. Используя TFM, мы наблюдали в первый раз, сила шаблонирования на В-клеток иммунной синапзы, как это представлено в нашем недавнемисследовании 6, открывая обнадеживающие перспективы в изучении лимфоцитов.
Примечательно, что этот метод использует изображение, взятое до прибытия ячеек на гель в качестве эталонного изображения для силовых вычислений. Обычные протоколы TFM предлагают сделать эталонное изображение в конце эксперимента, после отсоединения ячеек трипсином; это позволяет экспериментатору искать область, богатую клетками. Хотя это возможно и здесь, трипсин является довольно неэффективным при отсоединения В-клеток от антигенного гель, нужно долго ждать отслоения и риск модификации геля и движений (которые делают весь набор данных неэксплуатируемым) выше.
Представленный здесь метод является гибким и может быть применен для изучения влияния других сигналов на иммунную синапсис, поскольку он позволяет прививать другие белки на поверхность геля (например, были протестированы интегрин лиганды и иммуноглобулины) и даже флуоресцентный антиген (см. раздел 4). Кроме того, клетки остаются доступными для экспериментатора для лечения наркомании и местных возмущений. Наконец, метод также совместим с изображениями фиксированных ячеек. Для этих наблюдений рекомендуется сделать гель на крышке, испачкать клетки, приклеить крышку на слайде и только потом добавить монтажные средства и еще одну крышку. Наблюдение будет сделано с гелем на вершине, чтобы избежать деградации изображения через гель.
Возможными подводными камнями являются изменчивость геля в полимеризации и покрытии. Проблемы полимеризации в основном связаны с качеством инициатора/катализатора. Кроме того, гель может надуваться, особенно если не используется сразу после сборки. Эта проблема, кажется, не резко влияет на механические свойства геля, но это может сделать слой шарика недоступным для цели, фактически делая гель бесполезным. Мы рекомендуем готовить дополнительные гели для каждого состояния, когда эта проблема появляется. Там может быть также определенная изменчивость в покрытии, и очень важно иметь свежеотбавленный Сульфо SANPAH.
В заключение мы описали простой, дешевый и воспроизводимый метод измерения сил, оказываемых клетками группы В при иммунологическом синапсе при активации bcR лигандом. Он может быть адаптирован для изучения реакции на другие лиганды и другие виды лимфоцитов (клетки памяти В, Т-клетки и т.д.) с использованием правильного рецептора лиганда.

В-клетки являются антителами, производящими клетки иммунной системы. Чтобы активировать адаптивный иммунный ответ, они сначала приобретают антиген в родной форме (т.е. необработав) через специфический рецептор под названием B-клеточный рецептор (BCR)1. Этот процесс происходит в зоне клеток лимфатического узла В. Даже если некоторые антигены могут достичь В-клетки через лимфатические жидкости, большинство антигенов, особенно с высоким молекулярным весом (Nogt;70 kDa, который является предельным размером для лимфатических трубопроводов) действительно представлены в их родной форме на поверхности антигена, представляя клетки (APC), как правило, подкапсулярный синус макрофаг или фолликулярной дендритической клетки, через лектин или fc. Контакт с этой клеткой приводит к образованию иммунного синапса, при котором BCR оказывает силу на связанные с БТР антигены. Связывание антигена с BCR инициирует сигнализацию BCR, которая может активировать механизмы, генерирующие силу. Эти силы могут иметь важное значение для усиления BCR сигнализации, но также имеют важное значение для В-клеток для извлечения, а затем интернализировать антиген.
Недавние исследования показали, что BCR действительно mechanosensitive2. Например, более жесткие субстраты вызывают повышенную BCR сигнализацию3. Кроме того, сила, генерируемая при иммунном синапсе, тянет на одиночные BCRs, чтобы исследовать его близость к антигену и тем самым обеспечить сродстводискриминации 4. Поэтому интересно исследовать механическую реакцию В-клеток на презентацию антигена и вскрыть этот ответ с точкизрениятипа рецепторов, замешанных (IgG/IgM) 5 , молекул адгезии (интегрин лиганды) или в фармакологических и генетически модифицированных клетках (т.е. замалчивание белка ниже по течению от BCR сигнализации или цитоскелетнойдинамики) 6.
Простым методом наблюдения реакции клетки на субстрат физиологической жесткости и, в то же время, изучение сил, оказываемых на субстрат, является микроскопия силы тяги (TFM). TFM состоит из наблюдения за полем перемещения, производимым клеткой, потянув за эластичный субстрат. Первоначально деформация геля наблюдалась через морщины самого елатомера фазово-контрастноймикроскопией 7, но вставка микроволокной флуоресценции в качестве фидуциальных маркеров позволила лучшее разрешение и с тех пор стала стандартной8. Этот метод был использован для исследования силы тяги, оказываемой приверженцами клеток, тканей и даже органоидов, встроенных в гели. Несколько вариаций TFM былиразработаны 9 в том числе, сочетание с микроскопией суперрезолюции (т.е. STED10 или SRRF11), модификация рефракционного индекса геля, чтобы позволить TIRFмикроскопии 12, заменив бисер нано-печатныхмоделей 13, и с помощью нанопилларов вместоплоской поверхности 14. Полный обзор этих вариаций можно получить см. Колин-йорк и др.15.
В представленном здесь протоколе описывается процедура измерения сил, оказываемых клетками группы В на антигенный субстрат. Эти силы применяются на лигандах (антигене) для их кластеризации, а затем извлечения из антигеносующих субстратов. Мы адаптировали стандартный протокол TFM, чтобы имитировать жесткость физиологических антиген-представляя субстратов, размер и соответствующее покрытие для В-клеток. Этот протокол позволяет изучать несколько клеток одновременно и может быть использован в сочетании с методами флуоресценции микроскопии и химической обработки. Тем не менее, он не направлен на зондирование одной молекулы измерения силы, длякоторых оптические пинцеты 16,молекулярное напряжение зондов 17,18, биомембрана силызондов 19, и атомной микроскопиисилы 20 являются более подходящими методами. По сравнению с другими методами измерения силы одной клетки(например, микропипюты 21 или микроплэты 22) TFM позволяет работать над полной картой сил, оказываемых на синапсе с разрешением 300 нм. Это полезно для выявления пространственно-временных закономерностей в силах, оказываемых на поверхность, и, поскольку гель совместим с конфокальные изображения, соотносить их с набором конкретных белков (например, цитоскелета и сигнальных белков).
Хотя 3D TFM возможен, он не совместим с жесткостью и настройкой, которую мы использовали. Деформации в 3D достижимы другими, более сложнымиустановками,такими как микроскопия силы выступа (AFM, сканирующая деформируемую мембрану, гдеклетки побканы) 23,24 и эластичная микроскопия напряжения интерференциона ресонатора (ERISM, гель, выступающий в качестве резонирует полость для света иподчеркивая деформации субстрата с точностью в несколько нанометров) 25. Хотя эти методы являются весьма перспективными, они еще не были использованы в В-клеток. Другие типы TFM, такие как нанопиллары14, могут быть использованы, чтобы иметь более воспроизводимые субстраты. Однако эта геометрия не приспособлена к мягким клеткам, так как клетка интерпенетатит столбы, что усложняет анализ. Этот подход действительно был использован в Т-клеток для наблюдения за способностью клетки строить структуры вокруг столбов26.
Несмотря на свою простоту, TFM с использованием полиакриламинидных гелей позволяет одновременное наблюдение многих клеток и может быть легко и недорого реализованы в любой лаборатории оснащены скамейке и эпифлуоресценции микроскопа (хотя мы рекомендуем confocal / спиннинг диска).
Чтобы имитировать физиологическую жесткость БТР, мы использовали полиакриламидные гели с жесткостью 500 па27 и функционализировали гель с активировав антигенами. В этом протоколе мы функционализировали поверхность полиакриламинидного геля с лизозимом куриного яйца (HEL). Это позволяет измерять силы, генерируемые стимуляцией БЦР путем вовлечения антигенного связывающего участка. Использование этого антигена и HEL-специфических В-клеток от мышей MD4 обеспечивает относительно равномерное силовое поколение в ответ на антигенную перевязку28. Тем не менее, другие молекулы (такие как анти-IgM для мышей B6) могут быть привиты на гель, но силы, генерируемые в этих случаях может быть более неоднородным и менее интенсивным. Поскольку В-клетки являются небольшими клетками (диаметр 6 мкм), количество бусин было оптимизировано, чтобы быть максимальным, но все еще отслеживается. Для крупных клеток, которые оказывают силы кПа на их субстраты, можно достичь удовлетворительных результатов с помощью относительно редких бусин или выполнения простых частиц изображения велоциметрии (PIV) для реконструкции поля деформации. Тем не менее, для небольших клеток, таких как B лимфоцитов, которые оказывают стресс размером до 50 Па, использование одной частицы отслеживания требуется (частицы отслеживания велоциметрии, PTV) для достижения желаемой точности при реконструкции поля деформации. Для того, чтобы надежно отслеживать бисер индивидуально, увеличение объектива должно быть не менее 60x и его численная диафрагма около 1,3. Таким образом, гели должны быть относительно тонкими (lt;50 мкм), в противном случае шарики не видны, поскольку они находятся выше рабочего расстояния цели.
Основной протокол состоит из трех разделов: гелевая подготовка, функционализация геля и визуализация; еще два раздела являются необязательными и предназначены для количественной оценки и визуализации флуоресцентных клеток.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1224px;" width="1225">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:583px;">3-aminopropyltrimethoxysilane (APTMS)</td>
			<td style="width:285px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:177px;">281778</td>
			<td style="width:179px;">Store aliquoted, protected from humidity</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">40% Acrylamide Solution</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1610140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa555 microscale protein labeling kit</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A30007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ammonium Persulfate (APS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">B cell Isolation Kit, Mouse</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">B-mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31350-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2% Bis Solution</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>161-0142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>04-100-812-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Coverslip 18mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-1580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal calf serum</td>
			<td>PAA</td>
			<td>A15-151</td>
			<td>Decomplemented (40min @56&#176;C)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fluorodishes FD35</td>
			<td>World Precision Instruments, Inc</td>
			<td>FD35100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fluosphere: carboxylate-modified, 0.2um, dark red</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>F8807</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hen Egg Lysozyme</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6876</td>
			<td>Stocked in aliquote 100mg/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)</td>
			<td>Thermofisher/Gibco</td>
			<td>11140035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N,N,N&#39;,N&#39;-tetrametiletilendiammine (TEMED)</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>50406-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS (Phosfate Buffer Saline)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin&#8211;streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RMPI 1640 &#8211; Glutamax I</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>61870-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sigmacote</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SL2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360-039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sulfosuccinimidyl 6-(4&#39;-azido-2&#39;-nitrophenylamino)hexanoate (Sulfo-SANPAH)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>22589</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

traction force microscopy to study b lymphocyte activation

Силовая микроскопия тяги (TFM) позволяет измерять силы, производимые клеткой на субстрате. Этот метод позволяет сделать вывод о измерениях силы тяги из экспериментально наблюдаемого поля смещения, производимого клеткой, потянувшей за эластичный субстрат. Здесь мы адаптировали TFM для исследования пространственной и временной структуры силового поля, оказываемого клетками группы В при активации антигенным взаимодействием рецептора В-клеток. Плотность геля, плотность бисера и функционализация белка должны быть оптимизированы для изучения относительно небольших клеток ( й 6 мкм), которые взаимодействуют с, и реагировать конкретно на лиганды для рецепторов поверхности клеток.

Учитывая размер клеток, алгоритмы, которые извлекают карту смещения бисера с помощью коррелятивных методов (таких как велоциметрия изображения частиц), в целом не очень точны. Однако в зависимости от степени требуемого разрешения, можно легко получить качественные результаты с помощью бесплатного плагина Fiji/ImageJ31,32. Хотя этот подход достаточен для сравнения стимулирующих и нестимулирующего условий, для тщательного анализа мы рекомендуем использовать наше программное обеспечение,загружаемое из онлайн-хранилища 30,которое отслеживает бисер индивидуально и предоставляет карту поля перемещения в данный момент времени в качестве интерполяции отдельных перемещенийшарика 33. На данный момент возможно несколько количественных данных. Например (предполагая, что перемещение вызвано только стрессом, касательным для поверхности геля) программное обеспечение также обеспечивает стресс в каждой точке, вызывая, что конкретные карты перемещения. Это своего рода "проблема инверсии": перемещение в определенный момент зависит от суммы всех сил, применяемых во всех других точках. "Алгоритм инверсии" учитывает физические параметры субстрата: его жесткость (молодой модуль) и соотношение Пуассона. Прямые алгоритмы, как правило, очень точны, но вычислительно дороги. Алгоритмы, основанные на преобразовании Фурье, как и наша, выполняют по существу деконволюцию в пространстве Фурье и являются более эффективными, но склонными к некоторым ошибкам (главным образом из-за шага интерполяции). Эти алгоритмы, как правило, требуют настройки параметра, который предотвращает небольшие локальные (и потенциально артефактные) перемещения, чтобы стать слишком актуальными при вычислении поля напряжения (параметрготизации Тихонова 8,29; переменная "Екоманизация" в окне диалога; здесь мы обычно устанавливаем равные 5 х 10-19). Для более продвинутой интерпретации и анализа, таких как пространственно-временные корреляции, локальные движения, корреляции с флуоресцентными каналами, мы рекомендуем сотрудничать с экспертами в этой области. Для обзора вычислительных методовсм.
Как уже упоминалось выше, правильные изображения бисера выглядят как "звездное небо", равномерное и случайное распределение ярких пятен(рисунок 2A). Данные и анализ не являются надежными, когда количество бусинок слишком низко(рисунок 2B)или изображение находится вне фокуса(рисунок 2C). После того, как В-клетки поселились на поверхности геля, шарики под клетками начинают двигаться из-за силы тяги, оказываемой клеткой на гель. Кадры, для которых шарики не отслеживаются, должны быть отброшены.
В качестве проверки можно наблюдать на глазу движение бисера, сравнивая «справочную рамку», обычно предшествующую первому контакту клетки с субстратом. Приблизительные результаты можно получить из одного отслеживания частиц (например, Trackmate, Фиджи 34), как это делается на рисунке 3A. Анализ обеспечивает сегментацию бусин в справочном изображении («FILENAME.fig») в качестве управления.
С программным обеспечением мы предлагаем, можно получить смещения (Рисунок 3B) и стресс поле (вектор локального стресса на каждом пикселе, и каждый момент времени, полученные инверсии из поля перемещения, рисунок 3C). Scalar продукт смещения и силовых полей, интегрированных на площади клетки обеспечивает общую работу, оказываемую ячейкой на подложку (рисунок 4A). Для этого вычисления требуется маска ячейки, введенная в шаге 6.2 протокола.
Для сравнения двух биологических условий (как активация HEL по сравнению с неактивной субстрат BSA, или дикий тип по сравнению с нокаутом) полезно вычислитьсреднюю кривую (рисунок 4B) или, что еще более синтетически, среднее значение за последний раз точек (20 мин), где энергия достигает плато (Рисунок 4C). Когда пространственная информация сил актуальна, можно сравнить отдельные точки времени каждого состояния(рисунок 4D). Для более глубокого анализа обратитесь к Kumari et al.6.
Пример флуоресценции антигена извлечения промежуток времени показан на рисунке 5A: прогрессивный вид сигналов флуоресценции при синапсе указал антигенный отслоение от геля. Средняя кривая извлечения с интервалом доверия (стандартная погрешность среднего) более 15 ячеек показана на рисунке 5B.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60947/60947fig1v2.jpg"> Рисунок 1: Схема, показывающая подготовку геля и его функционализацию. Шаги описаны в протоколе. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60947/60947fig1v2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60947/60947fig2.jpg"> Рисунок 2: Три примера бисерных изображений различных качеств. (A) Пример изображения шарика с правильным соотношением сигнала к шуму и правильной плотностью. (B)Примеры изображений с слишком недостаточным количеством бисера и(C) из фокуса плоскости. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60947/60947fig2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60947/60947fig3.jpg"> Рисунок 3: Обработка изображений для извлечения силового поля. (A) Пример изображения бисера (очертания клетки в белом, извлеченные из изображения передачи), отслеживание бисера во время т 5 мин (красная накладка) и смещения (стрелки) по отношению к времени т 0 мин (шкала бар 5 мкм). (B)Интерполированное поле перемещения (представленное как векторная колчан и карта величины, стрелки пропорциональны смещению (нм); см. цветовую планку справа); внизу: более гладкое изображение величины (полученное интерполяцией с бикубической функцией). (C)Стрессовое поле из поля смещения в панели B (представлено как векторная колчан и карта величины; стрелки пропорциональны стрессу стрижки (Pa); см. цветовую планку справа); внизу: более гладкое изображение величины (полученное интерполяцией с бикубической функцией). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60947/60947fig3large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60947/60947fig4.jpg"> Рисунок 4: Пример информации, которая может быть извлечена из силовых и водоизмещений. ( Пример эволюции энергии во времени для одной ячейки: фаза плато (выделенная серым цветом) появляется примерно через 10 минут. (B) Сравнение средних кривых энергии и (C) относительных уровней плато для 65 клеток, покрытых HEL (активация) покрытием гель и 35 клеток на BSA (не активации) покрытием гель (средний ± межквартильные диапазоны показаны, Манн-Уитни тест был использован для статистической значимости). (D)Карты цветов замедленного действия стресса для HEL и управления состоянием BSA; показаны как масштабы, так и колчаны. Эти изображения были адаптированы из Кумари и др.6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60947/60947fig4large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60947/60947fig5.jpg"> Рисунок 5: Пример экспериментов с флуоресцентным антигеном.(A)Промежуток времени экстракции флуоресцентного HEL (см. процент от максимума, планка масштаба 3 м). (B) Сбор антигенов с течением времени (средняя ± SEM, n No 15). Эти изображения были адаптированы из Кумари и др.6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60947/60947fig5large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Traction Force Microscopy to Study B Lymphocyte Activation at JoVE.com

Traction Force Microscopy to Study B Lymphocyte Activation

Здесь мы представляем протокол, используемый для выполнения экспериментов по микроскопии силы тяги на В-клетках. Мы описываем подготовку мягких полиакриламидных гелей и их функционализацию, а также сбор данных под микроскопом и резюме анализа данных.

Микроскопия силы тяги для изучения активации лимфоцитов B

Traction force microscopy (TFM) enables the measurement of forces produced by a cell on a substrate. This technique infers traction force measurements ...

Этот метод позволяет измерить пространственное временное распределение сил, применяемых клетками В при иммунной синапсе, и соотнести их с набором конкретных белков. Силовая микроскопия тяги с использованием полиакриламинидных гелей проста в реализации. Этот протокол может быть использован для быстрой настройки измерения механических возможностей многих В-клеток.Этот метод является гибким и может быть адаптирован к графику других лигандов, как интегрины или для изучения других видов иммунных синапсов, как Т-клетки или разочарование фагоцитоза. Из-за физических и химических свойств гелей, требуемых этим экспериментом, адаптация классических методов силовой микроскопии тяги к клеткам группы В может быть сложной. Начните с засолинизации поддержки геля.Активируйте крышку или стеклянную нижнюю чашку Петри с уф-лампой в течение двух минут, затем засолйте ее 200 микролитров APTMS в течение пяти минут. Это подготовит поддержку ковалентной привязки геля. Тщательно мыть крышку или стеклянное дно блюдо с ультра чистой водой и высушить его с помощью вакуумной аспирации.Чтобы подготовить крышки для уплощения геля, положить их в керамический держатель крышки, положить держатель в небольшой стакан, и залить силиконизации реагента над coverslips убедившись, чтобы покрыть их полностью. Накройте стакан алюминиевой фольгой и оставьте его при комнатной температуре на три минуты. Между тем, заполнить большой стакан с ультра чистой водой.После трех минут инкубации в силиконовом реагенте, перенесите держатель крышки с крышками в стакан с водой. Тщательно промыть крышки с ультра чистой водой. Высушите их хорошо и поместите их на бумажные салфетки.Для получения наилучших результатов немедленно приступайте к полимеризации геля. Подготовь 500 гель Паскаля предварительно перемешать в соответствии с рукописными направлениями, а затем объединить 167 микролитров предварительно смешать с 1,67 микролитров бисера. Вихрь и sonicate смесь в ванне sonicator в течение пяти минут.Защитите смесь от света алюминиевой фольгой. Чтобы извлечь выгоду из полимеризации, добавьте 1,67 микролитров 10%аммония persulfate в смесь геля, а затем инициировать полимеризацию, добавив 0,2 микролитров TEMED и смешивая гель с пипеткой. Чтобы бросить гель, пипетка девять микролитров гель смеси на каждый соленой крышкой или стеклянное дно блюдо.Немедленно сгладить гель с силиконовой крышкой, нажав на него с щипся, чтобы убедиться, что гель распространяется по всей площади крышки и что некоторые из них вытекает. Инвертировать крышку или стеклянную нижнюю тарелку в большую чашку Петри и нажмите его на скамейке, чтобы заставить бисер к поверхности геля. Поместите увлажненной ткани на блюдо, чтобы создать влажную камеру.Обложка его алюминиевой фольгой и инкубировать его в течение одного часа. После инкубации облегчите высвобождение крышки, добавив PBS в образец. Аккуратно удалите крышку с помощью иглы, слегка наклоняя блюдо, но убедившись, что гель погружен в PBS.Силиконизирующий агент, акриламид, базовый акриламид и TEMED могут быть токсичными при вдыхании. Носите стандартное средства индивидуальной защиты и манипулировать этими продуктами под химическим капотом. Аспирировать PBS из гелей и добавить 150 микролитров Сульфо-САНПА при комнатной температуре.Выставить гель для УФ-лечения в течение двух минут, а затем мыть гель три раза с PBS. Повторите лечение сульфо-SANPAH и PBS моет, а затем добавить 250 микролитров куриного яйца лизозима или HEL к гелю и инкубировать его на ночь в камере влажности при четырех градусах по Цельсию покрыты алюминиевой фольгой. После инкубации снимите антиген HEL и трижды промойте гель PBS.Наконец, накройте гель 500 микролитров В-клеточных культур и оставьте его при комнатной температуре. Используйте конфокальный микроскоп с тепловым и углекислым газом для визуализации. Аспирировать средства массовой информации из геля, оставив около 200 микролитров.Распоить гель на микроскопе. Два основных слоя бисера появятся на дне и верхней части геля. Сосредоточьтесь на плоскости геля и найдите овеную область для изображения.Тщательно выберите область изображения и убедитесь, что оставаться в центре внимания. Соответствующая плотность бисера и овеженная поверхность являются ключом к получению надежных и надежных измерений силы. Добавьте 80 микролитров первичных лимфоцитов B от мышей MD4 к гелю, избегая прикосновения к гелю, чтобы сохранить фокус.Убедитесь, что фокус по-прежнему корректен и что клетки можно увидеть спускаясь в этом районе. Запустите приобретение до того, как клетки достигнут геля. Откройте фильм в качестве стопки изображений в ImageJ, а затем запустить макро cropandsave.ijm.Выберите каталог вывода и настройте настройки канала атрибутов. Выберите области, представляющие интерес, с помощью прямоугольника и добавьте их в список рентабельности инвестиций с помощью ключа T. Когда закончите, нажмите OK. Когда макрос предлагает маску ячейки, нажмите OK, если она является удовлетворительной.Если это неудовлетворительно, нажмите не ОК, а затем вручную выберите закрытый регион с любым инструментом выбора, а затем нажмите продолжить. Откройте MATLAB и запустите tfmv1.m. Вввеми необходимые параметры.В частности, проверьте свойства изображения, такие как размер пикселей и интервал времени приобретения и свойства геля, такие как коэффициент Young modulus E и Poisson. После завершения поиска выходных данных программного обеспечения в том же каталоге, что и исходный файл. Правильные изображения бисера выглядят как равномерное и случайное распределение ярких пятен, похожих на звездное небо.Данные и анализ не являются надежными, когда количество бусинок слишком низко или изображение находится вне фокуса. Наблюдать за движением бисера глазами можно с помощью эталонного кадра, который предшествовал первому контакту клетки с субстратом. Приблизительные результаты можно получить с помощью отслеживания отдельных частиц.Анализ обеспечивает сегментацию бусин в эталонное изображение в качестве контроля. Используя программное обеспечение, можно также получить смещения и стресса поле, которое является вектором локального стресса на каждом пикселе и каждый момент времени. Scalar продукт смещения и силовых полей, интегрированных на площади ячейки обеспечивает общую работу, оказываемую ячейкой на субстрате.При сравнении двух биологических условий можно рассчитать среднюю кривую или среднее значение за последний раз, когда энергия достигает плато. Когда пространственная информация сил актуальна, также можно сравнить одиночные точки времени каждого состояния. Пример флуоресценции антигена извлечения промежуток времени показан здесь.Прогрессивное появление флуоресцентных сигналов в синапсе указывает на отслоение антигена от геля. Данные флуоресценции могут быть использованы для построения средней кривой извлечения. Наиболее деликатным шагом в протоколе является полимеризация геля под крышкой.Этот шаг должен быть выполнен относительно быстро и тщательно, гарантируя, что гель сжимается равномерно под крышкой. После этой процедуры флуоресцентный белок, выражаюющий В-лимфоциты, может быть использован для одновременной оценки локализации внутриклеточных структур и силового узора. Этот метод может быть объединен с генетическими или химическими возмущениями для оценки роли конкретных белков на клеточной контрактности и поглощении антигена.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bacterial Immobilization for Imaging by Atomic Force Microscopy

Бактериальные Иммобилизация для обработки изображений методом атомно-силовой микроскопии

AFM is a high-resolution (nm scale) imaging tool that mechanically probes a surface.  It has the ability to image cells and biomolecules, in a liquid ...

Visualization of Recombinant DNA and Protein Complexes Using Atomic Force Microscopy

Визуализация рекомбинантных ДНК и белковых комплексов с помощью атомно-силовой микроскопии

Atomic force microscopy (AFM) allows for the visualizing of individual proteins, DNA molecules, protein-protein complexes, and DNA-protein complexes. On ...

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Дизайн Циклические биореактора давление для Ex Vivo Изучение аортального клапанов сердца

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

A Novel Method for Localizing Reporter Fluorescent Beads Near the Cell Culture Surface for Traction Force Microscopy

Новый метод для локализации Reporter флуоресцентные шарики Ближних культуре клеток для увеличения силы сцепления силовой микроскопии

PA gels have long been used as a platform to study cell traction forces due to ease of fabrication and the ability to tune their elastic properties. When ...

Surface Potential Measurement of Bacteria Using Kelvin Probe Force Microscopy

Поверхностный потенциал Измерение бактерий с помощью зонда Кельвина силовой микроскопии

Surface potential is a commonly overlooked physical characteristic that plays a dominant role in the adhesion of microorganisms to substrate surfaces. ...

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

Атомно-силовая микроскопия изображений и силовая спектроскопия поддерживаемых липидного бислоя

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

A High-throughput Cell Microarray Platform for Correlative Analysis of Cell Differentiation and Traction Forces

Высокая пропускная способность сотовых микрочипов платформы для корреляционного анализа клеточной дифференциации и тяговых усилий

Microfabricated cellular microarrays, which consist of contact-printed combinations of biomolecules on an elastic hydrogel surface, provide a tightly ...

High Throughput Traction Force Microscopy Using PDMS Reveals Dose-Dependent Effects of Transforming Growth Factor-&#946; on the Epithelial-to-Mesenchymal Transition

High Throughput Traction Force Microscopy Using PDMS Reveals Dose-Dependent Effects of Transforming Growth Factor-ÃƒÅ½Ã‚Â² on the Epithelial-to-Mesenchymal Transition

Высокой пропускной силы тяги Микроскопия использованием PDMS показывает доз-зависимые эффекты преобразования фактор роста-я на Эпителиальный-к-мезенхимальный переход

Cellular contractility is essential in diverse aspects of biology, driving processes that range from motility and division, to tissue contraction and ...

Fabrication and Implementation of a Reference-Free Traction Force Microscopy Platform

Изготовление и внедрение платформы микроскопии безсправочной тяговой силы

Quantifying cell-induced material deformation provides useful information concerning how cells sense and respond to the physical properties of their ...

Traction Microscopy Integrated with Microfluidics for Chemotactic Collective Migration

Тракция Микроскопия интегрирована с микрофлюиди для хемотаксической коллективной миграции

Cells change migration patterns in response to chemical stimuli, including the gradients of the stimuli. Cellular migration in the direction of a chemical ...