Name: traction force microscopy to study b lymphocyte activation
Uploaded: 2020-07-23T14:45:00
Duration: 9 min 28 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Traction Force Microscopy to Study B Lymphocyte Activation at JoVE.com

Författarna tackar M. Bolger-Munro för kritisk läsning och erkänner Nikon Imaging Center@CNRS-InstitutCurie och PICT-IBiSA, Institut Curie, Paris, medlem av France-BioImaging nationella forskningsinfrastruktur, för stöd i bild förvärv och Curie Animal Facility. PP stöddes av CNRS. AK och JP fick stöd av Paris Descartes PhD fellowship och Ecole Doctorale FIRE-Program Bettencourt. Detta projekt finansierades genom bidrag till PP (ANR-10-JCJC-1504-Immuphy) och AMLD (ANR-PoLyBex-12-BSV3-0014-001, ERC-Strapacemi-GA 243103).

1. Gelpreparat
<ol><li>Silanisering av gelstödet<ol>
<li>Aktivera täckslip eller glas-botten Petriskål (som kommer att användas som gel stöd) med en UV-lampa i 2 min (vänta 30 s före exponering för UV-lampan för att undvika exponering för kvarvarande ozon).</li>
		<li>Silanize den coverslip/ glas-botten skålen med hjälp av 200 μL aminopropyltrimeoxisilan (APTMS) i 5 min. Detta kommer att förbereda stödet för den kovalenta bindningen av gelen.</li>
		<li>Tvätta noggrant täckplattan/glas-bottenfatet med ultrarent vatten.</li>
		<li>Torka täcket/glas-botten skålen med hjälp av vakuum strävan.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Beredning av 18mm coverslip som används för att platta gelen<ol>
<li>För att förbereda täcken, först sätta dem i en keramisk täckpapper hållare. Lägg sedan täckpappershållaren i en liten bägare (50 mL) och häll silikoniseringsreagens (lagrad vid 4 °C, återanvändbar) över täcksläppen, var noga med att helt täcka över dem.</li>
		<li>Täck bägaren med aluminiumfolie och inkubera i 3 min i rumstemperatur. Under väntan fyller du en stor bägare (500 mL) med ultrarent vatten. Efter 3 min inkubation i silikoniserande reagens, överför du täckskyddshållaren med täckslips till bägaren med vatten.</li>
		<li>Skölj noga täcken med ultrarent vatten, torka dem väl och håll på pappersservetter. För bästa resultat, fortsätt omedelbart till nästa avsnitt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Gel polymerisation<ol>
<li>För geler på 0,5 kPa, blanda 75 μL av 40% akrylamid med 30 μL av 2% bisakrylamid (crosslinker) och 895 μL av fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Denna premix kan lagras i upp till en månad vid 4 °C.</li>
		<li>Till 167 μL av 0,5 kPa gel premix, tillsätt 1% (1,67 μL) pärlor, virvel och soniker i 5 min i ett bad sonicator (standard bänk ultraljud renare med effekt på 50–100 W och frekvens 40 kHz). Håll blandningen skyddad från ljus med hjälp av aluminiumfolie. OBS: Premixen polymeriserar inte förrän initieraren (TEMED) läggs till.</li>
		<li>För att katalysera polymerisering, tillsätt 1% (1,67 μL) av 10% w/v ammoniumpersulfat (APS).</li>
		<li>För att initiera polymerisering, tillsätt 0,1% (0,2 μL) N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine (TEMED). Blanda med en pipett. När APS och TEMED har lagts till, polymeriserar gelen snabbt så fortsätt snabbt till gelgjutning.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Gel gjutning<ol>
<li>Pipet 9 μL av gel blanda på varje täcken / glas-botten skålen (droppe i centrum, Figur 1A)</li>
		<li>Placera silaniserad/hydrofoba täckplattan och platta till gelen (Bild 1B). Med hjälp av forceps trycker du på täcket för att säkerställa att gelen sprider sig över hela området av täcket (Figur 1C) tills det börjar läcka ut.</li>
		<li>Invertera täcket/glas-botten skålen i en stor Petri skålen och knacka den på bänken för att tvinga pärlor går mot gel ytan (Figur 1D).</li>
		<li>Täck med aluminiumfolie och låt stå i 1 h för att polymerisera vid rumstemperatur i en fuktig kammare (dvs. sätta en våt vävnad ovanför skålen för att förhindra avdunstning).</li>
		<li>Efter 1 h, lägg TILL PBS till provet för att underlätta coverslip release. Försiktigt, ta bort täckskydd med hjälp av en nål (beläggningen med olika silaner bör tillåta enkel avskalning av täckslip från gelen, Figur 1E).</li>
		<li>Låt gelen vara kvar i PBS. OBS: Geler kan nu förvaras i PBS vid 4 °C i 5–7 dagar, men det rekommenderas att använda dem inom 48 h.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Gel funktionalisering
<ol><li>Förbered sulfosuccinimidyl 6-(4'-azido-2'-nitrofenylamino)hexanoat (Sulfo SANPAH) lösning vid 0,5 mg/mL i 10 mM HEPES buffert. Denna kan förvaras vid 4 °C täckt med aluminiumfolie i upp till en vecka.</li>
	<li>Aspirera PBSEN från gels.</li>
	<li>Tillsätt 150 μL sulfo SANPAH till gelen vid rumstemperatur (Bild 1F).</li>
	<li>Exponera gelen för UV-behandling i 2 min för att fotoaktivera platserna för Sulfo SANPAH och få den att fastna på gelytan.</li>
	<li>Tvätta med PBS tre gånger (Bild 1G).</li>
	<li>Upprepa steg 2.2–2.5.</li>
	<li>Tillsätt 250 μL hel (100 μg/mL) till varje gel och inkubera över natten i en fuktig kammare vid 4 °C över natten samtidigt som den håller täckt med aluminiumfolie (Figur 1H).</li>
	<li>Ta bort HEL-antigen och tvätta med PBS tre gånger. OBS: HEL fungerar både som ett antigen och som en vidhäftningsmolekyl. Den kan ersättas med andra molekyler som binder till receptorn (t.ex., en anti-mus IgM, Bovint SerumAlbumin, Ovalbumin) eller blandas med integrin ligander (t.ex. ICAM1 bindning till LFA1). Vid behov kan antigenutsug observeras med en fluorescerande version av HEL (erhålls genom färgning av molekylen med en proteinmärkningssats, se steg 4). Observera att en viss koncentration i bulk kanske inte ger samma ytkoncentration på gelen som på glaset: detta måste kvantifieras med sekundär färgning om direkt jämförelse krävs.</li>
</ol>3. Cell lastning och bildframställning
<ol><li>Innan bildtagning, ta bort PBS från gelerna och tillsätt 500 μL av B-cellmedia (RPMI 1640, 10% decomplemented fetala kalv serum, 1% penicillin-streptomycin, 2% Natrium Pyruvat, 50uM Merkaptoetanol och 1X Icke essentiella aminosyror) och låt dem jämvikt till RT.</li>
	<li>Förberedelse av celler<ol>
<li>Rena primära B-celler från mjälte enligt ett negativt urvalsprotokoll (se Table of Materials). Typisk slutcellsutbyte är runt 1 x 107 celler. Koncentrera detta till 3 x 106 celler/mL i B-cellmedium (RPMI-1640 kompletterat med 10% fetalt kalvserum, 1% penicillin–streptomycin, 0,1% merkaptoetanol och 2% natriumpyuvat).</li>
		<li>Förvara celler efter behov i upp till 6 h vid 4 °C.</li>
		<li>Håll cellerna på 37 °C i 30 min före bildförvärv.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Imaging<ol>
<li>Använd ett konfokalmikroskop med termisk och (eventuellt) CO2-kontroll. OBS: Oavsett om ett konfokal- eller spinn-diskmikroskop används är det viktigt att använda ett objektivt/hål som gör att en pixelstorlek <200 nm bekvämt spårar pärlorna i analysfasen (t.ex. 60x, NA 1.3). Epifluorescens mikroskopi kan också användas, men det ger lägre signal till brus förhållande och kan göra enskilda pärla spårning svårare.</li>
		<li>Två huvudlager av pärlor kommer att visas på botten och toppen av gelen. Fokusera på gelplanet. OBS: En fin gel kommer att visas som en stjärnhimmel, med pärlor ungefär jämnt fördelade på samma plan.</li>
		<li>Programmera förvärvet för 30 min med en bildhastighet på 5 s (detta är anpassningsbart till behoven i experimentet, t.ex.</li>
		<li>Aspirera media från gelen, lämnar ca 200 μL media på gelen. Placera gelen på mikroskopet och hitta ytskiktet av pärlor och ett trevligt jämnt område på gelen.</li>
		<li>Tillsätt 80 μL celler (undvik att vidröra gelen för att behålla fokus).</li>
		<li>Se till att fokus fortfarande är korrekt och att celler kan ses fallande i området (under transmitterat ljus). Starta förvärvet innan cellerna når gelen.</li>
		<li>Vid oavsiktlig kontakt med gel, vibrationer eller fokusavdrift, justera fokus. OBS: Det är avgörande att samla in en bild av den avslappnade gelen och detta kan vara någon bild tagen före ankomsten av cellerna på gelen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Fluorescerande HEL extraktion experiment
<ol><li>Förbered fluorescerande HEL genom att binda ett fluorescerande färgämne (av en färg som skiljer sig från pärlorna en som Alexa 555), se Tabellen för material.</li>
	<li>I steg 2.7, byt konventionell HEL med den fluorescerande HEL.</li>
	<li>Skaffa bilder med låga belysningsinställningar eller låg bildhastighet (t.ex. 2 bilder per minut) för att undvika fotoblekning.</li>
	<li>För att kvantifiera HEL extraktion, beräkna intensiteten integreras över cellområdet för varje ram I(t) korrigeras och normaliseras av intensiteten I(0) av ram 0 enligt formeln: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/60947/60947eq1.jpg"> OBS: Antigenet konjugerat med fluorofore syns inte (troligen på grund av släckning av fluorofore vid gelytan), men dess närvaro på gelén kan verifieras med en anti-HEL och en fluorescerande sekundär antikropp. Det kan verifieras att fluoroforen verkligen är fluorescerande när den lossnar genom att ta bort den från gelén med en täcks med anti-HEL och avslöja den med en sekundär fluorescerande antikropp (på täcket)6. Signalen av det extraherade antigenet är mycket svagt och maskeras ibland av läckage av pärlorna. Om man endast är intresserad av antigenutdragning rekommenderas att gelen utan pärlor förbereds (hoppa över steg 1.3.2 och 1.4.3).</li>
</ol>5. Avbildning av fluorescens
<ol><li>Erhåll fluorescerande B-celler genom att rena B-cell från mjältarna hos genetiskt modifierade möss som gjort för vildtypen (t.ex., från Lifeact-GFP- eller Myosin II GFP-möss).</li>
	<li>För bildgivande lysrörsceller, använd (om möjligt) ett snurrande diskmikroskop med ett vattenbadslångt 40x–100x-mål.</li>
	<li>Håll exponeringens varaktighet och bildhastighet låg för att undvika blekning. OBS: Punktspridningsfunktionen i Z är starkt nedbrytad av närvaron av gelén, därav föreslår vi att man använder ett vattenbadmål. Levande upprätt mikroskopi med vattendoppningsmålen lider av starka sfäriska aberrationer som framkallas av närvaron av (sfärisk) cellen (och cellkärnan) i emissionsbanan.</li>
</ol>6. Analys
OBS: Dataanalys är i allmänhet utförs genom att först korrigera hela stacken för drift, hitta pärlorna i varje ram, spåra deras rörelser med avseende på en referensram (tas i frånvaro av celler), interpolera förskjutningsfältet och invertera problemet för att få stressen med hjälp av Fourier transform29. För detta ändamål föreslår vi att du använder en kombination av ImageJ Macro och MATLAB program nedladdningsbara från en online-lagringsplats30.
<ol><li>Öppna filmen i ImageJ som hög med bilder</li>
	<li>Kör makrot "Crop_and_save.ijm"<ol>
<li>Välj de områden av intresse (ROI) med "Rectangle" verktyget och lägg till dem i ROI-listan med hjälp av 't'-tangenten.</li>
		<li>När du beskär cellen, se till att inkludera en region på minst 5– 10 pixlar med orörliga pärlor. Uteslut celler som ligger för nära gränserna eller till andra celler från analysen. När färdig klicka på 'OK'.</li>
		<li>Makrot föreslår en mask av cellen: om detta är tillfredsställande klicka på "OK". Om inte tillfredsställande, klicka på "Inte ok" och välj sedan manuellt en sluten region med något urvalsverktyg (t.ex. "Freehand" eller "Oval") och klicka på "Fortsätt".</li>
	</ol>
</li>
	<li>Öppna MATLAB och kör "TFM_v1.m".<ol>
<li>Mata in de parametrar som krävs: kontrollera särskilt bildegenskaperna (pixelstorlek, tidsintervall för förvärv) och gelegenskaperna (Young modulus E, Poisson ratio).</li>
		<li>Referensbilden är inställd på att vara den första som standard. Ställ in den på en annan ram om det behövs eller ställ in den på "0" för att läsa in en extern fil.</li>
		<li>Leta reda på utgångarna av programvaran i samma katalog som originalfilen (för en beskrivning se den User_notice.pdf filen). Detta inkluderar en preliminär spår av pärlorna ("FILENAME.fig"), en tomt av den kontraktila energi över tiden ("FILENAME_energy.fig"), en tabell över flera kvantiteter integrerade över cellen (energi, område, stunder, etc) "FILENAME_finaltable.mat", en struktur som innehåller deplacement och kraftfält, filmer av pärlan, förskjutningsfält, stress och energi (som kan öppnas med någon avi läsare). OBS: I indataparametrarna är "Fönsterstorleken" fönstret över vilket förskjutningen interpoleras, därav den slutliga upplösningen av fältet stress och förskjutning. Detta är inställt på några (som standard fyra) pixlar. Det är inte tillrådligt att minska detta eftersom det skulle på konstgjord väg öka upplösningen genom att interpolera regioner där det inte finns några pärlor.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Yuseff, M. -. I., Pierobon, P., Reversat, A., Lennon-Dum&#233;nil, A. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+B+cells+capture,+process+and+present+antigens:+a+crucial+role+for+cell+polarity.">How B cells capture, process and present antigens: a crucial role for cell polarity.</a> Nature Reviews. Immunology. 13 (7), 475-486 (2013).</li><li>Spillane, K. M., Tolar, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+cell+antigen+extraction+is+regulated+by+physical+properties+of+antigen-presenting+cells.">B cell antigen extraction is regulated by physical properties of antigen-presenting cells.</a> The Journal of Cell Biology. 216 (1), 217-230 (2017).</li><li>Shaheen, S., Wan, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrate+stiffness+governs+the+initiation+of+B+cell+activation+by+the+concerted+signaling+of+PKC&#946;+and+focal+adhesion+kinase.">Substrate stiffness governs the initiation of B cell activation by the concerted signaling of PKC&#946; and focal adhesion kinase.</a> eLife. 6, (2017).</li><li>Natkanski, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+cells+use+mechanical+energy+to+discriminate+antigen+affinities.">B cells use mechanical energy to discriminate antigen affinities.</a> Science. 340 (6140), 1587-1590 (2013).</li><li>Wan, Z., Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+activation+of+IgM-+or+isotype-switched+IgG-+and+IgE-BCR+exhibits+distinct+mechanical+force+sensitivity+and+threshold.">The activation of IgM- or isotype-switched IgG- and IgE-BCR exhibits distinct mechanical force sensitivity and threshold.</a> eLife. 4, (2015).</li><li>Kumari, A., Pineau, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actomyosin-driven+force+patterning+controls+endocytosis+at+the+immune+synapse.">Actomyosin-driven force patterning controls endocytosis at the immune synapse.</a> Nature Communications. 10 (1), 2870 (2019).</li><li>Dembo, M., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stresses+at+the+cell-to-substrate+interface+during+locomotion+of+fibroblasts.">Stresses at the cell-to-substrate interface during locomotion of fibroblasts.</a> Biophysical Journal. 76 (4), 2307-2316 (1999).</li><li>Sabass, B., Gardel, M. L., Waterman, C. M., Schwarz, U. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+traction+force+microscopy+based+on+experimental+and+computational+advances.">High resolution traction force microscopy based on experimental and computational advances.</a> Biophysical Journal. 94 (1), 207-220 (2008).</li><li>Schwarz, U. S., Soin&#233;, J. R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+force+microscopy+on+soft+elastic+substrates:+A+guide+to+recent+computational+advances.">Traction force microscopy on soft elastic substrates: A guide to recent computational advances.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1853 (11), 3095-3104 (2015).</li><li>Colin-York, H., Shrestha, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-Resolved+Traction+Force+Microscopy+(STFM).">Super-Resolved Traction Force Microscopy (STFM).</a> Nano Letters. 16 (4), 2633-2638 (2016).</li><li>Stubb, A., Laine, R. F., Guzm&#225;n, C., Henriques, R., Jacquemet, G., Ivaska, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluctuation-Based+Super-Resolution+Traction+Force+Microscopy.">Fluctuation-Based Super-Resolution Traction Force Microscopy.</a> BioRxiv. , (2019).</li><li>Gutierrez, E., Tkachenko, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+refractive+index+silicone+gels+for+simultaneous+total+internal+reflection+fluorescence+and+traction+force+microscopy+of+adherent+cells.">High refractive index silicone gels for simultaneous total internal reflection fluorescence and traction force microscopy of adherent cells.</a> Plos One. 6 (9), 23807 (2011).</li><li>Bergert, M., Lendenmann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+reference+free+traction+force+microscopy.">Confocal reference free traction force microscopy.</a> Nature Communications. 7, 12814 (2016).</li><li>Schoen, I., Hu, W., Klotzsch, E., Vogel, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+cellular+traction+forces+by+micropillar+arrays:+contribution+of+substrate+warping+to+pillar+deflection.">Probing cellular traction forces by micropillar arrays: contribution of substrate warping to pillar deflection.</a> Nano Letters. 10 (5), 1823-1830 (2010).</li><li>Colin-York, H., Fritzsche, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+future+of+traction+force+microscopy.">The future of traction force microscopy.</a> Current Opinion in Biomedical Engineering. 5, 1-5 (2018).</li><li>Feng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanosensing+drives+acuity+of+&#945;&#946;+T-cell+recognition.">Mechanosensing drives acuity of &#945;&#946; T-cell recognition.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (39), 8204-8213 (2017).</li><li>Spillane, K. M., Tolar, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA-Based+Probes+for+Measuring+Mechanical+Forces+in+Cell-Cell+Contacts:+Application+to+B+Cell+Antigen+Extraction+from+Immune+Synapses.">DNA-Based Probes for Measuring Mechanical Forces in Cell-Cell Contacts: Application to B Cell Antigen Extraction from Immune Synapses.</a> Methods in Molecular Biology. 1707, 69-80 (2018).</li><li>Stabley, D. R., Jurchenko, C., Marshall, S. S., Salaita, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+mechanical+tension+across+membrane+receptors+with+a+fluorescent+sensor.">Visualizing mechanical tension across membrane receptors with a fluorescent sensor.</a> Nature Methods. 9 (1), 64-67 (2011).</li><li>Merkel, R., Nassoy, P., Leung, A., Ritchie, K., Evans, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energy+landscapes+of+receptor-ligand+bonds+explored+with+dynamic+force+spectroscopy.">Energy landscapes of receptor-ligand bonds explored with dynamic force spectroscopy.</a> Nature. 397 (6714), 50-53 (1999).</li><li>Hinterdorfer, P., Dufr&#234;ne, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+localization+of+single+molecular+recognition+events+using+atomic+force+microscopy.">Detection and localization of single molecular recognition events using atomic force microscopy.</a> Nature Methods. 3 (5), 347-355 (2006).</li><li>Sawicka, A., Babataheri, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropipette+force+probe+to+quantify+single-cell+force+generation:+application+to+T-cell+activation.">Micropipette force probe to quantify single-cell force generation: application to T-cell activation.</a> Molecular Biology of the Cell. 28 (23), 3229-3239 (2017).</li><li>Desprat, N., Guiroy, A., Asnacios, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microplates-based+rheometer+for+a+single+living+cell.">Microplates-based rheometer for a single living cell.</a> Review of Scientific Instruments. 77 (5), 055111 (2006).</li><li>Labernadie, A., Bouissou, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protrusion+force+microscopy+reveals+oscillatory+force+generation+and+mechanosensing+activity+of+human+macrophage+podosomes.">Protrusion force microscopy reveals oscillatory force generation and mechanosensing activity of human macrophage podosomes.</a> Nature Communications. 5, 5343 (2014).</li><li>Bouissou, A., Proag, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protrusion+force+microscopy:+A+method+to+quantify+forces+developed+by+cell+protrusions.">Protrusion force microscopy: A method to quantify forces developed by cell protrusions.</a> Journal of Visualized Experiments. (136), 57636 (2018).</li><li>Kronenberg, N. M., Liehm, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+imaging+of+cellular+forces+with+high+precision+by+elastic+resonator+interference+stress+microscopy.">Long-term imaging of cellular forces with high precision by elastic resonator interference stress microscopy.</a> Nature Cell Biology. 19 (7), 864-872 (2017).</li><li>Basu, R., Whitlock, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytotoxic+T+cells+use+mechanical+force+to+potentiate+target+cell+killing.">Cytotoxic T cells use mechanical force to potentiate target cell killing.</a> Cell. 165 (1), 100-110 (2016).</li><li>Bufi, N., Saitakis, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Primary+Immune+Cells+Exhibit+Distinct+Mechanical+Properties+that+Are+Modified+by+Inflammation.">Human Primary Immune Cells Exhibit Distinct Mechanical Properties that Are Modified by Inflammation.</a> Biophysical Journal. 108 (9), 2181-2190 (2015).</li><li>Goodnow, C. C., Crosbie, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+immunoglobulin+expression+and+functional+silencing+of+self-reactive+B+lymphocytes+in+transgenic+mice.">Altered immunoglobulin expression and functional silencing of self-reactive B lymphocytes in transgenic mice.</a> Nature. 334 (6184), 676-682 (1988).</li><li>Butler, J. P., Toli&#263;-N&#248;rrelykke, I. M., Fabry, B., Fredberg, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+fields,+moments,+and+strain+energy+that+cells+exert+on+their+surroundings.">Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings.</a> American Journal of Physiology. Cell Physiology. 282 (3), 595-605 (2002).</li><li>. MBPPlab/TFM_v1: Software for Time dependent Traction Force Microscopy Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/MBPPlab/TFM_v1">https://github.com/MBPPlab/TFM_v1</a> (2019)</li><li>Tseng, Q., Duchemin-Pelletier, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+organization+of+the+extracellular+matrix+regulates+cell-cell+junction+positioning.">Spatial organization of the extracellular matrix regulates cell-cell junction positioning.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (5), 1506-1511 (2012).</li><li>. ImageJ plugins by Qingzong TSENG Available from: <a target="_blank" href="https://sites.google.com/site/qingzongtseng/">https://sites.google.com/site/qingzongtseng/</a> (2019)</li><li>Plotnikov, S. V., Sabass, B., Schwarz, U. S., Waterman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+traction+force+microscopy.">High-resolution traction force microscopy.</a> Methods in Cell Biology. 123, 367-394 (2014).</li><li>Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Wang, J., Lin, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+the+origin,+dynamics,+and+function+of+traction+force+in+B+cell+activation.">Profiling the origin, dynamics, and function of traction force in B cell activation.</a> Science Signaling. 11 (542), (2018).</li><li>Hui, K. L., Balagopalan, L., Samelson, L. E., Upadhyaya, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoskeletal+forces+during+signaling+activation+in+Jurkat+T-cells.">Cytoskeletal forces during signaling activation in Jurkat T-cells.</a> Molecular Biology of the Cell. 26 (4), 685-695 (2015).</li><li>Bashour, K. T., Gondarenko, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD28+and+CD3+have+complementary+roles+in+T-cell+traction+forces.">CD28 and CD3 have complementary roles in T-cell traction forces.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (6), 2241-2246 (2014).</li><li>Gardel, M. L., Sabass, B., Ji, L., Danuser, G., Schwarz, U. S., Waterman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+stress+in+focal+adhesions+correlates+biphasically+with+actin+retrograde+flow+speed.">Traction stress in focal adhesions correlates biphasically with actin retrograde flow speed.</a> The Journal of Cell Biology. 183 (6), 999-1005 (2008).</li><li>Stricker, J., Sabass, B., Schwarz, U. S., Gardel, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+traction+force+microscopy+for+micron-sized+focal+adhesions.">Optimization of traction force microscopy for micron-sized focal adhesions.</a> Journal of Physics. Condensed Matter. 22 (19), 194104 (2010).</li></ol>

Författarna har inget att avslöja.

DEN TFM-metod som beskrivs här möjliggör en systematisk studie av B-cellernas aktiva mekaniska förmåga. I samband med B-celler är detta relaterat till förmågan att extrahera och internalisera antigenet. Jämfört med andra TFM-metoder, det protokoll som presenteras här är enkel och ganska reproducerbara: styvheten, mätt genom indrag av ett glas mikrosfär och med hjälp av Hertz modell, är mellan 400 och 600 Pa. Liknande protokoll har framgångsrikt använts inte bara för B-celler35 men också för T-celler36. I jämförelse med nanopillars (används även för T-lymfocyter37) det ger en plan homogen yta, därav resultaten är lättare att tolka som samspelet av gelen är främst begränsad för att vara tangentiell till ytan.
Det protokoll vi beskrev ger tillgång till spatiotemporal dynamiken i de krafter som utövas av B-celler på antigen-presentera substrat. På den rumsliga nivån ger detta information om lokalisering av krafter, och i kombination med fluorescensmikroskopi, gör det möjligt för försöksmaskinen att korrelera lokala krafter med förekomsten av specifika molekyler (dvs. komponenter i cytoskeleton eller BCR-signaleringskaskad). På tidsnivå är det möjligt att integrera mängder (såsom total energi eller total stress) för att ge ett värde per tidpunkt och minska bullret. Detta möjliggör observation av utvecklingen av dragkraften i tid (tillväxt och platå) och förekomsten av pulsatila mönster.
Kritiska experimentella aspekter för analysen beskrivs som följande. i) Celltäthet: för att utföra en korrekt analys bör celler vara tillräckligt åtskilda. Vi anser att en cell kan analyseras om den har en tom region av egen storlek runt den. ii) Transmissionsbild: det är lämpligt att samla in åtminstone en transmissionsbild av cellerna under det experiment som ska användas som mask i analysen. (iii) Antal pärlor i bilden: vi föreslår att analysera endast bilder där antalet pärlor i synapsen är mellan 30 och 200 (dvs. 1–8 pärlor/μm²). Lägre tätheter tillåter inte för adekvat karta förskjutning återuppbyggnad. Höga pärltätheter gör en partikelspårning opålitlig. iv) Antal pärlor bör vara konstant under försöket; fluktuationer kan dock uppstå på grund av små variationer i bildförhållandena (särskilt hos pärlor som ligger för nära varandra). Fokusavdrift, om inträffar, måste korrigeras och problematiska ramar bör kasseras. (v) Gelkvalitet: geler med för många sprickor, variabilitet i pärlorsfördelning eller geler som är för tjocka ska kasseras. vi Beroende på celltyp kan celler vid sena tidpunkter (>300 bildrutor) efter upprepade exponeringar drabbas av fototoxiska effekter. Det är lämpligt att köra programmet på en mask saknar celler som en "baslinje" som skall jämföras med data. Detta ger en magnitud av bullernivån enbart på grund av de experimentella förhållandena.
Geler som används för att mäta dragkraft i klassisk vidhäftning möjliggör för undersökning av processer som sker vid fokal adhesion (aktinflöden och rekrytering av signalmolekyler)—de punkter där krafter appliceras38,39. Dock är krafter vid synapsen inte tillämpas genom fokala sammanväxningar. Den spatiotemporal mönster av kraft generation vid B-cellen immun synaps har inte undersökts kvantitativt med denna metod tills nyligen. Använda TFM, observerade vi för första gången, kraft mönstrar vid B-cellen immun synaps, som presenteras i vår senaste studie6, öppna uppmuntrande perspektiv i studien av lymfocyter.
Noterbart är att denna metod använder en bild som tagits före ankomsten av cellerna på gelen som en referensbild för kraftuträkningen. Vanliga TFM-protokoll föreslår att referensbilden tas i slutet av experimentet, efter att ha löst cellerna med trypsin; detta gör att experimenter att leta efter en region rik på celler. Även om detta är möjligt även här, trypsin är ganska ineffektivt på att lossa B-celler från antigen-belagda gel, måste man vänta länge för lossnar och risken för gel modifiering och rörelser (som gör hela datamängden oexploiterbar) är högre.
Den metod som presenteras här är flexibel och kan tillämpas för att studera effekten av andra signaler vid immunsynapsen eftersom den möjliggör ympning av andra proteiner på gelytan (t.ex. integrin ligander och immunglobuliner har testats) och även fluorescerande antigen (se avsnitt 4). Dessutom är cellerna fortfarande tillgängliga för försöksflamenten för läkemedelsbehandling och lokala perturbations. Slutligen är metoden också kompatibel med bildframställning fasta celler. För dessa observationer rekommenderas att göra gelen på ett täckskydd, färga cellerna, limma täcket på en bild och först därefter lägga till monteringsmedia och en annan täckbild. Observation kommer sedan att ske med gelen på toppen för att undvika nedbrytning av bilden genom gelen.
Möjliga fallgropar är variabiliteten i gel i polymerisering och beläggning. Polymerisationsproblem beror främst på kvaliteten på initiator/katalysator. Även gelen kan blåsa upp, särskilt om den inte används direkt efter montering. Detta problem verkar inte dramatiskt påverka gelens mekaniska egenskaper, men det kan göra pärlskiktet oantagbart för målet, vilket effektivt gör gelen värdelös. Vi rekommenderar att man förbereder extra geler för varje tillstånd när detta problem visas. Det kan också finnas en viss variation i beläggningen, och det är viktigt att ha nyligen utspädd Sulfo SANPAH.
Sammanfattningsvis har vi beskrivit en enkel, billig och reproducerbar metod för att mäta de krafter som utövas av B-celler vid den immunologiska synapsen när den aktiveras av BCR ligand. Den kan anpassas för att studera reaktionen på andra ligander och andra sorters lymfocyter (minnes B-celler, T-celler etc.) med användning av den rätta receptor liganden.

B-celler är de antikroppsproducerande cellerna i immunsystemet. För att aktivera det adaptiva immunsvaret förvärvar de först antigenet i en infödd form (dvs icke-bearbetad) genom en specifik receptor som kallas B-cellreceptor (BCR)1. Denna process sker i lymfkörtknuten B cellzonen. Även om vissa antigener kan nå B-cellen genom lymfvätskor, de flesta antigener, särskilt med hög molekylvikt (>70 kDa, som är gränsen storlek för lymfatiska ledningar) verkligen presenteras i sin inhemska form på ytan av en antigen presentera cell (APC), typiskt en subcapsular sinus makrofag eller follikulär dendritisk cell, genom lectin eller Fc receptorer (icke-specifika). Kontakten med denna cell leder till bildandet av en immunsynaps där BCR utövar kraft på de APC-associerade antigenerna. Bindningen av ett antigen till BCR initierar BCR-signalering, som kan aktivera kraftalstrande mekanismer. Dessa krafter kan vara viktiga för att förstärka BCR-signalering, men är också nödvändiga för B-celler att extrahera och sedan internalisera antigenet.
Nyligen genomförda studier har visat att BCR verkligen är mekanosenstiv2. Till exempel styvare substrat framkallar förstärkt BCR signalering3. Dessutom, kraft som genereras vid immun synapsen drar på enda BCRs att sond dess affinitet till antigen och därigenom säkerställa affinitet diskriminering4. Det är därför intressant att undersöka den mekaniska responsen av B-celler till antigen presentation och att dissekera detta svar i termer av typ av inblandade receptorer (IgG/ IgM)5, adhesion molekyler (integrin ligander) eller i farmakologiskt och genetiskt modifierade celler (dvs. tysta ett protein nedströms BCR signalering eller cytolesketon dynamik)6.
En enkel metod för att observera en cells respons på ett substrat av fysiologisk stelhet och samtidigt studiekrafter som utövas på substratet är Traction Force Microscopy (TFM). TFM består av att observera det förskjutningsfält som produceras av cellen dra på ett elastiskt substrat. Ursprungligen deformation av gelen observerades genom rynkor av elastomeren själv genom fas-kontrast mikroskopi7, men införandet av fluorescens microbeads som fiducial markörer tillåtet för bättre upplösning och har sedan dess blivit standard8. Denna metod har använts för att undersöka den dragkraft som utövas av anhängare celler, vävnader, och även organoider inbäddade i geler. Flera varianter av TFM har utvecklats9 inklusive, kombination med superresolution mikroskopi (dvs, STED10 eller SRRF11), modifiering av brytningsindex för gelen för att möjliggöra TIRF mikroskopi12, ersätter pärlor med nano-tryckta mönster13, och med hjälp av nanopillars i stället för plan yta14. För en fullständig genomgång av dessa variationer, se Colin-York et al.15.
Protokollet presenteras här beskriver ett förfarande för att mäta krafter som utövas av B-celler på en antigen-belagda substrat. Dessa krafter appliceras på liganderna (antigen) för att klustra dem och därefter utvinna dem ur det antigenpresentativa substratet. Vi har anpassat standard-TFM-protokollet för att efterlikna styvheten hos fysiologiska antigenpresentande substrat, storleken och den relevanta beläggningen för B-cellerna. Detta protokoll möjliggör studier av flera celler samtidigt och kan användas tillsammans med fluorescensmikroskopi tekniker och kemiska behandlingar. Det syftar dock inte till att sond enda molekyl kraft mätningar, för vilka optisk pincett16, molekylär spänning sonder17,18, biomembran kraft sonder19, och atomkraft mikroskopi20 är mer lämpliga tekniker. Jämfört med andra encelliga kraftmätningsmetoder (t.ex., mikropipettes21 eller mikroplattor22) tillåter TFM för rekonstruktion av en komplett karta över de krafter som utövas vid synapsen med en upplösning på ~300 nm. Detta är användbart för att identifiera spatio-temporala mönster i de krafter som utövas på ytan och, som gelen är kompatibel med confocal avbildning, att korrelera dem med rekrytering av specifika proteiner (till exempel cytoskelett och signalering proteiner).
Även om 3D TFM är möjligt, är det inte förenligt med styvhet och setup vi använde. Deformationer i 3D kan uppnås genom andra mer komplexa uppställningar såsom utsprång kraft mikroskopi (AFM skanning en deformerbar membran där cellerna är pläterade)23,24 ochelastisk resonator störningar stress mikroskopi (ERISM, en gel som fungerar som resonans hålighet för ljus och belysa deformationer av substratet med noggrannhet på några nanometer)25. Även om dessa tekniker är mycket lovande, har de ännu inte varit anställda i B-celler. Andra typer av TFM, såsom på nanopillars14, skulle kunna användas för att ha mer reproducerbara substrat. Denna geometri är dock inte anpassad till mjuka celler då cellen interpenetrates pelarna, vilket komplicerar analysen. Detta tillvägagångssätt har verkligen använts i T-celler för att observera cellens förmåga att bygga strukturer runt pelarna26.
Trots sin enkelhet, TFM med hjälp av polyakrylamid geler möjliggör samtidig observation av många celler och kan enkelt och billigt genomföras i alla lab utrustad med en bänk och en epifluorescens mikroskop (även om vi rekommenderar confocal/spinning disk).
För att efterlikna den fysiologiska styvheten hos en APC använde vi polyakrylamidgeler med en styvhet på ~500 Pa27 och funktionaliserade gelen med aktiverande antigener. I detta protokoll, vi funktionaliserade ytan av polyacrylamide gel med hen ägg lysozym (HEL). Detta möjliggör mätning av krafter som genereras genom stimulering av BCR genom engagemang av antigenbindningsstället. Användningen av detta antigen och de HEL-specifika B-cellerna från MD4-möss säkerställer relativt enhetlig kraftgenerering som svar på antigenligering28. Andra molekyler (såsom anti-IgM för B6-möss) kan dock ympas på gelen, men de krafter som genereras i dessa fall kan vara mer heterogena och mindre intensiva. Eftersom B-celler är små celler (diameter ~6 μm) har antalet pärlor optimerats för att vara maximalt men ändå spårbart. För stora celler som utövar ~kPa-krafter på sina substrat kan man uppnå tillfredsställande resultat med hjälp av relativt glesa pärlor eller utföra enkla partikelbildshastigheter (PIV) för att rekonstruera deformationsfältet. Men för små celler som B-lymfocyter som utövar stress så liten som ~ 50 Pa, är användningen av en partikel spårning krävs (partikel spårning velocimetry, PTV) för att uppnå önskad noggrannhet vid rekonstruera deformation fältet. För att på ett tillförlitligt sätt spåra pärlor individuellt, förstoringen av objektivet linsen måste vara minst 60x och dess numeriska bländare runt 1,3. Således måste gelerna vara relativt tunna (<50 μm), annars är pärlorna inte synliga eftersom de är över målets arbetsavstånd.
Huvudprotokollet består av tre sektioner: gelberedning, gelfunktionalisering och bildframställning; två avsnitt till är frivilliga och är dedikerade till antigenutvinningskvantering och avbildning av fluorescerande celler.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1224px;" width="1225">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:583px;">3-aminopropyltrimethoxysilane (APTMS)</td>
			<td style="width:285px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:177px;">281778</td>
			<td style="width:179px;">Store aliquoted, protected from humidity</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">40% Acrylamide Solution</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1610140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa555 microscale protein labeling kit</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A30007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ammonium Persulfate (APS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">B cell Isolation Kit, Mouse</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">B-mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31350-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2% Bis Solution</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>161-0142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>04-100-812-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Coverslip 18mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-1580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal calf serum</td>
			<td>PAA</td>
			<td>A15-151</td>
			<td>Decomplemented (40min @56&#176;C)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fluorodishes FD35</td>
			<td>World Precision Instruments, Inc</td>
			<td>FD35100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fluosphere: carboxylate-modified, 0.2um, dark red</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>F8807</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hen Egg Lysozyme</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6876</td>
			<td>Stocked in aliquote 100mg/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)</td>
			<td>Thermofisher/Gibco</td>
			<td>11140035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N,N,N&#39;,N&#39;-tetrametiletilendiammine (TEMED)</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>50406-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS (Phosfate Buffer Saline)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin&#8211;streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RMPI 1640 &#8211; Glutamax I</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>61870-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sigmacote</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SL2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360-039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sulfosuccinimidyl 6-(4&#39;-azido-2&#39;-nitrophenylamino)hexanoate (Sulfo-SANPAH)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>22589</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

traction force microscopy to study b lymphocyte activation

Traction force microscopy (TFM) möjliggör mätning av krafter som produceras av en cell på ett substrat. Denna teknik härda slutsatsen dragkraft mätningar från ett experimentellt observerade förskjutning fält som produceras av en cell drar på ett elastiskt substrat. Här anpassade vi TFM för att undersöka den rumsliga och tidsmässiga strukturen hos kraftfältet som utövas av B-celler när de aktiveras av antigen engagemang av B-cellens receptorn. Gelstelitet, pärldensitet och proteinfunktionalisering måste optimeras för studier av relativt små celler (~ 6 μm) som interagerar med, och svarar specifikt på ligander för cellytreceptorer.

Med tanke på storleken på cellerna, algoritmer som extraherar förskjutningskartan av pärlorna via korrelativa tekniker (såsom partikelbildshastighet) är i allmänhet inte särskilt exakt. Men beroende på graden av upplösning som krävs, kan man enkelt få kvalitativa resultat med hjälp av en fri Fiji / ImageJ plugin31,32. Medan detta tillvägagångssätt är tillräckligt för att jämföra stimulerande kontra icke-stimulerande förhållanden, för en grundlig analys rekommenderar vi att du använder vår programvara nedladdningsbar från en online-lagringsplats30, som spårar pärlorna individuellt och ger förskjutningsfältskartan vid en viss tidpunkt som interpolationen av de enskilda pärla förskjutningar33. Flera kvantifieringar är möjliga i detta läget. Till exempel (genom att anta förskjutningen orsakas endast av stress tangentiell till gelen yta) programvaran ger också stressen vid varje punkt orsakar att specifika förskjutning karta. Detta är en typ av "inversion problem": förskjutningen vid en viss punkt beror på summan av alla krafter som tillämpas över de andra punkterna. "Inversionsalgoritmen" tar hänsyn till substratets fysiska parametrar: dess styvhet (Young modulus) och Poisson-förhållande. Direkta algoritmer är vanligtvis mycket exakta men beräkningsmässigt dyra. Algoritmer baserade på Fourier transform, liksom vår, utföra i huvudsak en deconvolution i Fourier rymden och är mer effektiva men benägna att vissa fel (främst på grund av interpolation steg). Dessa algoritmer kräver allmänt att trimma av en parameter som förhindrar lilla lokal (och potentiellt artifactual) förskjutningar för att bli för relevant i uträkningen av stressen sätter in (Tikhonov regularizationparameter8,29; "Regularization" variabel i dialogfönstret; här vi typiskt ställa lika med 5 x 10-19). För mer avancerad tolkning och analys, såsom spatio-temporala korrelationer, lokala rörelser, korrelationer med fluorescerande kanaler, rekommenderar vi att samarbeta med experter inom området. För en översyn av beräkningsmetoder se Schwarz et al.9.
Som nämnts ovan, korrekt pärla bilder ser ut som en "stjärnhimmel", en enhetlig och slumpmässig fördelning av ljusa fläckar (Figur 2A). Data och analys är inte tillförlitliga när antalet pärlor är för lågt (Bild 2B) eller bilden är ur fokus (Bild 2C). När B-celler har bosatt sig på ytan av gelen, pärlorna under cellerna börjar röra sig på grund av dragkraft utövas av cellen på gelen. Ramar som pärlorna inte är spårbara för ska kasseras.
Som kontroll är det möjligt att genom öga observera förflyttning av pärlor som jämför "referensramen", typiskt den som föregår cellens första kontakt med substratet. Ungefärliga resultat kan erhållas från den enda partikelspårningen (t.ex., Trackmate, Fiji 34) som gjort i figur 3A. Analysen ger en segmentering av pärlorna i referensbilden ("FILENAME.fig") som en kontroll.
Med den programvara vi föreslår kan man få förskjutningen (Figur 3B) och stressfältet (den lokala stressens vektor vid varje pixel och varje tidspunkt som erhålls genom inversion från förskjutningsfältet, Figur 3C). Skalär produkt av de förskjutning och kraftfält integrerade på cellens areal ger totalt arbete som utövas av cellen på underlaget (Figur 4A). Denna beräkning kräver masken av cellen som infördes i steg 6.2 av protokollet.
För att jämföra två biologiska förhållanden (som aktiverande HEL kontra icke-aktiverande substrat BSA, eller vild typ kontra knock-out) är det praktiskt att beräkna den genomsnittliga kurvan (Figur 4B) eller, ännu mer syntetiskt, ett genomsnittsvärde under de senaste tidspunkterna (20 min) där energin når en platå (Figur 4C). När den rumsliga informationen av styrkorna är relevant är det möjligheten som jämför singeltidpunkter av varje villkorar (bild 4D). Hänvisa till Kumari et al.6 för djupare analys.
Ett exempel på fluorescensantigenutdragningstidsfördröjning visas i figur 5A: det progressiva utseendet av fluorescenssignaler vid synapsen indikerade antigenavlossning från gelen. Den genomsnittliga extraktionskurvan med sitt konfidensintervall (standardfel för medelvärdet) över 15 celler visas i figur 5B.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60947/60947fig1v2.jpg"> Bild 1: Schematisk visning av beredningen av gelén och dess funktionalisering. Steg beskrivs i protokollet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60947/60947fig1v2large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60947/60947fig2.jpg"> Figur 2: Tre exempel på pärlbilder av olika kvaliteter. ( A )Exempelpå pärlbild med rätt signal-till brusförhållande och rätt densitet. (B) Exempel på bilder med ett för otillräckligt antal pärlor och (C) ur fokus plan. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60947/60947fig2large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60947/60947fig3.jpg"> Bild 3: Bearbetning av bilderna för att extrahera kraftfältet. (A) Exempel på en bild av pärlorna (kontur av cellen i vitt, extraherad från transmissionsbilden), pärlspårning vid tiden t = 5 min (röd övertäckning) och förskjutning (pilar) i förhållande till tiden t = 0 min (skala bar 5 μm). (B) Interpolerade förskjutningsfält (representerat som vektor koger och magnitud karta, pilar är proportionella mot förskjutningen [nm]; se färgfältet till höger); botten: en jämnare bild av magnituden (erhållen genom interpolation med bikubisk funktion). (C) Stressfält från förskjutningsfält i panel B (representerat som vektorkyr och magnitudkarta; pilarna är proportionella mot skjuvningsstressen [Pa]; se färgfältet till höger); botten: en jämnare bild av magnituden (erhållen genom interpolation med bikubisk funktion). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60947/60947fig3large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60947/60947fig4.jpg"> Figur 4: Exempel på information som kan extraheras från kraft- och förskjutningsfält. (A) Exempel på utveckling av energi i tid för en enda cell: en platåfas (markerad i grått) dyker upp efter ca 10 min. (B) Jämförelse av de genomsnittliga energikurvorna och (C) av de relativa platånivåerna för 65 celler pläterade på HEL (aktiverande) belagda gel och 35 celler på BSA (icke-aktiverande) belagda gel (medianen för ± interquartila intervall visas, Mann- Whitney-test användes för statistisk signifikans). (D) Time-lapse färgkartor av stress för HEL och kontroll BSA skick; både magnitud och koger tomter visas. Dessa bilder har anpassats från Kumari et al.6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60947/60947fig4large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60947/60947fig5.jpg"> Figur 5: Exempel på experiment med fluorescerande antigen. (A) Tidsförlopp för extraktion av fluorescerande HEL (nedan: procent av den maximala, skalstång = 3μm). (B) Antigen insamling över tiden (Mean ± SEM, n = 15). Dessa bilder har anpassats från Kumari et al.6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60947/60947fig5large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Traction Force Microscopy to Study B Lymphocyte Activation at JoVE.com

Traction Force Microscopy to Study B Lymphocyte Activation

Här presenterar vi ett protokoll som används för att utföra traction force mikroskopi experiment på B-celler. Vi beskriver beredningen av mjuka polyakrylamid geler och deras funktionalisering, samt data förvärv i mikroskopet och en sammanfattning av data analys.

Traction Force Mikroskopi till studie B lymfocyt Aktivering

Traction force microscopy (TFM) enables the measurement of forces produced by a cell on a substrate. This technique infers traction force measurements ...

Denna metod gör det möjligt att mäta den rumsliga temporala fördelningen av de krafter som tillämpas av B-celler vid immunsynaps och korrelerar dem med rekrytering av specifika proteiner. Traction force mikroskopi med hjälp av polyakrylamid geler är lätt att genomföra. Detta protokoll kan användas för att snabbt ställa in mätningen av de mekaniska möjligheterna hos många B-celler.Denna metod är flexibel och kan anpassas till graf andra ligander som integrins eller att studera andra typer av immun synapser som T-celler eller frustrerade fagocytos. På grund av de fysiska och kemiska egenskaper hos gelerna som krävs av detta experiment, kan anpassning av klassisk dragkraft mikroskopi metoder till B-celler vara knepigt. Börja med att salinisera gelstödet.Aktivera täckplattan eller glasbotten Petriskålen med en UV-lampa i två minuter och fräs sedan den med 200 mikroliter APTMS i fem minuter. Detta kommer att förbereda stödet för den kovalenta bindningen av gelen. Tvätta noggrant täckplattan eller glasbottenskålen med ultrarent vatten och torka den med hjälp av vakuumaspiration.För att förbereda täcken för att platta gelen, lägg dem i en keramisk täckpapper hållare, sätta hållaren i en liten bägare, och häll silikoniserande reagens över täcken se till att täcka dem helt. Täck bägaren med aluminiumfolie och låt den stå i rumstemperatur i tre minuter. Under tiden, fyll en stor bägare med ultra rent vatten.Efter tre minuters inkubation i silikoniserande reagens, överför du täckskyddshållaren med täcken till bägaren med vatten. Skölj noggrant täckskydden med ultra rent vatten. Torka dem väl och placera dem på pappersservetter.För bästa resultat, fortsätt omedelbart med gelpolymerisering. Förbered en 500 Pascal gel pre-mix enligt manuskriptet riktningar, sedan kombinera 167 mikroliter av pre-mix med 1,67 microliters av pärlor. Vortex och sonikera blandningen i ett bad sonicator i fem minuter.Skydda blandningen mot ljus med aluminiumfolie. För att kapitalisera polymerisering, tillsätt 1,67 mikroliter av 10%ammoniumpersulfate till gelmixen, sedan initiera polymerisering genom att lägga till 0,2 mikroliter av TEMED och blanda gelen med en pipett. För att gjuta gelen, pipett nio mikroliter av gel blanda på varje salinized täckskydd eller glas botten skålen.Omedelbart platta gelen med silikoniserade coverslip, trycka ner på den med tlysen för att säkerställa att gelen sprider sig över hela området av täckplattan och att en del av det läcker ut. Invertera täckplattan eller glasbottenskålen till en stor petriskål och knacka på den på bänken för att tvinga pärlorna mot gelytan. Placera en befuktad vävnad på skålen för att skapa en våt kammare.Täck den med aluminiumfolie och inkubera den i en timme. Efter inkubationen, underlätta coverslip release genom att lägga PBS till provet. Ta försiktigt bort täcket med en nål, något luta skålen men se till att gelen är nedsänkt i PBS.Silikonmedel, akrylamid, bascrylamide, och TEMED kan vara giftiga genom inandning. Använd standard personlig skyddsutrustning och manipulera dessa produkter under en kemisk huva. Aspirera PBS från gelerna och tillsätt 150 mikroliter Sulfo-SANPAH i rumstemperatur.Utsätt gelen för UV-behandling i två minuter, tvätta sedan gelen tre gånger med PBS. Upprepa behandlingen med Sulfo-SANPAH och PBS tvättar, tillsätt sedan 250 mikroliter av hen ägg lysozym eller HEL till gelén och inkubera den över natten i en luftfuktighetskammare vid fyra grader Celsius täckt med aluminiumfolie. Efter inkubationen tar du bort HEL-antigenet och tvättar gelen med PBS tre gånger.Slutligen, täck gelen med 500 mikroliter av B-cellkultur media och lämna den i rumstemperatur. Använd ett konfokalmikroskop med värme- och koldioxidkontroll för avbildning. Aspirera media från gelén och lämna cirka 200 mikroliter.Placera gelen på mikroskopet. Två huvudlager av pärlor kommer att visas på botten och toppen av gelén. Fokusera på gelplanet och hitta ett jämnt område till bild.Välj bildområdet noggrant och se till att hålla fokus. En lämplig pärldensitet och en jämn yta är nyckeln till att erhålla robusta och tillförlitliga kraftmätningar. Tillsätt 80 mikroliter av primära B-lymfocyter från MD4-möss till gelen, undvik att röra gelen för att behålla fokus.Se till att fokus fortfarande är korrekt och att celler kan ses fallande i området. Starta förvärvet innan cellerna når gelen. Öppna filmen som en hög med bilder i ImageJ och kör sedan makrobeskärningen ochsave.ijm.Välj en utdatakatalog och konfigurera inställningarna för attributkanal. Markera de områden av intresse med rektangelverktyget och lägg till dem i roi-listan med hjälp av T-tangenten. Klicka på OK när du är klar. När makrot föreslår en mask av cellen klickar du på OK om det är tillfredsställande.Om inte tillfredsställande, klicka inte OK och sedan manuellt välja en stängd region med något markeringsverktyg, klicka sedan på Fortsätt. Öppna MATLAB och kör tfmv1.m. Mata in de parametrar som krävs.Specifikt, kontrollera bildegenskaper, till exempel pixelstorlek och tidsintervall för förvärv och gelegenskaperna som Young modulus E och Poisson ratio. När du är klar, leta reda på utgångarna av programvaran i samma katalog som den ursprungliga filen. Korrekt pärla bilder ser ut som en enhetlig och slumpmässig fördelning av ljusa fläckar som liknar en stjärnhimmel.Data och analys är inte tillförlitliga när antalet pärlor är för lågt eller bilden är ur fokus. Det är möjligt att observera förflyttning av pärlor genom ögat med hjälp av en referensram som föregick den första kontakten av cellen med substratet. Ungefärliga resultat kunde erhållas från enstaka partikelspårning.Analysen ger en segmentering av pärlorna i referensbilden som en kontroll. Med hjälp av programvara är det också möjligt att få förskjutning och stress fält, som är vektor för den lokala stressen vid varje pixel och varje tidpunkt punkt. Skalär produkt av de förskjutning och kraftfält integrerade på området av cellen ger totalt arbete som utövas av cellen på substratet.Vid jämförelse av två biologiska förhållanden kan en genomsnittlig kurva eller ett genomsnittsvärde under de senaste tidpunkterna där energin når en platå beräknas. När rumslig information av krafterna är relevant, är det också möjligt att jämföra enstaka tidpunkter för varje villkor. Ett exempel på fluorescensantogenutdragning time-lapse visas här.Det progressiva utseendet av fluorescerande signaler vid synapsen indikerar antigenavlossning från gelen. Fluorescensdata kan användas för att konstruera en genomsnittlig extraktionskurva. Det mest känsliga steget i protokollet är polymerisationen av gelen under täcket.Detta steg måste utföras relativt snabbt och noggrant se till att gelen pressas jämnt under täcket. Efter detta förfarande kan fluorescerande protein uttrycker B lymfocyter användas för att samtidigt bedöma lokalisering av intracellulära strukturer och kraft mönstrar. Denna teknik kan kombineras med genetiska eller kemiska perturbationer för att bedöma specifika proteiners roll på cellkontraktilitet och antigenupptag.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bacterial Immobilization for Imaging by Atomic Force Microscopy

Bakteriell Immobilisering for Imaging genom atomkraftsmikroskopi

AFM is a high-resolution (nm scale) imaging tool that mechanically probes a surface.  It has the ability to image cells and biomolecules, in a liquid ...

Visualization of Recombinant DNA and Protein Complexes Using Atomic Force Microscopy

Visualisering av Rekombinant DNA och proteinkomplex Använda atomkraftsmikroskopi

Atomic force microscopy (AFM) allows for the visualizing of individual proteins, DNA molecules, protein-protein complexes, and DNA-protein complexes. On ...

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Design av en cyklisk tryck Bioreaktor för Ex vivo Studie av Aorta hjärtklaffar

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

A Novel Method for Localizing Reporter Fluorescent Beads Near the Cell Culture Surface for Traction Force Microscopy

En ny metod för att lokalisera Reporter Fluorescent Pärlor Nära Cell Culture Yta för Traction Force Microscopy

PA gels have long been used as a platform to study cell traction forces due to ease of fabrication and the ability to tune their elastic properties. When ...

Surface Potential Measurement of Bacteria Using Kelvin Probe Force Microscopy

Ytpotential Mätning av bakterier Använda Kelvin Probe Force Microscopy

Surface potential is a commonly overlooked physical characteristic that plays a dominant role in the adhesion of microorganisms to substrate surfaces. ...

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

Atomic Force Microscopy Imaging och Force-spektra enligt stöds lipiddubbelskikt

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

A High-throughput Cell Microarray Platform for Correlative Analysis of Cell Differentiation and Traction Forces

En hög kapacitet Cell microarray plattform för Korrelat analys av celldifferentiering och dragkrafter

Microfabricated cellular microarrays, which consist of contact-printed combinations of biomolecules on an elastic hydrogel surface, provide a tightly ...

High Throughput Traction Force Microscopy Using PDMS Reveals Dose-Dependent Effects of Transforming Growth Factor-&#946; on the Epithelial-to-Mesenchymal Transition

High Throughput Traction Force Microscopy Using PDMS Reveals Dose-Dependent Effects of Transforming Growth Factor-ÃƒÅ½Ã‚Â² on the Epithelial-to-Mesenchymal Transition

Hög genomströmning dragkraft mikroskopi med PDMS avslöjar dosberoende effekter omvandla tillväxtfaktor-β på epitelial-till-mesenkymala övergång

Cellular contractility is essential in diverse aspects of biology, driving processes that range from motility and division, to tissue contraction and ...

Fabrication and Implementation of a Reference-Free Traction Force Microscopy Platform

Tillverkning och implementering av en referens fri dragkrafts mikroskopi plattform

Quantifying cell-induced material deformation provides useful information concerning how cells sense and respond to the physical properties of their ...

Traction Microscopy Integrated with Microfluidics for Chemotactic Collective Migration

Traktionsmikroskopi integrerat med mikrofluidik för Chemotactic kollektiv migration

Cells change migration patterns in response to chemical stimuli, including the gradients of the stimuli. Cellular migration in the direction of a chemical ...