Name: conventional bodipy conjugates for live-cell super-resolution microscopy and single-molecule tracking
Uploaded: 2020-06-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Conventional BODIPY Conjugates for Live-Cell Super-Resolution Microscopy and Single-Molecule Tracking at JoVE.com

Исследование, о проислизировавее в этой публикации, было поддержано Национальным институтом общих медицинских наук Национальных институтов здравоохранения под номером премии R21GM127965.

ПРИМЕЧАНИЕ: Для клонирования дрожжей и эндогенных пометок пожалуйста, обратитесь к нашей недавней публикации10.
1. Подготовка образцов дрожжевых клеток для визуализации
<ol><li>Подготовьте жидкую ночную культуру штамма дрожжей w303. Используя стерильную деревя?...

<ol>
	<li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+(STORM).">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nature Methods. 3 (10), 793-796 (2006).</li><li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution.">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).</li><li>Manley, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-density+mapping+of+single-molecule+trajectories+with+photoactivated+localization+microscopy.">High-density mapping of single-molecule trajectories with photoactivated localization microscopy.</a> Nature Methods. 5 (2), 155-157 (2008).</li><li>Wu, C. -. Y., Roybal, K. T., Puchner, E. M., Onuffer, J., Lim, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remote+control+of+therapeutic+T+cells+through+a+small+molecule-gated+chimeric+receptor.">Remote control of therapeutic T cells through a small molecule-gated chimeric receptor.</a> Science. 350 (6258), 4077 (2015).</li><li>Heilemann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subdiffraction-resolution+fluorescence+imaging+with+conventional+fluorescent+probes.">Subdiffraction-resolution fluorescence imaging with conventional fluorescent probes.</a> Angewandte Chemie. 47 (33), 6172-6176 (2008).</li><li>Cordes, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolving+single-molecule+assembled+patterns+with+superresolution+blink-microscopy.">Resolving single-molecule assembled patterns with superresolution blink-microscopy.</a> Nano Letters. 10 (2), 645-651 (2010).</li><li>Smith, E. M., Gautier, A., Puchner, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Molecule+Localization+Microscopy+with+the+Fluorescence-Activating+and+Absorption-Shifting+Tag+(FAST)+System.">Single-Molecule Localization Microscopy with the Fluorescence-Activating and Absorption-Shifting Tag (FAST) System.</a> ACS chemical biology. 14 (6), 1115-1120 (2019).</li><li>Yan, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+microscopy+using+noncovalent+fluorogen+activation+by+genetically+encoded+fluorogen-activating+proteins.">Localization microscopy using noncovalent fluorogen activation by genetically encoded fluorogen-activating proteins.</a> Chemphyschem: A: European Journal of Chemical Physics and Physical Chemistry. 15 (4), 687-695 (2014).</li><li>Jungmann, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+super-resolution+imaging+with+qPAINT.">Quantitative super-resolution imaging with qPAINT.</a> Nature Methods. 13 (5), 439-442 (2016).</li><li>Adhikari, S., Moscatelli, J., Smith, E. M., Banerjee, C., Puchner, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+localization+microscopy+and+tracking+with+red-shifted+states+of+conventional+BODIPY+conjugates+in+living+cells.">Single-molecule localization microscopy and tracking with red-shifted states of conventional BODIPY conjugates in living cells.</a> Nature Communications. 10 (1), 1-12 (2019).</li><li>Bergstr&#246;m, F., Mikhalyov, I., H&#228;ggl&#246;f, P., Wortmann, R., Ny, T., Johansson, L. B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dimers+of+dipyrrometheneboron+difluoride+(BODIPY)+with+light+spectroscopic+applications+in+chemistry+and+biology.">Dimers of dipyrrometheneboron difluoride (BODIPY) with light spectroscopic applications in chemistry and biology.</a> Journal of the American Chemical Society. 124 (2), 196-204 (2002).</li><li>Br&#246;ring, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bis(BF2)-2,2'-bidipyrrins+(BisBODIPYs):+highly+fluorescent+BODIPY+dimers+with+large+stokes+shifts.">Bis(BF2)-2,2'-bidipyrrins (BisBODIPYs): highly fluorescent BODIPY dimers with large stokes shifts.</a> Chemistry (Weinheim an Der Bergstrasse, Germany). 14 (10), 2976-2983 (2008).</li><li>Mikhalyov, I., Gretskaya, N., Bergstr&#246;m, F., Johansson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electronic+ground+and+excited+state+properties+of+dipyrrometheneboron+difluoride+(BODIPY):+Dimers+with+application+to+biosciences.">Electronic ground and excited state properties of dipyrrometheneboron difluoride (BODIPY): Dimers with application to biosciences.</a> Physical Chemistry Chemical Physics. 4 (22), 5663-5670 (2002).</li><li>Pagano, R. E., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+BODIPY-labeled+sphingolipids+to+study+membrane+traffic+along+the+endocytic+pathway.">Use of BODIPY-labeled sphingolipids to study membrane traffic along the endocytic pathway.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 845, 152-160 (1998).</li><li>Bergstr&#246;m, F., H&#228;ggl&#246;f, P., Karolin, J., Ny, T., Johansson, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+site-directed+fluorophore+labeling+and+donor-donor+energy+migration+to+investigate+solution+structure+and+dynamics+in+proteins.">The use of site-directed fluorophore labeling and donor-donor energy migration to investigate solution structure and dynamics in proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (22), 12477-12481 (1999).</li><li>Kowada, T., Maeda, H., Kikuchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BODIPY-based+probes+for+the+fluorescence+imaging+of+biomolecules+in+living+cells.">BODIPY-based probes for the fluorescence imaging of biomolecules in living cells.</a> Chemical Society Reviews. 44 (14), 4953-4972 (2015).</li><li>Rocha, J. M., Gahlmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Molecule+Tracking+Microscopy+-+A+Tool+for+Determining+the+Diffusive+States+of+Cytosolic+Molecules.">Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (151), (2019).</li><li>Sage, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+fight+club:+assessment+of+2D+and+3D+single-molecule+localization+microscopy+software.">Super-resolution fight club: assessment of 2D and 3D single-molecule localization microscopy software.</a> Nature Methods. 16 (5), 387-395 (2019).</li><li>Ovesn&#253;, M., K&#345;&#237;&#382;ek, P., Borkovec, J., Svindrych, Z., Hagen, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ThunderSTORM:+a+comprehensive+ImageJ+plug-in+for+PALM+and+STORM+data+analysis+and+super-resolution+imaging.">ThunderSTORM: a comprehensive ImageJ plug-in for PALM and STORM data analysis and super-resolution imaging.</a> Bioinformatics. 30 (16), 2389-2390 (2014).</li><li>Puchner, E. M., Walter, J. M., Kasper, R., Huang, B., Lim, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Counting+molecules+in+single+organelles+with+superresolution+microscopy+allows+tracking+of+the+endosome+maturation+trajectory.">Counting molecules in single organelles with superresolution microscopy allows tracking of the endosome maturation trajectory.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (40), 16015-16020 (2013).</li><li>Shim, S. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+fluorescence+imaging+of+organelles+in+live+cells+with+photoswitchable+membrane+probes.">Super-resolution fluorescence imaging of organelles in live cells with photoswitchable membrane probes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (35), 13978-13983 (2012).</li><li>Hansen, A. S., Woringer, M., Grimm, J. B., Lavis, L. D., Tjian, R., Darzacq, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+model-based+analysis+of+single-particle+tracking+experiments+with+Spot-On.">Robust model-based analysis of single-particle tracking experiments with Spot-On.</a> eLife. 7, (2018).</li><li>Bittel, A. M., Saldivar, I. S., Dolman, N. J., Nan, X., Gibbs, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superresolution+microscopy+with+novel+BODIPY-based+fluorophores.">Superresolution microscopy with novel BODIPY-based fluorophores.</a> PLoS ONE. 13 (10), (2018).</li><li>Wijesooriya, C. S., Peterson, J. A., Shrestha, P., Gehrmann, E. J., Winter, A. H., Smith, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Photoactivatable+BODIPY+Probe+for+Localization-Based+Super-Resolution+Cellular+Imaging.">A Photoactivatable BODIPY Probe for Localization-Based Super-Resolution Cellular Imaging.</a> Angewandte Chemie (International Ed. in English). 57 (39), 12685-12689 (2018).</li><li>Laissue, P. P., Alghamdi, R. A., Tomancak, P., Reynaud, E. G., Shroff, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+phototoxicity+in+live+fluorescence+imaging.">Assessing phototoxicity in live fluorescence imaging.</a> Nature Methods. 14 (7), (2017).</li><li>W&#228;ldchen, S., Lehmann, J., Klein, T., van de Linde, S., Sauer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-induced+cell+damage+in+live-cell+super-resolution+microscopy.">Light-induced cell damage in live-cell super-resolution microscopy.</a> Scientific Reports. 5, 15348 (2015).</li><li>Grimm, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+method+to+fine-tune+fluorophores+for+live-cell+and+in+vivo+imaging.">A general method to fine-tune fluorophores for live-cell and in vivo imaging.</a> Nature methods. 14 (10), 987-994 (2017).</li></ol>

В этом протоколе мы продемонстрировали, как обычные конъюгированные BODIPY могут быть использованы для получения изображений SMLM с улучшением пространственного разрешения на порядок. Этот метод основан на использовании ранее сообщалось, красно-сдвинутые DII состояния обычных краси?...

Одномолекулярная локализация микроскопии (SMLM) методы, такие как стохастической оптической реконструкции микроскопии (STORM) и фото-активированной локализации микроскопии (PALM) появились как методы для генерации супер-разрешение изображения с информацией за пределами оптического дифракции Абба предел1,2 и для отслеживания динамики отдельных биомолекул3,4. Одним из требований к зондам, совместимым с SMLM, является возможность контролировать количество активных фторфоров в любое время, чтобы избежать пространственного перекрытия их функций точечного распространения (PSF). В каждом из тысяч кадров для сбора данных местоположение каждого флуоресцентного флуорофора определяется с точностью 20 нм, устанавливая соответствующую функцию точечного распространения. Традиционно, выключенное мигание фторофоров было контролироваться через стохастические фотопереключения1,,2,,5 или химически индуцированного внутреннего мигает6. Другие подходы включают индуцированной активации флюорогенов при переходных связывания с флюорогеновым активированием белка7,,8 и программируемой связывания-несвязывающей помеченных олигомеров ДНК в общей внутренней флуоресценции отражения (TIRF) или возбуждения светового листа9. Недавно мы сообщили о новой и универсальной стратегии маркировки для SMLM10, в которой ранее сообщалось красно-сдвиной димерической (DII) состояния обычных бор ди-пирометан (BODIPY) конъюгирует11,12,13являются специально возбужденных и обнаружены с красными сдвинутых волн.13
BODIPYs широко используются красители с сотнями вариантов, которые специально этикетки субклеточных отсеков и биомолекул14,15,16. Из-за их простоты использования и применимости в живых клетках, варианты BODIPY коммерчески доступны для обычной флуоресценции микроскопии. Здесь мы описываем подробный и оптимизированный протокол о том, как сотни коммерчески доступных конъюгатов BODIPY могут быть использованы для живых ячеек SMLM. Путем настройки концентрации мономеров BODIPY и оптимизации лазерных функций возбуждения, параметров визуализации и анализа данных, в живых клетках получаются высококачественные изображения суперразрешения и данные слежения за одной молекулой. При использовании при низкой концентрации (25-100 нм), конъюгированные bodiPY могут быть одновременно использованы для SMLM в красно-сдвигаемканале и для корреляционной обычной флуоресценции микроскопии в обычном канале выбросов. Полученные данные одной молекулы могут быть проанализированы для количественной оценки пространственной организации неподвижных структур и извлечения диффузивных состояний молекул в живых клетках17. Наличие зондов BODIPY в зеленых и красных формах позволяет использовать многоцветные изображения при правильном сочетании с другими совместимыми флюорофорами.
В этом отчете мы предоставляем оптимизированный протокол для получения и анализа данных SMLM с живыми ячейками с использованием BODIPY-C12, BODIPY (493/503), BODIPY-C12 красного и lysotracker-зеленого цвета в нескольких цветах. Мы разрешаем жирные кислоты и нейтральные липиды в живых дрожжах и клетках млекопитающих с разрешением 30 нм. Мы также демонстрируем, что дрожжевые клетки регулируют пространственное распределение внешних жирных кислот в зависимости от их метаболического состояния. Мы находим, что добавленные БОДИПИ-жирные кислоты (FA) локализуются в эндоплазмический ретикулум (ER) и липидные капли (ЛД) в условиях fed, в то время как BODIPY-FAs образуют не-LD кластеры в плазменной мембране после поста. Мы также расширяем применение этого метода для изображения лизосомы и LDs в живых клетках млекопитающих. Наш оптимизированный протокол для SMLM с использованием обычных конъюгетов BODIPY может быть полезным ресурсом для изучения биологических процессов на наноуровне с множеством доступных конъюги BODIPY.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1009px;" width="1008">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">BODIPY C12</td>
			<td style="width:196px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:173px;">D3822</td>
			<td style="width:265px;">Green fatty acid analog</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">BODIPY C12 Red</td>
			<td style="width:196px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:173px;">D3835</td>
			<td>Red fatty acid analog</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">BODIPY(493/503)</td>
			<td style="width:196px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:173px;">D3922</td>
			<td>Neutral lipid marker</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Concanavalin A</td>
			<td style="width:196px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:173px;">C2010</td>
			<td>Cell immobilization on glass surface</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Drop-out Mix Complete w/o nitrogen base</td>
			<td style="width:196px;">US Biological</td>
			<td style="width:173px;">D9515</td>
			<td>Amino acids for SCD</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Dextrose</td>
			<td style="width:196px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:173px;">G7021</td>
			<td>Carbon source for SCD</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Eight Well</td>
			<td style="width:196px;">Cellvis</td>
			<td style="width:173px;">C8-1.58-N</td>
			<td>Chambered Coverglasses</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Eight Well, Lb-Tek II</td>
			<td style="width:196px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:173px;"></td>
			<td>Chambered Coverglasses</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">ET525/50</td>
			<td style="width:196px;">Chroma</td>
			<td style="width:173px;"></td>
			<td>Bandpass filter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">ET595/50</td>
			<td style="width:196px;">Chroma</td>
			<td style="width:173px;"></td>
			<td>Bandpass filter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">ET610/75</td>
			<td style="width:196px;">Chroma</td>
			<td style="width:173px;"></td>
			<td>Bandpass filter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:196px;">Gibco</td>
			<td style="width:173px;">26140079</td>
			<td>Serum</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">FF652</td>
			<td style="width:196px;">Semrock</td>
			<td style="width:173px;"></td>
			<td>Beam splitter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">FF731/137</td>
			<td style="width:196px;">Semrock</td>
			<td style="width:173px;"></td>
			<td>Bandpass filter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FluoroBrite DMEM</td>
			<td style="width:196px;">ThermoFisher</td>
			<td>A1896701</td>
			<td>Cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:375px;">Hal4000</td>
			<td style="width:196px;">Zhuang Lab, Harvard University</td>
			<td style="width:173px;"></td>
			<td>Data acquisition software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ixon89Ultra DU-897U</td>
			<td style="width:196px;">Andor</td>
			<td style="width:173px;"></td>
			<td>EMCCD camera for photon detection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Laser 405, 488, 561, 640 nm</td>
			<td style="width:196px;">CW-OBIS</td>
			<td style="width:173px;"></td>
			<td>Lasers for excitation</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:375px;">Insight3</td>
			<td style="width:196px;">Zhuang Lab, Harvard University</td>
			<td style="width:173px;"></td>
			<td>Single molecule localization software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:196px;">Gibco</td>
			<td style="width:173px;">25030-081</td>
			<td>Amino acid required for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">live-cell imaging solution</td>
			<td style="width:196px;">ThermoFisher</td>
			<td>A14291DJ</td>
			<td>Imaging buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Lysotracker Green</td>
			<td style="width:196px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:173px;">L7526</td>
			<td>Bodipy based lysosome marker</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mammalian ATCC U2OS cells (Manassas, VA)</td>
			<td colspan="2">Dr. Jochen Mueller (University of Minnesota)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nikon-CFI Apo 100 1.49 N.A</td>
			<td>Nikon</td>
			<td style="width:173px;"></td>
			<td>Oil immersion objective</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin streptomycin</td>
			<td style="width:196px;">Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Antibiotics</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Sodium Pyruvate</td>
			<td style="width:196px;">Gibco</td>
			<td style="width:173px;">11360-070</td>
			<td>Supplement for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">T562lpxr</td>
			<td style="width:196px;">Chroma</td>
			<td style="width:173px;"></td>
			<td>Beam splitter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:196px;">Gibco</td>
			<td>15400-054</td>
			<td>Dissociation of adherent cell</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">W303 MATa strain</td>
			<td style="width:196px;">Horizon-Dharmacon</td>
			<td style="width:173px;">YSC1058</td>
			<td>Parental yeast strain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Yeast Nitrogen Base</td>
			<td style="width:196px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:173px;">Y1250</td>
			<td>Nitrogen base without amino-acids</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">zt405/488/561/640rdc</td>
			<td style="width:196px;">Chroma</td>
			<td style="width:173px;"></td>
			<td>Quadband dichroic mirror</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

conventional bodipy conjugates for live-cell super-resolution microscopy and single-molecule tracking

Методы локализации одной молекулы (SMLM) преодолевают оптический предел дифракции обычной флуоресценционной микроскопии и могут разрешать внутриклеточные структуры и динамику биомолекул с точностью 20 нм. Предпосылкой для SMLM являются флюорофоры, которые переходят из темного в флуоресцентное состояние, чтобы избежать пространственно-временного перекрытия их функций точечного распространения в каждом из тысяч кадров для сбора данных. BODIPYs являются устоявшимися красителями с многочисленными конъюгами, используемыми в обычной микроскопии. Переходное образование красно-сдвигающихся димеров НАИППи (DII)приводит к яркому выбросу одной молекулы, позволяющему микроскопию локализации одной молекулы (SMLM). Здесь мы представляем простой, но универсальный протокол для SMLM с обычными спариями BODIPY в живых дрожжах и клетках млекопитающих. Эта процедура может быть использована для получения изображений супер-разрешения и для отслеживания одного состояния BODIPY-DII для извлечения пространственно-временной информации конъюгированных BODIPY. Мы применяем эту процедуру для разрешения липидных капель (ЛД), жирных кислот и лисосомы в живых дрожжах и клетках млекопитающих в наноскопической шкале длины. Кроме того, мы демонстрируем возможность многоцветной визуализации с красителями BODIPY при использовании в сочетании с другими флуоресцентными зондами. Наши репрезентативные результаты показывают дифференциальное пространственное распределение и подвижность БОДИПИ-жирных кислот и нейтральных липидов в дрожжах в условиях кормления и поста. Этот оптимизированный протокол для SMLM может быть использован с сотнями коммерчески доступных конъюгатов BODIPY и является полезным ресурсом для изучения биологических процессов на наноуровне, далеко за пределами применения этой работы.

Здесь мы представляем оптимизированную подготовку образца, процедуру сбора и анализа данных для SMLM с использованием конъюги для BODIPY на основе вышеуказанного протокола(рисунок 1A). Чтобы продемонстрировать пример рабочего процесса для получения и анализа данных SMLM, мы и...

Watch this Scientific Journal Video about Conventional BODIPY Conjugates for Live-Cell Super-Resolution Microscopy and Single-Molecule Tracking at JoVE.com

Conventional BODIPY Conjugates for Live-Cell Super-Resolution Microscopy and Single-Molecule Tracking (Video) | JoVE

Обычные конъюги BODIPY могут быть использованы для живой-клеточной одномолекулярной микроскопии локализации (SMLM) путем эксплуатации их преходящее, красно-сдвигаемых стриеров земли. Мы представляем оптимизированный протокол SMLM для отслеживания и разрешения субклеточных нейтральных липидов и жирных кислот в живых клетках млекопитающих и дрожжей в наноскопической шкале длины.

Обычные BODIPY конъюгирует для микроскопии с суперразрешением Live-Cell и одномолекулярного слежения

Single molecule localization microscopy (SMLM) techniques overcome the optical diffraction limit of conventional fluorescence microscopy and can resolve ...

Наш протокол описывает использование обычных красителей BODIPY для микроскопии супер-разрешения, используя их редкие, красные сдвинутые состояния. Это позволяет изучать органеллы и биомолекулы в живых клетках с разрешением 30 нанометров. Преимуществом этого метода является его простота и универсальность различных доступных КОНъюгатов BODIPY, которые обеспечивают долгосрочный источник сигналов одной молекулы.Наше продемонстрировано применение может стать важным, чтобы получить информацию в таких заболеваниях, как жировые заболевания печени или диабет типа 2 путем решения липидных капель и жирных кислот ниже предела дифракции. Мы получаем представление о жирной кислоты и липидных капель биологии в дрожжей и клеток млекопитающих. Тем не менее, этот метод применим ко всем другим прозрачным типам клеток с низкой фоновой флуоресценцией.При использовании техники в первый раз, убедитесь, что оптимизировать ди концентрации и лазерные силы, чтобы наблюдать яркие сигналы одной молекулы. Визуальная демонстрация этой техники важно посмотреть, как ди концентрации и оптимизации лазерной мощности приводит к ярким сигналам одной молекулы. Поддерживайте клетки млекопитающих U2OS в нефлуоресцентных DMBM с 10%фетальной сывороткой крупного рогатого скота четыре миллимолярновый глутамин, один миллимолянный пируват натрия, и один процент пенициллина стрептомицин антибиотики в колбе Т-25.Разделите клетки на 70 до 80% слияние от одного до пяти, и пипетку в одном колодец из восьми пластины хорошо. Измените клетки в восьми хорошо пластины в течение 12 до 24 часов. За десять минут до визуализации, добавить BODIPY-C12 Lysotracker зеленый или и другие СПряжения BODIPY, добавить окончательную концентрацию 100 наномолярных.Намонтировать соответствующие наборы фильтров в пути выбросов на основе используемого цвета выбросов BODIPY. Включите микроскоп. Микроскопная сцена, 488 нанометров и 561-нанометровые лазеры, а также камера.Добавьте каплю появляются масла на микроскоп цели. Откройте программное обеспечение HAL4000, которое управляет светодиодным светом для яркой визуализации поля, лазерной силы, лазерных ставней и настроек камеры для визуализации. Установите увеличение EMCCD до 30 и температуру камеры до минус 68 градусов по Цельсию.Подготовь камеру и соответствующее программное обеспечение для записи фильмов на 20 Герц. Включите нагреватель сцены микроскопа и установите его до температуры 37 градусов по Цельсию и до уровня углекислого газа в пять процентов. Соответствующим образом отрегулируйте цвет объективной коррекции.Намонтировать образец на стадии микроскопа и сосредоточиться до фокусировки системы занимается. Переместите сцену с помощью контроллера сцены до тех пор, пока здоровые ячейки не появятся в поле зрения. Загрузите лазерные последовательности затвора для возбуждения монума, а также диммеров, которым лазерная мощность 561-нанометрового лазера составляет от 821 киловатт на квадратный сантиметр для микроскопии локализации одной молекулы, так что в красном канале выбросов обнаруживаются одноярусные поры флуоресценции.Отрегулируйте мощность лазера между точкой 035 и точкой 07 Вт на квадратный сантиметр для 488-нанометрового лазера, так что обычная флуоресценция появляется в зеленом канале излучения. Выберите папку назначения для фильмов и завехать 5000-20000 кадров для сбора достаточного количества локализаций для восстановления изображений с супер разрешением. Перемещение в различные поля зрения и повторить для сбора данных для большего количество ячеек.Загрузите фильм в программное обеспечение для анализа локализации одной молекулы. Визуально экран фильма и настроить настройки контраста, так что одна молекула флуоресцентные мигает видно. Установить параметры идентификации одной молекулы для установки 2D Gaussian, PSFs.Визуально экран через некоторые примеры кадров, чтобы проверить параметры идентификации, и надежно обнаружить различные одной молекулы флуоресцентные всплески. Пресс-анализ для выполнения одной молекулы локализации микроскопии представьте себе анализ с оптимизированными параметрами идентификации. А затем, сделать каждую молекулу, как 2D Gaussian, ширина которого взвешивается обратный квадратный корень обнаруженного количества фотонов.Оцените качество данных. Используйте ограниченные диапазоны кадров для наблюдения за распределением одной молекулы в более конкретных экземплярах и времени. Это объясняет движение органелл во время сбора данных.В этом исследовании мы представили оптимизированную процедуру подготовки выборки, сбора данных и анализа с помощью микроскопии локализации одной молекулы с использованием конъюгатов BODIPY. Чтобы продемонстрировать пример рабочего процесса для приобретения и анализа данных микроскопии одной молекулы, BODIPY в дрожжах был использован для решения липидных капель ниже предела оптической дифракции. Здесь показаны примеры различных многоцветных режимов визуализации BODIPY в спряжении с другими зондами, такими как GFP и mEos2.BODIPY-C12 образуется в передвижных нелипидных скоплениях капель на периферии клеток при посте, в отличие от их включения в липидные капли в условиях питания. Для дальнейшего расширения одной молекулы локализации микроскопии возможности BODIPY конъюгации млекопитающих клеток, BODIPY-C12 и Lysotracker зеленый в живых клетках U2OS были изображены. Оптимизация концентрации BODIPY, а также захватывающие лазерные силы являются критическими шагами для того, чтобы визуализировать яркие сигналы одной молекулы, и реконструировать изображения супер разрешения.Этот метод может быть использован с любым другим СПряжением BODIPY, чтобы получить высокое разрешение понимания, в специальном временном распределении конкретных био-молекул внутри живых клеток. Наша техника проложила путь, чтобы еще больше допросить липидные капли и жирные кислоты биологии наноскопической шкале линзы. Тем не менее, это приложение выходит далеко за рамки конкретных филопектетов из-за наличия различных функциональных СПряжений BODIPY.Пожалуйста, не забудьте следовать стандартным операционным процедурам для обработки биологических образцов и красителей, а также быть нашими обязанными хеджеров и следовать процедурам лазерной безопасности.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Conventional BODIPY Conjugates for Live-Cell Super-Resolution Microscopy and Single-Molecule Tracking

Single-molecule Super-resolution Imaging of Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate in the Plasma Membrane with Novel Fluorescent Probes

Single-molecule Super-resolution Imaging of Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate in the Plasma Membrane with Novel Fluorescent Probes (Video) | JoVE

Одиночных молекул Super-Resolution Imaging фосфатидилинозит 4,5-бисфосфат в плазматической мембране с новыми флуоресцентных зондов

Phosphoinositides in the cell membrane are signaling lipids with multiple cellular functions. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PI(4,5)P2) is a ...

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination (Video) | JoVE

Высокая точность FRET на уровне одиночной молекулы для определения структуры биомолекулы

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers

Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers (Video) | JoVE

Одноместный молекула манипуляции G-quadruplexes, Магнитные пинцеты

Non-canonical nucleic acid secondary structure G-quadruplexes (G4) are involved in diverse cellular processes, such as DNA replication, transcription, RNA ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy (Video) | JoVE

Ковалентной иммобилизации белков для одной молекулы силой спектроскопии

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level (Video) | JoVE

Количественная оценка протеома общесистемной маркировки однородность на уровне одной молекулы

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules

Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules (Video) | JoVE

Одномолекулярная слежение за микроскопией - инструмент для определения диффузивных состояний цитосолильных молекул

Single-molecule localization microscopy probes the position and motions of individual molecules in living cells with tens of nanometer spatial and ...

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation (Video) | JoVE

Производство динамовских и кинезинских моторных ансамблей на наноструктурах ДНК оригами для наблюдения за одной молекулой

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...

OaAEP1-Mediated Enzymatic Synthesis and Immobilization of Polymerized Protein for Single-Molecule Force Spectroscopy

OaAEP1-Mediated Enzymatic Synthesis and Immobilization of Polymerized Protein for Single-Molecule Force Spectroscopy (Video) | JoVE

OaAEP1-опосредованный ферментативный синтез и иммобилизация полимеризованного белка для одномолекулярной силовой спектроскопии

Chemical and bio-conjugation techniques have been developed rapidly in recent years and allow the building of protein polymers. However, a controlled ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH (Video) | JoVE

Одноклеточный анализ транскрипционно активных аллелей одной молекулой FISH

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...

Making Precise and Accurate Single-Molecule FRET Measurements using the Open-Source smfBox

Making Precise and Accurate Single-Molecule FRET Measurements using the Open-Source smfBox (Video) | JoVE

Проведение точных и точных одномолекулярных измерений FRET с помощью smfBox с открытым исходным кодом

The smfBox is a recently developed cost-effective, open-source instrument for single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET), which makes ...