Name: identification of enhancer-promoter contacts in embryoid bodies by quantitative chromosome conformation capture (4c)
Uploaded: 2020-04-29T13:00:00
Duration: 10 min 2 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of Enhancer-Promoter Contacts in Embryoid Bodies by Quantitative Chromosome Conformation Capture 4C at JoVE.com

Мы хотели бы поблагодарить Ф. Ле Дили, Р. Стахудеров и членов лаборатории «Граф» за их советы и обсуждения. Г.С. была поддержана стипендией Марии Склодовской-Кюри (H2020-MSCA-IF-2016, miRStem), T.V.T. постдокторской стипендией Хуана де ла Червы (MINECO, FJCI-2014-22946). Эта работа была поддержана Европейским исследовательским советом в рамках7-й Рамочной программы FP7 (ERC Synergy Grant 4D-Genome, грантовое соглашение 609989 т.г.), Министерствоэкономики, промышленности и конкурентоспособности Испании (MEIC) к партнерству EMBL, Centro de Excelencia Severo Ochoa 2013-2017 и CERCA Program Generalit de Cat.

<ol>
	<li>Evans, M. J., Kaufman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+in+culture+of+pluripotential+cells+from+mouse+embryos.">Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos.</a> Nature. 292 (5819), 154-156 (1981).</li><li>Martello, G., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nature+of+embryonic+stem+cells.">The nature of embryonic stem cells.</a> Annual Review Cell and Developmental Biology. 30, 647-675 (2014).</li><li>Martin, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+a+pluripotent+cell+line+from+early+mouse+embryos+cultured+in+medium+conditioned+by+teratocarcinoma+stem+cells.">Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 78 (12), 7634-7638 (1981).</li><li>Loh, K. M., Lim, B., Ang, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+uno+plures:+molecular+designs+for+embryonic+pluripotency.">Ex uno plures: molecular designs for embryonic pluripotency.</a> Physiological Reviews. 95 (1), 245-295 (2015).</li><li>Sheridan, S. D., Surampudi, V., Rao, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+embryoid+bodies+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+as+a+means+to+assess+pluripotency.">Analysis of embryoid bodies derived from human induced pluripotent stem cells as a means to assess pluripotency.</a> Stem Cells International. 2012, 738910 (2012).</li><li>Gaszner, M., Felsenfeld, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulators:+exploiting+transcriptional+and+epigenetic+mechanisms.">Insulators: exploiting transcriptional and epigenetic mechanisms.</a> Nature Reviews in Genetics. 7 (9), 703-713 (2006).</li><li>Lenhard, B., Sandelin, A., Carninci, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metazoan+promoters:+emerging+characteristics+and+insights+into+transcriptional+regulation.">Metazoan promoters: emerging characteristics and insights into transcriptional regulation.</a> Nature Reviews in Genetics. 13 (4), 233-245 (2012).</li><li>Long, H. K., Prescott, S. L., Wysocka, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ever-Changing+Landscapes:+Transcriptional+Enhancers+in+Development+and+Evolution.">Ever-Changing Landscapes: Transcriptional Enhancers in Development and Evolution.</a> Cell. 167 (5), 1170-1187 (2016).</li><li>Schoenfelder, S., Fraser, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-range+enhancer-promoter+contacts+in+gene+expression+control.">Long-range enhancer-promoter contacts in gene expression control.</a> Nature Reviews in Genetics. 20 (8), 437-455 (2019).</li><li>Spitz, F., Furlong, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factors:+from+enhancer+binding+to+developmental+control.">Transcription factors: from enhancer binding to developmental control.</a> Nature Reviews in Genetics. 13 (9), 613-626 (2012).</li><li>Creyghton, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+H3K27ac+separates+active+from+poised+enhancers+and+predicts+developmental+state.">Histone H3K27ac separates active from poised enhancers and predicts developmental state.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 107 (50), 21931-21936 (2010).</li><li>Heintzman, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+modifications+at+human+enhancers+reflect+global+cell-type-specific+gene+expression.">Histone modifications at human enhancers reflect global cell-type-specific gene expression.</a> Nature. 459 (7243), 108-112 (2009).</li><li>Klemm, S. L., Shipony, Z., Greenleaf, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+accessibility+and+the+regulatory+epigenome.">Chromatin accessibility and the regulatory epigenome.</a> Nature Reviews in Genetics. 20 (4), 207-220 (2019).</li><li>Rada-Iglesias, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+unique+chromatin+signature+uncovers+early+developmental+enhancers+in+humans.">A unique chromatin signature uncovers early developmental enhancers in humans.</a> Nature. 470 (7333), 279-283 (2011).</li><li>Lettice, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+five+digits+is+controlled+by+a+bipartite+long-range+cis-regulator.">Development of five digits is controlled by a bipartite long-range cis-regulator.</a> Development. 141 (8), 1715-1725 (2014).</li><li>Dekker, J., Rippe, K., Dekker, M., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+chromosome+conformation.">Capturing chromosome conformation.</a> Science. 295 (5558), 1306-1311 (2002).</li><li>de Wit, E., de Laat, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+decade+of+3C+technologies:+insights+into+nuclear+organization.">A decade of 3C technologies: insights into nuclear organization.</a> Genes and Development. 26 (1), 11-24 (2012).</li><li>Lieberman-Aiden, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+mapping+of+long-range+interactions+reveals+folding+principles+of+the+human+genome.">Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome.</a> Science. 326 (5950), 289-293 (2009).</li><li>Simonis, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+organization+of+active+and+inactive+chromatin+domains+uncovered+by+chromosome+conformation+capture-on-chip+(4C).">Nuclear organization of active and inactive chromatin domains uncovered by chromosome conformation capture-on-chip (4C).</a> Nature Genetics. 38 (11), 1348-1354 (2006).</li><li>Splinter, E., de Wit, E., van de Werken, H. J., Klous, P., de Laat, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+long-range+chromatin+interactions+for+selected+genomic+sites+using+4C-seq+technology:+from+fixation+to+computation.">Determining long-range chromatin interactions for selected genomic sites using 4C-seq technology: from fixation to computation.</a> Methods. 58 (3), 221-230 (2012).</li><li>Stadhouders, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+chromosome+conformation+capture+sequencing+for+rapid+genome-scale+high-resolution+detection+of+long-range+chromatin+interactions.">Multiplexed chromosome conformation capture sequencing for rapid genome-scale high-resolution detection of long-range chromatin interactions.</a> Nature Protocols. 8 (3), 509-524 (2013).</li><li>van de Werken, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+4C-seq+data+analysis+to+screen+for+regulatory+DNA+interactions.">Robust 4C-seq data analysis to screen for regulatory DNA interactions.</a> Nature Methods. 9 (10), 969-972 (2012).</li><li>Schwartzman, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UMI-4C+for+quantitative+and+targeted+chromosomal+contact+profiling.">UMI-4C for quantitative and targeted chromosomal contact profiling.</a> Nature Methods. 13 (8), 685-691 (2016).</li><li>Tian, T. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whsc1+links+pluripotency+exit+with+mesendoderm+specification.">Whsc1 links pluripotency exit with mesendoderm specification.</a> Nature Cell Biology. 21 (7), 824-834 (2019).</li><li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+interplay+between+enhancer-promoter+topology+and+gene+activity.">Dynamic interplay between enhancer-promoter topology and gene activity.</a> Nature Genetics. 50 (9), 1296-1303 (2018).</li><li>Apostolou, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+chromatin+interactions+of+the+Nanog+locus+in+pluripotency,+differentiation,+and+reprogramming.">Genome-wide chromatin interactions of the Nanog locus in pluripotency, differentiation, and reprogramming.</a> Cell Stem Cell. 12 (6), 699-712 (2013).</li><li>de Wit, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pluripotent+genome+in+three+dimensions+is+shaped+around+pluripotency+factors.">The pluripotent genome in three dimensions is shaped around pluripotency factors.</a> Nature. 501 (7466), 227-231 (2013).</li><li>Krijger, P. H. L., Geeven, G., Bianchi, V., Hilvering, C. R. E., de Laat, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4C-seq+from+beginning+to+end:+A+detailed+protocol+for+sample+preparation+and+data+analysis.">4C-seq from beginning to end: A detailed protocol for sample preparation and data analysis.</a> Methods. , (2019).</li><li>Mumbach, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HiChIP:+efficient+and+sensitive+analysis+of+protein-directed+genome+architecture.">HiChIP: efficient and sensitive analysis of protein-directed genome architecture.</a> Nature Methods. 13 (11), 919-922 (2016).</li><li>Rao, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+3D+map+of+the+human+genome+at+kilobase+resolution+reveals+principles+of+chromatin+looping.">A 3D map of the human genome at kilobase resolution reveals principles of chromatin looping.</a> Cell. 159 (7), 1665-1680 (2014).</li><li>Schoenfelder, S., Javierre, B. M., Furlan-Magaril, M., Wingett, S. W., Fraser, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promoter+Capture+Hi-C:+High-resolution,+Genome-wide+Profiling+of+Promoter+Interactions.">Promoter Capture Hi-C: High-resolution, Genome-wide Profiling of Promoter Interactions.</a> Journal of Visualized Experiments. (136), e57320 (2018).</li></ol>

Авторам нечего раскрывать.

Метод висевой культуры падения не требует дополнительных факторов роста или цитокинов и воспроизводит однородные популяции ЭБ из заранее определенного количества mESCs5. Здесь мы описываем протокол количественного 4C, адаптированный из подхода UMI-4C для количественной оценки контакта усилителя-промоутера конкретных транскрипционных факторов в модели дифференциации EB. Мы определили области хроматина, которые контактируют с промоутерами генов Pou5f1 и T динамическим образом во время дифференциации EB. Pou5f1 был downregulated во время дифференциации EB и частота контакта между промоутером Pou5f1 и его дистальным усилителем уменьшилась. И наоборот, T был upregulated во время дифференциации EB, и мы определили три усилители, для которых контактчастоты с их промоутер уменьшается(Рисунок 3). Для подтверждения идентификации, хроматин иммунопреципции (CHIP) анализ активного гистона знак H3K27ac может бытьвыполнена 24, так как это гистон знак ассоциируется с усилителем активации и усилители теряют эту отметку во время их инактивации11.
Стандартная техника 4C широко используется для обследования контактного профиля хроматина конкретных геномных сайтов25. Однако, этот подход трудно интерпретировать количественно даже после обширной нормализации26,27,28 из-за предубеждений, введенных неоднородности размера фрагмента ПЦР и невозможность различать дубликаты ПЦР. Наш количественный метод 4C во многом идентичен методу UMI-4C, который позволяет количественно определить одиночные молекулы с помощью звуковой и вложенно-опосредованного ПЦР шага, чтобы обойти ограничение классического подхода 4C23. Однако, в отличие от UMI-4C, который использует уникальные молекулярные идентификаторы, наш количественный протокол 4C позволяет количественно определить одиночные молекулы на основе специфического разрыва ДНК, производимого звуковым шагом. Это делает наш протокол совместимым с коммерческими комплектами подготовки библиотеки ДНК, устраняя необходимость праймеров с уникальными молекулярными идентификаторами.
Наш протокол включает в себя несколько ключевых шагов, которые должны быть рассмотрены. Как и в классическом методе 4C28,критическими факторами нашего протокола являются эффективность пищеварения и перевязка при подготовке молекул 3C. Низкая эффективность пищеварения/лиги может значительно снизить сложность взаимодействия с фрагментом интереса, что приводит к уменьшению разрешения. Как уже описано ранее23, еще одним важным шагом протокола является проектирование грунтов для усиления библиотеки. Второй ПЦР реакции праймеры должны быть расположены 5-15 nt от допроса места ограничения. В 75 nt секвенирования читать, это позволяет по крайней мере 40 nt слева от длины захвата для отображения. Праймер, используемый в первой реакции ПЦР, должен быть разработан вверх по течению второй грунтовки без перекрытия, и оба должны быть достаточно конкретными, чтобы обеспечить эффективное усиление ДНК. Для мультиплексирования грунтовки должны быть разработаны независимо, с целью температуры плавления (Tм)60-65 градусов по Цельсию. Кроме того, как и для других методов 3C, разрешение количественного метода 4C определяется ограничение мэнзим, используемый в протоколе25. Этот протокол использует фермент ограничения с 4 bp сайт распознавания, MboI. Максимальное разрешение с этим ферментом составляет около 500 bp, но это сильно зависит от локуса и редко достигается. Другим ограничением является то, что взаимодействия, возникающие между элементами, расположенными в одном и том же фрагменте ограничения, не обнаруживаются. Кроме того, взаимодействия, происходящие на расстоянии одного участка ограничения, нельзя отличить от непереваренного фона. Использование шага заполнения до перевязки может позволить обнаружить эти взаимодействия.
Количественный 4C идеально подходит для допроса хроматина контактов целевых локутов. Тем не менее, конкретный шаг усиления ПЦР ограничивает количество локутов, которые могут быть исследованы одновременно. Способ увеличить количество целевых локутов заключается в мультиплексном пЦР-шагах, чтобы одновременно усилить несколько целей, но для этого требуется совместимость используемых праймеров и тестирование каждой пары праймеров до реализации. Если глобальные изменения архитектуры хроматина у промоутеров желательны, то подходы, такие как Hi-C, PC Hi-C или HiChIP, были бы более подходящими29,,30,,31.

У мышей внутренняя клеточная масса (ICM) 3,5-дневных эмбрионов содержит эмбриональные плюрипотентные стволовые клетки. ICM далее развивается в эпибласт на 4,5 день, генерации эктодерм, мезодерм, и эндодерм овых клеток, основных трех слоев зародыша в эмбрионе. Хотя плюрипотентные клетки в ICM существуют только преходяще in vivo, они могут быть захвачены в культуре путем создания эмбриональных стволовых клеток мыши (mESCs)1,2,3. MESCs остаются в недифференцированном состоянии и размножаются бесконечно, но на внутренних и выхнанных стимулов они также способны выхода из состояния плюрипотентности и генерации клеток из трех слоев зародышевых развития2,4. Интересно, что при культуре в подвеске в небольших капель, mESCs образуют трехмерные агрегаты (т.е. EBs), которые дифференцируются во все три слоя зародыша5. Исследование формирования EB является важным инструментом для изучения процесса спецификации ранней линии.
Во время спецификации линии, клетки каждого слоя зародыша приобретают специфическую программу экспрессии гена4. Точное пространственно-временное выражение генов регулируется различными цис-регуляторными элементами, включая основные промоторы, усилители, глушители и изоляторы6,,77,8,9. Enhancers, регулятивные сегменты ДНК, как правило, охватывающих несколько сотен пар базы, координировать ткани конкретных экспрессии генов8. Усилители активируются или заглушаются при связывании транскрипционных факторов и кофакторов, которые регулируют местную структуру хроматина8,10. Широко используемые методы для выявления предполагаемого усилителей генома всей хроматина иммунопрециция следуют секвенирования (ChIP-seq) и анализ транспозаз-доступных хроматин с использованием последовательности (ATAC-seq) методы. Таким образом, активные усилители характеризуются специфическими активными гистонными знаками и повышенной локальной доступностью ДНК11,,12,,13,,14. Кроме того, развитие усилители, как полагают, требуют физического взаимодействия с их коньяк промоутер8,9. Действительно, было показано, что усилитель варианты и удаления, которые нарушают усилитель-промоутер контакты могут привести к развитию пороков15. Поэтому существует необходимость в новых методах, которые предоставляют дополнительную информацию для идентификации функциональных усилителей, которые контролируют экспрессию генов развития.
С момента развития метода захвата хромосомного захвата (3С)16,картирование хромосомных контактов интенсивно используется для оценки физического расстояния между регулятивными элементами. Важно отметить, что в последнее время были разработаны высокопроизводительные варианты 3C-методов, обеспечивающие различные стратегии фиксации, пищеварения, перевязки и восстановления контактов между фрагментами хроматина17. Среди них, на месте Hi-C стала популярной техникой, позволяющей секвенировать 3C перевязочные продукты генома в ширину18. Тем не менее, высокие затраты на секвенирование, необходимые для достижения разрешения, подходящего для анализа контактов с усилителем-промоутером, делают этот метод нецелесообразным для изучения конкретных локусов. Поэтому были разработаны альтернативные методы для анализа целевых локутов при более высоком разрешении19,,20,,21,,22. Один из этих методов, а именно 4C, известный как один против всех стратегий, позволяет обнаруживать все последовательности, которые контактируют с выбранным в качестве точки зрения сайтом. Однако недостатком стандартной техники 4C является обратный ПЦР, который усиливает фрагменты разного размера, отдав предпочтение небольшим продуктам и предусмотрителям количественной оценки после секвенирования высокой пропускной способности. Недавно, UMI-4C, новый вариант техники 4C с использованием уникальных молекулярных идентификаторов (UMI) был разработан для количественного и целевого хромосомного профилирования контактов, что обходит эту проблему23. Этот подход использует частые резцы, sonication, и вложенно-ligation-опосредованного протокола PCR, таким образом включая усиление фрагментов дна с относительно равномерным распределением длины. Эта однородность уменьшает предубеждения в процессе усиления преференций ПЦР для более коротких последовательностей и позволяет эффективно восстанавливать и точно подсчитывать пространственно соединенные молекулы/фрагменты.
Здесь мы описываем протокол, который адаптирует метод UMI-4C для выявления и количественной оценки контактов хроматина между промоутерами и усилителями поучительных транскрипционных факторов линии во время дифференциации EB.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.1% EmbryoMax gelatin</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>ES-006-B</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin-EDTA</td>
			<td></td>
			<td>25200072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMPure XP</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>10136224</td>
			<td>4C/DNA purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta-mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31350010</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioruptor Pico</td>
			<td>Diagencode</td>
			<td>B01060010</td>
			<td>4C/sonication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B9000S</td>
			<td>4C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>Selleck Chemicals</td>
			<td>S1263</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CIP</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0212</td>
			<td>4C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4693116001</td>
			<td>4C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11320033</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N0447S</td>
			<td>4C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ESGRO Leukaemia Inhibitory Factor (LIF)</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>ESG1107</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde solution (37%)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>252549-25ML</td>
			<td>4C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>GE17-1323-01</td>
			<td>4C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen</td>
			<td>ThermoFischer</td>
			<td>R0551</td>
			<td>4C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Herculase II Fusion DNA polymerase</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>600675</td>
			<td>4C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IGEPAL CA-630</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I3021-50ML</td>
			<td>4C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout DMEM</td>
			<td></td>
			<td>10829018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030081</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MboI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0147M</td>
			<td>4C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM non-essential amino acids</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1370701</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext DNA Library prep</td>
			<td>NEB</td>
			<td>E6040</td>
			<td>4C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuffer 2.1</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B7202S</td>
			<td>4C/digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103049</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PD0325901</td>
			<td>Selleck Chemicals</td>
			<td>S1036</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>NEB</td>
			<td>P8107S</td>
			<td>4C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 4 Fluorometer</td>
			<td>ThermoFischer</td>
			<td>Q33238</td>
			<td>4C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td>ThermoFischer</td>
			<td>Q32851</td>
			<td>4C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A</td>
			<td>ThermoFischer</td>
			<td>EN0531</td>
			<td>4C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360070</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1110501</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase Reaction Buffer</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B0202S</td>
			<td>4C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase Reaction Buffer</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0202M</td>
			<td>4C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of enhancer-promoter contacts in embryoid bodies by quantitative chromosome conformation capture (4c)

Во время развития млекопитающих, судьбы клеток определяются путем создания регуляторных сетей, которые определяют специфику, сроки и пространственные модели экспрессии генов. Эмбрибридальные тела (EBs), полученные из плюрипотентных стволовых клеток, были популярной моделью для изучения дифференциации трех зародышевых слоев и определения регуляторных схем во время спецификации судьбы клеток. Хотя хорошо известно, что конкретные ткани усилители играют важную роль в этих сетях, взаимодействуя с промоутерами, назначение их их соответствующих генов цели по-прежнему остается сложной задачей. Для того чтобы это стало возможным, необходимы количественные подходы для изучения контактов с усилителем-промоутером и их динамикой в процессе разработки. Здесь мы адаптировали метод 4C для определения усилителей и их контактов с коньяк-промоутерами в модели дифференциации EB. Метод использует часто резки ограничения ферментов, sonication, и вложенных-лиги опосредованного ПЦР протокол совместим с коммерческими наборами подготовки библиотеки ДНК. Впоследствии библиотеки 4C подвергаются секвенированию и анализу биоинформации с высокой пропускной способностью и анализируются биоинформатически, что позволяет выявлять и количественно анализировать все последовательности, которые имеют контакты с выбранным промоутером. Полученные данные по секвенированию также могут быть использованы для получения информации о динамике контактов с усилителем-промоутером во время дифференциации. Метод, описанный для модели дифференциации EB, прост в реализации.

Через шесть дней после индукции дифференциации ESC в висячих каплях, мы получили однородную популяцию ЭБ, которые были использованы для дальнейшего анализа(рисунок 1). Мы адаптировали метод UMI-4C23 для количественной оценки специфического взаимодействия хроматина у промоторов родовых специфических генов в EBs24. Схематический обзор протокола с репрезентативными гелями контроля качества на разных этапах показан на рисунке 2A. Первый контроль качества был проведен для определения эффективности пищеварения фермента MboI ограничения. Эффективное пищеварение показало размер фрагмента менее 3 кбит/с(рисунок 2B). Следует отметить, что мЭСК и EB хроматин пищеварения было трудно, а иногда и остаточный непереваренный хроматин сохраняется. Второй контроль качества был проведен после перевязки, чтобы убедиться, что большинство фрагментов в настоящее время являются "gt; 3 кбит/с"(рисунок 2B). Затем фрагменты хроматина, полученные после звукования, были проанализированы гелевым электрофорисисом. Фрагмент размером 400-500 б.п. были ожидаемы(рисунок 2B).
После дефосфорилирования и перевязки одноконечных адаптеров были проведены два раунда ПЦР для усиления целей, представляющих интерес. Вложенный подход был использован для разработки набора из двух праймеров для каждого локуса. Это помогло улучшить специфичность. Каждая цель была усилена отдельно с двумя различными парами грунтовки для оптимизации условий ПЦР (т.е. праймер пар A и B для lou5f1 локус и праймер пары C и D для T локус, соответственно) и привело к МАЗок ДНК около 400 bp (Рисунок 2C). Кроме того, мультиплекс ПЦР был выполнен для одновременного усиления целей A и C(рисунок 2D)и привел к аналогичному размеру фрагмента после очистки(рисунок 2D). Праймеры, используемые для подготовки библиотеки 4C (лоджи Pou5f1 и T) можно найти в таблице 6.
Для анализа данных, необработанные считывания последовательности были впервые выровнены против генома мыши refence mm10, были дублированы, а низкое качество (Nolt; 20) считываний было удалено. Для каждой приманки информация о каждом фрагменте ограничения была получена путем вычисления количества прочитанных фрагментов, и был получен необработанный контактный профиль. Далее, область интереса была определена как все фрагменты ограничения с 2 кбит/с и 250 кбит/с расстояниедо к приманке. Размер каждого фрагмента ограничения увеличивался путем последовательного агрегирования смежных фрагментов ограничений для сглаживания профилей до достижения порога в 5% от общего числа необработанных контактов в интересующем регионе. Для обеспечения интеграции реплики и сопоставления условий мы включили как склоны, так и случайные перехваты на уровне фрагмента ограничения. Средний профиль на состояние и изменение складов между ними были построены, как показано на рисунке 3. Во время дифференциации EB, контакты между усилителями и промоутер омрачаемость ген pou5f1 уменьшился, в то время как усилитель-промоутер контакты мезендодера линии поучительный транскрипционный фактор T увеличился (Рисунок 3), обеспечивая функциональные идеи об этих усилителей развития.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60960/60960fig1.jpg"> Рисунок 1: Репрезентативные изображения mESC и производных эмбриональных тел. День 0 mESC культивируется в условиях без сыворотки (слева) и однородный день 6 EBs (справа) наблюдается перевернутый микроскоп. Шкала бар 500 мкм. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60960/60960fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60960/60960fig2.jpg"> Рисунок 2: рабочий процесс 4C и репрезентативные изображения основных этапов протокола. (A) Схематический рабочий процесс количественного 4C. RS - сайт ограничения; США - вверх по течению; DS - вниз по течению; UP - универсальная грунтовка; D - расстояние между RS и DS в идеале должно быть 5-15 bp. (B) Примеры MboI-переваренный хроматин (I), в-якли ligated хроматин (II), и sonicated хроматин (III). Цифры слева указывают на размеры ДНК, определяемые лестницей ДНК, пробежкой для каждого образца. (C) Примеры усиления ПЦР на двух локуляциях: Pou5f1 (праймеры A и B) и T (праймер C и D). (D) Примеры мультиплексного усиления ПЦР на Pou5f1 и T loci с использованием грунтовок A и C. ES - эмбриональных стволовых клеток; EB - эмбриональные тела. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60960/60960fig2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60960/60960fig3.jpg"> Рисунок 3: Примеры профилей 4C. Количественные профили 4C для приманок, расположенных на промоутерах генов Pou5f1 и T, ассссиемых в mESC и День 6 ЭБШ. Верхняя панель показывает участки средних контактов, генерируемых двумя независимыми биологическими репликациями; нижняя панель показывает среднее изменение контактного склада в 6-й день EBs по сравнению с mESCs (средний показатель двух репликатов). Светло-голубые коробки указывают расположение усилителей с динамическими изменениями во время дифференциации. Рисунок адаптированы из Тянь и др.24. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60960/60960fig3large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>Для 5mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>1M Tris-HCl, pH8.0</td>
			<td>50 зл</td>
		</tr>
<tr>
<td>5M NaCl</td>
			<td>10 зл</td>
		</tr>
<tr>
<td>10% Igepal CA630</td>
			<td>100 л</td>
		</tr>
<tr>
<td>50x Рош полный ингибиторы протеазы</td>
			<td>100 л</td>
		</tr>
<tr>
<td>Миллиовода</td>
			<td>4,74 мл л.</td>
		</tr>
</tbody></table>Таблица 1: Буфер лисиса.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>Для 1000 л</td>
		</tr>
<tr>
<td>Миллиовода</td>
			<td>869 Лл</td>
		</tr>
<tr>
<td>10X NEB T4 ДНК Лигаза Буфер</td>
			<td>120 л</td>
		</tr>
<tr>
<td>20 мг/мЛ Сыворотка Бойвина Альбумин</td>
			<td>6 зл</td>
		</tr>
<tr>
<td>2000 U/L T4 ДНК Лигаза</td>
			<td>5 зл</td>
		</tr>
</tbody></table>Таблица 2: Подготовка мастера лигации смеси.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>Для 15 Зл</td>
		</tr>
<tr>
<td>5X Быстрая лигационная реакция буфера</td>
			<td>10 зл</td>
		</tr>
<tr>
<td>NeBNext Адаптор</td>
			<td>3 зл</td>
		</tr>
<tr>
<td>Быстрый T4 ДНК лигаза</td>
			<td>2 л</td>
		</tr>
</tbody></table>Таблица 3: Реакция перевязки адаптера.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Настройка ПЦР</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Адаптер ligated библиотека-на-deads</td>
			<td>10 зл</td>
		</tr>
<tr>
<td>Вода класса ПЦР</td>
			<td>20.25 Лл</td>
		</tr>
<tr>
<td>10 мкм Целевой конкретный грунтовка</td>
			<td>3,75 л л.</td>
		</tr>
<tr>
<td>10 мкм НЭБ Индекс грунтовка</td>
			<td>3,75 л л.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Буфер Геркуласа II 5X</td>
			<td>10 зл</td>
		</tr>
<tr>
<td>10 Мм dNTPs</td>
			<td>1,25 л л.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Геркуласа II полимераза</td>
			<td>1 зл</td>
		</tr>
<tr>
<td>Общий объем</td>
			<td>50 зл</td>
		</tr>
<tr>
<td>Программа ПЦР</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Шаг 1: 98 КК - 2 мин</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Шаг 2: 98 КК - 20s</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Шаг 3: 65 КК - 30s</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Шаг 4: 72 КК - 45s</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Шаг 5: перейдите на шаг 2, чтобы сделать в общей сложности 15-18 циклов</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Шаг 6: 72 КК - 3 мин</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Шаг 7: 4 КК - удерживайте</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>Таблица 4: 4C хроматин взаимодействия библиотеки усиления, первый ПЦР.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Вложенная настройка ПЦР</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Фрагмент ДНК из первого ПЦР</td>
			<td>10 зл</td>
		</tr>
<tr>
<td>Вода класса ПЦР</td>
			<td>20.25 Лл</td>
		</tr>
<tr>
<td>10 км конкретных праймер</td>
			<td>3,75 л л.</td>
		</tr>
<tr>
<td>10 мкм P7 Illumina грунтовка</td>
			<td>3,75 л л.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Буфер Геркуласа II 5X</td>
			<td>10 зл</td>
		</tr>
<tr>
<td>10 Мм dNTPs</td>
			<td>1,25 л л.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Геркуласа II полимераза</td>
			<td>1 зл</td>
		</tr>
<tr>
<td>Общий объем</td>
			<td>50 зл</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nested PCR программа</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Шаг 1: 98 КК - 2 мин</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Шаг 2: 98 КК - 20s</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Шаг 3: 65 КК - 30s</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Шаг 4: 72 КК - 45s</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Шаг 5: перейдите на шаг 2, чтобы сделать в общей сложности 15-18 циклов</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Шаг 6: 72 КК - 3 мин</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Шаг 7: 4 КК - удерживайте</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>Таблица 5: 4C хроматин взаимодействия библиотеки усиления, вложенные ПЦР.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Имя</td>
			<td>Последовательность (5'-3')</td>
		</tr>
<tr>
<td>DS-Oct4-A</td>
			<td>ААТГАТАКЧАККАКСТАКАЦТАКАЦТАКТАКТАКТАКТАКТАКСТИКТТЦКЦТАКАКГАКГ CTCTTGATCTCTCTCTGCAAGATAACTAAGКАКККАГКАГКАГКАГКАГКАГКАГКАГКАГКАГКАГКАГКАГКАГКАГКАГКАГКАГКАГКАГКА</td>
		</tr>
<tr>
<td>США-Октябрь4-A</td>
			<td>ТККТГКЦААААААААААКАККАКАКАКК</td>
		</tr>
<tr>
<td>DS-Oct4-B</td>
			<td>ААТГАТАКЧАККАКСТАКАЦТАКАЦТАКТАКТАКТАКТАКТАКСТИКТТЦКЦТАКАКГАКГ CTCTTCCGATGTGTGATGGGGGTCAGCGGGGGGGGGGGGGCGC</td>
		</tr>
<tr>
<td>США-Октябрь4-B</td>
			<td>АККАГГГГГГГГГГГГГГГГГКККККККККТ</td>
		</tr>
<tr>
<td>DS-T-C</td>
			<td>ААТГАТАКЧАККАКСТАКАЦТАКАЦТАКТАКТАКТАКТАКТАКСТИКТТЦКЦТАКАКГАКГ CTCTTCCCTCCTGGGTCCCTGCACATTCGCCAAAGGAGC</td>
		</tr>
<tr>
<td>US-T-C</td>
			<td>ГАТТАКАККТГГТКТКакАТКККАКАА</td>
		</tr>
<tr>
<td>DS-T-D</td>
			<td>ААТГАТАКЧАККАКСТАКАЦТАКАЦТАКТАКТАКТАКТАКТАКСТИКТТЦКЦТАКАКГАКГ CTCTTGATCTGGCTCTTGGAGAGCAAGGAGACCCGGGAGGAGGAGGAGGAGGAGGAGGAGGAGGAGGAG</td>
		</tr>
<tr>
<td>US-T-D</td>
			<td>GCTGAGGCTTGGAGAGGTCAGAGGAGACC</td>
		</tr>
<tr>
<td>UP-4C</td>
			<td>КААГКАГААГААКККАТАЦГАКГАКГАКГАКГАКГАКГАКГАКГАКГА</td>
		</tr>
<tr>
<td>Адап-i1</td>
			<td>КААГКААГААГААКГАЗГКААТАКАГАГАГАТАГАТГАТТАГАТТАКГАГГА CGTGTGTCTCTCTCTGATC</td>
		</tr>
<tr>
<td>Адап-i2</td>
			<td>КААГКААГААГААКГАЗГКАТАГАГАГАТАКАТГГГГГГАТТАГГАГТЦАГА CGTGTGTCTCTCTCTGATC</td>
		</tr>
<tr>
<td>Адап-i3</td>
			<td>КААГКААГААГААКГАЗГКАТАГАГАТГККТТААГГАТТАГАТТАГГАТТЦАГАГАГА CGTGTGTCTCTCTCTGATC</td>
		</tr>
<tr>
<td>Адап-i4</td>
			<td>КААГКААГААГААКГАЗГАЗКАТАКГАГАТААТТГТЦАГАТТАКГАГТЦАГАГА CGTGTGTCTCTCTCTGATC</td>
		</tr>
</tbody></table>Таблица 6: Праймеры, используемые для подготовки библиотеки 4C.

Watch this Scientific Journal Video about Identification of Enhancer-Promoter Contacts in Embryoid Bodies by Quantitative Chromosome Conformation Capture 4C at JoVE.com

Identification of Enhancer-Promoter Contacts in Embryoid Bodies by Quantitative Chromosome Conformation Capture 4C

Мы сообщаем о применении количественного улавливания конформации хромосом с последующим секвенированием с высокой пропускной способностью эмбриональных тел, генерируемых из эмбриональных стволовых клеток. Этот метод позволяет определить и количественно контакты между преподобными усилителями и промоториками регионов данного гена во время дифференциации эмбриональных стволовых клеток.

Идентификация контактов Enhancer-Promoter в эмбриоидных телах по количественному захвату конформации хромосомы (4C)

During mammalian development, cell fates are determined through the establishment of regulatory networks that define the specificity, timing, and spatial ...

Точная spatiotemporal регуляции генов контролируется различными цис-регуляторных элементов, которые взаимодействуют между ними. Наш протокол позволяет количественно допрашивать хроматин контакты отдельных локусов, таких как промоутеры. Этот метод позволяет одновременно выявлять и количественно определять частоты взаимодействия между различными нормативными элементами.Для создания эмбриональных тел, начните с культивирования эмбриональных стволовых клеток мыши до 60% слияния. Затем удалить культуру среды, и мыть дважды с двумя миллилитров стерилизованных PBS. Удалите PBS полностью, и добавить два миллилитров ячейки отслоения среды.Инкубировать блюдо культуры при 37 градусах по Цельсию. После инкубации в течение пяти минут, добавить восемь миллилитров EB дифференциации среды к блюду. Чтобы разобщить колонии mESC, чтобы получить одноклеточную подвеску, пипетка среды вверх и вниз от 15 до 20 раз, и передать подвеску в 10-миллилитровую трубку.Центрифуга клетки при 300 раз г при комнатной температуре в течение пяти минут. Затем аккуратно удалите супернатант. После подсчета клеток, повторное течение клеточной гранулы с EB дифференциации среды.Инвертировать крышку 15-сантиметрового блюда культуры. Используя 200-микролитровую многоканаллеровую пипетку, на хранение 20-микролитровых капель хепонизированных клеток на крышке. Тщательно переверните крышку и поместите ее на нижнюю часть культурного блюда.Инкубировать блюдо с висячими каплями в течение трех дней. Чтобы собрать клетки после инкубации, аккуратно промойте крышку 10 миллилитров PBS. Перенесите PBS, который будет содержать EBs, к 50-миллилитровой пластиковой трубке.После сдачи трубки сидеть в течение 30 минут при комнатной температуре, тщательно удалить супернатант. EB будут оставлены в нижней части трубки. Аккуратно повторно посовестите EB в 10 миллилитров свежей среды дифференциации EB.Перенесите суспензию на 10-сантиметровую бактериологическую чашку Петри. Три-шесть дней спустя, использовать перевернутый микроскоп, чтобы проверить образование EB. EB должны быть круглыми и однородными по размеру.Соберите EBs из двух или трех 10-сантиметровых блюд в 50-миллилитровую пластиковую трубку. Центрифуга EBs при 300 раз g в течение пяти минут при комнатной температуре. Аккуратно удалите супернатант и повторно посовелите EB в 10 миллилитров PBS.Центрифуга EBs при 300 раз g при комнатной температуре снова, на этот раз в течение трех минут. Удалите супернатант и добавьте в гранулы два миллилитров трипсина-ЭДТА. Инкубировать трубку при 37 градусах по Цельсию в течение 15 минут.Во время инкубации, пипетка вверх и вниз каждые три минуты, чтобы получить одноклеточную подвеску. Чтобы остановить реакцию трипсина, добавьте восемь миллилитров среды дифференциации EB. После повторного перерасхода клеток в свежей среде EB, добавить параформальдегид к окончательной концентрации 1%Инкубировать клетки в течение 10 минут при комнатной температуре при вращении.Утолить формальдегид, добавив глицин в окончательную концентрацию 0,125 молара. Завершите процесс фиксации, как описано в рукописи, а затем заморозить клеточные гранулы в жидком азоте. Аккуратно повторно посовеская клеточные гранулы в свежеприготовленный ледяной лиз буфер, и поместите трубку на лед.Через 15 минут центрифуга клетки по 1000 раз г в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. Откажитесь от супернатанта и вымойте гранулы 500 микролитров холодного буфера лиза. Повторное производство гранул в 1,5-миллилитровой трубке с 50 микролитров 0,5%SDS в 1x буфер два, и поместите трубку в нагревательный блок на 62 градусов по Цельсию.Через 10 минут снимите трубку с нагревательного блока и добавьте буфер пищеварения. Хорошо перемешать путем трубопроводов, избегая чрезмерного вспенивания, и инкубировать трубку при 37 градусах по Цельсию. Для обеспечения эффективного ограничения пищеварения ферментов, в этом протоколе, мы включили повторяющийся шаг пищеварения.Вот почему также важно хорошо использовать ядра в буфере пищеварения. Добавьте еще 25 микролитров буфера пищеварения, смешайте путем инвертирования и примите восемь микролитров в качестве непереваренного контроля. Храните непереваренный контрольный образец при отрицательных 20 градусах по Цельсию.Далее, вы добавите несколько aliquots ограничения фермента Mbol, инкубации при 37 градусов по Цельсию под вращением после каждого aliquot. Возьмите восемь микролитров в качестве переваренного образца управления. Чтобы декрестить оба контрольных образца, добавьте 80 микролитров буфера TE в 10 микролитров протеиназы K.Incubate при 65 градусах по Цельсию в течение одного часа.Чтобы проверить эффективность пищеварения, запустите 20-микролитровые алициты на 0,6% геля. Успешные пищеварения показывают фрагменты в основном в диапазоне от 3,0 до 5,0 килобазы пар. Подготовь ДНК для стрижки, как описано в рукописи.Используйте соникатор, чтобы спарить ДНК размером от 150 до 700 базовых пар. Перенесите срублированную ДНК в обычную новую безопасную трубку, объединяют несколько звуковых данных из одного и того же образца. Добавьте разогретые бусы для очистки ДНК в количестве, равном в 1,8 раза существующему объему, и перемешайте путем повторного перерасхода.После пяти минут инкубации, собирать бисер с магнитной стойкой. Держа трубки в магнитной стойке, мыть бисер два раза с одним миллилитр свежеприготовленных 80% этанола. После высыхания воздуха бисер при комнатной температуре в течение двух-трех минут, elute ДНК путем повторного перерасхода бисера в 1x Tris буфера.Используя метод подвесного падения, однородная популяция ЭБ была получена через шесть дней после индукции дифференциации ESC. Гель-электрофорез выполнялся на протяжении всего протокола контроля качества. Эффективное пищеварение Mbol приводит к фрагментам менее трех пар килобазы.Электрофорез после перевязки показал, что большинство фрагментов были больше, чем три пары килобазы. Фрагмент размеров от 400 до 500 базовых пар, как ожидается, после sonication. После дефофорилирования и однокурсной перевязки адаптера, два раунда ПЦР были выполнены для усиления целей, представляющих интерес.Каждая цель была усилена отдельно двумя различными парами грунтовок, A и B для локуса Pou5f1 и C и D для локуса T. Это привело к мазка ДНК около 400 базовых пар. Кроме того, мультиплекс ПЦР был выполнен для одновременного усиления целей A и C, что привело к аналогичному размеру фрагмента после очистки.В этих профилях 4C светло-голубые коробки указывают расположение усилителей с динамическими изменениями во время дифференциации. Хроматин регионы контакт промоутеров Pou5f1 и T генов во время дифференциации EB. Pou5f1 был downregulated во время дифференциации EB.И наоборот, T был upregulated во время дифференциации EB. Эффективное ограничение пищеварения ферментов, а затем близость перевязки пересечения геномной ДНК являются ключевыми факторами для обеспечения успеха этого протокола. Другое дело, грунтовка дизайн для допроса контактной карты каждого локуса.Эта процедура идеально подходит для допроса хроматина контакт на целевых локусов. Если потребуются глобальные изменения, могут быть выполнены такие подходы, как Hi-C, промоутер Hi-C или HiChIP.

Research

JoVE Journal

Genetics

Identification of Enhancer-Promoter Contacts in Embryoid Bodies by Quantitative Chromosome Conformation Capture (4C)

Expedited Radiation Biodosimetry by Automated Dicentric Chromosome Identification (ADCI) and Dose Estimation

Expedited Radiation Biodosimetry by Automated Dicentric Chromosome Identification ADCI and Dose Estimation

Ускоренной излучения Биодозиметрические, автоматизированной идентификации Dicentric хромосомы (ADCI) и оценки дозы

Biological radiation dose can be estimated from dicentric chromosome frequencies in metaphase cells. Performing these cytogenetic dicentric chromosome ...

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

Поколение генома общесистемной Chromatin конформации захвата библиотек из плотно поставил раннего дрозофилы эмбрионов

Investigating the three-dimensional architecture of chromatin offers invaluable insight into the mechanisms of gene regulation. Here, we describe a ...

High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

Высок объём идентификации наркотиков синергических сочетаний методом дублирования2

Although antimicrobial drugs have dramatically increased the lifespan and quality of life in the 20th century, antimicrobial resistance threatens our ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

Высок объём идентификации генов регулирования последовательностей с использованием следующего поколения последовательности круговой хромосома конформации захвата (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

Identification of Footprints of RNA:Protein Complexes via RNA Immunoprecipitation in Tandem Followed by Sequencing (RIPiT-Seq)

Identification of Footprints of RNA:Protein Complexes via RNA Immunoprecipitation in Tandem Followed by Sequencing RIPiT-Seq

Идентификация следов РНК:Белковые комплексы через РНК иммунопреципиция в Тандеме После секвенирования (RIPiT-Seq)

RNA immunoprecipitation in tandem (RIPiT) is a method for enriching RNA footprints of a pair of proteins within an RNA:protein (RNP) complex. RIPiT ...

Investigation of the Transcriptional Role of a RUNX1 Intronic Silencer by CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein in Acute Myeloid Leukemia Cells

Investigation of the Transcriptional Role of a RUNX1 Intronic Silencer by CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein in Acute Myeloid Leukemia Cells

Исследование транскрипционной роли интронического глушителя RUNX1 от CRISPR/Cas9 Рибонуклеопротеин в острых миелоидных клеток лейкемии

The bulk of the human genome (~98%) is comprised of non-coding sequences. Cis-regulatory elements (CREs) are non-coding DNA sequences that contain binding ...

Identification of Host Pathways Targeted by Bacterial Effector Proteins using Yeast Toxicity and Suppressor Screens

Идентификация хост Пути целевых бактериальных протеинов с использованием дрожжей токсичности и супрессорэкранов

Intracellular bacteria secrete virulence factors called effector proteins into the host cytosol that act to subvert host proteins and/or their associated ...

Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Zebrafish Spermatocytes

Приготовление Мейотических хромосомных спредов из сперматозоидов зебрафиш

Meiosis is the key cellular process required to create haploid gametes for sexual reproduction. Model organisms have been instrumental in understanding ...

Inducing Hairy Roots by Agrobacterium rhizogenes-Mediated Transformation in Tartary Buckwheat (Fagopyrum tataricum)

Inducing Hairy Roots by Agrobacterium rhizogenes-Mediated Transformation in Tartary Buckwheat Fagopyrum tataricum

Индуцирование волосатых корней агробактериями rhizogenes- Посредника Преобразование в тартарной гречихе(Фагопырум татарикум)

Tartary buckwheat (TB) [Fagopyrum tataricum (L.) Gaertn] possesses various biological and pharmacological activities because it contains abundant ...

Chromosome Screening of Human Preimplantation Embryos by Using Spent Culture Medium: Sample Collection and Chromosomal Ploidy Analysis

Хромосомный скрининг преимплантационных эмбрионов человека с использованием отработанной питательной среды: забор образцов и анализ хромосомной плоидности

In clinical in vitro fertilization (IVF), the prevailing method for PGT-A requires biopsy of a few cells from the trophectoderm (TE). This is the lineage ...