Name: identification of enhancer-promoter contacts in embryoid bodies by quantitative chromosome conformation capture (4c)
Uploaded: 2020-04-29T13:00:00
Duration: 10 min 2 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of Enhancer-Promoter Contacts in Embryoid Bodies by Quantitative Chromosome Conformation Capture 4C at JoVE.com

Vi vill tacka F. Le Dily, R. Stadhouders och medlemmar av Graf laboratoriet för deras råd och diskussioner. G.S. stöddes av en Marie Sklodowska-Curie-stipendium (H2020-MSCA-IF-2016, miRStem), T.V.T av en Juan de la Cierva postdoc fellowship (MINECO, FJCI-2014-22946). Detta arbete stöddes av Europeiska forskningsrådet inom ramenför sjunde ramprogrammet för sjunde ramprogrammet (ERC Synergy Grant 4D-Genome, bidragsavtal 609989 till T.G.), det spanska ministeriet för ekonomi, industri och konkurrenskraft (MEIC) till EMBL-partnerskapet, Centro de Excelencia Severo Ochoa 2013–2017 och CERCA-programmet Generalitat de Catalunya.

1. Embryoid kroppsgenerering från mus embryonala stamceller
<ol><li>Förbered mESC serumfri odlingsmedium: DMEM/F12 och neurobasalmedium blandat i ett förhållande av 1:1. Odlingsmediet kompletteras med MEM icke-essentiell aminosyrorlösning (1x), natriumpyruvat (1 mM), L-glutamin (2 mM), penicillin-streptomycin (100 U/ml), beta-mercaptoetanol (5 0 μM), N2 och B27 kosttillskott (1x), PD0325901 (1 μM), CHIR99021 (3 μM) och leukemi hämmande faktor (LIF) (1,000 U/mL).</li>
	<li>Förbered EB differentiering medium: DMEM kompletteras med 10% fetala nötkreatur serum (FBS), MEM icke-essentiella aminosyror (1x), natriumpyruvat (1 mM), L-glutamin (2 mM), penicillin-sptotremycin (100 U/mL), beta-mercaptoetanol (50 μM).</li>
	<li>Kultur mESCs på 10 cm plasträtter förbelagd med 0,1% (w / v) gelatin i mESC kultur serum-fritt medium.</li>
	<li>När mESC når 60% konfluenser, ta bort odlingsmedium och tvätta försiktigt 1x med 2 ml steriliserad PBS.</li>
	<li>Ta bort PBS helt och tillsätt 2 ml cellavlossningsmedium. Inkubera kulturskålen vid 37 °C i 5 min.</li>
	<li>Inaktivera reaktionen genom att lägga till 8 ml EB-differentieringsmedium i skålen.</li>
	<li>Separera mESC kolonier genom pipettering upp och ner 15-20 gånger för att få en enda cell suspension.</li>
	<li>Centrifugera cellerna vid 300 x g vid rumstemperatur (RT) i 5 min och ta försiktigt bort supernatanten.</li>
	<li>Räkna celler (t.ex. med hjälp av en hemocytometer).</li>
	<li>Resuspend cell pelleten med EB differentiering medium och justera koncentrationen till 2 x 104 celler/ml.</li>
	<li>Vänd locket på en 15 cm odlad skål och använd en 200 μL flerkanalig pipett för att deponera 20 μL droppar återsuspenderade celler (~400 celler/droppe) på locket.</li>
	<li>Vänd försiktigt locket på bottenkammaren och ruva skålen med hängande droppar vid 37 °C med 5% CO2 och 95% luftfuktighet i 3 dagar.</li>
	<li>Samla upp EBs genom att tvätta locket försiktigt med 10 ml PBS och överför EB-innehållande fjädringen till ett 50 ml plaströr.</li>
	<li>Placera röret på RT i 30 min, så att EBs sjunker till botten av gravitationen. Ta försiktigt bort supernatanten.</li>
	<li>Resuspend EBs försiktigt med 10 ml färsk EB differentiering medium och överför till en 10 cm bakteriologiska petriskål.</li>
	<li>Kontrollera EB-formationen 3-6 dagar senare med hjälp av ett inverterat mikroskop. De EBs som genereras bör vara runda och homogena i storlek.</li>
	<li>Inkubera kulturerna vid 37 °C med 5% CO2 och 95% luftfuktighet. EBs kommer att fortsätta att differentiera sig i de tre könscellerna och kan samlas in vid olika tidpunkter för analys.</li>
</ol>2. Dissociation av EBs
<ol><li>Samla EBs från två till tre 10 cm rätter i en 50 ml plaströr. Centrifugera EBs på 300 x g vid RT i 5 min, ta sedan försiktigt bort supernatanten.</li>
	<li>Resuspend EBs med 10 ml PBS. Centrifugera EBs vid 300 x g vid RT i 3 min och ta bort supernatanten.</li>
	<li>Lägg till 2 ml trypsin-EDTA (0,25%) till pelleten och inkubera röret vid 37 °C i 15 min. Pipett upp och ner var 3:e minut för att erhålla en encellig suspension.</li>
	<li>Tillsätt 8 ml EB-differentieringsmedium för att stoppa trypsinreaktionen. Kontrollera EB-dissociation under mikroskopet och räkna cellerna.</li>
</ol>3. Fixering
<ol><li>Resuspend cellerna i färsk EB odlingsmedium på 1 x 106 celler/ml. För ett 50 ml-rör, använd högst 4,5 x 107 celler i 45 ml medium.</li>
	<li>Tillsätt paraformaldehyd från en 37% lager (inte äldre än 6 månader) till en 1% slutlig koncentration. VARNING: Följ lämpliga hälso- och säkerhetsföreskrifter vid hantering av paraformaldehyd eftersom det är en farlig kemikalie.</li>
	<li>Inkubera i 10 min vid RT under rotation.</li>
	<li>Släck formaldehyden genom att tillsätta glycin till en slutlig koncentration på 0,125 M.</li>
	<li>Inkubera i 5 min vid RT under rotation.</li>
	<li>Överför de fasta cellerna till is och håll kallt vid 4 °C från och med nu.</li>
	<li>Pellet cellerna vid 300 x g i 5 min i en kyld centrifug.</li>
	<li>Kasta supernatanten och resuspend pelleten i kalla PBS (1 ml för 5 x 106 celler), sedan överföra till 1,5 ml säkerlås rör.</li>
	<li>Pellet cellerna vid 300 x g i 5 min vid 4 °C, kassera supernatanten och snap-frysa pellets i flytande kväve. Förvara på -80 °C eller fortsätt med protokollet nedan.</li>
</ol>4. Celllys och begränsning enzymsmältning
<ol><li>Försiktigt återsuspend cellletlet i 0,25 ml nyberedd iskall lys buffert (10 mM Tris-HCl pH = 8,0, 10 mM NaCl, 0,2% Igepal CA630, och 1x protease hämmare) per 2-5 x 106 celler. För att förbereda 5 ml lysbuffert, se tabell 1.</li>
	<li>Inkubera cellerna i 15 min på is.</li>
	<li>Centrifug vid 1 000 x g i 5 min vid 4 °C. Kasta supernatanten och håll pelleten, som innehåller kärnorna.</li>
	<li>Tvätta pelleterade kärnor med 500 μL kalllysbuffert.</li>
	<li>Försiktigt återsuspend pelleten i ett 1,5 ml rör med 50 μL av 0,5% SDS i 1x buffert 2, sedan inkubera röret i ett värmeblock vid 62 °C i 10 min.</li>
	<li>Ta bort rören från värmeblocket och tillsätt 170 μl rötningsbuffert som innehåller 25 μL 10% triton X-100 för att släcka SDS. Blanda väl genom pipettering, undvika överdriven skumbildning.</li>
	<li>Inkubera vid 37 °C i 15 min.</li>
	<li>Tillsätt 25 μL rötningsbuffert, blanda genom invertering och ta 8 μL som en osmält kontroll. Håll det osmälta kontrollprovet vid -20 °C. Tillsätt 100 U MboI-restriktionsenzym (4 μL av ett 25 U/μL-lager) till de återstående kärnorna och röt kromatinen i 2 h vid 37 °C under rotation. Tillsätt ytterligare en alikvot på 100 U mboI och inkubera för ytterligare 2 h.</li>
	<li>Tillsätt ytterligare 100 U mboI och inkubera under rotation över natten vid 37 °C.</li>
	<li>Nästa dag, tillsätt ytterligare 100 U mboI och inkubera för 3 h vid 37 °C under rotation.</li>
	<li>Ta 8 μL som ett smält kontrollprov. De-crosslink smält kontrollprover och osmält kontrollprover från steg 4.8 genom att tillsätta 80 μL TE buffert (10 mM Tris pH = 8, 1 mM EDTA) och 10 μL proteinas K (10 mg/ml). Inkubera vid 65 °C i 1 h.</li>
	<li>Kör 20 μL alikvoter på en 0,6% gel för att kontrollera matsmältningseffektiviteten. Framgångsrika matsmältningar visar mestadels fragment i intervallet 3,0-0,5 kb.</li>
</ol>5. Närhet ligering och crosslink återföring
<ol><li>Inkubera de MboI-smälta proverna vid 65 °C i ett värmeblock i 20 min för att inaktivera MboI och kyl sedan till RT.</li>
	<li>Centrifugera rören i 5 min vid 1000 x g vid RT, ta bort supernatanten och lös upp pelleten i 200 μL färsk ligasebuffert.</li>
	<li>Tillsätt 1 000 μL av ligeringsbären till varje prov. Se tabell 2för att förbereda 1 000 μL av ligeringbärsblandningen.</li>
	<li>Blanda genom invertering och inkubera på RT över natten med långsam rotation (9 rpm).</li>
	<li>Eliminera RNA- och proteinrester genom att tillsätta 100 μl proteinas K (10 mg/ml) och 10 μl RNase A (10 mg/ml). Inkubera prover vid 55 °C i 45-60 min.</li>
	<li>Fortsätt inkubera proverna vid 65 °C i ytterligare 4 timmar.</li>
</ol>6. DNA-klippning och storleksval
<ol><li>Kyl rören till RT.</li>
	<li>Centrifug i 5 min vid 1 000 x g vid 4 °C.</li>
	<li>Dela upp provet i tre 400 μL alikvoter i 2 ml-rör och tillsätt 2 μl glykogen (20 mg/m), 40 μl natriumacetat (3 M, pH = 5,2) och 2,5 x volymer (1 ml) 100 % etanol till varje rör. Blanda genom invertering och inkubera vid -80 °C i 45-60 min.</li>
	<li>Centrifugera vid 16 000 x g vid 4 °C i 25 min. Förvara rören på is efter spinnning och ta försiktigt bort supernatanten genom pipettering.</li>
	<li>Tvätta DNA-pelletsen genom att återanvända 800 μL 70 % etanol. Centrifug vid 16 000 x g vid 4 °C i 5 min.</li>
	<li>Ta bort supernatanten och utför tvätten en gång till med 800 μL 70 % etanol.</li>
	<li>Lös upp pelleten i 130 μL 1x Tris buffert (10 mM Tris-HCl, pH = 8) och inkubera vid 37 °C i 15 min för att helt lösa upp DNA. Använd vid behov pipettering för att återsuspena någon fällning.</li>
	<li>Mät DNA-avkastningen; 2,5-5 μg kromatin kan förväntas för 1 x 106 celler. Kontrollera ligering genom att köra ± 200 ng av 3C-produkten på en 0,6% agaros gel. Framgångsrika ligationer visar oftast DNA-fragment > 3 kb. Förvara proverna vid -20 °C.</li>
	<li>Späd ett prov i ett 0,65 ml-rör som lämpar sig för ultraljudsbehandling till 10 ng/μL i 100 μL 1x Tris buffertvolym (1 μg per rör). Standardmängden som används för biblioteksberedning är 3 μg, så utför ultraljudsbehandling i tre separata rör om det behövs.</li>
	<li>Skjuter DNA till en storlek på 150-700 bp (genomsnitt = 400-500 bp) med hjälp av följande parametrar på sonicator: Cykler: 6-8 av 20 s på -60 s off. Detta bör göra DNA lämplig för hög genomströmning sekvensering bibliotek beredning med Hjälp av Illumina sequencers.</li>
	<li>Överför det klippda DNA:t till ett vanligt nytt säkert låsrör. Pool flera ultraljudsbehandling från samma prov.</li>
	<li>Värm en flaska DNA-rening pärlor på RT. Från och med nu, använd låga bindningstips.</li>
	<li>Tillsätt 1,8 x volymer pärlor i DNA-röret och resuspend försiktigt.</li>
	<li>Inkubera på RT i 5 min.</li>
	<li>Samla pärlor med ett magnetiskt rack. Tvätta pärlorna 2x med 1 ml nyberedd 80% etanol samtidigt som rören i magnetstället håller. OBS: Ta bort alla etanol, inklusive restdroppar.</li>
	<li>Lufttorka pärlorna kort (2-3 min) på RT. OBS: Torka inte pärlor som är längre än 5 minuter. Detta kommer att minska DNA-avkastningen.</li>
	<li>Resuspend pärlorna med 90 μL 1x Tris buffert (10 mM Tris-HCl, pH = 8) för att eluera DNA.</li>
	<li>Mät DNA-avkastningen och analysera en 5 μL alikvot på en 1,5% gel. Det bör finnas mycket liten förlust jämfört med presonication avkastning.</li>
</ol>7. Biblioteksförberedelse för sekvensering
<ol><li>Tillsätt 15 μL master mix från bibliotekets beredningssats. För att reparera ändarna av klippt DNA, kombinera 10 μL av 10x end reparation reaktionsbuffert och 5 μL slutet reparation enzym mix.</li>
	<li>Inkubera på RT i 30 min.</li>
	<li>Tillsätt 1,1x volym DNA-rening pärlor och återsuspend försiktigt.</li>
	<li>Inkubera på RT i 5 min.</li>
	<li>Samla pärlor med ett magnetiskt rack. Tvätta pärlorna två gånger med 1 ml nyberedd 80% etanol samtidigt som rören i magnetstället hållers. Ta bort etanol.</li>
	<li>Lufttorka pärlorna i 2-3 min vid RT. Resuspend pärlorna med 42 μL 1x Tris buffert (10 mM Tris-HCl, pH = 8) för att eluera DNA.</li>
	<li>Tillsätt 8 μl dA-tailing master mix till varje prov. För att förbereda dA-tailing master mix, kombinera 5 μL av 10x dA-tailing reaktion buffert och 3 μL Klenow fragment exo minus.</li>
	<li>Inkubera vid 37 °C i 30 min.</li>
	<li>Tillsätt 2 μL kalv intestinala alkaliska fosfatas (CIP) till defosforylat DNA.</li>
	<li>Inkubera i 30 min vid 37 °C, sedan 60 min vid 50 °C.</li>
	<li>Tillsätt 1,1 x dna-reningspärlor och resuspend försiktigt.</li>
	<li>Inkubera på RT i 5 min.</li>
	<li>Samla pärlor med ett magnetiskt rack. Tvätta pärlorna 2x med 1 ml nyberedd 80% etanol samtidigt som rören i magnetstället håller.</li>
	<li>Lufttorka pärlorna kort (2-3 min) på RT. Resuspend pärlor med 35 μL 1x Tris buffert (10 mM Tris-HCl, pH = 8) för att eluera DNA.</li>
	<li>Utför adapterns ligeringreaktion. Använd reducerade koncentrationer av adaptrar/ligase enligt tabell 3.</li>
	<li>Inkubera vid 20 °C i 15 min.</li>
	<li>Tillsätt 3 μl av blandningen av uracil DNA glykosylas och DNA glykosylaslyase endonuclease VII (t.ex. USER) enzym, blanda genom pipettering och inkubera vid 37 °C i 15 min.</li>
	<li>Öka volymen till 100 μL med vatten, koka 5 min vid 96 °C och förvara sedan proverna på is.</li>
	<li>Tillsätt 1,1 x dna-reningspärlor och resuspend försiktigt.</li>
	<li>Inkubera på RT i 5 min.</li>
	<li>Samla pärlor med ett magnetiskt rack. Tvätta pärlorna 2x med 1 ml nyberedd 80% etanol samtidigt som rören i magnetstället håller.</li>
	<li>Lufttorka pärlorna i 2-3 min vid RT. Resuspend pärlorna med 50 μL 1x Tris buffert (10 mM Tris-HCl, pH = 8) för att eluera DNA.</li>
</ol>8. 4C kromatin interaktion bibliotek förstärkning och rening
<ol><li>Förstärk 4C-biblioteket med 10 μl bibliotek för att utföra den första PCR. PCR-installationen och programmet finns i tabell 4.</li>
	<li>Utför kapslad PCR. Den kapslade PCR-installationen och programmet finns i tabell 5.</li>
	<li>Pool PCR produkter för varje bibliotek och rena med en 1.1x DNA rening pärlor.</li>
	<li>Mät DNA-avkastningen och analysera en 5 μL alikvot på en 1,5% gel.</li>
	<li>Justera bibliotekets koncentration och ordna biblioteket. Om biblioteken indexeras kan de poolas före sekvensering.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Evans, M. J., Kaufman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+in+culture+of+pluripotential+cells+from+mouse+embryos.">Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos.</a> Nature. 292 (5819), 154-156 (1981).</li><li>Martello, G., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nature+of+embryonic+stem+cells.">The nature of embryonic stem cells.</a> Annual Review Cell and Developmental Biology. 30, 647-675 (2014).</li><li>Martin, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+a+pluripotent+cell+line+from+early+mouse+embryos+cultured+in+medium+conditioned+by+teratocarcinoma+stem+cells.">Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 78 (12), 7634-7638 (1981).</li><li>Loh, K. M., Lim, B., Ang, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+uno+plures:+molecular+designs+for+embryonic+pluripotency.">Ex uno plures: molecular designs for embryonic pluripotency.</a> Physiological Reviews. 95 (1), 245-295 (2015).</li><li>Sheridan, S. D., Surampudi, V., Rao, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+embryoid+bodies+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+as+a+means+to+assess+pluripotency.">Analysis of embryoid bodies derived from human induced pluripotent stem cells as a means to assess pluripotency.</a> Stem Cells International. 2012, 738910 (2012).</li><li>Gaszner, M., Felsenfeld, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulators:+exploiting+transcriptional+and+epigenetic+mechanisms.">Insulators: exploiting transcriptional and epigenetic mechanisms.</a> Nature Reviews in Genetics. 7 (9), 703-713 (2006).</li><li>Lenhard, B., Sandelin, A., Carninci, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metazoan+promoters:+emerging+characteristics+and+insights+into+transcriptional+regulation.">Metazoan promoters: emerging characteristics and insights into transcriptional regulation.</a> Nature Reviews in Genetics. 13 (4), 233-245 (2012).</li><li>Long, H. K., Prescott, S. L., Wysocka, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ever-Changing+Landscapes:+Transcriptional+Enhancers+in+Development+and+Evolution.">Ever-Changing Landscapes: Transcriptional Enhancers in Development and Evolution.</a> Cell. 167 (5), 1170-1187 (2016).</li><li>Schoenfelder, S., Fraser, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-range+enhancer-promoter+contacts+in+gene+expression+control.">Long-range enhancer-promoter contacts in gene expression control.</a> Nature Reviews in Genetics. 20 (8), 437-455 (2019).</li><li>Spitz, F., Furlong, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factors:+from+enhancer+binding+to+developmental+control.">Transcription factors: from enhancer binding to developmental control.</a> Nature Reviews in Genetics. 13 (9), 613-626 (2012).</li><li>Creyghton, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+H3K27ac+separates+active+from+poised+enhancers+and+predicts+developmental+state.">Histone H3K27ac separates active from poised enhancers and predicts developmental state.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 107 (50), 21931-21936 (2010).</li><li>Heintzman, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+modifications+at+human+enhancers+reflect+global+cell-type-specific+gene+expression.">Histone modifications at human enhancers reflect global cell-type-specific gene expression.</a> Nature. 459 (7243), 108-112 (2009).</li><li>Klemm, S. L., Shipony, Z., Greenleaf, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+accessibility+and+the+regulatory+epigenome.">Chromatin accessibility and the regulatory epigenome.</a> Nature Reviews in Genetics. 20 (4), 207-220 (2019).</li><li>Rada-Iglesias, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+unique+chromatin+signature+uncovers+early+developmental+enhancers+in+humans.">A unique chromatin signature uncovers early developmental enhancers in humans.</a> Nature. 470 (7333), 279-283 (2011).</li><li>Lettice, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+five+digits+is+controlled+by+a+bipartite+long-range+cis-regulator.">Development of five digits is controlled by a bipartite long-range cis-regulator.</a> Development. 141 (8), 1715-1725 (2014).</li><li>Dekker, J., Rippe, K., Dekker, M., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+chromosome+conformation.">Capturing chromosome conformation.</a> Science. 295 (5558), 1306-1311 (2002).</li><li>de Wit, E., de Laat, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+decade+of+3C+technologies:+insights+into+nuclear+organization.">A decade of 3C technologies: insights into nuclear organization.</a> Genes and Development. 26 (1), 11-24 (2012).</li><li>Lieberman-Aiden, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+mapping+of+long-range+interactions+reveals+folding+principles+of+the+human+genome.">Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome.</a> Science. 326 (5950), 289-293 (2009).</li><li>Simonis, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+organization+of+active+and+inactive+chromatin+domains+uncovered+by+chromosome+conformation+capture-on-chip+(4C).">Nuclear organization of active and inactive chromatin domains uncovered by chromosome conformation capture-on-chip (4C).</a> Nature Genetics. 38 (11), 1348-1354 (2006).</li><li>Splinter, E., de Wit, E., van de Werken, H. J., Klous, P., de Laat, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+long-range+chromatin+interactions+for+selected+genomic+sites+using+4C-seq+technology:+from+fixation+to+computation.">Determining long-range chromatin interactions for selected genomic sites using 4C-seq technology: from fixation to computation.</a> Methods. 58 (3), 221-230 (2012).</li><li>Stadhouders, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+chromosome+conformation+capture+sequencing+for+rapid+genome-scale+high-resolution+detection+of+long-range+chromatin+interactions.">Multiplexed chromosome conformation capture sequencing for rapid genome-scale high-resolution detection of long-range chromatin interactions.</a> Nature Protocols. 8 (3), 509-524 (2013).</li><li>van de Werken, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+4C-seq+data+analysis+to+screen+for+regulatory+DNA+interactions.">Robust 4C-seq data analysis to screen for regulatory DNA interactions.</a> Nature Methods. 9 (10), 969-972 (2012).</li><li>Schwartzman, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UMI-4C+for+quantitative+and+targeted+chromosomal+contact+profiling.">UMI-4C for quantitative and targeted chromosomal contact profiling.</a> Nature Methods. 13 (8), 685-691 (2016).</li><li>Tian, T. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whsc1+links+pluripotency+exit+with+mesendoderm+specification.">Whsc1 links pluripotency exit with mesendoderm specification.</a> Nature Cell Biology. 21 (7), 824-834 (2019).</li><li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+interplay+between+enhancer-promoter+topology+and+gene+activity.">Dynamic interplay between enhancer-promoter topology and gene activity.</a> Nature Genetics. 50 (9), 1296-1303 (2018).</li><li>Apostolou, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+chromatin+interactions+of+the+Nanog+locus+in+pluripotency,+differentiation,+and+reprogramming.">Genome-wide chromatin interactions of the Nanog locus in pluripotency, differentiation, and reprogramming.</a> Cell Stem Cell. 12 (6), 699-712 (2013).</li><li>de Wit, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pluripotent+genome+in+three+dimensions+is+shaped+around+pluripotency+factors.">The pluripotent genome in three dimensions is shaped around pluripotency factors.</a> Nature. 501 (7466), 227-231 (2013).</li><li>Krijger, P. H. L., Geeven, G., Bianchi, V., Hilvering, C. R. E., de Laat, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4C-seq+from+beginning+to+end:+A+detailed+protocol+for+sample+preparation+and+data+analysis.">4C-seq from beginning to end: A detailed protocol for sample preparation and data analysis.</a> Methods. , (2019).</li><li>Mumbach, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HiChIP:+efficient+and+sensitive+analysis+of+protein-directed+genome+architecture.">HiChIP: efficient and sensitive analysis of protein-directed genome architecture.</a> Nature Methods. 13 (11), 919-922 (2016).</li><li>Rao, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+3D+map+of+the+human+genome+at+kilobase+resolution+reveals+principles+of+chromatin+looping.">A 3D map of the human genome at kilobase resolution reveals principles of chromatin looping.</a> Cell. 159 (7), 1665-1680 (2014).</li><li>Schoenfelder, S., Javierre, B. M., Furlan-Magaril, M., Wingett, S. W., Fraser, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promoter+Capture+Hi-C:+High-resolution,+Genome-wide+Profiling+of+Promoter+Interactions.">Promoter Capture Hi-C: High-resolution, Genome-wide Profiling of Promoter Interactions.</a> Journal of Visualized Experiments. (136), e57320 (2018).</li></ol>

Författarna har inget att avslöja.

Metoden för hängande droppodling behöver inte ytterligare tillväxtfaktorer eller cytokiner och genererar reproducerbart homogena populationer av EBs från ett förutbestämt antal mESC5. Här beskriver vi ett protokoll av kvantitativa 4C anpassas från UMI-4C strategi för att kvantifiera förstärkare-promotor kontakt av härstamning specifika transkription faktorer i EB differentiering modell. Vi identifierade kromatin regioner som kontaktar initiativtagare till Pou5f1 och T gener på ett dynamiskt sätt under EB differentiering. Pou5f1 var nedreglerad under EB differentiering och kontaktfrekvensen mellan Pou5f1 promotorn och dess distala förstärkare minskade. Omvänt var T uppreglerad under EB differentiering och vi identifierade tre förstärkare för vilka kontaktfrekvenser med deras promotor minskar (figur 3). För att bekräfta identifieringen kan en kromatinimmunprecipitation (ChIP) analys av aktiv histon märke H3K27ac utföras24, eftersom detta histon märke har visat sig vara associerad med förstärkare aktivering och förstärkare förlorar detta märke under sin inaktivering11.
En standard 4C-teknik har använts i stor utsträckning för att kartlägga kromatinkontaktprofilen för specifika genomiska platser25. Detta tillvägagångssätt är dock svårt att tolka kvantitativt även efter omfattande normalisering26,27,28 på grund av de fördomar som införts av heterogenitet PCR fragmentstorlek och omöjligheten att skilja PCR dubbletter. Vår kvantitativa 4C-metod är i stort sett identisk med UMI-4C-tekniken som gör det möjligt att kvantifiera enstaka molekyler med ultraljudsbehandling och en kapslad ligering-medierad PCR-steg för att kringgå begränsningen av den klassiska 4C-metoden23. Men till skillnad från UMI-4C som använder unika molekylära identifierare, tillåter vårt kvantitativa 4C-protokoll kvantifiering av enstaka molekyler baserat på den specifika DNA-paus som produceras av ultraljudsbehandlingssteget. Det gör vårt protokoll kompatibelt med kommersiella DNA-biblioteksberedningssatser, vilket undanröjer behovet av primers med unika molekylära identifierare.
Vårt protokoll omfattar flera viktiga steg som bör övervägas. Som i den klassiska 4C-metoden28är kritiska faktorer i vårt protokoll effektiviteten i matsmältningen och ligeringen under beredningen av 3C-molekylerna. Låg matsmältning/ligering effektivitet kan dramatiskt minska komplexiteten i interaktion med ett fragment av intresse, vilket resulterar i en reducerad upplösning. Som tidigare beskrivits23, ett annat kritiskt steg i protokollet är utformningen av primers för biblioteket förstärkning. Den andra PCR reaktion primers bör placeras 5-15 nt från förhörsbegränsning webbplats. I en 75 nt sekvensering läsa, detta möjliggör minst 40 nt vänster om fångstlängden för kartläggning. Den primer som används i den första PCR-reaktionen bör utformas uppströms den andra primern utan överlappning och båda bör vara tillräckligt specifika för att säkerställa effektiv DNA-förstärkning. För multiplexering bör grundfärger utformas oberoende av dem och sikta på en smälttemperatur (Tm)på 60-65 °C. Dessutom bestäms upplösningen av den kvantitativa 4C-metoden av det restriktionsenzym som används i protokoll25. Detta protokoll använder en begränsning enzym med en 4 bp erkännande webbplats, MboI. Den maximala upplösningen med detta enzym är runt 500 bp, men detta är mycket locus beroende och sällan uppnås. En annan begränsning är att interaktioner som uppstår mellan element som finns i samma begränsningsfragment inte kan upptäckas. Dessutom kan interaktioner som sker på ett avstånd av en begränsning webbplats inte skiljas från den osmält bakgrunden. Användning av ett ifyllnadssteg före ligering kan göra det möjligt att upptäcka dessa interaktioner.
Kvantitativa 4C är idealisk för förhör kromatin kontakter riktade lokus. Det specifika PCR-förstärkningssteget begränsar dock antalet loci som kan undersökas samtidigt. Ett sätt att öka antalet riktade loci är att multiplex PCR steg för att samtidigt förstärka flera mål, men detta kräver kompatibilitet av primers används och testa varje primer par före genomförandet. Om globala förändringar av kromatinarkitektur hos initiativtagare önskas, skulle genomomfattande metoder som Hi-C, PC Hi-C eller HiChIP vara lämpligare29,,30,31.

Hos möss innehåller den inre cellmassan (ICM) av 3,5 dagar gamla embryon embryon embryonala pluripotenta stamceller. ICM utvecklas ytterligare till epiblast på dag 4,5, genererar ektoderm, mesoderm, och endoderm celler, de viktigaste tre könsceller i embryot. Även om pluripotenta celler i ICM endast finns övergående in vivo, kan de fångas i kultur genom inrättandet av mus embryonala stamceller (mESCs)1,2,3. De mESC kvar i ett odifferentierat tillstånd och föröka sig på obestämd tid, men på inneboende och intrinsic stimuli de är också i stånd att lämna pluripotency tillstånd och generera celler i de tre utvecklingsmässiga groddar lager2,4. Intressant, när odlas i suspension i små droppar, mESC bildar tredimensionella aggregat (dvs. EBs) som skiljer sig i alla tre groddar lager5. EB-formationsanalysen är ett viktigt verktyg för att studera den tidiga härstamningsspecifikationsprocessen.
Under härstamningsspecifikationen förvärvar celler i varje könsskikt ett specifikt genuttrycksprogram4. Den exakta spatiotemporal uttryck av gener regleras av olika cis-reglerande element, inklusive centrala initiativtagare, förstärkare, ljuddämpare och isolatorer6,,7,8,9. Förstärkare, regulatoriska DNA-segment som vanligtvis spänner över några hundra baspar, samordna vävnadsspecifika genuttryck8. Förstärkare aktiveras eller tystas genom bindning av transkriptionsfaktorer och kofaktorer som reglerar lokal kromatinstruktur8,10. Vanliga tekniker för att identifiera förmodade förstärkare är genom-hela kromatin immunoprecipitation följt av sekvensering (ChIP-seq) och analysen för transposas-tillgänglig kromatin med sekvensering (ATAC-seq) tekniker. Således kännetecknas aktiva förstärkare av specifika aktiva histonmärken och av ökad lokal DNA-tillgänglighet11,12,13,14. Dessutom, utvecklingsmässiga förstärkare tros kräva fysisk interaktion med sin cognate promotor8,9. Det har faktiskt visat sig att förstärkare varianter och strykningar som stör förstärkare-promotor kontakter kan leda till utvecklingsmässiga missbildningar15. Därför finns det ett behov av nya tekniker som ger ytterligare information för identifiering av funktionella förstärkare som styr utvecklingsgenuttryck.
Sedan utvecklingen av kromosomkonformationsavskiljning (3C) teknik16,kartläggning av kromosomal kontakter har intensivt använts för att bedöma fysiskt avstånd mellan regulatoriska element. Viktigt, hög genomströmning varianter av 3C tekniker har nyligen utvecklats, vilket ger olika strategier för fixering, matsmältning, ligering, och återvinning av kontakter mellan kromatin fragment17. Bland dem, in situ Hi-C har blivit en populär teknik som möjliggör sekvensering av 3C ligering produkter genomet hela18. De höga sekvenseringskostnader som krävs för att nå en lösning som lämpar sig för analys av förstärkare-promotor kontakter gör dock denna teknik opraktiskt för studier av specifika lokus. Därför utvecklades alternativa metoder för att analysera riktade lokus vid högre upplösning19,20,21,22. En av dessa metoder, nämligen 4C, känd som en en mot alla strategi, gör det möjligt att upptäcka alla sekvenser som kontaktar en webbplats som valts som synvinkel. Men en nackdel med den vanliga 4C-tekniken är den omvända PCR krävs, som förstärker olika stora fragment, gynnar små produkter och partiska kvantifiering efter hög genomströmning sekvensering. Nyligen, UMI-4C, en ny variant av 4C-tekniken med hjälp av unika molekylära identifierare (UMI) har utvecklats för kvantitativa och riktade kromosomal kontakt profilering som kringgår detta problem23. Detta tillvägagångssätt använder täta fräsar, ultraljudsbehandling, och en kapslad-ligation-medierad PCR protokoll, vilket innebär förstärkning av DNA-fragment med relativt enhetlig längdfördelning. Denna homogenitet minskar fördomar i förstärkningsprocessen av PCR-preferenser för kortare sekvenser och möjliggör effektiv återhämtning och korrekt räkning av rumsligt anslutna molekyler/fragment.
Här beskriver vi ett protokoll som anpassar UMI-4C-tekniken för att identifiera och kvantifiera kromatinkontakter mellan initiativtagare och förstärkare av härstamning instructive transkription faktorer under EB differentiering.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.1% EmbryoMax gelatin</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>ES-006-B</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin-EDTA</td>
			<td></td>
			<td>25200072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMPure XP</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>10136224</td>
			<td>4C/DNA purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta-mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31350010</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioruptor Pico</td>
			<td>Diagencode</td>
			<td>B01060010</td>
			<td>4C/sonication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B9000S</td>
			<td>4C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>Selleck Chemicals</td>
			<td>S1263</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CIP</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0212</td>
			<td>4C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4693116001</td>
			<td>4C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11320033</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N0447S</td>
			<td>4C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ESGRO Leukaemia Inhibitory Factor (LIF)</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>ESG1107</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde solution (37%)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>252549-25ML</td>
			<td>4C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>GE17-1323-01</td>
			<td>4C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen</td>
			<td>ThermoFischer</td>
			<td>R0551</td>
			<td>4C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Herculase II Fusion DNA polymerase</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>600675</td>
			<td>4C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IGEPAL CA-630</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I3021-50ML</td>
			<td>4C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout DMEM</td>
			<td></td>
			<td>10829018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030081</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MboI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0147M</td>
			<td>4C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM non-essential amino acids</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1370701</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext DNA Library prep</td>
			<td>NEB</td>
			<td>E6040</td>
			<td>4C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuffer 2.1</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B7202S</td>
			<td>4C/digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103049</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PD0325901</td>
			<td>Selleck Chemicals</td>
			<td>S1036</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>NEB</td>
			<td>P8107S</td>
			<td>4C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 4 Fluorometer</td>
			<td>ThermoFischer</td>
			<td>Q33238</td>
			<td>4C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td>ThermoFischer</td>
			<td>Q32851</td>
			<td>4C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A</td>
			<td>ThermoFischer</td>
			<td>EN0531</td>
			<td>4C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360070</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1110501</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase Reaction Buffer</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B0202S</td>
			<td>4C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase Reaction Buffer</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0202M</td>
			<td>4C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of enhancer-promoter contacts in embryoid bodies by quantitative chromosome conformation capture (4c)

Under däggdjursutvecklingen bestäms cellöditet genom att upprätta regleringsnätverk som definierar genuttryckens specificitet, timing och rumsliga mönster. Embryoid organ (EBs) som härrör från pluripotenta stamceller har varit en populär modell för att studera differentiering av de viktigaste tre könsceller lager och att definiera regulatoriska kretsar under cell öde specifikation. Även om det är välkänt att vävnadsspecifika förstärkare spelar en viktig roll i dessa nätverk genom att interagera med initiativtagare, är det fortfarande svårt att tilldela dem till deras relevanta målgener. För att göra detta möjligt behövs kvantitativa metoder för att studera förstärkare-initiativtagare kontakter och deras dynamik under utveckling. Här har vi anpassat en 4C-metod för att definiera förstärkare och deras kontakter med cognate-initiativtagare i EB-differentieringsmodellen. Metoden använder ofta skärande begränsning enzymer, ultraljudsbehandling, och en kapslad-ligation-medierad PCR protokoll kompatibel med kommersiella DNA-bibliotek förberedelse kit. Därefter utsätts 4C-biblioteken för sekvensering med hög genomströmning och analyseras bioinformatiskt, vilket möjliggör detektion och kvantifiering av alla sekvenser som har kontakter med en vald promotor. De resulterande sekvenseringsdata kan också användas för att få information om dynamiken i förstärkare-promotor kontakter under differentiering. Den teknik som beskrivs för EB-differentieringsmodellen är lätt att implementera.

Sex dagar efter induktionen av ESC-differentiering i hängande droppar, fick vi en homogen population av EBs som användes för ytterligare analyser (figur 1). Vi har anpassat UMI-4C-metoden23 för att kvantifiera specifik kromatininteraktion hos främjare av härstamningsspecifika gener i EBs24. En schematisk översikt över protokollet med representativa kvalitetskontrollgeler vid olika steg visas i figur 2A. Den första kvalitetskontroll genomfördes för att bestämma effektiviteten i MboI begränsning enzym matsmältningen. Effektiv matsmältning visade en fragmentstorlek på mindre än 3 kbp (figur 2B). Notera, mESC och EB kromatin matsmältningen var svårt och ibland resterande osmält kromatin kvarstod. Den andra kvalitetskontroll genomfördes efter ligering för att kontrollera att de flesta fragmenten var nu > 3 kbp (figur 2B). Sedan, kromatin fragment som erhållits efter ultraljudsbehandling analyserades av gel elektrofores. Fragmentstorlekar på 400-500 bp förväntades(figur 2B).
Efter defosforylering och enkelsluten adapter ligering, två rundor av PCR utfördes för att förstärka målen av intresse. En kapslad metod användes för att utforma en uppsättning av två primers för varje locus. Detta bidrog till att förbättra specificiteten. Varje mål förstärktes separat med två olika primerpar för att optimera PCR-förhållanden (dvs. primerpar A och B för Pou5f1 locus och primer par C och D för T locus, respektive) och resulterade i ett DNA-utstryk runt 400 bp (figur 2C). Alternativt utfördes multiplex PCR för att förstärka mål A och C samtidigt (figur 2D) och resulterade i en liknande fragmentstorlek efter rening (figur 2D). Primers som används för 4C bibliotek beredning (lokus av Pou5f1 och T)finns i tabell 6.
För dataanalys, rå sekvensering läsningar var först i linje mot refence mm10 mus genomet, var alla duplicerade, och låg kvalitet (< 20) läsningar togs bort. För varje bete erhölls informationen om varje begränsningsfragment genom att beräkna antalet lästa fragment och en rå kontaktprofil erhölls. Därefter definierades regionen av intresse som alla begränsningfragment med 2 kbp och 250 kbp avstånd till betet. Storleken på varje begränsningsfragment ökade genom att sammanläggningen av de intilliggande begränsningsfragmenten sekventiellt för att jämna ut profilerna tills ett tröskelvärde på 5 % av det totala antalet råkontakter uppnåddes i den region som är av intresse. För att säkerställa att replikerna integrerades och förhållandena jämfördes inkluderade vi både sluttningar och slumpmässiga avlyssningar på begränsningsfragmentnivån. Den genomsnittliga profilen per villkor och vikförändringen mellan dem ritades enligt figur 3. Under EB differentiering minskade kontakterna mellan förstärkarna och initiativtagaren till pluripotensgenen Pou5f1, medan förstärkare-promotorkontakter av mesendoderm härstamning lärorikt transkriptionsfaktor T ökade (figur 3), vilket ger funktionella insikter om dessa utvecklingshöjande förstärkare.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60960/60960fig1.jpg"> Figur 1: Representativa bilder av mESC och härledda embryoidkroppar. Dag 0 mESC odlad i serumfria förhållanden (vänster) och homogen dag 6 EBs (höger) observeras av ett inverterat mikroskop. Skala Bar = 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60960/60960fig1large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60960/60960fig2.jpg"> Figur 2: 4C arbetsflöde och representativa bilder av de viktigaste stegen i protokollet. (A)Schematiskt arbetsflöde för den kvantitativa 4C. RS = begränsningsplats; USA = uppströms; DS = nedströms; UP = universell primer; D = Avståndet mellan RS och DS bör helst vara 5-15 bp.(B)Exempel på MboI-smält kromatin (I), in-nuclei ligated kromatin (II) och sonicated kromat (III). Siffrorna till vänster anger de DNA-storlekar som bestäms av DNA-stegen för varje prov. (C)Exempel på PCR förstärkning vid de två loci: Pou5f1 (primers A och B) och T (primer C och D). (D)Exempel på multiplex PCR-förstärkning vid Pou5f1 och T loci med grundfärger A och C. ES = embryonala stamceller. EB = embryoidkroppar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60960/60960fig2large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60960/60960fig3.jpg"> Figur 3: Exempel på 4C-profiler. Kvantitativa 4C profiler för beten som finns på Pou5f1 och T gen promotorer analyseras i mESCs och dag 6 EBS. Den övre panelen visar områden med genomsnittliga kontakter som genereras från två oberoende biologiska replikat. den nedre panelen visar den genomsnittliga kontaktvikningsändringen av 6 EBs dag 6 jämfört med mESC (medelvärdet av de två replikaten). Ljusblå rutor anger placeringen av förstärkare med dynamiska förändringar under differentiering. Figur anpassad från Tian et al.24. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60960/60960fig3large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>För 5mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>1M Tris-HCl, pH8.0</td>
			<td>50 μl</td>
		</tr>
<tr>
<td>5M NaCl (5M NaCl)</td>
			<td>10 μl</td>
		</tr>
<tr>
<td>10% Igepal CA630</td>
			<td>100 μl</td>
		</tr>
<tr>
<td>50x Roche komplett proteashämmare</td>
			<td>100 μl</td>
		</tr>
<tr>
<td>Milliq vatten</td>
			<td>4,74 mL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 1: Lysbuffert.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>För 1000μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Milliq vatten</td>
			<td>869 μl</td>
		</tr>
<tr>
<td>10X NEB T4 DNA Ligase Buffert</td>
			<td>120 μl</td>
		</tr>
<tr>
<td>20mg/mL Bovint serum albumin</td>
			<td>6 μl</td>
		</tr>
<tr>
<td>2000 U/μL T4 DNA Ligase</td>
			<td>5 μl</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 2: Beredning av ligeringsbärblandning.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>För 15 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>5x snabb ligering reaktion buffert</td>
			<td>10 μl</td>
		</tr>
<tr>
<td>NEBNext Adapter</td>
			<td>3 μl</td>
		</tr>
<tr>
<td>Snabb T4 DNA-liga</td>
			<td>2 μl</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 3: Adapter ligering reaktion.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>PCR-konfiguration</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Adaptor ligated bibliotek-on-deads</td>
			<td>10 μl</td>
		</tr>
<tr>
<td>Vatten av PCR-kvalitet</td>
			<td>20,25 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>10 μM Målspecifik primer</td>
			<td>3,75 μl</td>
		</tr>
<tr>
<td>10 μM NEB-indexprimer</td>
			<td>3,75 μl</td>
		</tr>
<tr>
<td>Herculase II 5X buffert</td>
			<td>10 μl</td>
		</tr>
<tr>
<td>10 mm dNTPs</td>
			<td>1,25 μl</td>
		</tr>
<tr>
<td>Herculase II polymeras</td>
			<td>1 μl</td>
		</tr>
<tr>
<td>Total volym</td>
			<td>50 μl</td>
		</tr>
<tr>
<td>PCR-program</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Steg 1: 98 °C - 2 min</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Steg 2: 98 °C - 20s</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Steg 3: 65 °C - 30s</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Steg 4: 72 °C - 45s</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Steg 5: gå till steg 2 för att göra totalt 15-18 cykler</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Steg 6: 72 °C - 3 min</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Steg 7: 4 °C – håll</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 4: 4C kromatin interaktion bibliotek förstärkning, första PCR.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Kapslad PCR-konfiguration</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>DNA-fragment från den första PCR</td>
			<td>10 μl</td>
		</tr>
<tr>
<td>Vatten av PCR-kvalitet</td>
			<td>20,25 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>10 μM specifik primer+P5 Illumina primer</td>
			<td>3,75 μl</td>
		</tr>
<tr>
<td>10 μM P7 Illumina primer</td>
			<td>3,75 μl</td>
		</tr>
<tr>
<td>Herculase II 5X buffert</td>
			<td>10 μl</td>
		</tr>
<tr>
<td>10 mm dNTPs</td>
			<td>1,25 μl</td>
		</tr>
<tr>
<td>Herculase II polymeras</td>
			<td>1 μl</td>
		</tr>
<tr>
<td>Total volym</td>
			<td>50 μl</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kapslat PCR-program</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Steg 1: 98 °C - 2 min</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Steg 2: 98 °C - 20s</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Steg 3: 65 °C - 30s</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Steg 4: 72 °C - 45s</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Steg 5: gå till steg 2 för att göra totalt 15-18 cykler</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Steg 6: 72 °C - 3 min</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Steg 7: 4 °C – håll</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 5: 4C kromatin interaktion bibliotek förstärkning, kapslade PCR.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Namn</td>
			<td>Sekvens (5'-3')</td>
		</tr>
<tr>
<td>DS-Oct4-A</td>
			<td>AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACG CTCTTCCGATCTTCTTGCAAAGATAACTAAGCACCAGGCCAG</td>
		</tr>
<tr>
<td>USA-Okt4-A</td>
			<td>TCTCTTGCAAAGATAACTAAGCACCAGGCC</td>
		</tr>
<tr>
<td>DS-Okt4-B</td>
			<td>AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACG CTCTTCCGATCTGTGATGGGTCAGCAGGGCTGGAGCCGGGCT</td>
		</tr>
<tr>
<td>USA-Okt4-B</td>
			<td>ACCAGGTGGGGGTGATGGGTCAGCAGGGCT</td>
		</tr>
<tr>
<td>DS-T-C</td>
			<td>AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACG CTCTTCCGATCTCCTGGGTCCCTGCACATTCGCCAAAGGAGC</td>
		</tr>
<tr>
<td>USA-T-C</td>
			<td>GATTACACCTGGGTCCCTGCACATTCGCCAA</td>
		</tr>
<tr>
<td>DS-T-D</td>
			<td>AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACG CTCTTCCGATCTGGCTTTGGAGAGGTCAAGGAGACCCGGGAG</td>
		</tr>
<tr>
<td>USA-T-D</td>
			<td>GCTGAGGCTTTGGAGAGGTCAAGGAGACC</td>
		</tr>
<tr>
<td>UPP-4C</td>
			<td>CAAGCAGAAGACGGCATACGA</td>
		</tr>
<tr>
<td>Adap-i1</td>
			<td>CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGATGTGACTGGTTTTCAGA CGTGTGCTCTTCCGATC</td>
		</tr>
<tr>
<td>Adap-i2</td>
			<td>CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACATCGGTGACTGGTTTTCAGA CGTGTGCTCTTCCGATC</td>
		</tr>
<tr>
<td>Adap-i3</td>
			<td>CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCCTAAGTGACTGGTTTTCAGA CGTGTGCTCTTCCGATC</td>
		</tr>
<tr>
<td>Adap-i4</td>
			<td>CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGGTCAGTGACTGGTTTTCAGA CGTGTGCTCTTCCGATC</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 6: Grundfärger som används för 4C-biblioteksberedning.

Watch this Scientific Journal Video about Identification of Enhancer-Promoter Contacts in Embryoid Bodies by Quantitative Chromosome Conformation Capture 4C at JoVE.com

Identification of Enhancer-Promoter Contacts in Embryoid Bodies by Quantitative Chromosome Conformation Capture 4C

Vi rapportera tillämpningen av kvantitativa kromosom konformation fånga följt av hög genomströmning sekvensering i embryoid organ som genereras från embryonala stamceller. Denna teknik gör det möjligt att identifiera och kvantifiera kontakterna mellan förmodade förstärkare och promotorregioner av en viss gen under embryonal stamcellsdifferentiering.

Identifiering av förstärkare-promotor kontakter i embryoid organ av kvantitativa kromosom konformation Capture (4C)

During mammalian development, cell fates are determined through the establishment of regulatory networks that define the specificity, timing, and spatial ...

Den exakta spatiotemporal reglering av gener styrs av olika cis-reglerande element som interagerar mellan dem. Vårt protokoll gör det möjligt att kvantitativt förhöra kromatin kontakter av utvalda lokus såsom initiativtagare. Denna teknik gör det möjligt för oss att identifiera och kvantifiera interaktionsfrekvenserna mellan olika reglerande element samtidigt.För att generera embryoid organ, börja med culturing mus embryonala stamceller till 60%konfluency. Ta sedan bort odlingssubstratet, och tvätta två gånger med två milliliter steriliserad PBS. Ta bort PBS helt, och tillsätt två milliliter cell lossnar medium.Inkubera kulturrätten vid 37 grader Celsius. Efter inkubation i fem minuter, tillsätt åtta milliliter EB differentiering medium till skålen. För att dissociera mESC-kolonierna för att erhålla en encellsupphängning, pipettera mediet upp och ner 15 till 20 gånger, och överför suspensionen till ett 10-milliliterrör.Centrifugera cellerna vid 300 gånger g vid rumstemperatur i fem minuter. Ta sedan försiktigt bort supernatanten. Efter att ha räknat cellerna, resuspend cell pelleten med EB differentiering medium.Invertera locket på en 15-centimeters odlingsrätt. Med hjälp av en 200-mikroliter flerkanalig pipett, deponera 20-mikroliter droppar av återanvändbara celler på locket. Invertera locket försiktigt, och placera den på den nedre delen av kultur skålen.Inkubera skålen med hängande droppar i tre dagar. För att samla upp cellerna efter inkubationen, tvätta locket försiktigt med 10 milliliter PBS. Överför PBS, som kommer att innehålla EBs, till en 50-milliliter plaströr.Efter att ha låtit röret sitta i 30 minuter i rumstemperatur, ta försiktigt bort supernatanten. EBs kommer att lämnas längst ner på röret. Försiktigt återanvända EBs i 10 milliliter av färska EB differentiering medium.Överför suspensionen till en 10-centimeters bakteriologisk Petriskål. Tre till sex dagar senare, använd ett inverterat mikroskop för att kontrollera EB-formation. DE EBs bör vara runda och homogena i storlek.Samla in EBs från två eller tre 10-centimeters rätter i en 50-milliliter plaströr. Centrifugera EBsen på g 300 gånger i fem minuter i rumstemperatur. Ta försiktigt bort supernatanten och återanvänd eBs i 10 milliliter PBS.Centrifugera EBsna på g 300 gånger på rumstemperatur igen, denna tid för tre noterar. Ta bort supernatanten och tillsätt två milliliter trypsin-EDTA till pelleten. Inkubera röret i 37 grader Celsius i 15 minuter.Under inkubationen, pipetten uppåt och nedåt var tredje minut för att få en encellig suspension. För att stoppa trypsinreaktionen, tillsätt åtta milliliter EB-differentieringsmedium. Efter resuspending cellerna i färskt EB medium, tillsätt paraformaldehyd till en slutlig koncentration av 1%Inkubera cellerna i 10 minuter vid rumstemperatur under rotation.Släck formaldehyden genom att tillsätta glycin till en slutlig koncentration av 0,125 molar. Slutför fixeringsprocessen enligt beskrivningen i manuskriptet och snap-frys sedan cellpelletsen i flytande kväve. Försiktigt återanvänd cell pelleten i nyberedda iskall lysbuffert, och placera röret på is.Efter 15 minuter centrifugera cellerna vid 1, 000 gånger g i fem minuter vid fyra grader Celsius. Kassera supernatanten och tvätta pelleten med 500 mikroliter av kalllysbuffert. Resuspend pelleten i en 1,5-milliliter rör med 50 mikroliter av 0,5%SDS i 1x buffert två, och placera röret i ett värmeblock på 62 grader Celsius.Efter 10 minuter, ta bort röret från värmeblocket, och tillsätt matsmältningsbuffert. Blanda väl genom pipettering, undvika överdriven skumning, och inkubera röret vid 37 grader Celsius. För att säkerställa effektiv begränsning enzym matsmältning, i detta protokoll, har vi inkluderat ett repetitivt steg av matsmältningen.Det är därför det är också viktigt att återanvända väl kärnorna i matsmältningsbufferten. Lägg till ytterligare 25 mikroliter av matsmältningsbuffert, blanda genom invertera, och ta åtta mikroliter som en osmält kontroll. Förvara det osmälta kontrollprovet vid minus 20 grader Celsius.Därefter kommer du att lägga till flera alikvoter av restriktionsenzymet Mbol, inkubering vid 37 grader Celsius under rotation efter varje alikvot. Ta åtta mikroliter som ett smält kontrollprov. För att de-crosslink båda kontrollprover, tillsätt 80 mikroliter te buffert i 10 mikroliter proteinas K.Incubate vid 65 grader Celsius i en timme.För att kontrollera matsmältningen effektivitet, kör 20-microliter alikvoter på en 0,6%gel. Framgångsrika matsmältningar visar fragment mestadels i intervallet 3,0 till 5,0 kilobase par. Förbered DNA för skjuvning enligt vad som beskrivs i manuskriptet.Använd en ljudiker för att skjuva DNA till en storlek på 150 till 700 baspar. Överför det skjuvade DNA:t till ett normalt nytt safe-lock-rör, poolande av multipla ultraljudsbehandlingar från samma prov. Tillsätt uppvärmda DNA-rening pärlor i ett belopp som motsvarar 1,8 gånger den befintliga volymen, och blanda genom resuspending.Efter fem minuters inkubering, samla pärlorna med ett magnetiskt rack. Hålla rören i magnetstället, tvätta pärlorna två gånger med en milliliter nyberedd 80%etanol. Efter lufttorkning pärlorna i rumstemperatur i två till tre minuter, elute DNA genom att återutgöra pärlorna i 1x Tris buffert.Med hjälp av metoden hanging-drop erhölls en homogen population av EBs sex dagar efter induktionen av ESC-differentiering. Gel elektrofores utfördes i hela protokollet för kvalitetskontroll. Effektiv matsmältning av Mbol resulterar i fragment av mindre än tre kilobase par.Elektrofores efter ligatur visade att de flesta fragment var större än tre kilobase par. Fragment storlekar av 400 till 500 baspar förväntas efter ultraljudsbehandling. Efter dephosphorylation och single-end adapter ligering, två omgångar av PCR utfördes för att förstärka målen för intresse.Varje mål förstärktes separat med två olika primerpar, A och B för Pou5f1 locus och C och D för T locus. Detta resulterade i ett DNA-utstryk runt 400 baspar. Alternativt utfördes multiplex PCR för att förstärka mål A och C samtidigt, vilket resulterar i en liknande fragmentstorlek efter rening.I dessa 4C-profiler anger de ljusblå rutorna placeringen av förstärkare med dynamiska förändringar under differentiering. Kromatin regioner kontakt främjare av Pou5f1 och T gener under EB differentiering. Pou5f1 var nedreglerade under EB differentiering.Omvänt var T uppreglerad under EB differentiering. Effektiv begränsning enzym matsmältning och sedan närhet ligering av korsningen genomiska DNA är viktiga faktorer för att säkerställa framgång för detta protokoll. En annan sak är primer designen för att förhöra kontaktkartan på varje locus.Detta förfarande är idealiskt lämpad att förhöra kromatin kontakt på riktade loci. Om globala förändringar krävs kan genomomfattande metoder som Hi-C, promotor capture Hi-C eller HiChIP utföras.

Research

JoVE Journal

Genetics

Identification of Enhancer-Promoter Contacts in Embryoid Bodies by Quantitative Chromosome Conformation Capture (4C)

Expedited Radiation Biodosimetry by Automated Dicentric Chromosome Identification (ADCI) and Dose Estimation

Expedited Radiation Biodosimetry by Automated Dicentric Chromosome Identification ADCI and Dose Estimation

Skyndsam strålning Biodosimetry automatiserade av disentrisk kromosom identifiering (ADCI) och dos uppskattning

Biological radiation dose can be estimated from dicentric chromosome frequencies in metaphase cells. Performing these cytogenetic dicentric chromosome ...

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

Generation av Genome-wide kromatin konformation fånga bibliotek från tätt stegvis tidiga Drosophila embryon

Investigating the three-dimensional architecture of chromatin offers invaluable insight into the mechanisms of gene regulation. Here, we describe a ...

High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

Hög genomströmning identifiering av synergistisk läkemedelskombinationer med överlappning2 Metod

Although antimicrobial drugs have dramatically increased the lifespan and quality of life in the 20th century, antimicrobial resistance threatens our ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

Hög genomströmning identifiering av reglerande gensekvenser som använder nästa generations sekvensering av cirkulär kromosom konformation fånga (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

Identification of Footprints of RNA:Protein Complexes via RNA Immunoprecipitation in Tandem Followed by Sequencing (RIPiT-Seq)

Identification of Footprints of RNA:Protein Complexes via RNA Immunoprecipitation in Tandem Followed by Sequencing RIPiT-Seq

Identifiering av spår av RNA: protein komplex via RNA immunoprecipitation i tandem följt av sekvensering (RIPiT-SEQ)

RNA immunoprecipitation in tandem (RIPiT) is a method for enriching RNA footprints of a pair of proteins within an RNA:protein (RNP) complex. RIPiT ...

Investigation of the Transcriptional Role of a RUNX1 Intronic Silencer by CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein in Acute Myeloid Leukemia Cells

Investigation of the Transcriptional Role of a RUNX1 Intronic Silencer by CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein in Acute Myeloid Leukemia Cells

Utredning av den transkriptionella roll som en RUNX1 Intronic ljuddämpare av CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein i akut myeloisk leukemi celler

The bulk of the human genome (~98%) is comprised of non-coding sequences. Cis-regulatory elements (CREs) are non-coding DNA sequences that contain binding ...

Identification of Host Pathways Targeted by Bacterial Effector Proteins using Yeast Toxicity and Suppressor Screens

Identifiering av värdvägar riktade av bakteriella Effektorproteiner med hjälp av jäst toxicitet och suppressor skärmar

Intracellular bacteria secrete virulence factors called effector proteins into the host cytosol that act to subvert host proteins and/or their associated ...

Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Zebrafish Spermatocytes

Beredning av meiotiska kromosom sprider sig från Zebrafish Spermatocytes

Meiosis is the key cellular process required to create haploid gametes for sexual reproduction. Model organisms have been instrumental in understanding ...

Inducing Hairy Roots by Agrobacterium rhizogenes-Mediated Transformation in Tartary Buckwheat (Fagopyrum tataricum)

Inducing Hairy Roots by Agrobacterium rhizogenes-Mediated Transformation in Tartary Buckwheat Fagopyrum tataricum

Inducera Hairy Roots av Agrobacterium rhizogenes-medierad transformation i tartary bovete (Fagopyrum tataricum)

Tartary buckwheat (TB) [Fagopyrum tataricum (L.) Gaertn] possesses various biological and pharmacological activities because it contains abundant ...

Chromosome Screening of Human Preimplantation Embryos by Using Spent Culture Medium: Sample Collection and Chromosomal Ploidy Analysis

Kromosomscreening av humana preimplantatoriska embryon med hjälp av använt odlingsmedium: provsamling och kromosomal ploidyanalys

In clinical in vitro fertilization (IVF), the prevailing method for PGT-A requires biopsy of a few cells from the trophectoderm (TE). This is the lineage ...