Name: preparation of drosophila larval and pupal testes for analysis of cell division in live, intact tissue
Uploaded: 2020-05-19T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue at JoVE.com

وقد تم دعم هذا العمل من قبل وزارة الدفاع بدء الأموال لJ.T.S.

1. إعداد الحيوانات والأدوات ووسائل الإعلام للتشريح
<ol><li>عبر الذباب الذكور والإناث للحصول على ذرية من النمط الجيني المطلوب. علامات معدلة مفيدة لتحديد والتدريج من الحيوانات المنوية meiotic تشمل GFP-tubulin لتسمية المغزل meiotic وRFP-histone 2A لتسمية الكروموس8. استخدم خمس إلى عشر إناث لكل صليب و...

<ol>
	<li>Khodjakov, A., Rieder, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+division+process+in+living+tissue+culture+cells.">Imaging the division process in living tissue culture cells.</a> Methods. 38 (1), 2-16 (2006).</li><li>Ong, J. Y., Torres, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+mechanisms+of+cell+division.">Dissecting the mechanisms of cell division.</a> The Journal of Biological Chemistry. 294 (30), 11382-11390 (2019).</li><li>Levine, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cycling+through+development.">Cell cycling through development.</a> Development. 131 (10), 2241-2246 (2004).</li><li>Gross, S. M., Rotwein, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unraveling+Growth+Factor+Signaling+and+Cell+Cycle+Progression+in+Individual+Fibroblasts.">Unraveling Growth Factor Signaling and Cell Cycle Progression in Individual Fibroblasts.</a> The Journal of Biological Chemistry. 291 (28), 14628-14638 (2016).</li><li>Mittelman, D., Wilson, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fractured+genome+of+HeLa+cells.">The fractured genome of HeLa cells.</a> Genome Biology. 14 (4), 111 (2013).</li><li>Bury, L., Coelho, P. A., Glover, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+Meiosis+to+Mitosis:+The+Astonishing+Flexibility+of+Cell+Division+Mechanisms+in+Early+Mammalian+Development.">From Meiosis to Mitosis: The Astonishing Flexibility of Cell Division Mechanisms in Early Mammalian Development.</a> Current Topics in Developmental Biology. 120, 125-171 (2016).</li><li>Giansanti, M. G., Fuller, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+Drosophila+spermatocytes+tell+us+about+the+mechanisms+underlying+cytokinesis.">What Drosophila spermatocytes tell us about the mechanisms underlying cytokinesis.</a> Cytoskeleton. 69 (11), 869-881 (2012).</li><li>Karabasheva, D., Smyth, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel,+dynein-independent+mechanism+focuses+the+endoplasmic+reticulum+around+spindle+poles+in+dividing+Drosophila+spermatocytes.">A novel, dynein-independent mechanism focuses the endoplasmic reticulum around spindle poles in dividing Drosophila spermatocytes.</a> Scientific Reports. 9 (1), 12456 (2019).</li><li>Polevoy, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+roles+for+the+Drosophila+PI+4-kinase+four+wheel+drive+in+localizing+Rab11+during+cytokinesis.">Dual roles for the Drosophila PI 4-kinase four wheel drive in localizing Rab11 during cytokinesis.</a> Journal of Cell Biology. 187 (6), 847-858 (2009).</li><li>Rebollo, E., Llamazares, S., Reina, J., Gonzalez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+noncentrosomal+microtubules+to+spindle+assembly+in+Drosophila+spermatocytes.">Contribution of noncentrosomal microtubules to spindle assembly in Drosophila spermatocytes.</a> PLoS Biology. 2 (1), 8 (2004).</li><li>Smyth, J. T., Schoborg, T. A., Bergman, Z. J., Riggs, B., Rusan, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proper+symmetric+and+asymmetric+endoplasmic+reticulum+partitioning+requires+astral+microtubules.">Proper symmetric and asymmetric endoplasmic reticulum partitioning requires astral microtubules.</a> Open Biology. 5 (8), (2015).</li><li>Demarco, R. S., Eikenes, &. #. 1. 9. 7. ;. H., Haglund, K., Jones, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+spermatogenesis+in+Drosophila+melanogaster.">Investigating spermatogenesis in Drosophila melanogaster.</a> Methods. 68 (1), 218-227 (2014).</li><li>Fuller, M. T., Bate, M., Martinez-Arias, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Development of Drosophila melanogaster. , 71-147 (1993).</li><li>Dunleavy, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cell+Cycle+Timing+of+Centromeric+Chromatin+Assembly+in+Drosophila+Meiosis+Is+Distinct+from+Mitosis+Yet+Requires+CAL1+and+CENP-C.">The Cell Cycle Timing of Centromeric Chromatin Assembly in Drosophila Meiosis Is Distinct from Mitosis Yet Requires CAL1 and CENP-C.</a> PLOS Biology. 10 (12), 1001460 (2012).</li><li>Fabian, L., Brill, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+spermiogenesis:+Big+things+come+from+little+packages.">Drosophila spermiogenesis: Big things come from little packages.</a> Spermatogenesis. 2 (3), 197-212 (2012).</li><li>Ramm, S. A., Scharer, L., Ehmcke, J., Wistuba, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sperm+competition+and+the+evolution+of+spermatogenesis.">Sperm competition and the evolution of spermatogenesis.</a> Molecular Human Reproduction. 20 (12), 1169-1179 (2014).</li><li>Savoian, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopy+Methods+for+Analysis+of+Spindle+Dynamics+in+Meiotic+Drosophila+Spermatocytes.">Microscopy Methods for Analysis of Spindle Dynamics in Meiotic Drosophila Spermatocytes.</a> Methods in Molecular Biology. 1471, 265-276 (2017).</li><li>Sitaram, P., Hainline, S. G., Lee, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytological+analysis+of+spermatogenesis:+live+and+fixed+preparations+of+Drosophila+testes.">Cytological analysis of spermatogenesis: live and fixed preparations of Drosophila testes.</a> Journal of Visualized Experiments. (83), e51058 (2014).</li><li>Zamore, P. D., Ma, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Drosophila+melanogaster+testes.">Isolation of Drosophila melanogaster testes.</a> Journal of Visualized Experiments. (51), (2011).</li><li>Lerit, D. A., Plevock, K. M., Rusan, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+Drosophila+larval+neuroblasts.">Live imaging of Drosophila larval neuroblasts.</a> Journal of Visualized Experiments. (89), (2014).</li><li>Belloni, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+Cog7+affect+Golgi+structure,+meiotic+cytokinesis+and+sperm+development+during+Drosophila+spermatogenesis.">Mutations in Cog7 affect Golgi structure, meiotic cytokinesis and sperm development during Drosophila spermatogenesis.</a> Journal of Cell Science. 125 (22), 5441-5452 (2012).</li><li>Harel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistence+of+major+nuclear+envelope+antigens+in+an+envelope-like+structure+during+mitosis+in+Drosophila+melanogaster+embryos.">Persistence of major nuclear envelope antigens in an envelope-like structure during mitosis in Drosophila melanogaster embryos.</a> Journal of Cell Science. 94 (3), 463-470 (1989).</li><li>Katsani, K. R., Karess, R. E., Dostatni, N., Doye, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+dynamics+of+Drosophila+nuclear+envelope+components.">In vivo dynamics of Drosophila nuclear envelope components.</a> Mol Biol Cell. 19 (9), 3652-3666 (2008).</li><li>Tates, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cytodifferentiation during spermatogenesis in Drosophila melanogaster: An electron microscope study. , (1971).</li><li>Gartner, S. M., Rathke, C., Renkawitz-Pohl, R., Awe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+culture+of+Drosophila+pupal+testis+and+single+male+germ-line+cysts:+dissection,+imaging,+and+pharmacological+treatment.">Ex vivo culture of Drosophila pupal testis and single male germ-line cysts: dissection, imaging, and pharmacological treatment.</a> Journal of Visualized Experiments. (91), 51868 (2014).</li><li>Ohkura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiosis:+an+overview+of+key+differences+from+mitosis.">Meiosis: an overview of key differences from mitosis.</a> Cold Spring Harbor perspectives in biology. 7 (5), (2015).</li><li>Friedman, J. R., Webster, B. M., Mastronarde, D. N., Verhey, K. J., Voeltz, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ER+sliding+dynamics+and+ER-mitochondrial+contacts+occur+on+acetylated+microtubules.">ER sliding dynamics and ER-mitochondrial contacts occur on acetylated microtubules.</a> Journal of Cell Biology. 190 (3), 363-375 (2010).</li><li>Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methanol-acetone+fixation+of+Drosophila+testes.">Methanol-acetone fixation of Drosophila testes.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (10), 1270-1272 (2011).</li><li>Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paraformaldehyde+fixation+of+Drosophila+testes.">Paraformaldehyde fixation of Drosophila testes.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (1), 102-104 (2012).</li></ol>

لقد وصفنا بروتوكولًا لإعداد اختبارات اليرقات أو الجرو المبكر ة Drosophila ، الأمثل للتصوير الحي على المدى الطويل لانقسام خلايا الحيوانات المنوية. هذا هو وسيلة قوية لتحليل انقسام الخلايا في السياق الفسيولوجي للأنسجة سليمة. يتم توسيع قوة هذه الطريقة عند دمجها مع الأدوات الوراثية Drosophila</e...

وغالبا ما يدرس انقسام الخلية باستخدام خطوط الخلية نمت في الثقافة1. في حين أننا قد اكتسبت ثروة من البصيرة لا تقدر بثمن وفهم الآليات الأساسية من هذه الدراسات2، والخلايا التي تزرع في الثقافة لا يمكن تلخيصها تماما فيزيولوجيا انقسام الخلايا كما يحدث في سليمة ، والأنسجة الحية. على سبيل المثال ، في الأنسجة والأعضاء السليمة ، يجب تقسيم الخلايا في المكان المناسب وفي الوقت المناسب بحيث تكون الخلايا الذرية موجودة بشكل صحيح داخل الأنسجة ، بحيث يمكن أن تخضع للتمايز المناسب أو البرامج الوظيفية ، وحتى يتم تنسيق انتشار الخلايا بشكل صحيح مع نمو الأنسجة أو التوازن3. بالنسبة للخلايا التي تزرع في الثقافة من ناحية أخرى ، يتم تنظيم انقسام الخلايا بشكل عام من خلال عوامل النمو في الثقافة المتوسطة4، وبالتالي لا يمكننا أن نتعلم من هذه الخلايا كيف تؤثر العوامل البيئية في الجسم الحي مثل بنية الأنسجة أو إشارات النمو على عملية التقسيم. من المهم أيضًا ملاحظة أن العديد من خطوط الخلايا المستخدمة لدراسة انقسام الخلايا ، مثل خلايا HeLa و U2OS ، كانت مشتقة من الأورام النقيلية5. لذلك ، من المرجح أن يتم تغيير العديد من جوانب علم وظائف الأعضاء الأساسي لهذه الخلايا السرطانية ، مثل الآليات التنظيمية لدورة الخلية والاستقرار الكروموسومي ، مقارنة بالخلايا السليمة. الفهم الكامل لفسيولوجيا انقسام الخلية ، لذلك ، يعتمد على قدرتنا على دراسة تقسيم الخلايا في مواطنها ، في بيئات الجسم الحي التي تحافظ على الآليات التنظيمية الفسيولوجية وهندسة الأنسجة.
ويعوق التقدم في فهم كيفية عمل انقسام الخلية داخل الأنسجة والأعضاء سليمة من الصعوبات الكامنة في تحليل الجسم الحي أو الجسم الحي. أولاً، قد يكون من الصعب أو المستحيل الوصول إلى الخلايا المنقسمة للتحليل المجهري داخل الأعضاء الكبيرة أو الأنسجة السميكة. ثانياً، غالباً ما يكون من الصعب التنبؤ بالوقت الذي ستنقسم فيه الخلايا الفردية في الجسم الحي. ثالثا، قد تتدهور فسيولوجيا الأنسجة بسرعة خلال زراعة الجسم الحي السابق. في هذا البروتوكول، ونحن نصف طرق يمكن الوصول إليها بسهولة لتحليل الحية والثابتة من الحيوانات المنوية drosophila melanogaster لأنها تخضع لانقسامات الخلايا meiotic داخل الخصيتين سليمة تماما. هذه الخلايا مثالية لتحليل الحية، على سبيل المثال على الجسم الحي لأنها يمكن الوصول إليها بسهولة مع الأساليب البصرية القياسية مثل المجهر الكونستبكي، فإنها تقسم في أوقات ومواقع يمكن التنبؤ بها، ويمكن الحفاظ على الخصيتين سليمة في ثقافة الجسم الحي على ما يصل إلى حوالي 24 ساعة. بالإضافة إلى ذلك، فإن خلايا الحيوانات المنوية في دروسوفيلا هي خلايا مستديرة كبيرة (قطرها حوالي 20-30 ميكرون) لا تغير الشكل عند تقسيمها، مما يجعلها مثالية للدقة العالية والتصوير الفاصل الزمني للمكونات الخلوية مثل جهاز المغزل والعضيات السيتوبلازمية. على الرغم من أن هذه الخلايا تخضع للmeiosis بدلا من الانقسام ، فإن العديد من عمليات تقسيم الخلايا الأساسية متشابهة للغاية بين هاتين الآليتين لانقسام الخلايا6. جعلت هذه المزايا، جنبا إلى جنب مع أدوات قوية Drosophila الوراثية، Drosophila spermatocytes نموذج يستخدم على نطاق واسع لتحليل الجسم الحي من عمليات تقسيم الخلايا الأساسية بما في ذلك تشكيل المغزل والتنظيم، cytokinesis، وإعادة عرض organelle وتقسيم7،8،9،10،11.
الخلايا المنوية هي الخلايا التي هي في مرحلة meiotic من تكوين الحيوانات المنوية. في دروسوفيلا، يبدأ تكوين الحيوانات المنوية بمجموعة من الخلايا الجذعية الجرثومية التي تقع في منطقة صغيرة أو "محور" في قطب واحد من الخصية12،13. تنقسم هذه الخلايا بسبب الانقسام غير المتماثل ، مما يؤدي إلى وجود نطاف واحد متمايز. الحيوانات المنوية ثم الخضوع لأربعة mitoses متزامن لإنتاج مجموعة من 16 الخلايا التي لا تزال مرتبطة ارتباطا وثيقا داخل كيس واحد. في هذه المرحلة، تنتقل الخلايا من دورة الخلايا الميطيّة إلى دورة الخلية الميّواتية ويشار إليها باسم الخلايا المنوية. الخلايا المنوية تنفق حوالي يومين إلى ثلاثة أيام في مرحلة G2 الموسعة من دورة الخلية، والتي تنمو بشكل كبير والخضوع لتغيرات الخلوي استعدادا للقسمين meiotic والحيوانات المنوية اللاحقة13،14. المجموعة بأكملها من 16 الخلايا المنوية داخل كيس واحد ثم أدخل الانقسام meiotic الأولى في نفس الوقت. وهكذا، يمكن أن يتم التصوير العديد من الحيوانات المنوية meiotic في وقت واحد لأنها تتحرك من خلال انقسام الخلية. يشرع القسم الميوتيكي الأول لمدة 1.5 ساعة تقريبًا ويتبعها على الفور تقريبًا القسم الميوطي الثاني ، مما ينتج عنه 64 من الحيوانات المنوية الإجمالية التي تستمر في التفريق إلى الحيوانات المنوية الناضجة.
ميزة فريدة من نوعها لاستخدام الخلايا المنوية لدراسة انقسام الخلايا في الأنسجة الحية وسليمة هي أن مجموعات أو الخراجات من الخلايا تتقدم باستمرار من خلال مراحل مختلفة من تكوين الحيوانات المنوية، والخلايا في جميع مراحل تكوين الحيوانات المنوية يمكن عادة تحديدها في أي الخصية معينة (انظر الشكل 3A). لذلك ، من السهل نسبيًا العثور على خلايا ميوتيكية في الخصيتين الكاملتين. نحن نركز بشكل عام تحليلاتنا على الأول بدلاً من meiosis الثاني لأن هذه الخلايا أكبر بكثير وأكثر قابلية للتصوير عالي الدقة ، ولكن العملية بأكملها التي تشمل كلا القسمين meiotic يمكن تصويرها بنجاح. تجدر الإشارة أيضا إلى أن البروتوكول العام لإعداد الخصية والثقافة يمكن استخدامها لتحليل العمليات الأخرى لتكوين الحيوانات المنوية كذلك، مثل الخلايا الجذعية mitotic في وقت سابق أو الانقسامات المنوية أو التغيرات الخلوية التي تحدث كما الحيوانات المنوية تنضج في الحيوانات المنوية15. يتم الحفاظ على العديد من هذه الجوانب من تكوين الحيوانات المنوية بشكل كبير بين دروسوفيلا والبشر16.
الخلايا المنوية Drosophila تبدأ في الوصول إلى مرحلة meiotic من تكوين الحيوانات المنوية خلال المرحلة الثالثة من اليرقات instar من تطوير Drosophila 13. لذلك ، يمكن استخدام الخصيتين المعزولات من مراحل دورة الحياة بدءًا من يرقات الإنستار الثالثة بما في ذلك الخوخ والبالغين لتحليل تقسيم الخلايا المنوية. تتوفر العديد من البروتوكولات الممتازة لاستخراج الخصيات من الذباب الذكور البالغين للتحليل الحي والثابت لتكوين الحيوانات المنوية17،18،19. قد تكون هذه البروتوكولات مفضلة لدراسة المراحل المتأخرة من تكوين الحيوانات المنوية أو إذا كان يجب استخدام العلامات الوراثية التي لا تظهر إلا لدى البالغين. يركز البروتوكول بدلاً من ذلك على إعداد الخصية من اليرقات والخوخ المبكر ، لأن الخصيتين في هذه المراحل لها العديد من المزايا التي ترتبط على وجه التحديد بتحليل انقسام الخلايا عن طريق التحليل الدقيق العالي والمجهر الفاصل زمنيًا. أولاً ، الخصيتان من اليرقات والخوخ أصغر من تلك التي من البالغين ، والخلايا داخل الجهاز أقل ازدحامًا. وبسبب هذا، يمكن في كثير من الأحيان تقسيم الخلايا المنوية يمكن أن تكون صورة بالقرب من السطح الخارجي للاختبارات اليرقات، دون الحاجة إلى اختراق من خلال طبقات متعددة من الأنسجة المتناثرة الضوء. ثانياً، تتحرك خصيّات البالغين بشكل إيقاعي بسبب تقلصات الأعضاء الملحقة، وهذه الحركات تجعل تصوير الخلايا الفردية ينطوي على ضيق زمني. وثالثاً، تكون اختبارات اليرقات مفيدة عند دراسة الطفرات الجينية التي تسبب الفتك الجروية أو البالغة. تم تحسين أساليبنا لثقافة طويلة الأجل من الخصيتين على مرحلة المجهر ، مما يسمح بتصوير جولات متعددة من انقسام الخلايا أو تطور الخلايا الفردية من خلال مراحل متعددة من تكوين الحيوانات المنوية في نفس الإعداد. كما أننا نصف بروتوكول لتثبيت ومناعة الخصيتين بأكملها. وعموما، بروتوكولاتنا مفيدة بشكل خاص لأولئك المهتمين في دراسة انقسام الخلايا في الأنسجة سليمة، والقدرة على الجمع بين تحليل الحيوانات المنوية مع أدوات الحمض العضلي ة القابلة للاستغناء عن الأدوات الوراثية دروسوفيلا يجعل هذا النهج قوية خاصة.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>5&#34; Dissecting Probe</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-965-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5.75&#34; Glass Pasteur Pipet</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-678-20A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP9703-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-20</td>
			<td>Straight forcepts with fine tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frosted Microscope Slides</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-544-2</td>
			<td>Slides for mounting fixed tissue, with frosted writing surface</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halocarbon oil 700</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H8898-100 mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lumox Dish 50</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>SAR946077410</td>
			<td>Gas-permeable tissue culture dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Cover Glass</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-541-B</td>
			<td>22x22 mm, #1.5 glass coverslip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minutien Pins</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26002-15</td>
			<td>Insect pins used to make scalpel tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nickel Plated Pin Holder</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26018-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 32% Solution, EM Grade</td>
			<td>Electron Microsocopy Sciences</td>
			<td>15714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plan Beveled Edge Microscope Slides</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-549-5</td>
			<td>Slides used for dissections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PYREX Spot Plates</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-748B</td>
			<td>9-well glass dissecting dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schneider&#39;s Drosophila medium</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>21720-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Filter, 0.22 &#181;m</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>SLGS033SB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP151-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>H-1000</td>
			<td>Microscopy mounting medium</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of drosophila larval and pupal testes for analysis of cell division in live, intact tissue

التحليل التجريبي للخلايا التي تنقسم في الأنسجة والأعضاء الحية والسليمة أمر ضروري لفهمنا لكيفية تكامل انقسام الخلايا مع التطور وتناط الأنسجة وعمليات المرض. الخلايا المنوية Drosophila التي تخضع للmeiosis مثالية لهذا التحليل لأن (1) اختبارات Drosophila كاملة تحتوي على الخلايا المنوية من السهل نسبيا لإعداد للميكروسسكوبية، (2) حجم الحيوانات المنوية كبيرة يجعلها مناسبة تماما للتصوير عالية الدقة، و (3) أدوات قوية Drosophila الوراثية يمكن دمجها مع في تحليل الجسم الحي. هنا ، نقدم بروتوكولًا يسهل الوصول إليه لإعداد الخصيتين الكاملتين من يرقات الانستار الثالثة Drosophila والخوخ المبكر. نحن نصف كيفية تحديد الحيوانات المنوية meiotic في الخصيتين كله أعدت وكيفية تصويرها تعيش عن طريق المجهر الفاصل الزمني. كما يتم توفير بروتوكولات التثبيت والاختبارات الكاملة المناعية. استخدام الخصية اليرقات له العديد من المزايا على البروتوكولات المتاحة التي تستخدم الخصية الكبار لتحليل الحيوانات المنوية. الأهم من ذلك، الخصيتين اليرقات هي أصغر وأقل ازدحاما مع الخلايا من الخصيتين الكبار، وهذا يسهل إلى حد كبير التصوير عالية الدقة من الخلايا المنوية. لإثبات هذه المزايا وتطبيقات البروتوكولات، نقدم نتائج تبين إعادة توزيع التبهيل الإندوسلي في ما يتعلق بالميكروتوبولين المغزل أثناء انقسام الخلية في صورة واحدة من الحيوانات المنوية التي تم تصويرها بواسطة المجهر confocal الفاصل الزمني. يمكن الجمع بين البروتوكولات مع التعبير عن أي عدد من البروتينات الموسومة بفلوريأو علامات العضين ، وكذلك الطفرات الجينية وغيرها من الأدوات الوراثية ، مما يجعل هذا النهج قويًا بشكل خاص لتحليل آليات تقسيم الخلايا في السياق الفسيولوجي للأنسجة والأعضاء الكاملة.

عندما يتم تنفيذ هذا البروتوكول بنجاح، ستبقى الخصيتين سليمتين تمامًا للتصوير عن طريق المجهر المحوري أو طرق المجهر الفلورية الأخرى. كما رأينا في الشكل 3A، يتم الحفاظ على التنظيم الخلوي للخصيتين ، ويكون تطور تمايز الخلية من نهاية واحدة من الخصية إلى الطرف الآخر بما في ذلك الح...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue at JoVE.com

Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

الهدف من هذا البروتوكول هو تحليل انقسام الخلايا في الأنسجة السليمة عن طريق المجهر الخلية الحية والثابتة باستخدام الحيوانات المنوية الميواتية Drosophila. يوضح البروتوكول كيفية عزل الخصيتان الكاملة والسليمة من يرقات دروسوفيلا والخوخ المبكر ، وكيفية معالجتها وتركيبها للتنظير المجهري.

إعداد دروسوفيلا رفال واختبارات Pupal لتحليل انقسام الخلايا في الأنسجة الحية والسليمة

Experimental analysis of cells dividing in living, intact tissues and organs is essential to our understanding of how cell division integrates with ...

يمكن استخدام هذا البروتوكول لتحليل آليات انقسام الخلايا في سياق المعيشة، والأنسجة سليمة باستخدام المجهر المفلور. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن يتم الحفاظ على البيئات الفسيولوجية الأصلية للخلايا ، مع السماح أيضًا بالتصوير المباشر على مدار دورات زمنية طويلة. أهم جزء من هذه التقنية هو التأكد من أن الخصيتان لا تتلف أثناء التشريح أو التركيب.هذه هي المهارة التي يتم اكتسابها مع القليل من الوقت والممارسة. إن العرض التوضيحي البصري لهذه الطريقة أمر بالغ الأهمية، لأنه يوضح كيفية تحديد الخصيين وعزلهما، وكيفية تركيبهما للتصوير دون إتلاف الأنسجة. إعداد الحيوانات والأدوات ووسائل الإعلام كما هو موضح في المخطوطة.قبل البدء في تشريح، واستخدام وسائل الإعلام شغل حقنة مرشح لطرد ثلاث قطرات من وسائل الإعلام كل 50 ميكرولترات في أعلى، وسط، وأسفل من شريحة زجاجية. باستخدام مسبار تشريح، نقل خمسة إلى 10 ثالث اليرقات نجمة أو pupae في وقت مبكر إلى أعلى قطرة من وسائل الإعلام على الشريحة. يهيج بلطف اليرقات والضجر في وسائل الإعلام مع مسبار تشريح لإزالة أي طعام أو حطام.استخدم المجس المتشريح لتحويل يرقات أو خادرة واحدة على جانبها. ابحث عن الخصيتين الثنائيتين التي تظهر كهياكل بيضاوية شفافة على الثلث الخلفي من الجسم. الحيوانات التي تفتقر إلى الخصيتان هي أنثى، وينبغي التخلص منها.عندما يتم العثور على يرقات الذكور أو الخواد ونظيفة ، نقله إلى قطرة ثانية من وسائل الإعلام. كرر حتى يتم نقل ثلاثة أو أربعة يرقات ذكورية أو خادرة إلى القطرة الثانية من الوسائط. ثم العمل في قطرة الثانية من وسائل الإعلام، فهم واحد مع زوج من ملقط في منتصف المنطقة، فقط في الجزء الأمامي من الخصيات.استخدام زوج الثاني من ملقط لتمزيق بلطف الحيوان في النصف. باستخدام زوج من ملقط، عقد الطرف الخلفي من الحيوان إلى أسفل على الشريحة الزجاجية. بدءا من مجرد بجوار ملقط، ودفع إلى أسفل على بشرة باستخدام حافة مشرط.تحريك مشرط نحو نهاية قطع من الحيوان. هذا سوف يطرد الأعضاء الداخلية للحيوان، والتي تشمل الشجاعة، والهيئات الدهنية، والخصيتين. الخصيتان عديمتان اللون وشفافية تقريباً أعضاء بيضاوية مدمجة في شرائط من الجسم الدهني.ندف بلطف بعيدا الخصيات من بقية الأعضاء. لنقل الخصيات واحدة في وقت واحد، أدخل حافة المشرط تحت الجسم الدهون، ورفع الأنسجة من وسائل الإعلام، ونقلها بسرعة إلى قطرة الثالثة. إذا لم يكن هناك ما يكفي من الجسم الدهون لا تزال تعلق على الخصيتين لرفع الأنسجة مع مشرط استخدام ماصة باستور الزجاج الذي تم prewetted مع المتوسطة تشريح.العمل في قطرة ثالثة من المتوسطة، واستخدام نهاية حادة من مشرط لشريحة بلطف بعيدا الجسم الدهون الزائدة من الخصيات، وترك مجرد حافة صغيرة من الجسم الدهون حول حواف. أولاً، استخدم حقنة الفلتر لإيداع قطرة واحدة من متوسط شنايدر حوالي 30 ميكرولتر على مركز طبق ثقافة قابل للنفاذ من الغاز 50 ملليمتر. باستخدام أداة مشرط أو ماصة باستور prewetted نقل ما يصل إلى خمسة من الخصيتين المعدة إلى قطرة على الطبق.بعد ذلك ، استخدم أداة المشرط لدفع الخصيات بلطف إلى الغشاء نفاذي الغاز ، وإلى مركز قطرة المتوسطة. باستخدام حقنة ملليلتر واحدة، ضع أربع قطرات من زيت الهالوكربون على غشاء نفاذي للغاز المحيط بقطة الوسط. وينبغي أن مواقع قطرات تتوافق مع الزوايا الأربعة من 22 ملليمتر من الدرجة coverslip.ثم محاذاة زوايا 22 ملليمتر الزجاج الأغطية مع أربع قطرات من زيت الهالوكربون وبلطف خفض الغطاء على وسائل الإعلام والنفط. السماح لل coverlip لتسوية، وبالنسبة لوسائل الإعلام التي تحتوي على الخصيتين انتشار بين قطرات من النفط. ضع طبق الثقافة تحت مجهر تشريح.لإزالة الوسائط الزائدة، قم بإدراج زاوية مسح مهمة حساسة أسفل غطاء الأغطية. ويك بعيدا ما يكفي من وسائل الإعلام لالأغطية الزجاج لمجرد إجراء اتصال مع سطح أكبر الخصية. لا تقم بإزالة الكثير من الوسائط وخفض الغطاء بعيدا جدا.وهذا سوف يمارس الضغط على الخصيات، وقد يسبب لهم تمزق. وأخيرا، ضع قطرة من زيت الغمر على غطاء الزجاج فوق الخصية. تسليم الطبق، ووضعها على مرحلة المجهر.نقل الهدف 40 أو 60 X المجهر في النفط حتى يكون أقل بقليل من الخصية. استخدام الضوء المنقولة للعثور على الخصية واحدة وإحضارها في التركيز. مكان 0.5 ملليلتر من 8٪ شبهformaldehyde في PBSTx في بئر واحد من تسعة صحن تشريح جيدا.استخدم ماصة باستور الزجاجية لنقل ما يصل إلى 10 من الخصيات إلى البئر. تأكد من أن الخصيتان مستلقيتان على الجزء السفلي من البئر. بعد 20 دقيقة، نقل الخصيتين إلى بئر يحتوي على 0.5 ملليلتر من PBSTx.غسل الخصيتين عن طريق التحريض بلطف لمدة خمس دقائق. اغسل مرتين في آبار جديدة مع PBSTx الطازجة.ثم نقل الخصيات من تسعة بئر الزجاج تشريح الطبق إلى الأنبوب. احتضان الأنبوب بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية مع هزاز لطيف أو nutation. الإجراء تلطيخ الخصيات مع الأجسام المضادة الثانوية مماثلة.انظر المخطوطة لمزيد من التفاصيل. أولاً، باستخدام ماصة باستور، قم بنقل الخصيات من لوحة الآبار التسعة إلى شريحة مجهرية زجاجية. إذا لزم الأمر، استخدم حافة المشرط لدفع الخصيات إلى أسفل على سطح الشريحة.المقبل، واستخدام زاوية من مهمة حساسة مسح لإبْكة السائل الزائد بعيداً عن الخصية. إزالة السائل قدر الإمكان. ثم تطبيق 30 إلى 50 قطرات ميكرولتر من المجهر تصاعد المتوسطة إلى الخصيات.وأخيرا، ضع غطاء 22 ملليمتر على قطرة متوسطة التركيب. السماح لل coverlip لتسوية، والمتوسطة تصاعد للانتشار تحت غطاء. إذا لزم الأمر، وتطبيق ضغط لطيف على غطاء للضغط على زيادة المتوسطة تصاعد والسماح للأغطية للراحة على سطح الخصية.عندما يتم تنفيذ هذا البروتوكول بنجاح، يتم الاحتفاظ بالتنظيم الخلوي للخصيات، وتدرج تمايز الخلية من نهاية واحدة من الخصية إلى الأخرى مرئياً. يمكن تحديد الحيوانات المنوية على وشك البدء في الداء الوسيم وتلك الموجودة في ميتافاتايز. في الخصيات المعدة باستخدام هذا البروتوكول، يظهر تحليل التصوير الحي إعادة التنظيم الديناميكي للرطب endoplasmic وبيبات صغيرة في تقسيم الحيوانات المنوية.كما هو موضح في البروتوكول، يجب توخي الحذر الشديد لعدم ممارسة الضغط الذي يسبب الخصيتان لتنفجر. تتدفق الخراجات من الخلايا المنوية بسرعة من الخصية الممزقة ، مما يجعل التصوير الحي لفاصل الوقت صعبًا. هذا البروتوكول هو الأمثل للتصوير تقسيم الخلايا المنوية في الأنسجة الحية، سليمة.ولذلك، فمن الضروري أن لا تتلف الخصيتان أثناء التشريح أو التركيب. يجب أن تكون طريقتنا مناسبة أيضًا لتقنيات التصوير فائقة الدقة ، مثل المجهر المُنظم للإضاءة ، مما يوفر رؤى جديدة في العمليات الخلوية الفرعية الديناميكية التي تحكم انقسام الخلايا.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

يعيش التصوير لل<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; العذراء العين

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track ...

Preparation of Mitochondrial Enriched Fractions for Metabolic Analysis in Drosophila

Preparation of Mitochondrial Enriched Fractions for Metabolic Analysis in Drosophila

إعداد الميتوكوندريا المخصب الكسور لتحليل التمثيل الغذائي في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em

Since mitochondria play roles in amino acid metabolism, carbohydrate metabolism and fatty acid oxidation, defects in mitochondrial function often ...

Observing Mitotic Division and Dynamics in a Live Zebrafish Embryo

مراقبة قسم الميتوزى وديناميكية في الأجنة الزرد لايف

Mitosis is critical for organismal growth and differentiation. The process is highly dynamic and requires ordered events to accomplish proper chromatin ...

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

في المختبر زراعة ovule للتصوير خلايا حية من الاستقطاب الزيجوت والزخرفة الجنين في التمويل نبات

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

تصوير لايف من ماوس الثانوي باليت فيوجن

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue

Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue

أساليب للأس الهيدروجيني "التصوير داخل الخلايا" من "سلالة الخلايا الجذعية جريب" في "أنسجة المبيض" المورفولوجية لايف

Changes in intracellular pH (pHi) play important roles in the regulation of many cellular functions, including metabolism, proliferation, and ...

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

تشريح وتلطيخ المبايض المورفولوجية الخوادر

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a ...

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

تشريح الشبكية الخوادر المورفولوجية إيمونوهيستوتشيميستري والتحليل الغربي، وعزل الحمض النووي الريبي

The Drosophila pupal retina provides an excellent model system for the study of morphogenetic processes during development. In this paper, we present a ...

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

التصوير الحي وتحليل تقلصات العضلات في جنين دروسوفيلا

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits ...