Name: preparation of drosophila larval and pupal testes for analysis of cell division in live, intact tissue
Uploaded: 2020-05-19T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue at JoVE.com

这项工作得到了国防部对J.T.S.的启动资金的支持。

1. 准备动物、工具和介质进行解剖
<ol><li>交叉雄性苍蝇和雌性苍蝇，以获得所需的基因型的后代。用于鉴定和分期的转基因标记包括GFP-tubulin标记的美质主轴和RFP-组音2A来标记染色体8。每十字架使用5至10只雌性，并在25°C的培养箱中保持标准飞食上的十字架，直到第三只小幼虫开始爬起小瓶的两侧（4~5天）。早白的小狗将在一天后开始形成。</li>
	<li>获得两对带细尖的直钳。确?...

<ol>
	<li>Khodjakov, A., Rieder, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+division+process+in+living+tissue+culture+cells.">Imaging the division process in living tissue culture cells.</a> Methods. 38 (1), 2-16 (2006).</li><li>Ong, J. Y., Torres, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+mechanisms+of+cell+division.">Dissecting the mechanisms of cell division.</a> The Journal of Biological Chemistry. 294 (30), 11382-11390 (2019).</li><li>Levine, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cycling+through+development.">Cell cycling through development.</a> Development. 131 (10), 2241-2246 (2004).</li><li>Gross, S. M., Rotwein, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unraveling+Growth+Factor+Signaling+and+Cell+Cycle+Progression+in+Individual+Fibroblasts.">Unraveling Growth Factor Signaling and Cell Cycle Progression in Individual Fibroblasts.</a> The Journal of Biological Chemistry. 291 (28), 14628-14638 (2016).</li><li>Mittelman, D., Wilson, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fractured+genome+of+HeLa+cells.">The fractured genome of HeLa cells.</a> Genome Biology. 14 (4), 111 (2013).</li><li>Bury, L., Coelho, P. A., Glover, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+Meiosis+to+Mitosis:+The+Astonishing+Flexibility+of+Cell+Division+Mechanisms+in+Early+Mammalian+Development.">From Meiosis to Mitosis: The Astonishing Flexibility of Cell Division Mechanisms in Early Mammalian Development.</a> Current Topics in Developmental Biology. 120, 125-171 (2016).</li><li>Giansanti, M. G., Fuller, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+Drosophila+spermatocytes+tell+us+about+the+mechanisms+underlying+cytokinesis.">What Drosophila spermatocytes tell us about the mechanisms underlying cytokinesis.</a> Cytoskeleton. 69 (11), 869-881 (2012).</li><li>Karabasheva, D., Smyth, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel,+dynein-independent+mechanism+focuses+the+endoplasmic+reticulum+around+spindle+poles+in+dividing+Drosophila+spermatocytes.">A novel, dynein-independent mechanism focuses the endoplasmic reticulum around spindle poles in dividing Drosophila spermatocytes.</a> Scientific Reports. 9 (1), 12456 (2019).</li><li>Polevoy, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+roles+for+the+Drosophila+PI+4-kinase+four+wheel+drive+in+localizing+Rab11+during+cytokinesis.">Dual roles for the Drosophila PI 4-kinase four wheel drive in localizing Rab11 during cytokinesis.</a> Journal of Cell Biology. 187 (6), 847-858 (2009).</li><li>Rebollo, E., Llamazares, S., Reina, J., Gonzalez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+noncentrosomal+microtubules+to+spindle+assembly+in+Drosophila+spermatocytes.">Contribution of noncentrosomal microtubules to spindle assembly in Drosophila spermatocytes.</a> PLoS Biology. 2 (1), 8 (2004).</li><li>Smyth, J. T., Schoborg, T. A., Bergman, Z. J., Riggs, B., Rusan, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proper+symmetric+and+asymmetric+endoplasmic+reticulum+partitioning+requires+astral+microtubules.">Proper symmetric and asymmetric endoplasmic reticulum partitioning requires astral microtubules.</a> Open Biology. 5 (8), (2015).</li><li>Demarco, R. S., Eikenes, &. #. 1. 9. 7. ;. H., Haglund, K., Jones, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+spermatogenesis+in+Drosophila+melanogaster.">Investigating spermatogenesis in Drosophila melanogaster.</a> Methods. 68 (1), 218-227 (2014).</li><li>Fuller, M. T., Bate, M., Martinez-Arias, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Development of Drosophila melanogaster. , 71-147 (1993).</li><li>Dunleavy, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cell+Cycle+Timing+of+Centromeric+Chromatin+Assembly+in+Drosophila+Meiosis+Is+Distinct+from+Mitosis+Yet+Requires+CAL1+and+CENP-C.">The Cell Cycle Timing of Centromeric Chromatin Assembly in Drosophila Meiosis Is Distinct from Mitosis Yet Requires CAL1 and CENP-C.</a> PLOS Biology. 10 (12), 1001460 (2012).</li><li>Fabian, L., Brill, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+spermiogenesis:+Big+things+come+from+little+packages.">Drosophila spermiogenesis: Big things come from little packages.</a> Spermatogenesis. 2 (3), 197-212 (2012).</li><li>Ramm, S. A., Scharer, L., Ehmcke, J., Wistuba, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sperm+competition+and+the+evolution+of+spermatogenesis.">Sperm competition and the evolution of spermatogenesis.</a> Molecular Human Reproduction. 20 (12), 1169-1179 (2014).</li><li>Savoian, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopy+Methods+for+Analysis+of+Spindle+Dynamics+in+Meiotic+Drosophila+Spermatocytes.">Microscopy Methods for Analysis of Spindle Dynamics in Meiotic Drosophila Spermatocytes.</a> Methods in Molecular Biology. 1471, 265-276 (2017).</li><li>Sitaram, P., Hainline, S. G., Lee, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytological+analysis+of+spermatogenesis:+live+and+fixed+preparations+of+Drosophila+testes.">Cytological analysis of spermatogenesis: live and fixed preparations of Drosophila testes.</a> Journal of Visualized Experiments. (83), e51058 (2014).</li><li>Zamore, P. D., Ma, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Drosophila+melanogaster+testes.">Isolation of Drosophila melanogaster testes.</a> Journal of Visualized Experiments. (51), (2011).</li><li>Lerit, D. A., Plevock, K. M., Rusan, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+Drosophila+larval+neuroblasts.">Live imaging of Drosophila larval neuroblasts.</a> Journal of Visualized Experiments. (89), (2014).</li><li>Belloni, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+Cog7+affect+Golgi+structure,+meiotic+cytokinesis+and+sperm+development+during+Drosophila+spermatogenesis.">Mutations in Cog7 affect Golgi structure, meiotic cytokinesis and sperm development during Drosophila spermatogenesis.</a> Journal of Cell Science. 125 (22), 5441-5452 (2012).</li><li>Harel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistence+of+major+nuclear+envelope+antigens+in+an+envelope-like+structure+during+mitosis+in+Drosophila+melanogaster+embryos.">Persistence of major nuclear envelope antigens in an envelope-like structure during mitosis in Drosophila melanogaster embryos.</a> Journal of Cell Science. 94 (3), 463-470 (1989).</li><li>Katsani, K. R., Karess, R. E., Dostatni, N., Doye, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+dynamics+of+Drosophila+nuclear+envelope+components.">In vivo dynamics of Drosophila nuclear envelope components.</a> Mol Biol Cell. 19 (9), 3652-3666 (2008).</li><li>Tates, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cytodifferentiation during spermatogenesis in Drosophila melanogaster: An electron microscope study. , (1971).</li><li>Gartner, S. M., Rathke, C., Renkawitz-Pohl, R., Awe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+culture+of+Drosophila+pupal+testis+and+single+male+germ-line+cysts:+dissection,+imaging,+and+pharmacological+treatment.">Ex vivo culture of Drosophila pupal testis and single male germ-line cysts: dissection, imaging, and pharmacological treatment.</a> Journal of Visualized Experiments. (91), 51868 (2014).</li><li>Ohkura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiosis:+an+overview+of+key+differences+from+mitosis.">Meiosis: an overview of key differences from mitosis.</a> Cold Spring Harbor perspectives in biology. 7 (5), (2015).</li><li>Friedman, J. R., Webster, B. M., Mastronarde, D. N., Verhey, K. J., Voeltz, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ER+sliding+dynamics+and+ER-mitochondrial+contacts+occur+on+acetylated+microtubules.">ER sliding dynamics and ER-mitochondrial contacts occur on acetylated microtubules.</a> Journal of Cell Biology. 190 (3), 363-375 (2010).</li><li>Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methanol-acetone+fixation+of+Drosophila+testes.">Methanol-acetone fixation of Drosophila testes.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (10), 1270-1272 (2011).</li><li>Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paraformaldehyde+fixation+of+Drosophila+testes.">Paraformaldehyde fixation of Drosophila testes.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (1), 102-104 (2012).</li></ol>

我们已经描述了一种用于制备幼虫或早期果蝇睾试验的协议，该测试针对精子细胞细胞分裂的长期活成像进行了优化。这是分析完整组织生理语境中细胞分裂的有力方法。当与果蝇遗传工具结合使用时，这种方法的力量会进一步扩大，例如特定的基因突变、组织特异性RNAi介导的抑制以及荧光标记的蛋白质和细胞标记物。此外，幼虫和脓器睾试验体积小，以及成像离玻璃罩滑非常近的...

细胞分裂通常使用培养1中生长的细胞系进行研究。虽然我们从这些研究中获得了丰富的宝贵见解和理解基本机制2，但培养中生长的细胞不能完全概括细胞分裂的生理，因为它发生在完好的活组织中。例如，在完好的组织和器官中，细胞必须在正确的地点和正确的时间进行分裂，以便后代细胞正确位于组织内，以便它们能够进行适当的分化或功能程序，使细胞增殖与组织生长或平衡3适当协调。另一方面，对于在培养中生长的细胞，细胞分裂一般受培养媒介4的生长因子调节，因此我们不能从这些细胞中学习体内环境因素，如组织结构或发育信号如何影响分裂过程。还必须注意，许多用于研究细胞分裂的细胞系，如HeLa和U2OS细胞，都来自转移性肿瘤5。因此，与健康细胞相比，这些癌细胞的基本生理的许多方面，如细胞周期调节机制和染色体稳定性，都可能发生变化。因此，对细胞分裂生理学的完全理解取决于我们研究其原生体内的分裂细胞的能力，这些环境中保存了生理调节机制和组织结构。
理解细胞分裂如何在完好的组织和器官内运作的进展受到体内或外体分析所固有的困难的阻碍。首先，在大型器官或厚组织中，很难或不可能进入分裂细胞进行微观分析。其次，通常很难预测单个细胞何时在体内分裂。第三，组织生理学在外活体培养过程中可能迅速恶化。在此协议中，我们描述了在完全完好的睾口中接受微粒细胞分裂时，对果蝇黑色无粒细胞进行活和固定分析的易访问方法。这些细胞是活的、活的、活的分析的理想选择，因为它们很容易通过标准光学方法（如共聚焦显微镜）访问，它们在可预测的时间和地点进行分裂，并且完整的睾试验可在体内培养下保持长达 24 小时。此外，果蝇精子细胞是大圆形细胞（直径约20~30μm），在分裂时不会改变形状，因此非常适合对细胞组分（如主轴装置和细胞质细胞器）进行高分辨率、延时成像。虽然这些细胞经历梅氏病，而不是线虫病，许多必要的细胞分裂过程是非常相似的这两个细胞分裂机制6。这些优势，加上强大的果蝇遗传工具，使果蝇精子细胞成为一个广泛使用的模型，用于对基本细胞分裂过程进行前活体分析，包括主轴形成和调节、细胞激酶和细胞机重塑和分区7、8、9、10、11。8,9,10,117
精子细胞是处于精子成形阶段的细胞。在果蝇，精子生成开始于一组生殖系干细胞，位于一个小区域或"枢纽"在睾比12，13,13的一个极点。这些细胞被不对称的线粒体分裂，产生一个单一的分化精子。然后，精子经过四个同步线粒体，产生一组16个细胞，在单个囊肿内保持密切关联。在这个阶段，细胞从线粒体过渡到半胱细胞循环，被称为精子细胞。精子细胞在细胞周期的G2延长阶段花费大约两到三天，在此期间，它们急剧生长，并经历细胞学变化，为两个间皮分裂和随后的精子发生13，14,14做准备。在单个囊肿内，整个16个精子细胞组，然后同时进入第一个囊肿。因此，在细胞分裂中可以同时成像几种美细胞。第一次美粒分进行约1.5小时，几乎立即跟随第二个美粒分，产生64个总精子，继续分化成成熟的精子。
使用精子细胞研究活的、完整组织的细胞分裂的一个独特优点是，细胞的组或囊肿在精子成世的不同阶段不断进步，精子成世各个阶段的细胞通常可以在任何给定的睾瘤中识别（见图3A）。因此，在整个睾试验中相对容易找到碘细胞。我们通常将分析重点放在第一个而不是第二个美病上，因为这些细胞更大，更容易接受高分辨率成像，但包含两个网格分裂的整个过程可以成功成像。还应注意的是，睾精制剂和培养的一般协议也可用于分析精子生成的其他过程，例如早期的线粒体干细胞或精子分裂，或当精子成熟成精子15时发生的细胞学变化。精子成世的许多方面在果蝇和人类之间高度保存。
果蝇精子细胞开始达到精子成形的膜阶段，在果蝇发育的第三个星幼虫阶段13。因此，从生命周期阶段分离的睾试验从第三颗星幼虫开始，包括幼虫和成人可用于分析精子细胞的分裂。一些优秀的协议可用于从成年雄性苍蝇中提取睾子，用于活和固定分析精子生成17，18，19。17,18,19这些协议对于研究精子成世的晚期或必须使用仅在成人中可见的遗传标记可能更可取。该协议侧重于幼虫和早期普帕的睾制剂，因为这些阶段的睾试验具有几个优点，这些优点与高分辨率延时显微镜的细胞分裂分析特别相关。首先，幼虫和幼虫的睾比成人小，器官内的细胞不那么拥挤。因此，分裂精子细胞通常可以在幼虫睾试验的外表面附近成像，而不必穿透多层光散射组织。其次，成人睾试验由于附加的附属器官收缩而有节奏地移动，这些运动使单个细胞的延时成像具有挑战性。第三，幼虫睾试验在研究导致阴极或成人致命性的基因突变时是有利的。我们的方法针对显微镜阶段睾试验的长期培养进行了优化，允许在同一制备中通过精子成能的多个阶段对多轮细胞分裂或单个细胞的进展进行成像。我们还描述了一种用于固定和免疫染色整个睾试验的协议。总体而言，我们的协议对于有兴趣研究完整组织中细胞分裂的人特别有用，能够将精子细胞分析与高可处理的果蝇遗传工具相结合，使得这种方法特别有力。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>5&#34; Dissecting Probe</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-965-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5.75&#34; Glass Pasteur Pipet</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-678-20A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP9703-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-20</td>
			<td>Straight forcepts with fine tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frosted Microscope Slides</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-544-2</td>
			<td>Slides for mounting fixed tissue, with frosted writing surface</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halocarbon oil 700</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H8898-100 mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lumox Dish 50</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>SAR946077410</td>
			<td>Gas-permeable tissue culture dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Cover Glass</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-541-B</td>
			<td>22x22 mm, #1.5 glass coverslip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minutien Pins</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26002-15</td>
			<td>Insect pins used to make scalpel tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nickel Plated Pin Holder</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26018-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 32% Solution, EM Grade</td>
			<td>Electron Microsocopy Sciences</td>
			<td>15714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plan Beveled Edge Microscope Slides</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-549-5</td>
			<td>Slides used for dissections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PYREX Spot Plates</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-748B</td>
			<td>9-well glass dissecting dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schneider&#39;s Drosophila medium</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>21720-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Filter, 0.22 &#181;m</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>SLGS033SB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP151-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>H-1000</td>
			<td>Microscopy mounting medium</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of drosophila larval and pupal testes for analysis of cell division in live, intact tissue

实验性分析活细胞、完整组织和器官中的分裂，对于我们理解细胞分裂如何与发育、组织平衡和疾病过程结合至关重要。接受梅氏病的果蝇精子细胞是这种分析的理想选择，因为 （1） 含有精子细胞的整个果蝇睾比相对容易准备显微镜，（2） 精子细胞的体积大使它们非常适合高分辨率成像，（3） 强大的果蝇遗传工具可与体内分析相结合。在这里，我们提出了一个易于访问的协议，用于制备来自果蝇的第三颗幼虫和早期幼虫的整个睾试验。我们描述了如何识别制备的整个睾底中的微细胞，以及如何通过延时显微镜来描绘它们的生活。还提供了固定和免疫染色整个睾试验的协议。与使用成人睾测试进行精子细胞分析的现有协议，幼虫睾试验的使用有几个优点。最重要的是，幼虫睾比比成人睾比更小，对细胞的挤拥程度更低，这极大地方便了精子细胞的高分辨率成像。为了证明这些优点和协议的应用，我们展示了在通过延时共聚焦显微镜成像的单一精子细胞中，在细胞分裂过程中，内质视网膜在主轴微管的再分配。协议可以结合表达任意数量的荧光标记蛋白或细胞标记，以及基因突变和其他遗传工具，使这种方法特别强大，分析细胞分裂机制在整个组织和器官的生理背景下。

成功执行此协议后，通过共聚焦显微镜或其他荧光显微镜方法进行成像的睾口将完全完好无损。如图3A所示，睾牛的细胞组织得以保存，细胞分化从睾酮的一端到另一端（包括精子、精子细胞和单倍体精子）的进展是可见的。GFP-tubulin是识别精细胞分裂和细胞通过梅氏肿的活体成像的有用标记。如图3B所示，关于开始梅氏病的精子细胞可以通过他们的两?...

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Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

该协议的目的是使用果蝇美细胞精细胞，通过活细胞和固定细胞显微镜分析完整组织中细胞分裂。该协议演示了如何从果蝇幼虫和早期幼虫中分离出完整、完整的睾口，以及如何处理和安装它们进行显微镜检查。

用于活、完整组织中细胞分部分析的果蝇拉瓦尔和普帕尔睾试验的制备

Experimental analysis of cells dividing in living, intact tissues and organs is essential to our understanding of how cell division integrates with ...

该协议可用于利用荧光显微镜分析活的、完整的组织背景下细胞分裂的机制。该技术的主要优点是保留了细胞的原生生理环境，同时还允许在长时间的课程内进行活体成像。这项技术最重要的部分是确保睾丸在解剖或安装过程中不会损坏。这是一种用一点时间和实践获得的技能。此方法的视觉演示至关重要，因为它演示了如何识别和隔离睾丸，以及如何在不损害组织的情况下安装睾丸进行成像。准备手稿中描述的动物、工具和介质。在开始解剖之前，使用充满介质的过滤注射器在玻璃滑梯的顶部、中间和底部排出三滴介质，每 50 微升。使用解剖探针，将五到十分之一的星体幼虫或早期幼虫转移到幻灯片上介质的顶部掉落。用解剖探针轻轻搅动介质中的幼虫和幼虫，以清除任何食物或碎屑。使用解剖探针将单个幼虫或幼虫侧翻。寻找两个双边睾丸，在身体的后三分之一上显示为半透明的椭圆形结构。缺乏睾丸的动物是女性，应该丢弃。当发现雄性幼虫或幼虫并清洁时，将它移动到第二滴介质。重复，直到三或四个雄性幼虫或幼虫被转移到第二滴介质。然后在第二滴介质中工作，抓住一只动物，在它的中区用一对钳子，就在睾丸的前部。使用第二对钳子轻轻地将动物撕成两半。使用一对钳子，将动物的后端放在玻璃滑梯上。从钳子旁边开始，使用手术刀的边缘向下推角质层。将手术刀移向动物的切端。这将驱逐动物的内部器官，包括肠道、脂肪身体和睾丸。睾丸是无色和几乎透明的椭圆形器官嵌入在脂肪身体的丝带。轻轻地把睾丸与其他器官分开。要一次转移一个睾丸，请将手术刀的边缘插入脂肪体下，将组织从介质中提起，并快速将其移动到第三滴。如果没有足够的脂肪身体仍然附着在睾丸上，用手术刀抬起组织使用玻璃巴斯德移液器，已经预先洗过解剖介质。在第三滴介质中工作，使用手术刀的尖端轻轻地将多余的脂肪体从睾丸中切开，在边缘周围留下一小块脂肪身体边缘。首先，使用过滤注射器将施耐德的一滴介质（约30微升）沉积到50毫米气体渗透培养皿的中心。使用手术刀工具或预洗的巴斯德移液器将多达五个准备好的睾丸转移到盘子上的掉落。接下来，使用手术刀工具轻轻地将睾丸向下推至气体渗透膜上，并插入介质掉落的中心。使用一毫升注射器，将四滴卤化碳油放在介质滴周围的气体渗透膜上。掉落的位置应对应于 22 毫米类盖玻片的四个角。然后将 22 毫米玻璃盖玻片的角与四滴卤化碳油对齐，然后轻轻地将盖玻片降至介质和机油上。让盖玻片沉淀，让包含睾丸的介质在油滴之间扩散。将培养皿放在解剖显微镜下。要去除多余的介质，请将细腻任务一角插入盖玻片下。Wick 远离足够的介质，使玻璃盖玻片与最大的睾丸表面接触。请勿取出太多介质，请将盖玻片降低得太远。这将对睾丸施加压力，并可能导致睾丸破裂。最后，在测试仪上方的玻璃盖玻片上放置一滴浸入油。翻盘，放在显微镜舞台上。将 40 或 60 X 显微镜目标移入机油中，直到其位于睾丸正下方。使用透光查找单个睾丸并聚焦。将 0.5 毫升 8% 甲状甲醛放在 PBSTx 中的一个井中，放在九井解剖盘中的一个井中。使用玻璃巴氏移液器将多达 10 个睾丸转移到井中。确保睾丸位于井底。20 分钟后，将睾丸转移到含有 0.5 毫升 PBSTx 的井中。轻轻搅拌五分钟，清洗睾丸。用新鲜的PBSTx在新井中清洗两次。如手稿所述，在1.5毫升微离心管中准备稀释原抗体。然后将睾丸从九井玻璃解剖盘转移到管子上。在四摄氏度下用柔和的摇动或螺母孵育管子过夜。用二次抗体染色睾丸的程序相似。有关详细信息，请参阅手稿。首先，使用巴斯德移液器，将睾丸从九井板转移到玻璃显微镜幻灯片上。如有必要，使用手术刀的边缘将睾丸向下推至幻灯片表面。接下来，使用精细任务擦拭的一角，将多余的液体从睾丸中清除。尽可能多地去除液体。然后将 30 至 50 微升的显微镜安装介质应用到睾丸上。最后，在安装介质的掉落上放置一个 22 毫米的盖玻片。让盖玻片沉淀，让安装介质在盖玻片下扩散。如有必要，对盖玻片施加温和压力，以挤出多余的安装介质，让盖玻片放在睾丸表面。当此协议成功执行时，睾丸的细胞组织将保留，并且从睾丸的一端到另一端的细胞分化进展是可见的。精子细胞即将开始美病和那些在元相可以识别。在使用本协议准备的睾丸中，实时成像分析显示内质性细胞和微管在分体精子细胞中的动态重组。如协议所述，必须非常小心，不要施加导致睾丸爆裂的压力。精子细胞的囊肿迅速从破裂的睾丸中流出，使活时间推移成像变得困难。该协议优化了成像分裂精子细胞在活的，完整的组织。因此，在解剖或安装过程中，睾丸不得损坏，这一点至关重要。我们的方法还应适用于超分辨率成像技术，如结构化照明显微镜，为控制细胞分裂的动态亚细胞过程提供新的见解。

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

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实时成像<em&gt;果蝇</em&gt;蛹眼

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track ...

科研

发育生物学

Preparation of Mitochondrial Enriched Fractions for Metabolic Analysis in Drosophila

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在代谢分析准备线粒体富集级的<em&gt;果蝇</em

Since mitochondria play roles in amino acid metabolism, carbohydrate metabolism and fatty acid oxidation, defects in mitochondrial function often ...

Observing Mitotic Division and Dynamics in a Live Zebrafish Embryo

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In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

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小鼠第二腭融合的实时成像

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