Name: preparation of drosophila larval and pupal testes for analysis of cell division in live, intact tissue
Uploaded: 2020-05-19T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af Department of Defense start-up midler til J.T.S.

1. Forbered dyr, værktøjer og medier til dissektion
<ol><li>Cross mandlige og kvindelige fluer for at opnå afkom af den ønskede genotype. Nyttige transgene markører til identifikation og iscenesættelse af meiotiske sædceller omfatter GFP-tubulin til mærkning af meiotiske spindel og RFP-histone 2A til mærkning af kromosomer8. Brug fem til ti hunner pr. kors og hold kors på standard fluemad i hætteglas i en 25 °C-inkubator, indtil tredje instarlarver begynder at kravle op langs siderne...

<ol>
	<li>Khodjakov, A., Rieder, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+division+process+in+living+tissue+culture+cells.">Imaging the division process in living tissue culture cells.</a> Methods. 38 (1), 2-16 (2006).</li><li>Ong, J. Y., Torres, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+mechanisms+of+cell+division.">Dissecting the mechanisms of cell division.</a> The Journal of Biological Chemistry. 294 (30), 11382-11390 (2019).</li><li>Levine, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cycling+through+development.">Cell cycling through development.</a> Development. 131 (10), 2241-2246 (2004).</li><li>Gross, S. M., Rotwein, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unraveling+Growth+Factor+Signaling+and+Cell+Cycle+Progression+in+Individual+Fibroblasts.">Unraveling Growth Factor Signaling and Cell Cycle Progression in Individual Fibroblasts.</a> The Journal of Biological Chemistry. 291 (28), 14628-14638 (2016).</li><li>Mittelman, D., Wilson, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fractured+genome+of+HeLa+cells.">The fractured genome of HeLa cells.</a> Genome Biology. 14 (4), 111 (2013).</li><li>Bury, L., Coelho, P. A., Glover, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+Meiosis+to+Mitosis:+The+Astonishing+Flexibility+of+Cell+Division+Mechanisms+in+Early+Mammalian+Development.">From Meiosis to Mitosis: The Astonishing Flexibility of Cell Division Mechanisms in Early Mammalian Development.</a> Current Topics in Developmental Biology. 120, 125-171 (2016).</li><li>Giansanti, M. G., Fuller, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+Drosophila+spermatocytes+tell+us+about+the+mechanisms+underlying+cytokinesis.">What Drosophila spermatocytes tell us about the mechanisms underlying cytokinesis.</a> Cytoskeleton. 69 (11), 869-881 (2012).</li><li>Karabasheva, D., Smyth, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel,+dynein-independent+mechanism+focuses+the+endoplasmic+reticulum+around+spindle+poles+in+dividing+Drosophila+spermatocytes.">A novel, dynein-independent mechanism focuses the endoplasmic reticulum around spindle poles in dividing Drosophila spermatocytes.</a> Scientific Reports. 9 (1), 12456 (2019).</li><li>Polevoy, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+roles+for+the+Drosophila+PI+4-kinase+four+wheel+drive+in+localizing+Rab11+during+cytokinesis.">Dual roles for the Drosophila PI 4-kinase four wheel drive in localizing Rab11 during cytokinesis.</a> Journal of Cell Biology. 187 (6), 847-858 (2009).</li><li>Rebollo, E., Llamazares, S., Reina, J., Gonzalez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+noncentrosomal+microtubules+to+spindle+assembly+in+Drosophila+spermatocytes.">Contribution of noncentrosomal microtubules to spindle assembly in Drosophila spermatocytes.</a> PLoS Biology. 2 (1), 8 (2004).</li><li>Smyth, J. T., Schoborg, T. A., Bergman, Z. J., Riggs, B., Rusan, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proper+symmetric+and+asymmetric+endoplasmic+reticulum+partitioning+requires+astral+microtubules.">Proper symmetric and asymmetric endoplasmic reticulum partitioning requires astral microtubules.</a> Open Biology. 5 (8), (2015).</li><li>Demarco, R. S., Eikenes, &. #. 1. 9. 7. ;. H., Haglund, K., Jones, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+spermatogenesis+in+Drosophila+melanogaster.">Investigating spermatogenesis in Drosophila melanogaster.</a> Methods. 68 (1), 218-227 (2014).</li><li>Fuller, M. T., Bate, M., Martinez-Arias, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Development of Drosophila melanogaster. , 71-147 (1993).</li><li>Dunleavy, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cell+Cycle+Timing+of+Centromeric+Chromatin+Assembly+in+Drosophila+Meiosis+Is+Distinct+from+Mitosis+Yet+Requires+CAL1+and+CENP-C.">The Cell Cycle Timing of Centromeric Chromatin Assembly in Drosophila Meiosis Is Distinct from Mitosis Yet Requires CAL1 and CENP-C.</a> PLOS Biology. 10 (12), 1001460 (2012).</li><li>Fabian, L., Brill, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+spermiogenesis:+Big+things+come+from+little+packages.">Drosophila spermiogenesis: Big things come from little packages.</a> Spermatogenesis. 2 (3), 197-212 (2012).</li><li>Ramm, S. A., Scharer, L., Ehmcke, J., Wistuba, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sperm+competition+and+the+evolution+of+spermatogenesis.">Sperm competition and the evolution of spermatogenesis.</a> Molecular Human Reproduction. 20 (12), 1169-1179 (2014).</li><li>Savoian, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopy+Methods+for+Analysis+of+Spindle+Dynamics+in+Meiotic+Drosophila+Spermatocytes.">Microscopy Methods for Analysis of Spindle Dynamics in Meiotic Drosophila Spermatocytes.</a> Methods in Molecular Biology. 1471, 265-276 (2017).</li><li>Sitaram, P., Hainline, S. G., Lee, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytological+analysis+of+spermatogenesis:+live+and+fixed+preparations+of+Drosophila+testes.">Cytological analysis of spermatogenesis: live and fixed preparations of Drosophila testes.</a> Journal of Visualized Experiments. (83), e51058 (2014).</li><li>Zamore, P. D., Ma, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Drosophila+melanogaster+testes.">Isolation of Drosophila melanogaster testes.</a> Journal of Visualized Experiments. (51), (2011).</li><li>Lerit, D. A., Plevock, K. M., Rusan, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+Drosophila+larval+neuroblasts.">Live imaging of Drosophila larval neuroblasts.</a> Journal of Visualized Experiments. (89), (2014).</li><li>Belloni, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+Cog7+affect+Golgi+structure,+meiotic+cytokinesis+and+sperm+development+during+Drosophila+spermatogenesis.">Mutations in Cog7 affect Golgi structure, meiotic cytokinesis and sperm development during Drosophila spermatogenesis.</a> Journal of Cell Science. 125 (22), 5441-5452 (2012).</li><li>Harel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistence+of+major+nuclear+envelope+antigens+in+an+envelope-like+structure+during+mitosis+in+Drosophila+melanogaster+embryos.">Persistence of major nuclear envelope antigens in an envelope-like structure during mitosis in Drosophila melanogaster embryos.</a> Journal of Cell Science. 94 (3), 463-470 (1989).</li><li>Katsani, K. R., Karess, R. E., Dostatni, N., Doye, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+dynamics+of+Drosophila+nuclear+envelope+components.">In vivo dynamics of Drosophila nuclear envelope components.</a> Mol Biol Cell. 19 (9), 3652-3666 (2008).</li><li>Tates, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cytodifferentiation during spermatogenesis in Drosophila melanogaster: An electron microscope study. , (1971).</li><li>Gartner, S. M., Rathke, C., Renkawitz-Pohl, R., Awe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+culture+of+Drosophila+pupal+testis+and+single+male+germ-line+cysts:+dissection,+imaging,+and+pharmacological+treatment.">Ex vivo culture of Drosophila pupal testis and single male germ-line cysts: dissection, imaging, and pharmacological treatment.</a> Journal of Visualized Experiments. (91), 51868 (2014).</li><li>Ohkura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiosis:+an+overview+of+key+differences+from+mitosis.">Meiosis: an overview of key differences from mitosis.</a> Cold Spring Harbor perspectives in biology. 7 (5), (2015).</li><li>Friedman, J. R., Webster, B. M., Mastronarde, D. N., Verhey, K. J., Voeltz, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ER+sliding+dynamics+and+ER-mitochondrial+contacts+occur+on+acetylated+microtubules.">ER sliding dynamics and ER-mitochondrial contacts occur on acetylated microtubules.</a> Journal of Cell Biology. 190 (3), 363-375 (2010).</li><li>Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methanol-acetone+fixation+of+Drosophila+testes.">Methanol-acetone fixation of Drosophila testes.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (10), 1270-1272 (2011).</li><li>Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paraformaldehyde+fixation+of+Drosophila+testes.">Paraformaldehyde fixation of Drosophila testes.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (1), 102-104 (2012).</li></ol>

Vi har beskrevet en protokol til fremstilling af larve eller tidlige pupal Drosophila testikler, optimeret til langsigtet, levende billeddannelse af spermatocyt celledeling. Dette er en kraftfuld metode til analyse af celledeling i den fysiologiske sammenhæng med intakt væv. Effekten af denne metode er yderligere udvidet, når det kombineres med Drosophila genetiske værktøjer, såsom specifikke genmutationer, væv-specifikke RNAi-medieret undertrykkelse, og fluorescerende mærket protein og organell...

Celledeling studeres ofte ved hjælp af cellelinjer dyrket i kultur1. Mens vi har fået et væld af uvurderlig indsigt og forståelse af grundlæggende mekanismer fra disse undersøgelser2, celler dyrket i kultur kan ikke fuldt ud opsummere fysiologi celledeling, da det forekommer i intakt, levende væv. For eksempel, i intakt væv og organer, celler skal opdele på det rigtige sted og på det rigtige tidspunkt, således at afkom celler er korrekt placeret i vævet, så de kan gennemgå passende differentiering eller funktionelle programmer, og således at cellespredning er ordentligt koordineret med vævvækst eller homøostase3. For celler, der dyrkes i kultur på den anden side, er celledeling generelt reguleret af vækstfaktorer i kulturmediet4, og derfor kan vi ikke lære af disse celler, hvordan in vivo miljømæssige faktorer som vævsarkitektur eller udviklingssignalering påvirker delingsprocessen. Det er også vigtigt at bemærke, at mange af de cellelinjer, der anvendes til at studere celledeling, såsom HeLa og U2OS celler, var afledt af metastatiske tumorer5. Derfor, mange aspekter af den grundlæggende fysiologi af disse kræftceller, såsom cellecyklus regulerende mekanismer og kromosomale stabilitet, er sandsynligvis blevet ændret i forhold til raske celler. Fuldstændig forståelse af celledeling fysiologi, derfor afhænger af vores evne til at studere dividere celler i deres oprindelige, in vivo miljøer, der bevarer fysiologiske regulerende mekanismer og væv arkitektur.
Fremskridt med hensyn til at forstå, hvordan celledeling fungerer inden for intaktvæv og -organer, hæmmes af vanskeligheder, der er forbundet med in vivo- eller ex vivo-analyser. For det første kan det være vanskeligt eller umuligt at få adgang til deleceller til mikroskopisk analyse i store organer eller tykt væv. For det andet er det ofte vanskeligt at forudsige, hvornår de enkelte celler vil opdele in vivo. For det tredje kan vævsfysiologi hurtigt forværres under ex vivo kultur. I denne protokol beskriver vi let tilgængelige metoder til levende og fast analyse af Drosophila melanogaster spermatocytter, da de gennemgår meiotiske celledelinger inden for fuldt intakte testikler. Disse celler er ideelle til levende, ex vivo analyse, fordi de er let tilgængelige med standard optiske metoder såsom konfokal mikroskopi, de deler på forudsigelige tidspunkter og steder, og intakte testikler kan opretholdes i ex vivo kultur i op til omkring 24 timer. Desuden er Drosophila spermatocytter store runde celler (ca. 20-30 μm i diameter), der ikke ændrer form, når de deler sig, hvilket gør dem ideelle til høj opløsning, time-lapse billeddannelse af cellulære komponenter såsom spindelapparat og cytoplasmatiske organeller. Selv om disse celler gennemgår meiose i modsætning til mitose, mange af de væsentlige celledeling processer er meget ens mellem disse to celledeling mekanismer6. Disse fordele, kombineret med kraftfulde Drosophila genetiske værktøjer, har gjort Drosophila spermatocytter en flittigt anvendt model for ex vivo analyse af væsentlige celledeling processer, herunder spindel dannelse og regulering, cytokinese, og organelle remodeling og partitionering7,8,9,10,11.
Spermatocytter er celler, der er på det meiotiske stadium af spermatogenese. I Drosophilabegynder spermatogenese med en gruppe kønsceller , der er placeret i en lille region eller "hub" på en pæle af testiklerne12,13. Disse celler divideres med en asymmetrisk mitose, hvilket giver anledning til et enkelt differentieret spermatogonium. Spermatogonia derefter gennemgå fire synkrone midoser til at producere en gruppe på 16 celler, der forbliver tæt forbundet med en enkelt cyste. På dette stadium, cellerne overgangen fra en mitotic til en meiotisk celle cyklus og kaldes spermatocytter. Spermatocytter tilbringer omkring to til tre dage i en udvidet G2 fase af cellecyklussen, hvor de vokser dramatisk og undergår cytologiske ændringer i forberedelsen til de to meiotiske divisioner og efterfølgende spermiogenesis13,14. Hele gruppen af 16 spermatocytter inden for en enkelt cyste derefter indtaste den første meiotiske division på samme tid. Således kan flere meiotiske spermatocytter afbildes samtidigt, når de fortsætter gennem celledeling. Den første meiotiske division fortsætter i ca 1,5 timer og efterfølges næsten øjeblikkeligt af den anden meiotiske division, hvilket giver 64 samlede spermatids, der går på at differentiere i modne spermatozoer.
En unik fordel ved at bruge spermatocytter til at studere celledeling i levende, intakt væv er, at grupper eller cyster af celler konstant fremskridt gennem de forskellige stadier af spermatogenese, og celler på alle stadier af spermatogenesis kan normalt identificeres i en given testis (se figur 3A). Derfor er det relativt nemt at finde meiotiske celler i hele testikler. Vi fokuserer generelt vores analyser på den første i modsætning til anden meiose, fordi disse celler er meget større og mere modtagelige for billeddannelse i høj opløsning, men hele processen, der omfatter både meiotiske divisioner, kan afbildes med succes. Det skal også bemærkes, at den generelle protokol for testis forberedelse og kultur kan bruges til at analysere andre processer i spermatogenese samt, såsom den tidligere mitotiske stamceller eller spermatogonial divisioner eller cytologiske ændringer, der opstår som spermatids modnes til spermatozoa15. Mange af disse aspekter af spermatogenese er stærkt bevaret mellem Drosophila og mennesker16.
Drosophila spermatocytter begynder at nå den meiotiske fase af spermatogenesis under den tredje instar larve fase af Drosophila udvikling13. Derfor kan testikler, der er isoleret fra livscyklusstadier, der begynder med tredje instarlarver og indeholder pupper og voksne, anvendes til analyse af dividere sædceller. Flere fremragende protokoller er tilgængelige for udvinding af testikler fra voksne mandlige fluer til levende og fast analyse af spermatogenesis17,18,19. Disse protokoller kan være at foretrække for at studere sene stadier af spermatogenese, eller hvis genetiske markører, der kun er synlige hos voksne, skal anvendes. Protokollen fokuserer i stedet på testis præparat fra larver og tidlig pupper, fordi testiklerne på disse stadier har flere fordele, der er specifikt relevante for celledeling analyse ved høj opløsning, time-lapse mikroskopi. For det første er testiklerne fra larver og pupper mindre end fra voksne, og cellerne i orglet er mindre overfyldte. På grund af dette, dividere spermatocytter kan ofte afbildes nær den ydre overflade af larve testikler, uden at skulle trænge gennem flere lag af lys spredning væv. For det andet, voksne testikler bevæge sig rytmisk på grund af sammentrækninger af de vedhæftede tilbehør organer, og disse bevægelser gør time-lapse billeddannelse af de enkelte celler udfordrende. Og for det tredje, larve testikler er fordelagtige, når man studerer genmutationer, der forårsager pupal eller voksen dødelighed. Vores metoder er optimeret til langsigtet kultur af testikler på mikroskopstadiet, hvilket giver mulighed for billeddannelse af flere runder af celledeling eller progression af individuelle celler gennem flere stadier af spermatogenesis i samme præparat. Vi beskriver også en protokol for fiksering og immunfarvning af hele testikler. Samlet set vores protokoller er særligt nyttige for dem interesseret i at studere celledeling i intakt væv, og evnen til at kombinere spermatocyt analyse med meget tractable Drosophila genetiske værktøjer gør dette til en særlig kraftfuld tilgang.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>5&#34; Dissecting Probe</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-965-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5.75&#34; Glass Pasteur Pipet</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-678-20A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP9703-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-20</td>
			<td>Straight forcepts with fine tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frosted Microscope Slides</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-544-2</td>
			<td>Slides for mounting fixed tissue, with frosted writing surface</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halocarbon oil 700</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H8898-100 mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lumox Dish 50</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>SAR946077410</td>
			<td>Gas-permeable tissue culture dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Cover Glass</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-541-B</td>
			<td>22x22 mm, #1.5 glass coverslip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minutien Pins</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26002-15</td>
			<td>Insect pins used to make scalpel tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nickel Plated Pin Holder</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26018-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 32% Solution, EM Grade</td>
			<td>Electron Microsocopy Sciences</td>
			<td>15714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plan Beveled Edge Microscope Slides</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-549-5</td>
			<td>Slides used for dissections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PYREX Spot Plates</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-748B</td>
			<td>9-well glass dissecting dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schneider&#39;s Drosophila medium</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>21720-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Filter, 0.22 &#181;m</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>SLGS033SB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP151-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>H-1000</td>
			<td>Microscopy mounting medium</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of drosophila larval and pupal testes for analysis of cell division in live, intact tissue

Eksperimentel analyse af celler, der deler sig i levende, intaktvæv og organer er afgørende for vores forståelse af, hvordan celledeling integreres med udvikling, vævhomøostase, og sygdomsprocesser. Drosophila spermatocytter gennemgår meiose er ideelle til denne analyse, fordi (1) hele Drosophila testikler indeholdende spermatocytter er relativt nemme at forberede til mikroskopi, (2) spermatocytternes store størrelse gør dem velegnede til billeddannelse i høj opløsning, og (3) kraftige Drosophila genetiske værktøjer kan integreres med in vivo analyse. Her præsenterer vi en let tilgængelig protokol til fremstilling af hele testikler fra Drosophila tredje instar larver og tidlig pupper. Vi beskriver, hvordan man identificerer meiotiske spermatocytter i forberedte hele testikler, og hvordan man billede dem leve af time-lapse mikroskopi. Der findes også protokoller for fiksering og immunfarvning af hele testiklerne. Brugen af larve testikler har flere fordele i forhold til tilgængelige protokoller, der bruger voksne testikler til spermatocyt analyse. Vigtigst er det, larve testikler er mindre og mindre overfyldt med celler end voksne testikler, og dette i høj grad letter høj opløsning billeddannelse af spermatocytter. For at demonstrere disse fordele og anvendelsen af protokollerne præsenterer vi resultater, der viser omfordelingen af det endeoplasmiske reticulum med hensyn til spindelmikrotubuli under celledeling i en enkelt spermatocyt, der er afbildet ved time-lapse konfokal mikroskopi. Protokollerne kan kombineres med ekspression af et vilkårligt antal fluorescerende mærkede proteiner eller organelle markører samt genmutationer og andre genetiske værktøjer, hvilket gør denne fremgangsmåde særlig kraftfuld til analyse af celledelingsmekanismer i den fysiologiske kontekst af hele væv og organer.

Når denne protokol er gennemført med succes, vil testiklerne forblive helt intakte til billeddannelse ved konfokal mikroskopi eller andre fluorescensmikroskopimetoder. Som det ses i figur 3A, den cellulære organisation af testiklerne bevares, og udviklingen af celle differentiering fra den ene ende af testiklerne til den anden, herunder spermatogoni, spermatocytter, og haploid spermatids er synlig. GFP-tubulin er en nyttig markør til identifikation af dividere spermatocytter og til leven...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue at JoVE.com

Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

Målet med denne protokol er at analysere celledeling i intakt væv ved levende og fast celle mikroskopi ved hjælp af Drosophila meiotiske spermatocytter. Protokollen viser, hvordan man isolere hele, intakte testikler fra Drosophila larver og tidlig pupper, og hvordan man behandler og montere dem til mikroskopi.

Præparat af Drosophila Larve og Pupal Testikler til analyse af celledeling i Levende, Intakt væv

Experimental analysis of cells dividing in living, intact tissues and organs is essential to our understanding of how cell division integrates with ...

Denne protokol kan bruges til at analysere mekanismerne i celledeling i forbindelse med levende, intakt væv ved hjælp af fluorescensmikroskopi. Den største fordel ved denne teknik er, at cellernes indfødte fysiologiske miljøer bevares, samtidig med at der er mulighed for levende billeddannelse over lange tidsforløb. Den vigtigste del af denne teknik er at sikre, at testiklerne ikke er beskadiget under dissektion eller montering.Dette er en færdighed, der er erhvervet med en lille smule tid og praksis. Visuel demonstration af denne metode er kritisk, fordi det viser, hvordan man identificerer og isolerer testiklerne, og hvordan man monterer dem til billeddannelse uden at beskadige vævet. Forbered dyr, værktøjer og medier som beskrevet i manuskriptet.Før dissektionen påbegyndes, skal du bruge den mediefyldte filtersprøjte til at udvise tre dråber medier hver 50 mikroliter øverst, i midten og i bunden af et glasdias. Ved hjælp af en dissekerende sonde, overføre fem til 10 tredje instar larver eller tidlig puppe til den øverste dråbe af medierne på diaset. Ryst forsigtigt larverne og pupperen i medierne med dissekeringssonden for at fjerne mad eller snavs.Brug dissekeresonden til at vende en enkelt larver eller puppe på siden. Kig efter de to bilaterale testikler, der vises som gennemskinnelige ovale strukturer på den bageste tredjedel af kroppen. Dyr, der mangler testikler, er kvinder og bør kasseres.Når en hanlarver eller pupper er fundet og er ren, flytte den til den anden dråbe af medierne. Gentag indtil tre eller fire mandlige larver eller pupper er blevet overført til den anden dråbe af medierne. Så arbejder i den anden dråbe af medierne, forstå et enkelt dyr med et par saftrænbånd i midten af regionen, bare forreste til testiklerne.Brug et andet par vicess til forsigtigt at rive dyret i halve. Brug et par spånglas, hold den bageste ende af dyret ned på glasdiaset. Starter lige ved siden af de slæt, tryk ned på neglebånd ved hjælp af kanten af skalpellen.Flyt skalpel mod den afskårne ende af dyret. Dette vil udvise dyrets indre organer, som omfatter indvolde, fedt organer, og testikler. Testiklerne er farveløse og næsten gennemsigtige ovale organer indlejret i bånd af fedt krop.Forsigtigt drille fra hinanden testiklerne fra resten af organerne. For at overføre testiklerne en ad gangen, indsætte kanten af skalpel under fedt kroppen, løfte vævet ud af medierne, og hurtigt flytte den til den tredje dråbe. Hvis der ikke er nok fedt krop stadig er knyttet til testiklerne til at løfte vævet med skalpel bruge et glas Pasteur pipette, der er blevet prewetted med dissektion medium.Arbejde i den tredje dråbe af medium, bruge den skarpe ende af skalpellen til forsigtigt skive væk overskydende fedt krop fra testiklerne, efterlader kun en lille kant af fedt krop omkring kanterne. Først skal du bruge filtersprøjten til at deponere en enkelt dråbe schneiders medium omkring 30 mikroliter på midten af en 50 millimeter gas gennemtrængelig kulturskål. Ved hjælp af skalpel værktøj eller en prewetted Pasteur pipette overføre op til fem af de forberedte testikler til dråben på fadet.Brug derefter skalpelværktøjet til forsigtigt at skubbe testiklerne ned på gasmembranen og ind i midten af mediets fald. Ved hjælp af en en milliliter sprøjte, placere fire dråber halocarbon olie på gas gennemtrængelig membran omkring dråbe medium. Placeringen af dråberne skal svare til de fire hjørner af en 22 millimeter klasse coverslip.Derefter justere hjørnerne af en 22 millimeter glas coverslip med de fire dråber halocarbon olie og forsigtigt sænke coverslip på medier og olie. Lad dækslæden falde til ro, og for de medier, der indeholder testiklerne spredningen mellem dråberne af olie. Placer kulturskålen under et dissekerende mikroskop.Hvis du vil fjerne overskydende medier, skal du indsætte hjørnet af en delikat opgavesletning under dækslet. Wick væk nok medier til glas coverslip til bare komme i kontakt med overfladen af de største testikler. Fjern ikke for mange medier, og sænk dækslen for langt.Dette vil lægge pres på testiklerne og kan få dem til at briste. Endelig placere en dråbe nedsænkning olie på glasset coverslip lige over testiklerne. Vend skålen, og læg den på mikroskopscenen.Flyt 40 eller 60 X mikroskopmålet ind i olien, indtil det er lige under testiklerne. Brug transmitteret lys til at finde en enkelt testik og bringe det i fokus. Placer 0,5 milliliter 8% paraformaldehyd i PBSTx i en brønd af en ni brønd dissekere fad.Brug et glas Pasteur pipette til at overføre op til 10 af testiklerne til brønden. Sørg for, at testiklerne ligger på bunden af brønden. Efter 20 minutter overføres testiklerne til en brønd, der indeholder 0,5 milliliter PBSTx.Testiklerne vaskes ved at omrøre forsigtigt i fem minutter. Vask to gange mere i nye brønde med frisk PBSTx. Forbered en fortynding af det primære antistof i et 1,5 milliliter mikrocentrifugerør som beskrevet i manuskriptet.Overfør derefter testiklerne fra de ni brøndglas dissekere skålen til røret. Inkuber røret natten over ved fire grader Celsius med blid rokkende eller nødde. Proceduren for farvning af testiklerne med det sekundære antistof er den samme.Se manuskriptet for detaljer. Først ved hjælp af en Pasteur pipette, overføre testiklerne fra de ni godt plade på et glas mikroskopi dias. Hvis det er nødvendigt, skal du bruge kanten af skalpellen til at skubbe testiklerne ned på overfladen af diaset.Dernæst skal du bruge hjørnet af en delikat opgave tørre at væge væk overskydende væske fra testiklerne. Fjern så meget væske som muligt. Derefter anvende en 30 til 50 mikroliter dråbe mikroskopi montering medium til testiklerne.Endelig placere en 22 millimeter coverslip på dråbe montering medium. Lad dækslæbet falde til ro, og monteringsmediet spredes under dækslæbet. Hvis det er nødvendigt, skal du trykke let på dækslerne for at presse overskydende monteringsmedium ud og lade dækslen hvile på overfladen af testiklerne.Når denne protokol udføres korrekt, bevares testiklernes cellulære organisation, og udviklingen af celledifferentiering fra den ene ende af testiklerne til den anden er synlig. Spermatocytter ved at begynde meiose og dem i metafase kan identificeres. I testikler udarbejdet ved hjælp af denne protokol, levende billeddannelse analyse viser den dynamiske reorganisering af endoplasmatiske reticulum og mikro tubuli i dividere spermatocytter.Som beskrevet i protokollen skal der gøres stor for ikke at lægge pres på testiklerne, der får testiklerne til at briste. Cyster af spermatocytter hurtigt flyde ud af en bristet testikler, hvilket gør levende tid bortfalder billeddannelse vanskelig. Denne protokol er optimeret til billeddannelse dividere spermatocytter i levende, intakt væv.Derfor er det vigtigt, at testiklerne ikke beskadiges under dissektion eller montering. Vores metode bør også være egnet til super opløsning billeddannelse teknikker, såsom struktureret belysning mikroskopi, der giver ny indsigt i dynamiske sub-cellulære processer, der styrer celledeling.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Levende-billeddannelse af<em&gt; Drosophila</em&gt; Puppe Eye

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track ...

Preparation of Mitochondrial Enriched Fractions for Metabolic Analysis in Drosophila

Preparation of Mitochondrial Enriched Fractions for Metabolic Analysis in Drosophila

Forberedelse om mitokondriel berigede Brøker for Metabolic Analyse i<em&gt; Drosophila</em

Since mitochondria play roles in amino acid metabolism, carbohydrate metabolism and fatty acid oxidation, defects in mitochondrial function often ...

Observing Mitotic Division and Dynamics in a Live Zebrafish Embryo

Observation Mitotisk Division og Dynamics i en Live zebrafisk Embryo

Mitosis is critical for organismal growth and differentiation. The process is highly dynamic and requires ordered events to accomplish proper chromatin ...

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

In Vitro Ovule dyrkning for Live-celle Imaging af Zygote polarisering og Embryo mønstre i Arabidopsis thaliana

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue

Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue

Metoder til billeddannelse intracellulære pH af follikel stamcelle afstamning i Live Drosophila æggestokkene væv

Changes in intracellular pH (pHi) play important roles in the regulation of many cellular functions, including metabolism, proliferation, and ...

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

Dissektion og farvning af Drosophila puppe æggestokke

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a ...

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

Dissektion af Drosophila puppe nethinden for immunhistokemi, vestlige analyse og RNA isolering

The Drosophila pupal retina provides an excellent model system for the study of morphogenetic processes during development. In this paper, we present a ...

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Levende billeddannelse og analyse af muskelsammentrækninger i Drosophila embryo

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits ...