Name: preparation of drosophila larval and pupal testes for analysis of cell division in live, intact tissue
Uploaded: 2020-05-19T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue at JoVE.com

עבודה זו נתמכת על ידי מחלקת ההגנה הסטארט-up לJ.T.S.

1. הכנת בעלי חיים, כלים ומדיה לחיתוך
<ol><li>להצליב זבובים זכר ונקבה כדי להשיג צאצאים של גנוטיפ הרצוי. סמנים הטרנסגניים שימושיים לזיהוי ואחסון זמני של הספרציטים כוללים GFP-טובולין כדי לתייג את ציר meiotic ו RFP-histone 2A כדי תווית כרומזומים8. השתמש חמש עד עשר נקבות לחצות ולשמור על צלבים על מ...

<ol>
	<li>Khodjakov, A., Rieder, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+division+process+in+living+tissue+culture+cells.">Imaging the division process in living tissue culture cells.</a> Methods. 38 (1), 2-16 (2006).</li><li>Ong, J. Y., Torres, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+mechanisms+of+cell+division.">Dissecting the mechanisms of cell division.</a> The Journal of Biological Chemistry. 294 (30), 11382-11390 (2019).</li><li>Levine, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cycling+through+development.">Cell cycling through development.</a> Development. 131 (10), 2241-2246 (2004).</li><li>Gross, S. M., Rotwein, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unraveling+Growth+Factor+Signaling+and+Cell+Cycle+Progression+in+Individual+Fibroblasts.">Unraveling Growth Factor Signaling and Cell Cycle Progression in Individual Fibroblasts.</a> The Journal of Biological Chemistry. 291 (28), 14628-14638 (2016).</li><li>Mittelman, D., Wilson, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fractured+genome+of+HeLa+cells.">The fractured genome of HeLa cells.</a> Genome Biology. 14 (4), 111 (2013).</li><li>Bury, L., Coelho, P. A., Glover, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+Meiosis+to+Mitosis:+The+Astonishing+Flexibility+of+Cell+Division+Mechanisms+in+Early+Mammalian+Development.">From Meiosis to Mitosis: The Astonishing Flexibility of Cell Division Mechanisms in Early Mammalian Development.</a> Current Topics in Developmental Biology. 120, 125-171 (2016).</li><li>Giansanti, M. G., Fuller, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+Drosophila+spermatocytes+tell+us+about+the+mechanisms+underlying+cytokinesis.">What Drosophila spermatocytes tell us about the mechanisms underlying cytokinesis.</a> Cytoskeleton. 69 (11), 869-881 (2012).</li><li>Karabasheva, D., Smyth, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel,+dynein-independent+mechanism+focuses+the+endoplasmic+reticulum+around+spindle+poles+in+dividing+Drosophila+spermatocytes.">A novel, dynein-independent mechanism focuses the endoplasmic reticulum around spindle poles in dividing Drosophila spermatocytes.</a> Scientific Reports. 9 (1), 12456 (2019).</li><li>Polevoy, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+roles+for+the+Drosophila+PI+4-kinase+four+wheel+drive+in+localizing+Rab11+during+cytokinesis.">Dual roles for the Drosophila PI 4-kinase four wheel drive in localizing Rab11 during cytokinesis.</a> Journal of Cell Biology. 187 (6), 847-858 (2009).</li><li>Rebollo, E., Llamazares, S., Reina, J., Gonzalez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+noncentrosomal+microtubules+to+spindle+assembly+in+Drosophila+spermatocytes.">Contribution of noncentrosomal microtubules to spindle assembly in Drosophila spermatocytes.</a> PLoS Biology. 2 (1), 8 (2004).</li><li>Smyth, J. T., Schoborg, T. A., Bergman, Z. J., Riggs, B., Rusan, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proper+symmetric+and+asymmetric+endoplasmic+reticulum+partitioning+requires+astral+microtubules.">Proper symmetric and asymmetric endoplasmic reticulum partitioning requires astral microtubules.</a> Open Biology. 5 (8), (2015).</li><li>Demarco, R. S., Eikenes, &. #. 1. 9. 7. ;. H., Haglund, K., Jones, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+spermatogenesis+in+Drosophila+melanogaster.">Investigating spermatogenesis in Drosophila melanogaster.</a> Methods. 68 (1), 218-227 (2014).</li><li>Fuller, M. T., Bate, M., Martinez-Arias, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Development of Drosophila melanogaster. , 71-147 (1993).</li><li>Dunleavy, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cell+Cycle+Timing+of+Centromeric+Chromatin+Assembly+in+Drosophila+Meiosis+Is+Distinct+from+Mitosis+Yet+Requires+CAL1+and+CENP-C.">The Cell Cycle Timing of Centromeric Chromatin Assembly in Drosophila Meiosis Is Distinct from Mitosis Yet Requires CAL1 and CENP-C.</a> PLOS Biology. 10 (12), 1001460 (2012).</li><li>Fabian, L., Brill, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+spermiogenesis:+Big+things+come+from+little+packages.">Drosophila spermiogenesis: Big things come from little packages.</a> Spermatogenesis. 2 (3), 197-212 (2012).</li><li>Ramm, S. A., Scharer, L., Ehmcke, J., Wistuba, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sperm+competition+and+the+evolution+of+spermatogenesis.">Sperm competition and the evolution of spermatogenesis.</a> Molecular Human Reproduction. 20 (12), 1169-1179 (2014).</li><li>Savoian, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopy+Methods+for+Analysis+of+Spindle+Dynamics+in+Meiotic+Drosophila+Spermatocytes.">Microscopy Methods for Analysis of Spindle Dynamics in Meiotic Drosophila Spermatocytes.</a> Methods in Molecular Biology. 1471, 265-276 (2017).</li><li>Sitaram, P., Hainline, S. G., Lee, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytological+analysis+of+spermatogenesis:+live+and+fixed+preparations+of+Drosophila+testes.">Cytological analysis of spermatogenesis: live and fixed preparations of Drosophila testes.</a> Journal of Visualized Experiments. (83), e51058 (2014).</li><li>Zamore, P. D., Ma, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Drosophila+melanogaster+testes.">Isolation of Drosophila melanogaster testes.</a> Journal of Visualized Experiments. (51), (2011).</li><li>Lerit, D. A., Plevock, K. M., Rusan, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+Drosophila+larval+neuroblasts.">Live imaging of Drosophila larval neuroblasts.</a> Journal of Visualized Experiments. (89), (2014).</li><li>Belloni, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+Cog7+affect+Golgi+structure,+meiotic+cytokinesis+and+sperm+development+during+Drosophila+spermatogenesis.">Mutations in Cog7 affect Golgi structure, meiotic cytokinesis and sperm development during Drosophila spermatogenesis.</a> Journal of Cell Science. 125 (22), 5441-5452 (2012).</li><li>Harel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistence+of+major+nuclear+envelope+antigens+in+an+envelope-like+structure+during+mitosis+in+Drosophila+melanogaster+embryos.">Persistence of major nuclear envelope antigens in an envelope-like structure during mitosis in Drosophila melanogaster embryos.</a> Journal of Cell Science. 94 (3), 463-470 (1989).</li><li>Katsani, K. R., Karess, R. E., Dostatni, N., Doye, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+dynamics+of+Drosophila+nuclear+envelope+components.">In vivo dynamics of Drosophila nuclear envelope components.</a> Mol Biol Cell. 19 (9), 3652-3666 (2008).</li><li>Tates, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cytodifferentiation during spermatogenesis in Drosophila melanogaster: An electron microscope study. , (1971).</li><li>Gartner, S. M., Rathke, C., Renkawitz-Pohl, R., Awe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+culture+of+Drosophila+pupal+testis+and+single+male+germ-line+cysts:+dissection,+imaging,+and+pharmacological+treatment.">Ex vivo culture of Drosophila pupal testis and single male germ-line cysts: dissection, imaging, and pharmacological treatment.</a> Journal of Visualized Experiments. (91), 51868 (2014).</li><li>Ohkura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiosis:+an+overview+of+key+differences+from+mitosis.">Meiosis: an overview of key differences from mitosis.</a> Cold Spring Harbor perspectives in biology. 7 (5), (2015).</li><li>Friedman, J. R., Webster, B. M., Mastronarde, D. N., Verhey, K. J., Voeltz, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ER+sliding+dynamics+and+ER-mitochondrial+contacts+occur+on+acetylated+microtubules.">ER sliding dynamics and ER-mitochondrial contacts occur on acetylated microtubules.</a> Journal of Cell Biology. 190 (3), 363-375 (2010).</li><li>Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methanol-acetone+fixation+of+Drosophila+testes.">Methanol-acetone fixation of Drosophila testes.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (10), 1270-1272 (2011).</li><li>Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paraformaldehyde+fixation+of+Drosophila+testes.">Paraformaldehyde fixation of Drosophila testes.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (1), 102-104 (2012).</li></ol>

תיארנו פרוטוקול להכנת זחל או גולמי מוקדם drosophila ילה האשכים, אופטימיזציה לטווח ארוך, לחיות הדמיה של מחלקת התא spermatocyte. זוהי שיטה רבת-עוצמה לניתוח חלוקת תאים בהקשר הפיזיולוגי של רקמות שלמות. העוצמה של שיטה זו מורחבת עוד יותר כאשר בשילוב עם כלים גנטיים דרוזוהילה , כגון מוטציות גנטיות ?...

חלוקת התא לומדת לעתים קרובות באמצעות קווי תאים הגדלים בתרבות1. למרות שרכשנו שפע של תובנה והבנה לא יסולא בפז של מנגנונים בסיסיים ממחקרים אלה2, תאים שגדלו בתרבות לא יכולים ללכוד באופן מלא את הפיזיולוגיה של חלוקת התא כפי שהוא מתרחש ברקמה חיה שלמה. לדוגמה, ברקמות ובאיברים שלמים, התאים חייבים להתחלק במקום הנכון ובזמן הנכון כך שתאים צאצאים ממוקמים כראוי בתוך הרקמה, כך שהם יכולים לעבור בידול מתאים או תוכניות פונקציונלי, ולכן התפשטות התא מתואמת כראוי עם צמיחה רקמות או הומאוסטזיס3. עבור תאים שגדלו בתרבות מצד שני, החטיבה התא מוסדר בדרך כלל על ידי גורמי גדילה במדיום התרבות4, ולכן אנחנו לא יכולים ללמוד מתאים אלה איך בvivo גורמים סביבתיים כגון אדריכלות רקמות או איתות התפתחותי להשפיע על תהליך החלוקה. חשוב גם לציין כי רבים של קווי התא המשמשים לחקר חלוקת התא, כגון התאים הלה ו U2OS, נגזר גידולים גרורתי5. לכן, היבטים רבים של הפיזיולוגיה הבסיסית של תאים אלה סרטניים, כגון מנגנוני הרגולציה מחזור התא ויציבות כרומוזומלית, סביר להניח ששונו לעומת תאים בריאים. הבנה מלאה של הפיזיולוגיה של חלוקת התא, לפיכך, תלויה ביכולתנו ללמוד את התאים המקוריים שלהם, בסביבות vivo השימור מנגנונים פיזיולוגיים וארכיטקטורת רקמות.
ההתקדמות בהבנת האופן שבו חטיבת התאים פועלת בתוך רקמות ואברים שלמים, מתקשים בvivo או בניתוח vivo לשעבר. ראשית, זה יכול להיות קשה או בלתי אפשרי כדי לגשת מחלוקת תאים לניתוח מיקרוסקופי בתוך איברים גדולים או עבה רקמות. שנית, קשה לעתים קרובות לנבא כאשר תאים בודדים מתחלקים בvivo. שלישית, פיזיולוגיה של רקמות עלולה להתדרדר במהירות במהלך התרבות הvivo לשעבר. בפרוטוקול זה, אנו מתארים שיטות נגישות בקלות לניתוח בשידור חי וקבוע של דרוסופילה מלאנומנוציטים בזמן שהם עוברים מחלקות תאים מיוטיות בתוך האשכים שלמים לחלוטין. תאים אלה הם אידיאליים עבור לחיות, לשעבר ניתוח vivo כי הם נגישים בקלות עם שיטות אופטיות סטנדרטיות כגון קונפוקלית מיקרוסקופ, הם מתחלקים בזמנים צפויים ומיקומים, ואת האשכים שלמים ניתן לשמור בתרבות לשעבר vivo עד כ 24 h. בנוסף, דרוזופילה ספרציטים הם תאים עגולים גדולים (כ -20-30 יקרומטר בקוטר) שאינם משנים צורה כאשר הם מתחלקים, והופכים אותם לאידיאליים ברזולוציה גבוהה, הדמיה של מרכיבי הסלולר כגון מנגנון הצירים והאורגלים הציטוטיים. למרות תאים אלה עוברים מיוזה לעומת mitosis, רבים של התהליכים החיוניים החטיבה התא דומים מאוד בין שני אלה מנגנוני חלוקת התא6. יתרונות אלה, בשילוב עם כלים גנטיים בעלי עוצמה דרוזוהילה , עשו דרוזוהילה ספרמטציטים בשימוש נרחב בדגם vivo ex של תהליכים של חטיבת תאים חיוניים, כולל היווצרות צירים ורגולציה, ציטוקינזה, ושיפוץ ארגונית וחלוקה למחיצות7,8,9,10,11.
הספרציטים הם תאים הנמצאים בשלב המיוטיסטי של זרע. בדרוזופילה, מתחילה הזרע עם קבוצה של תאי גזע של germline הממוקמים באזור קטן או "hub" בעמוד אחד של ה-12,13. תאים אלה מתחלקים על ידי מיטוזיס אסימטרית, ומעניק הרבה spermatogonium אחד הבדיל. הזרע לאחר מכן לעבור ארבעה mitoses סינכרוני כדי לייצר קבוצה של 16 תאים שנותרו קשורים היטב בתוך ציסטה אחת. בשלב זה, התאים מעבר מmitotic למחזור התא meiotic ומכונים spermatocytes. Spermatocytes לבלות שניים עד שלושה ימים בשלב מורחב G2 של מחזור התא, במהלכו הם גדלים באופן דרמטי ולעבור שינויים ציטולוגיים בהכנה עבור שתי חטיבות meiotic ו spermiogenesis הבאים13,14. הקבוצה כולה של 16 spermatocytes בתוך ציסטה אחת ולאחר מכן להיכנס החלוקה meiotic הראשון באותו זמן. לפיכך, ניתן לבצע יצירת תמונות של מספר ספרציטים במקביל כשהם ממשיכים דרך מחלקת התאים. החטיבה meiotic הראשון ההכנסות עבור כ 1.5 h והוא עקב כמעט מיד על ידי החטיבה השנייה meiotic, מניב 64 הכולל הכוללת כי להמשיך להבדיל לתוך הזרע בוגרת.
היתרון הייחודי של שימוש בספרציטים כדי ללמוד החטיבה התא בחיים, רקמה שלמה היא כי קבוצות או ציסטות של תאים התקדמות מתמדת דרך בשלבים שונים של הזרע, ותאים בכל שלבי הזרע ניתן בדרך כלל להיות מזוהה בכל בעיות נתון (ראה איור 3A). לכן, קל יחסית למצוא תאים meiotic באשכים שלמים. אנחנו בדרך כלל למקד את הניתוחים שלנו על הראשון לעומת מיוזה השני משום תאים אלה הם הרבה יותר גדול ומקובל יותר הדמיה ברזולוציה גבוהה, אבל התהליך כולו המקיף הן מחלקות מיוזה ניתן לבצע דימות בהצלחה. יצוין גם כי הפרוטוקול הכללי לקראת הכנה ותרבות ניתן להשתמש כדי לנתח תהליכים אחרים של הזרע כמו גם, כגון תא הגזע הקודם mitotic או מחלקות spermatogonial או שינויים ציטולוגיים המתרחשים כמו זכותנו מבוגרים לתוך הזרע15. רבים מן ההיבטים הללו של הזרע נשמרים במידה רבה בין דרוזוהילה לבני אדם16.
דרוזוהפילה ספרציטים מתחיל להגיע לשלב המיוסטי של הזרע במהלך הזחל השלישי של דרוזוהילה לפיתוח13. לפיכך, האשכים מבודדים משלבי מחזור חיים המתחילים בזחלים שלישיים ובכללם גלמים ומבוגרים יכולים לשמש לניתוח של חלוקת ספרציטים. פרוטוקולים מצוינים מספר זמינים עבור חילוץ של האשכים של גברים בוגרים זבובים לניתוח חי וקבוע של זרע בראשית17,18,19. פרוטוקולים אלה עשויים להיות עדיפים ללמוד בשלבים מאוחרים של הזרע או אם סמנים גנטיים הגלויים רק אצל מבוגרים יש להשתמש. הפרוטוקול מתמקד בהכנה של בדיקת הרימות והגלמים המוקדמים, משום שלאשכים בשלבים אלה יש מספר יתרונות הרלוונטיים במיוחד לניתוח של חלוקת תאים ברזולוציה גבוהה, מיקרוסקופ בזמן הקפיצה. ראשית, האשכים של הזחלים והגלמים קטנים יותר מאלה של מבוגרים, והתאים בתוך האיבר הם פחות צפוף. בגלל זה, חלוקת הספרציטים יכולה לעתים קרובות להיות בתמונה ליד המשטח החיצוני של האשכים זחל, מבלי לחדור דרך שכבות מרובות של רקמת פיזור אור. שנית, האשכים מבוגרים לזוז בקצב בשל התכווצויות של אברי האביזר המצורף, ותנועות אלה להפוך זמן לפקיעה הדמיה של תאים בודדים מאתגרת. ושלישית, האשכים הזחל הם יתרון כאשר לומדים מוטציות גנים הגורמות גולמי או מבוגרים השפעה. השיטות שלנו ממוטבת לתרבות ארוכת טווח של האשכים על הבמה המיקרוסקופ, המאפשר דימות של סיבובים מרובים של חלוקת התא או התקדמות של תאים בודדים באמצעות שלבים מרובים של הזרע באותו הכנה. אנו מתארים גם פרוטוקול עבור קיבוע וכתמים חיסוני של האשכים שלמים. בסך הכל, הפרוטוקולים שלנו שימושיים במיוחד עבור אלה המעוניינים ללמוד חלוקת תאים ברקמה שלמה, ואת היכולת לשלב ניתוח spermatocyte עם מאוד צייתן הכלים הגנטיים הופך את זה גישה חזקה במיוחד.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>5&#34; Dissecting Probe</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-965-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5.75&#34; Glass Pasteur Pipet</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-678-20A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP9703-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-20</td>
			<td>Straight forcepts with fine tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frosted Microscope Slides</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-544-2</td>
			<td>Slides for mounting fixed tissue, with frosted writing surface</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halocarbon oil 700</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H8898-100 mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lumox Dish 50</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>SAR946077410</td>
			<td>Gas-permeable tissue culture dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Cover Glass</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-541-B</td>
			<td>22x22 mm, #1.5 glass coverslip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minutien Pins</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26002-15</td>
			<td>Insect pins used to make scalpel tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nickel Plated Pin Holder</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26018-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 32% Solution, EM Grade</td>
			<td>Electron Microsocopy Sciences</td>
			<td>15714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plan Beveled Edge Microscope Slides</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-549-5</td>
			<td>Slides used for dissections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PYREX Spot Plates</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-748B</td>
			<td>9-well glass dissecting dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schneider&#39;s Drosophila medium</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>21720-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Filter, 0.22 &#181;m</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>SLGS033SB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP151-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>H-1000</td>
			<td>Microscopy mounting medium</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of drosophila larval and pupal testes for analysis of cell division in live, intact tissue

ניתוח ניסיוני של תאים חילוק בחיים, רקמות ואיברים שלמים הוא חיוני להבנת איך חלוקת התא משתלב עם פיתוח, רקמות הומאוסטזיס, ותהליכי מחלות. דרוזופילה ספרמטוציטים שעוברים מיוזיס הם אידיאליים עבור ניתוח זה, כי (1) כל drosophila האשכים המכילים spermatocytes קל יחסית להתכונן למיקרוסקופיה, (2) בגודל גדול של הספרציטים הופך אותם מתאימים היטב לדימות ברזולוציה גבוהה, ו (3) הכלים הגנטיים של drosophila יכול להיות משולב כאן, אנו מציגים פרוטוקול נגיש בקלות להכנת האשכים שלמים מדרוזוהילה הזחלים השלישי והגלמים המוקדמים. אנו מתארים כיצד לזהות ספרמטציטים מיוטיות בתוך האשכים המוכנים וכיצד לדמות אותם חיים על ידי מיקרוסקופ זמן לשגות. פרוטוקולים עבור קיבוע והכתים האשכים שלם מסופקים גם. השימוש האשכים זחל יש מספר יתרונות על פרוטוקולים זמינים המשתמשים באשכים מבוגרים לניתוח spermatocyte. החשוב ביותר, האשכים זחל הם קטנים פחות צפוף עם תאים מאשר האשכים למבוגרים, וזה מאפשר מאוד הדמיה ברזולוציה גבוהה של spermatocytes. כדי להדגים את היתרונות הללו ואת היישומים של הפרוטוקולים, אנו מציגים את התוצאות המציגות את ההפצה משנה של הרשת האנדופלזמית לגבי מיקרוטובוקלס במהלך חלוקת תאים באמצעות מיקרוסקופ בודד שנוצר על-ידי מיקרוסקופיה בזמן הקפיצה. הפרוטוקולים יכולים להיות משולבים עם הביטוי של כל מספר של חלבונים מתויגים fluorescently או סמנים ארגונית, כמו גם מוטציות גנטיות וכלים גנטיים אחרים, מה שהופך גישה זו חזק במיוחד עבור ניתוח של מנגנוני חלוקת התא בהקשר הפיזיולוגי של רקמות ואיברים שלמים.

כאשר פרוטוקול זה מבוצע בהצלחה, האשכים יישארו שלמים לחלוטין לדימות על ידי מיקרוסקופ מוקד או שיטות אחרות מיקרוסקופ הזריחה. כפי שניתן לראות באיור 3a, הארגון הסלולר של האשכים נשמר, ואת ההתקדמות של בידול התא מקצה אחד של הפנים אל השני כולל הזרע, spermatציטים, ו פלואידי spermatids הוא גלוי. ...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue at JoVE.com

Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

המטרה של פרוטוקול זה היא לנתח את חלוקת התא ברקמה שלמה על ידי מיקרוסקופ התאים החיים והקבוע באמצעות דרוסוילה מיוטיק מאיוציטים. הפרוטוקול מדגים כיצד לבודד את כל האשכים שלמים, מזחלים מדרוזופילה ומהגלמים המוקדמים, וכיצד לעבד ולטעון אותם למיקרוסקופיה.

הכנת מדרוזופילה זחל ופופל אשכים לניתוח חטיבת תאים בשידור חי, רקמה שלמה

Experimental analysis of cells dividing in living, intact tissues and organs is essential to our understanding of how cell division integrates with ...

פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לנתח את המנגנונים של חלוקת התא בהקשר של חיים, רקמות שלמות באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטי. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהסביבה הפיזיולוגית של התאים נשמרת, וגם מאפשרת הדמיה חיה לאורך קורסים ארוכים. החלק החשוב ביותר בטכניקה זו הוא לוודא כי האשכים אינם פגומים במהלך ניתוח או הרכבה.זוהי מיומנות שנרכשת עם קצת זמן ותרגול. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, משום שהיא מראה כיצד לזהות ולבודד את האשכים, וכיצד להרכיב אותם להדמיה מבלי לפגוע ברקמה. הכן בעלי חיים, כלים ומדיה כמתואר בכתב היד.לפני תחילת הניתוח, השתמש במזרק המסנן מלא המדיה כדי לגרש שלוש טיפות מדיה כל 50 מיקרוליטר בחלק העליון, האמצעי והתחתון של שקופית זכוכית. באמצעות בדיקה לנתח, להעביר חמישה עד 10 זחלים instar שלישי או גלמים מוקדמים לירידה העליונה של מדיה על השקופית. בעדינות להתסיס את הזחלים ואת הגלמים בתקשורת עם בדיקה לנתח כדי להסיר כל מזון או פסולת.השתמש בבדיקה לנתח כדי להפוך זחלים בודדים או גלמים על צידו. חפש את שני האשכים הדו-צדדיים המופיעים כמבנים אליפטיים שקופים בשליש האחורי של הגוף. בעלי חיים חסרי אשכים הם נקבות, ויש להשליך אותם.כאשר זחלים זכרים או גלמי נמצא והוא נקי, להעביר אותו טיפה השנייה של התקשורת. חזור על הפעולה עד ששלושה או ארבעה זחלים זכרים או גלמיות הועברו לירידה השנייה של התקשורת. ואז לעבוד בירידה השנייה של התקשורת, לתפוס חיה אחת עם זוג ממטרים במרכז האזור שלה, רק לפני האשכים.השתמש בזוג מדפים שני כדי לקרוע בעדינות את החיה לשניים. באמצעות זוג מדפים, החזק את הקצה האחורי של החיה למטה על מגלשת הזכוכית. החל ממש ליד המדפים, לדחוף למטה על קוטיקל באמצעות קצה האזמל.להזיז את האזמל לכיוון הקצה החתך של החיה. פעולה זו תגרש את האיברים הפנימיים של החיה, הכוללים את המעיים, גופי השומן וה האשכים. האשכים הם איברים אליפטיים חסרי צבע וכמעט שקופים המוטמעים בסרטים של גוף שומן.בעדינות להקניט את האשכים משאר האיברים. כדי להעביר את האשכים אחד בכל פעם, להכניס את קצה האזמל מתחת לגוף השומן, להרים את הרקמה מהתקשורת, ולהעביר אותו במהירות לירידה השלישית. אם אין מספיק גוף שומן עדיין מחובר האשכים כדי להרים את הרקמה עם אזמל להשתמש פיפטה פסטר זכוכית כי כבר prewetted עם מדיום ניתוח.עבודה בירידה השלישית של המדיום, להשתמש בקצה החד של האזמל כדי לחתוך בעדינות את גוף שומן עודף מן האשכים, משאיר רק שפה קטנה של גוף שומן סביב הקצוות. ראשית, השתמש במזרק המסנן כדי להפקיד טיפה אחת של המדיום של שניידר על 30 microliters על מרכז צלחת תרבות חדירה גז 50 מילימטר. באמצעות הכלי אזמל או פיפטה פסטר prewetted להעביר עד חמישה האשכים מוכנים טיפה על המנה.לאחר מכן, השתמש בכלי האזמל כדי לדחוף בעדינות את האשכים אל קרום הגז חדיר, ולתוך מרכז טיפת המדיום. בעזרת מזרק מיליליטר אחד, מניחים ארבע טיפות שמן ההלוקרבון על קרום הגז החודר המקיף את טיפת המדיום. מיקומי הטיפות צריכים להתאים לארבע הפינות של כיסוי מחלקה של 22 מילימטר.לאחר מכן ליישר את הפינות של כיסוי זכוכית 22 מילימטר עם ארבע טיפות שמן halocarbon בעדינות להוריד את כיסוי על התקשורת ושמן. אפשר לכיסוי להתיישב, ולתקשורת המכילה את האשכים את התפשטות בין טיפות השמן. מניחים את צלחת התרבות תחת מיקרוסקופ ניתוח.כדי להסיר מדיה עודפת, הכנס את הפינה של מחיקת משימה עדינה מתחת לכיסוי. Wick משם מספיק מדיה עבור כיסוי הזכוכית רק כדי ליצור קשר עם פני השטח של האשכים הגדולים ביותר. אל תסיר יותר מדי מדיה והורד את הכיסוי רחוק מדי.זה יפעיל לחץ על האשכים ועשוי לגרום להם להיקרע. לבסוף, מניחים טיפה של שמן טבילה על כיסוי הזכוכית ממש מעל האשכים. הופכים את המנה, ומ מניחים אותה על במת המיקרוסקופ.הזז את המטרה מיקרוסקופ 40 או 60 X לתוך השמן עד שהוא ממש מתחת האשכים. השתמש באור משודר כדי למצוא אשך יחיד ולהביא אותו לפוקוס. מניחים 0.5 מיליליטר של 8% paraformaldehyde ב PBSTx ב באר אחת של תשעה צלחת לנתח היטב.השתמש פיפטה פסטר זכוכית להעביר עד 10 של האשכים ל הבאר. ודא כי האשכים שוכבים על החלק התחתון של הבאר. לאחר 20 דקות, להעביר את האשכים ל הבאר המכילה 0.5 מיליליטר של PBSTx.לשטוף את האשכים על ידי תסיסה בעדינות במשך חמש דקות. לשטוף פעמיים נוספות בארות חדשות עם PBSTx טרי. להכין דילול של הנוגדן העיקרי בצינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מיליליטר כמתואר בכתב היד.ואז להעביר את האשכים מתשעת צלחת לנתח זכוכית היטב לצינור. דגירה הצינור לילה בארבע מעלות צלזיוס עם נדנדה עדינה או אגוזים. ההליך להכתמת האשכים בנוגדן המשני דומה.עיין בכתב היד לקבלת פרטים. ראשית, באמצעות פיפטה פסטר, להעביר את האשכים מתשע צלחת גם על מגלשת מיקרוסקופ זכוכית. במידת הצורך, השתמש בקצה האזמל כדי לדחוף את האשכים אל פני השטח של השקופית.לאחר מכן, השתמש בפינה של מחיקת משימה עדינה כדי לפתיק נוזל עודף מהתרכים. הסר נוזלים רב ככל האפשר. לאחר מכן להחיל טיפה 30 עד 50 microliter של מדיום הרכבה מיקרוסקופיה על האשכים.לבסוף, מניחים כיסוי 22 מילימטר על טיפת מדיום הרכבה. אפשר לכיסוי להתיישב, ואת המדיום הרכבה להתפשט מתחת לכיסוי. במידת הצורך, יש להפעיל לחץ עדין על המכסה כדי לסחוט מדיום הרכבה עודף ולאפשר לכיסוי לנוח על פני האשכים.כאשר פרוטוקול זה מבוצע בהצלחה, הארגון התאי של האשכים נשמר, והתקדמות ההבחנה בין התאים מקצה אחד של האשך לקצה השני גלויה. זרע עומד להתחיל meiosis ואלה metaphase ניתן לזהות. בבדיקה שהוכנה באמצעות פרוטוקול זה, ניתוח הדמיה חיה מראה את הארגון מחדש הדינמי של הרשתית האנטופלסמית ומיקרו צינוריות בחלוקת זרעונים.כפי שמתואר בפרוטוקול, יש לדאוג מאוד לא להפעיל לחץ שגורם לאשמים להתפוצץ. ציסטות של זרעונים זורמות במהירות מתוך אשכים קרועים, מה שהופך את הדמיה זמן חי לשגות קשה. פרוטוקול זה מותאם להדמיית זרע חלוקת זרע ברקמות חי, שלם.לכן, חיוני כי האשכים אינם פגומים במהלך ניתוח או הרכבה. השיטה שלנו צריכה להתאים גם לטכניקות הדמיה ברזולוציית-על, כגון מיקרוסקופיית תאורה מובנית, המספקת תובנות חדשות על תהליכים תת-תאיים דינמיים השולטים בחלוקת התאים.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Live-הדמיה של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; גלמי עין

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track ...

Preparation of Mitochondrial Enriched Fractions for Metabolic Analysis in Drosophila

Preparation of Mitochondrial Enriched Fractions for Metabolic Analysis in Drosophila

הכנת הברים מועשר מיטוכונדריאלי לניתוח חילוף חומרים ב<em&gt; דרוזופילה</em

Since mitochondria play roles in amino acid metabolism, carbohydrate metabolism and fatty acid oxidation, defects in mitochondrial function often ...

Observing Mitotic Division and Dynamics in a Live Zebrafish Embryo

התבוננות mitotic חטיבת Dynamics בעובר דג הזברה לחיות

Mitosis is critical for organismal growth and differentiation. The process is highly dynamic and requires ordered events to accomplish proper chromatin ...

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

במבחנה ביצית טיפוח עבור Live-תא הדמיה של הזיגוטה קיטוב והמתבנת העובר ב תודרנית לבנה

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

הדמיה חיה של עכבר משניים פיוז &#39;ן

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue

Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue

שיטות הדמיה תאיים pH של השושלת תאי זקיק ברקמת השחלה דרוזופילה בשידור חי

Changes in intracellular pH (pHi) play important roles in the regulation of many cellular functions, including metabolism, proliferation, and ...

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

חיתוך, צביעה של השחלות הגולמי דרוזופילה

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a ...

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

דיסקציה של הרשתית הגולמי דרוזופילה אימונוהיסטוכימיה, ניתוח המערבי של RNA בידוד

The Drosophila pupal retina provides an excellent model system for the study of morphogenetic processes during development. In this paper, we present a ...

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

הדמיה חיה וניתוח של התכווצויות שרירים בתוך העובר דרוזופילה

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits ...