Name: preparation of drosophila larval and pupal testes for analysis of cell division in live, intact tissue
Uploaded: 2020-05-19T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue at JoVE.com

この作業は、J.T.S.への国防総省のスタートアップ資金によって支援されました。

1. 動物、道具、メディアの解剖の準備
<ol><li>オスとメスのハエを交配して、所望の遺伝子型の子孫を得る。大腸精子細胞の同定およびステージングに有用なトランスジェニックマーカーは、クロムソーム8を標識するMeioticスピンドルおよびRFPヒストン2Aにラベルを付けるGFP-tubulinを含む。十字架あたり5〜10人のメスを使用し、3番目のインスター幼虫がバイアルの側面を這い?...

<ol>
	<li>Khodjakov, A., Rieder, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+division+process+in+living+tissue+culture+cells.">Imaging the division process in living tissue culture cells.</a> Methods. 38 (1), 2-16 (2006).</li><li>Ong, J. Y., Torres, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+mechanisms+of+cell+division.">Dissecting the mechanisms of cell division.</a> The Journal of Biological Chemistry. 294 (30), 11382-11390 (2019).</li><li>Levine, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cycling+through+development.">Cell cycling through development.</a> Development. 131 (10), 2241-2246 (2004).</li><li>Gross, S. M., Rotwein, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unraveling+Growth+Factor+Signaling+and+Cell+Cycle+Progression+in+Individual+Fibroblasts.">Unraveling Growth Factor Signaling and Cell Cycle Progression in Individual Fibroblasts.</a> The Journal of Biological Chemistry. 291 (28), 14628-14638 (2016).</li><li>Mittelman, D., Wilson, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fractured+genome+of+HeLa+cells.">The fractured genome of HeLa cells.</a> Genome Biology. 14 (4), 111 (2013).</li><li>Bury, L., Coelho, P. A., Glover, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+Meiosis+to+Mitosis:+The+Astonishing+Flexibility+of+Cell+Division+Mechanisms+in+Early+Mammalian+Development.">From Meiosis to Mitosis: The Astonishing Flexibility of Cell Division Mechanisms in Early Mammalian Development.</a> Current Topics in Developmental Biology. 120, 125-171 (2016).</li><li>Giansanti, M. G., Fuller, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+Drosophila+spermatocytes+tell+us+about+the+mechanisms+underlying+cytokinesis.">What Drosophila spermatocytes tell us about the mechanisms underlying cytokinesis.</a> Cytoskeleton. 69 (11), 869-881 (2012).</li><li>Karabasheva, D., Smyth, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel,+dynein-independent+mechanism+focuses+the+endoplasmic+reticulum+around+spindle+poles+in+dividing+Drosophila+spermatocytes.">A novel, dynein-independent mechanism focuses the endoplasmic reticulum around spindle poles in dividing Drosophila spermatocytes.</a> Scientific Reports. 9 (1), 12456 (2019).</li><li>Polevoy, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+roles+for+the+Drosophila+PI+4-kinase+four+wheel+drive+in+localizing+Rab11+during+cytokinesis.">Dual roles for the Drosophila PI 4-kinase four wheel drive in localizing Rab11 during cytokinesis.</a> Journal of Cell Biology. 187 (6), 847-858 (2009).</li><li>Rebollo, E., Llamazares, S., Reina, J., Gonzalez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+noncentrosomal+microtubules+to+spindle+assembly+in+Drosophila+spermatocytes.">Contribution of noncentrosomal microtubules to spindle assembly in Drosophila spermatocytes.</a> PLoS Biology. 2 (1), 8 (2004).</li><li>Smyth, J. T., Schoborg, T. A., Bergman, Z. J., Riggs, B., Rusan, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proper+symmetric+and+asymmetric+endoplasmic+reticulum+partitioning+requires+astral+microtubules.">Proper symmetric and asymmetric endoplasmic reticulum partitioning requires astral microtubules.</a> Open Biology. 5 (8), (2015).</li><li>Demarco, R. S., Eikenes, &. #. 1. 9. 7. ;. H., Haglund, K., Jones, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+spermatogenesis+in+Drosophila+melanogaster.">Investigating spermatogenesis in Drosophila melanogaster.</a> Methods. 68 (1), 218-227 (2014).</li><li>Fuller, M. T., Bate, M., Martinez-Arias, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Development of Drosophila melanogaster. , 71-147 (1993).</li><li>Dunleavy, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cell+Cycle+Timing+of+Centromeric+Chromatin+Assembly+in+Drosophila+Meiosis+Is+Distinct+from+Mitosis+Yet+Requires+CAL1+and+CENP-C.">The Cell Cycle Timing of Centromeric Chromatin Assembly in Drosophila Meiosis Is Distinct from Mitosis Yet Requires CAL1 and CENP-C.</a> PLOS Biology. 10 (12), 1001460 (2012).</li><li>Fabian, L., Brill, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+spermiogenesis:+Big+things+come+from+little+packages.">Drosophila spermiogenesis: Big things come from little packages.</a> Spermatogenesis. 2 (3), 197-212 (2012).</li><li>Ramm, S. A., Scharer, L., Ehmcke, J., Wistuba, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sperm+competition+and+the+evolution+of+spermatogenesis.">Sperm competition and the evolution of spermatogenesis.</a> Molecular Human Reproduction. 20 (12), 1169-1179 (2014).</li><li>Savoian, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopy+Methods+for+Analysis+of+Spindle+Dynamics+in+Meiotic+Drosophila+Spermatocytes.">Microscopy Methods for Analysis of Spindle Dynamics in Meiotic Drosophila Spermatocytes.</a> Methods in Molecular Biology. 1471, 265-276 (2017).</li><li>Sitaram, P., Hainline, S. G., Lee, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytological+analysis+of+spermatogenesis:+live+and+fixed+preparations+of+Drosophila+testes.">Cytological analysis of spermatogenesis: live and fixed preparations of Drosophila testes.</a> Journal of Visualized Experiments. (83), e51058 (2014).</li><li>Zamore, P. D., Ma, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Drosophila+melanogaster+testes.">Isolation of Drosophila melanogaster testes.</a> Journal of Visualized Experiments. (51), (2011).</li><li>Lerit, D. A., Plevock, K. M., Rusan, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+Drosophila+larval+neuroblasts.">Live imaging of Drosophila larval neuroblasts.</a> Journal of Visualized Experiments. (89), (2014).</li><li>Belloni, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+Cog7+affect+Golgi+structure,+meiotic+cytokinesis+and+sperm+development+during+Drosophila+spermatogenesis.">Mutations in Cog7 affect Golgi structure, meiotic cytokinesis and sperm development during Drosophila spermatogenesis.</a> Journal of Cell Science. 125 (22), 5441-5452 (2012).</li><li>Harel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistence+of+major+nuclear+envelope+antigens+in+an+envelope-like+structure+during+mitosis+in+Drosophila+melanogaster+embryos.">Persistence of major nuclear envelope antigens in an envelope-like structure during mitosis in Drosophila melanogaster embryos.</a> Journal of Cell Science. 94 (3), 463-470 (1989).</li><li>Katsani, K. R., Karess, R. E., Dostatni, N., Doye, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+dynamics+of+Drosophila+nuclear+envelope+components.">In vivo dynamics of Drosophila nuclear envelope components.</a> Mol Biol Cell. 19 (9), 3652-3666 (2008).</li><li>Tates, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cytodifferentiation during spermatogenesis in Drosophila melanogaster: An electron microscope study. , (1971).</li><li>Gartner, S. M., Rathke, C., Renkawitz-Pohl, R., Awe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+culture+of+Drosophila+pupal+testis+and+single+male+germ-line+cysts:+dissection,+imaging,+and+pharmacological+treatment.">Ex vivo culture of Drosophila pupal testis and single male germ-line cysts: dissection, imaging, and pharmacological treatment.</a> Journal of Visualized Experiments. (91), 51868 (2014).</li><li>Ohkura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiosis:+an+overview+of+key+differences+from+mitosis.">Meiosis: an overview of key differences from mitosis.</a> Cold Spring Harbor perspectives in biology. 7 (5), (2015).</li><li>Friedman, J. R., Webster, B. M., Mastronarde, D. N., Verhey, K. J., Voeltz, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ER+sliding+dynamics+and+ER-mitochondrial+contacts+occur+on+acetylated+microtubules.">ER sliding dynamics and ER-mitochondrial contacts occur on acetylated microtubules.</a> Journal of Cell Biology. 190 (3), 363-375 (2010).</li><li>Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methanol-acetone+fixation+of+Drosophila+testes.">Methanol-acetone fixation of Drosophila testes.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (10), 1270-1272 (2011).</li><li>Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paraformaldehyde+fixation+of+Drosophila+testes.">Paraformaldehyde fixation of Drosophila testes.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (1), 102-104 (2012).</li></ol>

我々は、精子細胞分裂の長期的な、生画像化のために最適化された幼虫または初期の小児性ショウジョウバエ精巣の調製のためのプロトコルを説明した。これは、無傷の組織の生理的文脈における細胞分裂の分析のための強力な方法である。この方法のパワーは、特定の遺伝子変異、組織特異的RNAi媒介抑制、および蛍光標識タンパク質およびオルガネラマーカーなどのショウジョ?...

細胞分裂は、培養1で増殖した細胞株を用いて研究されることが多い。これらの研究2から、我々は、これらの研究から、基本的なメカニズムの豊富な洞察力と理解を得ているが、培養で成長した細胞は、それが無傷の、生体組織で起こる細胞分裂の生理学を完全に再現することはできません。例えば、無傷の組織や臓器では、細胞は、子孫細胞が組織内に適切に位置するように適切な場所と適切なタイミングで分裂しなければならず、適切な分化または機能的プログラムを受けることができ、細胞増殖が組織の成長または恒常性3と適切に調整されるようにする。一方、培養で増殖した細胞については、細胞分裂は一般に培地4の成長因子によって調節されるため、生体内の環境因子(組織アーキテクチャや発育シグナル伝達など)が分裂過程にどのような影響を与えるかをこれらの細胞から学ぶことはできない。また、HeLaやU2OS細胞などの細胞分裂を研究するために使用される細胞株の多くは、転移性腫瘍5に由来していたことに注意することも重要である。したがって、これらの癌細胞の基礎生理学の多くの側面は、細胞周期調節機構および染色体安定性など、健康な細胞と比較して改変された可能性が高い。したがって、細胞分裂生理学の完全な理解は、生理学的調節機構および組織アーキテクチャを維持する生体環境における分裂細胞を研究する能力に依存する。
細胞分裂が無傷の組織や臓器内でどのように機能するかを理解する上での進歩は、生体内またはエクスビボ分析に固有の困難によって妨げられます。まず、大きな臓器や厚い組織内の顕微鏡分析のために分割細胞にアクセスすることは困難または不可能です。第二に、個々の細胞が生体内でいつ分裂するかを予測することはしばしば困難である。第3に、組織生理学は、元の生体培養中に急速に悪化する可能性がある。このプロトコルでは、完全に無傷の精巣内で細胞分裂を受けるショウジョウバエメラノガスター精子細胞の生きた固定分析のための容易にアクセス可能な方法について説明する。これらの細胞は、共焦点顕微鏡などの標準的な光学方法で容易にアクセス可能であり、予測可能な時間と場所で分裂し、無傷の精巣を約24時間までex vivo培養で維持できるため、生きているex vivo分析に最適です。さらに、ショウジョウバエ精子細胞は、分裂しても形が変わらない大きな丸い細胞(直径約20~30μm)であり、スピンドル装置や細胞質小器官などの細胞成分の高解像度、タイムラプスイメージングに最適です。これらの細胞は有糸分裂とは対照的に分裂を起こしますが、必須の細胞分裂プロセスの多くは、これら2つの細胞分裂機構6の間で非常に類似しています。これらの利点は、強力なショウジョウバエの遺伝的ツールと組み合わせることで、ショウジョウバエ精子細胞を紡錘形成および調節、サイトカネシス、および小器官改修および仕切り77、8、9、10、118,9,10,を含む必須細胞分裂プロセスのex vivo分析のために広く使用されるモデルにした。11
精子細胞は、精子形成の大精期にある細胞である。ショウジョウバエでは、精巣12,13,の1極に小さな領域または「ハブ」に位置する生殖細胞幹細胞群から精子形成が始まる。これらの細胞は非対称の有糸分裂によって分裂し、単一の分化された精子を生じさせる。精子は、その後、単一の嚢胞内に密接に関連付けられたままの16個の細胞のグループを生成するために4つの同期マイトースを受ける。この段階では、細胞は有糸分裂性から大細胞周期に移行し、精子細胞と呼ばれる。精子細胞は、細胞周期の拡張G2段階で約2〜3日間を過ごし、その間に劇的に成長し、2つの細分分裂とその後の精子形成13、14,14に対する準備において細胞学的変化を受ける。単一の嚢胞内の16個の精子細胞のグループ全体が同時に最初の大腸分裂に入る。したがって、いくつかのメオティック精子細胞は、細胞分裂を進める間同時に画像化することができる。最初の大腸分裂は約1.5時間進行し、ほぼ即座に第2の大腸分裂が続き、成熟した精子に分化するために進む64の総精子が得られる。
精子細胞を使用して生きている無傷の組織で細胞分裂を研究するユニークな利点は、細胞のグループまたは嚢胞が精子形成の異なる段階を経て絶えず進行し、精子形成のすべての段階の細胞が通常任意の精巣で同定できることである(図3Aを参照)。したがって、精巣全体で大腸細胞を見つけることは比較的容易である。これらの細胞ははるかに大きく、高解像度イメージングに適しているため、第2の除細症とは対照的に、一般的に最初の分析に焦点を当てていますが、両方のmeiotic部門を含むプロセス全体を正常にイメージングすることができます。また、精巣の準備および培養のための一般的なプロトコルは、精子形成の他のプロセスを分析するためにも使用することができることに留意すべきである。15精子形成のこれらの側面の多くは、ショウジョウバエとヒト16の間で高度に保存されている。
ショウジョウバエ精子細胞は、ショウジョウバエ開発13の第3のインスター幼虫段階の間に精子形成のmeiotic段階に達し始める。したがって、第3のインスター幼虫から始まり、子犬と成人を含むライフサイクル段階から分離された精巣を、精子細胞の分裂の分析に使用することができる。いくつかの優れたプロトコルは、精子形成17、18、19,18,19の生きている、固定分析のために、成人男性ハエからの精巣の抽出のために利用可能である。これらのプロトコルは、精子形成の後期段階を研究するために好ましいかもしれないか、または成人にのみ目に見える遺伝マーカーを使用しなければならない場合。これらの段階での精巣は、高解像度、タイムラプス顕微鏡による細胞分裂解析に特に関連するいくつかの利点を有するため、このプロトコルは、幼虫および早期の子犬からの精巣調製に焦点を当てる。まず、幼虫や子犬の精巣は成人の精巣よりも小さく、臓器内の細胞は混雑が少ない。このため、精子を分割することは、多くの場合、光散乱組織の複数の層を貫通することなく、幼虫精巣の外表面の近くで画像化することができます。第二に、成体精巣は付属の付属器官の収縮のためにリズミカルに動き、これらの動きは個々の細胞のタイムラプスイメージングを困難にする。第三に、幼虫精巣は、プパルまたは成人の致死を引き起こす遺伝子変異を研究する際に有利である。我々の方法は、顕微鏡段階で精巣の長期培養のために最適化され、同じ調製物中の精子形成の複数段階を通して細胞分裂の複数のラウンドまたは個々の細胞の進行のイメージングを可能にする。また、精巣全体の固定および免疫染色のためのプロトコルについても述べている。全体として、私たちのプロトコルは、無傷の組織における細胞分裂を研究することに興味がある人にとって特に有用であり、精子細胞分析と非常に難解なショウジョウバエ遺伝ツールを組み合わせる能力は、これを特に強力なアプローチにします。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>5&#34; Dissecting Probe</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-965-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5.75&#34; Glass Pasteur Pipet</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-678-20A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP9703-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-20</td>
			<td>Straight forcepts with fine tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frosted Microscope Slides</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-544-2</td>
			<td>Slides for mounting fixed tissue, with frosted writing surface</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halocarbon oil 700</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H8898-100 mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lumox Dish 50</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>SAR946077410</td>
			<td>Gas-permeable tissue culture dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Cover Glass</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-541-B</td>
			<td>22x22 mm, #1.5 glass coverslip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minutien Pins</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26002-15</td>
			<td>Insect pins used to make scalpel tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nickel Plated Pin Holder</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26018-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 32% Solution, EM Grade</td>
			<td>Electron Microsocopy Sciences</td>
			<td>15714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plan Beveled Edge Microscope Slides</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-549-5</td>
			<td>Slides used for dissections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PYREX Spot Plates</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-748B</td>
			<td>9-well glass dissecting dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schneider&#39;s Drosophila medium</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>21720-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Filter, 0.22 &#181;m</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>SLGS033SB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP151-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>H-1000</td>
			<td>Microscopy mounting medium</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of drosophila larval and pupal testes for analysis of cell division in live, intact tissue

細胞分裂が発達、組織恒常性、疾患プロセスとどのように統合されているかを理解するには、生きている、無傷の組織および器官で分裂する細胞の実験的分析が不可欠である。梅毒を受けているショウジョウバエ精子細胞は、(1)精子細胞を含むショウジョウバエ精巣全体が顕微鏡の準備が比較的容易であり、(2)精子細胞の大きなサイズは高解像度イメージングに適しており、(3)強力なショウジョフィラ遺伝ツールを生体内分析と統合することができるため、この分析に最適です。ここでは、ショウジョウバエ第3インスター幼虫および早期の子犬からの精巣全体の調製のための容易にアクセス可能なプロトコルを提示する。精巣全体で大腸精子細胞を同定する方法と、タイムラプス顕微鏡で生きている様子を画像化する方法について説明する。また、精巣全体の固定および免疫染色のためのプロトコルも提供される。幼虫精巣の使用は、精子細胞分析のために成人精巣を使用する利用可能なプロトコルよりもいくつかの利点があります。最も重要なことは、幼虫精巣は成人精巣よりも小さく、細胞で混雑が少なく、これは精子細胞の高解像度イメージングを大幅に促進する。これらの利点およびプロトコルの応用を実証するために、時間経過共焦点顕微鏡で画像化された単一の精子細胞における細胞分裂中の紡錘微小管に対する小胞細管の再分配を示す結果を提示する。このプロトコルは、蛍光タグ付きタンパク質やオルガネラマーカー、遺伝子変異、その他の遺伝的ツールの発現と組み合わせることで、組織および器官全体の生理学的文脈における細胞分裂機構の分析に特に強力です。

このプロトコルが正常に実行されると、精巣は共焦点顕微鏡または他の蛍光顕微鏡法によるイメージングのために完全に無傷のままです。図3Aに示すように、精巣の細胞組織は保存され、精巣の一端から精子、精子、およびハプロイド精子を含む他の端への細胞分化の進行が見える。GFP-tubulinは、分裂する精子を同定し、そして、細胞のマイオシスを通して細胞の進行の...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue at JoVE.com

Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

このプロトコルの目的は、ショウジョウバエの精細細胞を用いた細胞顕微鏡と固定細胞顕微鏡法により、無傷組織における細胞分裂を解析することである。このプロトコルは、ショウジョウバエ幼虫と初期の子犬から全体の無傷の精巣を分離する方法と、顕微鏡検査のためにそれらを処理し、マウントする方法を示しています。

生きた無傷組織における細胞分裂解析のためのショウジョウバエ・ラーバルとプパル精巣の調製

Experimental analysis of cells dividing in living, intact tissues and organs is essential to our understanding of how cell division integrates with ...

このプロトコルは、蛍光顕微鏡を用いて、生きている無傷の組織の文脈で細胞分裂のメカニズムを分析するために使用することができる。この技術の主な利点は、細胞の本来の生理学的環境が保存され、また、長時間のコース上でのライブイメージングを可能にすることです。この技術の最も重要な部分は、解剖または取り付け中に精巣が破損していないことを確認することです。これは少しの時間と練習で習得されるスキルです。この方法の視覚的なデモンストレーションは、精巣を同定して隔離する方法と、組織を損傷することなくイメージングのためにそれらを取り付ける方法を示すため、非常に重要です。原稿に記載されている動物、道具、メディアを準備する。解剖を開始する前に、メディア充填フィルタシリンジを使用して、ガラススライドの上部、中央、底部に50マイクロリットルのメディアを3滴ずつ排出します。解剖プローブを使用して、5〜10分の10のインスター幼虫または早期の子犬をスライド上のメディアのトップドロップに移します。解剖プローブでメディアの幼虫と子犬を軽く攪拌し、食べ物や破片を取り除きます。解剖プローブを使用して、単一の幼虫または子犬を横に回します。体の後部3分の1に半透明の楕円形の構造として現れる2つの両側精巣を探してください。精巣を欠いている動物はメスであり、捨てるべきです。雄の幼虫や子犬が見つかり、清潔になったら、メディアの2番目のドロップに移動します。3、4匹の雄の幼虫または子犬がメディアの2番目の滴に移されるまで繰り返します。その後、メディアの2番目のドロップで作業し、その中間領域で鉗子のペアで単一の動物をつかみ、精巣の前にだけ。2番目の鉗子を使用して、動物を半分に優しく引き裂きます。鉗子のペアを使用して、ガラススライド上の動物の後端を押し下げます。鉗子のすぐ隣から、メスの端を使用してキューティクルを押し下げます。メスを動物のカットエンドに向かって動かします。これは、腸、脂肪体、精巣を含む動物の内臓を追放します。精巣は、脂肪体のリボンに埋め込まれた無色で、ほぼ透明な楕円形の器官です。精巣を残りの器官からそっといじめる。精巣を一度に1つずつ転写するには、メスの縁を脂肪の下に挿入し、組織を培地から持ち上げ、3番目のドロップに素早く移動します。メスで組織を持ち上げるのに精巣にまだ十分な脂肪体が付着していない場合は、解剖媒体で予水したガラスパスツールピペットを使用する。ミディアムの3番目のドロップで作業し、メスの鋭い端を使用して精巣から余分な脂肪体を優しくスライスし、エッジの周りに脂肪体の小さな縁を残します。まず、フィルターシリンジを使用して、シュナイダーの培地の1滴を約30マイクロリットルを50ミリメートルのガス透過培養皿の中央に堆積させます。メスツールまたはあらかじめ濡れたパスツールピペットを使用して、準備された精巣の5つまで皿のドロップに移します。次に、メスツールを使用して、精巣をガス透過膜に静かに押し下げ、媒体の滴の中心に押し込みます。1ミリリットルのシリンジを使用して、培地の滴を取り囲むガス透過性膜に4滴のハロカーボン油を置きます。滴の位置は22ミリメートル級のカバースリップの四隅に対応する必要があります。その後、22ミリメートルのガラスカバースリップの角を4滴のハロカーボンオイルに合わせ、カバースリップをメディアとオイルにそっと下げます。カバースリップが落ち着くようにし、精巣を含む媒体のために油の滴の間に広がりを。培養皿を解剖顕微鏡の下に置きます。余分なメディアを取り除くために、カバースリップの下に繊細なタスクワイプの角を挿入します。ガラスカバースリップが最大の精巣の表面に接触するのに十分なメディアを離れてウィック。メディアを取り外しすぎてカバースリップを下げすぎないようにしてください。これは精巣に圧力をかけ、破裂する可能性があります。最後に、精巣のすぐ上のガラスカバースリップに浸漬油を一滴置きます。皿をひっくり返し、顕微鏡のステージに置きます。40または60 Xの顕微鏡の目的を精巣のすぐ下になるまでオイルに移します。透過光を使用して単一の精巣を見つけ、焦点を当てます。9つのよく解剖皿の1つの井戸にPBSTxで8%パラホルムアルデヒドの0.5ミリリットルを置きます。ガラスのパスツールピペットを使用して、最大10個の精巣を井戸に移します。精巣が井戸の底に横たわっていることを確認します。20分後、精巣を0.5ミリリットルのPBSTxを含むウェルに移します。5分間やさしく攪拌して精巣を洗います。新しいPBSTxで新しい井戸でさらに2回洗浄します。原稿に記載されているように、1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに一次抗体の希釈を準備します。その後、9つのウェルガラス解剖皿からチューブに精巣を移します。穏やかなロッキングまたはヌツェーションで摂氏4度で一晩チューブをインキュベートします。二次抗体で精巣を染色する手順は同様である。詳細は原稿を参照してください。まず、パスツールピペットを使用して、9つのウェルプレートからガラス顕微鏡スライドに精巣を移します。必要に応じて、メスのエッジを使用して、精巣をスライドの表面に押し下げます。次に、精巣から余分な液体を吸い取るために繊細なタスクワイプのコーナーを使用します。できるだけ多くの液体を取り除きます。次いで、30~50マイクロリットルの顕微鏡実装媒体を精巣に塗布します。最後に、22ミリのカバースリップを取り付け媒体の落下に置きます。カバースリップが落ち着き、取り付け媒体がカバースリップの下に広がります。必要に応じて、カバースリップに穏やかな圧力をかけて余分な取り付け媒体を絞り出し、カバースリップを精巣の表面に置きます。このプロトコルが正常に実行されると、精巣の細胞組織が保存され、精巣の一方の端から他方の端への細胞分化の進行が見える。精子細胞は、起こす間に起きようとしているが、転移性の細胞を同定することができる。このプロトコルを用いて調製された精巣において、ライブイメージング分析は、精子細胞を分割する際の小胞子および微小細管の動的再編成を示す。プロトコルで説明されているように、精巣が破裂する原因となる圧力を加えないように細心の注意を払う必要があります。精子細胞の嚢胞は破裂した精巣から急速に流出し、ライブタイムラプスイメージングが困難になる。このプロトコルは、生きている、無傷の組織で精子を分割するイメージングに最適化されています。したがって、解剖や取り付け時に精巣が破損しないことが不可欠です。我々の方法は、構造化された照明顕微鏡などの超解像度イメージング技術にも適し、細胞分裂を支配する動的なサブセルラープロセスに関する新しい洞察を提供する必要があります。

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

のライブイメージング<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;蛹アイ

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track ...

Preparation of Mitochondrial Enriched Fractions for Metabolic Analysis in Drosophila

Preparation of Mitochondrial Enriched Fractions for Metabolic Analysis in Drosophila

代謝分析のためのミトコンドリア富化画分の調製で<em&gt;ショウジョウバエ</em

Since mitochondria play roles in amino acid metabolism, carbohydrate metabolism and fatty acid oxidation, defects in mitochondrial function often ...

Observing Mitotic Division and Dynamics in a Live Zebrafish Embryo

ライブゼブラフィッシュ胚における有糸分裂とダイナミクスを観察します

Mitosis is critical for organismal growth and differentiation. The process is highly dynamic and requires ordered events to accomplish proper chromatin ...

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

体外受精卵の Live 細胞イメージング偏光とシロイヌナズナの胚パターン形成の胚珠培養

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

マウス二次口蓋融合のライブイメージング

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue

Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue

ライブショウジョウバエ卵巣組織の卵胞幹細胞系列のイメージング細胞内 pH の方法

Changes in intracellular pH (pHi) play important roles in the regulation of many cellular functions, including metabolism, proliferation, and ...

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

郭清およびショウジョウバエ蛹卵巣の汚損

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a ...

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

免疫組織化学、西部の分析、および RNA の隔離のためのショウジョウバエ蛹網膜の解剖

The Drosophila pupal retina provides an excellent model system for the study of morphogenetic processes during development. In this paper, we present a ...

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

ショウジョウバエ胚における筋収縮のライブイメージングと解析

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits ...