Name: preparation of drosophila larval and pupal testes for analysis of cell division in live, intact tissue
Uploaded: 2020-05-19T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue at JoVE.com

이 작품은 J.T.S에 국방부 창업 자금에 의해 지원되었다.

1. 해부를 위한 동물, 도구 및 미디어 준비
<ol><li>수컷과 암컷이 날아다니는 것을 교차하여 원하는 유전자형의 자손을 얻습니다. meiotic spermatocytes의 확인 및 발판을 위한 유용한 형질전환 마커는 meiotic 스핀들 및 RFP-히스톤 2A를 표지하는 GFP-tubulin을 포함합니다8. 십자가 당 5 ~10 암컷을 사용하고 세 번째 instar 애벌레가 바이알의 측면을 크롤링 시작할 때까지 25 °C 인큐베이터에서 ...

<ol>
	<li>Khodjakov, A., Rieder, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+division+process+in+living+tissue+culture+cells.">Imaging the division process in living tissue culture cells.</a> Methods. 38 (1), 2-16 (2006).</li><li>Ong, J. Y., Torres, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+mechanisms+of+cell+division.">Dissecting the mechanisms of cell division.</a> The Journal of Biological Chemistry. 294 (30), 11382-11390 (2019).</li><li>Levine, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cycling+through+development.">Cell cycling through development.</a> Development. 131 (10), 2241-2246 (2004).</li><li>Gross, S. M., Rotwein, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unraveling+Growth+Factor+Signaling+and+Cell+Cycle+Progression+in+Individual+Fibroblasts.">Unraveling Growth Factor Signaling and Cell Cycle Progression in Individual Fibroblasts.</a> The Journal of Biological Chemistry. 291 (28), 14628-14638 (2016).</li><li>Mittelman, D., Wilson, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fractured+genome+of+HeLa+cells.">The fractured genome of HeLa cells.</a> Genome Biology. 14 (4), 111 (2013).</li><li>Bury, L., Coelho, P. A., Glover, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+Meiosis+to+Mitosis:+The+Astonishing+Flexibility+of+Cell+Division+Mechanisms+in+Early+Mammalian+Development.">From Meiosis to Mitosis: The Astonishing Flexibility of Cell Division Mechanisms in Early Mammalian Development.</a> Current Topics in Developmental Biology. 120, 125-171 (2016).</li><li>Giansanti, M. G., Fuller, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+Drosophila+spermatocytes+tell+us+about+the+mechanisms+underlying+cytokinesis.">What Drosophila spermatocytes tell us about the mechanisms underlying cytokinesis.</a> Cytoskeleton. 69 (11), 869-881 (2012).</li><li>Karabasheva, D., Smyth, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel,+dynein-independent+mechanism+focuses+the+endoplasmic+reticulum+around+spindle+poles+in+dividing+Drosophila+spermatocytes.">A novel, dynein-independent mechanism focuses the endoplasmic reticulum around spindle poles in dividing Drosophila spermatocytes.</a> Scientific Reports. 9 (1), 12456 (2019).</li><li>Polevoy, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+roles+for+the+Drosophila+PI+4-kinase+four+wheel+drive+in+localizing+Rab11+during+cytokinesis.">Dual roles for the Drosophila PI 4-kinase four wheel drive in localizing Rab11 during cytokinesis.</a> Journal of Cell Biology. 187 (6), 847-858 (2009).</li><li>Rebollo, E., Llamazares, S., Reina, J., Gonzalez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+noncentrosomal+microtubules+to+spindle+assembly+in+Drosophila+spermatocytes.">Contribution of noncentrosomal microtubules to spindle assembly in Drosophila spermatocytes.</a> PLoS Biology. 2 (1), 8 (2004).</li><li>Smyth, J. T., Schoborg, T. A., Bergman, Z. J., Riggs, B., Rusan, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proper+symmetric+and+asymmetric+endoplasmic+reticulum+partitioning+requires+astral+microtubules.">Proper symmetric and asymmetric endoplasmic reticulum partitioning requires astral microtubules.</a> Open Biology. 5 (8), (2015).</li><li>Demarco, R. S., Eikenes, &. #. 1. 9. 7. ;. H., Haglund, K., Jones, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+spermatogenesis+in+Drosophila+melanogaster.">Investigating spermatogenesis in Drosophila melanogaster.</a> Methods. 68 (1), 218-227 (2014).</li><li>Fuller, M. T., Bate, M., Martinez-Arias, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Development of Drosophila melanogaster. , 71-147 (1993).</li><li>Dunleavy, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cell+Cycle+Timing+of+Centromeric+Chromatin+Assembly+in+Drosophila+Meiosis+Is+Distinct+from+Mitosis+Yet+Requires+CAL1+and+CENP-C.">The Cell Cycle Timing of Centromeric Chromatin Assembly in Drosophila Meiosis Is Distinct from Mitosis Yet Requires CAL1 and CENP-C.</a> PLOS Biology. 10 (12), 1001460 (2012).</li><li>Fabian, L., Brill, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+spermiogenesis:+Big+things+come+from+little+packages.">Drosophila spermiogenesis: Big things come from little packages.</a> Spermatogenesis. 2 (3), 197-212 (2012).</li><li>Ramm, S. A., Scharer, L., Ehmcke, J., Wistuba, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sperm+competition+and+the+evolution+of+spermatogenesis.">Sperm competition and the evolution of spermatogenesis.</a> Molecular Human Reproduction. 20 (12), 1169-1179 (2014).</li><li>Savoian, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopy+Methods+for+Analysis+of+Spindle+Dynamics+in+Meiotic+Drosophila+Spermatocytes.">Microscopy Methods for Analysis of Spindle Dynamics in Meiotic Drosophila Spermatocytes.</a> Methods in Molecular Biology. 1471, 265-276 (2017).</li><li>Sitaram, P., Hainline, S. G., Lee, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytological+analysis+of+spermatogenesis:+live+and+fixed+preparations+of+Drosophila+testes.">Cytological analysis of spermatogenesis: live and fixed preparations of Drosophila testes.</a> Journal of Visualized Experiments. (83), e51058 (2014).</li><li>Zamore, P. D., Ma, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Drosophila+melanogaster+testes.">Isolation of Drosophila melanogaster testes.</a> Journal of Visualized Experiments. (51), (2011).</li><li>Lerit, D. A., Plevock, K. M., Rusan, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+Drosophila+larval+neuroblasts.">Live imaging of Drosophila larval neuroblasts.</a> Journal of Visualized Experiments. (89), (2014).</li><li>Belloni, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+Cog7+affect+Golgi+structure,+meiotic+cytokinesis+and+sperm+development+during+Drosophila+spermatogenesis.">Mutations in Cog7 affect Golgi structure, meiotic cytokinesis and sperm development during Drosophila spermatogenesis.</a> Journal of Cell Science. 125 (22), 5441-5452 (2012).</li><li>Harel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistence+of+major+nuclear+envelope+antigens+in+an+envelope-like+structure+during+mitosis+in+Drosophila+melanogaster+embryos.">Persistence of major nuclear envelope antigens in an envelope-like structure during mitosis in Drosophila melanogaster embryos.</a> Journal of Cell Science. 94 (3), 463-470 (1989).</li><li>Katsani, K. R., Karess, R. E., Dostatni, N., Doye, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+dynamics+of+Drosophila+nuclear+envelope+components.">In vivo dynamics of Drosophila nuclear envelope components.</a> Mol Biol Cell. 19 (9), 3652-3666 (2008).</li><li>Tates, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cytodifferentiation during spermatogenesis in Drosophila melanogaster: An electron microscope study. , (1971).</li><li>Gartner, S. M., Rathke, C., Renkawitz-Pohl, R., Awe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+culture+of+Drosophila+pupal+testis+and+single+male+germ-line+cysts:+dissection,+imaging,+and+pharmacological+treatment.">Ex vivo culture of Drosophila pupal testis and single male germ-line cysts: dissection, imaging, and pharmacological treatment.</a> Journal of Visualized Experiments. (91), 51868 (2014).</li><li>Ohkura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiosis:+an+overview+of+key+differences+from+mitosis.">Meiosis: an overview of key differences from mitosis.</a> Cold Spring Harbor perspectives in biology. 7 (5), (2015).</li><li>Friedman, J. R., Webster, B. M., Mastronarde, D. N., Verhey, K. J., Voeltz, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ER+sliding+dynamics+and+ER-mitochondrial+contacts+occur+on+acetylated+microtubules.">ER sliding dynamics and ER-mitochondrial contacts occur on acetylated microtubules.</a> Journal of Cell Biology. 190 (3), 363-375 (2010).</li><li>Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methanol-acetone+fixation+of+Drosophila+testes.">Methanol-acetone fixation of Drosophila testes.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (10), 1270-1272 (2011).</li><li>Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paraformaldehyde+fixation+of+Drosophila+testes.">Paraformaldehyde fixation of Drosophila testes.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (1), 102-104 (2012).</li></ol>

우리는 정액 세포 분열의 장기, 살아있는 화상 진찰을 위해 최적화된 애벌레 또는 초기 pupal Drosophila 고환의 준비를 위한 프로토콜을 기술했습니다. 이것은 손상되지 않은 조직의 생리적 맥락에서 세포 분열을 분석하기위한 강력한 방법입니다. 이 방법의 힘은 특정 유전자 돌연변이, 조직 특이적 RNAi 매개 억제 및 형광 표지된 단백질 및 세포기관 마커와 같은 Drosophila 유전 도구와 결?...

세포 분열은 배양1에서자란 세포주를 사용하여 종종 연구된다. 우리는 이 연구 결과2에서근본적인 기계장치의 귀중한 통찰력 그리고 이해의 재산을 얻고 있는 동안, 배양에서 성장한 세포는 온전하고 살아있는 조직에서 생기는 세포 분열의 생리학을 완전히 되풀이할 수 없습니다. 예를 들어, 손상되지 않은 조직 및 장기에서 세포는 자손 세포가 조직 내에 적절하게 위치할 수 있도록 적절한 장소와 적절한 시기에 분할하여 적절한 분화 또는 기능적 프로그램을 겪을 수 있도록 하고 세포 증식이 조직 성장 또는 항상성과 적절하게 조정되도록 해야 합니다3. 한편, 배양에서 성장한 세포의 경우, 세포 분열은 일반적으로 배양 배지4의성장 인자에 의해 조절되며, 따라서 우리는 이러한 세포로부터 조직 구조 또는 발달 신호전달과 같은 환경적 요인이 분열 과정에 어떻게 영향을 미치는지 배울 수 없다. HeLa 및 U2OS 세포와 같은 세포 분열을 연구하는 데 사용되는 많은 세포주가 전이성 종양5에서유래되었다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 따라서, 이러한 암세포의 기본 생리학의 많은 양상, 예: 세포 주기 조절 기전 및 염색체 안정성은 건강한 세포에 비해 변경되었을 가능성이 있다. 세포 분열 생리학의 완전한 이해는, 그러므로, 생리적인 규정 기계장치 및 조직 건축을 보존하는 그들의 네이티브, 생체 내 환경에서 분할 세포를 공부하는 우리의 기능에 달려 있습니다.
세포 분열이 손상되지 않은 조직 및 기관 내에서 어떻게 작동하는지 이해하는 발전은 생체 내 또는 생체 내 분석에 내재된 어려움에 의해 방해받습니다. 첫째, 큰 기관 또는 두꺼운 조직 내의 현미경 분석을 위해 분할 세포에 접근하는 것이 어렵거나 불가능할 수 있습니다. 둘째, 개별 세포가 생체 내에서 분할 될 때 예측하는 것은 종종 어렵습니다. 셋째, 조직 생리학은 생체 배양 동안 급속히 악화될 수 있다. 이 프로토콜에서는, 우리는 완전히 온전한 고환 내의 meiotic 세포 분열을 겪을 때 Drosophila melanogaster 정액 세포의 살아있는 및 고정된 분석을 위한 쉽게 접근가능한 방법을 기술합니다. 이 세포는 공초점 현미경 검사법과 같은 표준 광학 방법으로 쉽게 접근할 수 있기 때문에 생체 내 생체 분석에 이상적이며, 예측 가능한 시간과 위치에서 분할되며, 손상되지 않은 고환은 최대 약 24 시간 동안 생체 배양에서 유지될 수 있습니다. 또한, Drosophila 정자 세포는 큰 둥근 세포 (약 20-30 μm 직경) 그들은 분할 할 때 모양을 변경하지 않습니다, 스핀들 장치 및 세포질 세포기관과 같은 세포 구성 요소의 고해상도, 시간 경과 이미징에 이상적이다. 이 세포는 유사분열과 반대로 만피증을 겪더라도, 많은 필수 세포 분열 프로세스는 이 2개의 세포 분열 기계장치6사이에서 아주 유사합니다. 이러한 장점은, 강력한 Drosophila 유전 도구와 결합, 스피들 형성 및 조절, 사이토 카인시스, 및 소기관 리모델링 및 분할7,8,8,9,,10,,11을포함하여 필수 세포 분열 과정의 생체 분석을 위해 광범위하게 사용되는 모델로 Drosophila 정자 세포를 만들었습니다.
정자 세포는 정자 발생의 meiotic 단계에 있는 세포입니다. Drosophila에서정자 발생은 고환12,,13의한 극에서 작은 영역 또는 "허브"에 위치한 생식선 줄기 세포의 그룹으로 시작됩니다. 이 세포는 비대칭 유사분열에 의해 분할되고, 단 하나 분화한 정자를 초래합니다. Spermatogonia는 그 때 단 하나 낭종 내의 밀접하게 연관된 남아 있는 16의 세포의 단을 생성하기 위하여 4개의 동기 미토를 겪습니다. 이 단계에서, 세포는 meiotic 세포 주기에 유사분열에서 전이하고 정액 세포로 불립니다. 정자 세포는 세포 주기의 확장된 G2 단계에서 약 2~3일을 소비하며, 이 기간 동안 극적으로 성장하고 두 가지 메소다 분열 및 후속 정자 발생에 대비하여 세포학적 변화를 겪는다13,,14. 단일 낭종 내의 16 정자 세포의 전체 그룹은 동시에 첫 번째 meiotic 분열을 입력합니다. 따라서, 몇몇 meiotic 정자 는 세포 분열을 통해서 진행하는 때 동시에 심상될 수 있습니다. 첫번째 meiotic 분할은 대략 1.5 시간 동안 진행하고 성숙한 정자로 분화하기 위하여 계속하는 64의 총 정자를 산출하는 두 번째 meiotic 분할에 의해 거의 즉시 따릅니다.
살아있는 세포 분열을 연구하기 위하여 정액 세포를 사용하는 유일한 이점은, 온전한 조직은 세포의 단 또는 낭종이 정액 발생의 다른 단계를 통해 지속적으로 점진하고, 정액 발생의 모든 단계에서 세포는 일반적으로 어떤 주어진 된 고환에서 확인될 수 있습니다 (그림 3A참조). 따라서 전체 고환에서 meiotic 세포를 찾는 것이 비교적 쉽습니다. 우리는 일반적으로 이 세포가 고해상도 화상 진찰에 훨씬 더 크고 더 순종하기 때문에 두 번째 만두와 반대로 첫번째에 우리의 분석을 집중합니다, 그러나 두 meiotic 분할을 포괄하는 전체 프로세스는 성공적으로 심상될 수 있습니다. 또한 고환 제제 및 배양을 위한 일반적인 프로토콜은 정자 의전증으로 성숙함에 따라 발생하는 초기 유사분열 줄기 세포 또는 정자 분열 또는 세포학적 변화와 같은 정자 발생의 다른 과정을 분석하는데 사용될 수 있다는 점에 유의해야 한다15. 정자 발생의 이러한 측면의 대부분은 매우 초파리와 인간 사이에 보존16.
초파리 정자세포는 초파리 발달13의세 번째 유충 단계에서 정자 발생의 메소형성 단계에 도달하기 시작한다. 따라서, 세 번째 instar 애벌레로 시작하고 pupae 및 성인을 포함하여 수명 주기 단계에서 격리된 고환은 정자 세포의 분할 분석용으로 사용될 수 있습니다. 몇 가지 우수한 프로토콜은 정자 발생의 라이브 및 고정 분석을위한 성인 남성 파리에서 고환의 추출을 위해 사용할 수 있습니다17,,18,,19. 이 프로토콜은 정자 발생의 후기 단계를 공부하기 위해 바람직할 지도 모릅니다 또는 성인에서만 보이는 유전 마커가 이용되어야 하는 경우에. 이 프로토콜은 이 단계에서 고환이 고해상도, 시간 경과 현미경 검사법에 의하여 세포 분열 분석에 특히 관련되는 몇몇 이점이 있기 때문에, 애벌레와 초기 pupae에서 고환 준비에 대신 집중합니다. 첫째, 애벌레와 번데기의 고환은 성인보다 작고 장기 내의 세포는 덜 혼잡합니다. 이 때문에, 분할 정자 세포는 종종 빛 산란 조직의 여러 층을 통해 침투 할 필요없이, 애벌레 고환의 외부 표면 근처에 이미지 화 될 수있다. 둘째, 성인 고환은 연결된 부속 기관의 수축으로 인해 리드미컬하게 움직이며, 이러한 움직임은 개별 세포의 시간 경과 이미징을 어렵게 만듭니다. 셋째, 애벌레 고환은 pupal 또는 성인 치사성을 일으키는 유전자 돌연변이를 연구할 때 유리합니다. 우리의 방법은 현미경 단계에 고환의 장기 문화를 위해 최적화되어, 동일한 준비에 있는 정액 발생의 다중 단계를 통해 세포 분열의 다중 라운드 또는 개별 세포의 진행의 화상 진찰을 허용합니다. 우리는 또한 전체 고환의 고정 및 면역 염색을 위한 프로토콜을 기술합니다. 전반적으로, 우리의 프로토콜은 손상되지 않은 조직에서 세포 분열을 공부에 관심이 있는 사람들을 위해 특히 유용하고, 고도로 견인성 Drosophila 유전 공구와 정액 세포 분석을 결합하는 기능은 이것을 특히 강력한 접근하게 합니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>5&#34; Dissecting Probe</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-965-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5.75&#34; Glass Pasteur Pipet</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-678-20A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP9703-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-20</td>
			<td>Straight forcepts with fine tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frosted Microscope Slides</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-544-2</td>
			<td>Slides for mounting fixed tissue, with frosted writing surface</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halocarbon oil 700</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H8898-100 mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lumox Dish 50</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>SAR946077410</td>
			<td>Gas-permeable tissue culture dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Cover Glass</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-541-B</td>
			<td>22x22 mm, #1.5 glass coverslip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minutien Pins</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26002-15</td>
			<td>Insect pins used to make scalpel tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nickel Plated Pin Holder</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26018-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 32% Solution, EM Grade</td>
			<td>Electron Microsocopy Sciences</td>
			<td>15714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plan Beveled Edge Microscope Slides</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-549-5</td>
			<td>Slides used for dissections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PYREX Spot Plates</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-748B</td>
			<td>9-well glass dissecting dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schneider&#39;s Drosophila medium</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>21720-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Filter, 0.22 &#181;m</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>SLGS033SB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP151-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>H-1000</td>
			<td>Microscopy mounting medium</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of drosophila larval and pupal testes for analysis of cell division in live, intact tissue

세포 분열이 발달, 조직 항상성 및 질병 과정과 어떻게 통합되는지에 대한 우리의 이해에 필수적입니다. (1) 정자를 포함하는 전체 Drosophila 고환은 현미경 검사법을 위해 준비하기 가 상대적으로 쉽기 때문에, (2) 정자 세포의 큰 크기는 고해상도 화상 진찰을 위해 그(것)들을 잘 적색하고, (3) 강력한 Drosophila 유전 공구는 생체 내 분석과 통합될 수 있기 때문에 만연증을 겪고 있는 혈소판 세포는 이 분석을 위해 이상적입니다. 여기에서, 우리는 Drosophila 제 3 instar 애벌레 및 초기 pupae에서 전체 고환의 준비를 위한 쉽게 접근가능한 프로토콜을 제시합니다. 우리는 준비된 전체 고환에 있는 meiotic 정자 를 확인하는 방법과 시간 경과 현미경 검사법에 의해 그(것)들을 사는 심상하는 방법을 기술합니다. 전체 고환의 고정 및 면역 염색을 위한 프로토콜도 제공됩니다. 애벌레 고환의 사용은 정자 세포 분석을 위해 성인 고환을 사용하는 사용 가능한 프로토콜에 비해 몇 가지 장점이 있습니다. 가장 중요한 것은, 애벌레 고환은 성인 고환 보다는 세포로 더 작고 적게 혼잡하고, 이것은 크게 정액 세포의 고해상도 화상 진찰을 촉진합니다. 이러한 장점과 프로토콜의 적용을 입증하기 위해, 우리는 시간 경과 공초점 현미경검사법에 의해 이미지된 단일 정자 세포에서 세포 분열 동안 스핀들 미세소관에 대하여 소포체의 재분배를 보여주는 결과를 제시한다. 프로토콜은 형광 태그 단백질 또는 세포 기관 마커의 수의 발현과 결합 될 수있다, 유전자 돌연변이 및 기타 유전 도구뿐만 아니라, 전체 조직과 장기의 생리적 맥락에서 세포 분열 메커니즘의 분석을 위해이 접근 방식을 특히 강력.

이 프로토콜이 성공적으로 실행되면, 고환은 공초점 현미경 검사법 또는 그밖 형광 현미경 방법에 의하여 화상 진찰을 위해 완전히 손상되지 않을 것입니다. 그림 3A에서볼 수 있듯이, 고환의 세포 조직이 보존되고, 정자 세포, 및 haploid 정자를 포함하여 다른 고환의 한쪽 끝에서 다른 세포 분화의 진행이 볼 수 있습니다. GFP-tubulin는 분할 정자 세포를 확인하고 만피증을 통해 ...

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Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

이 프로토콜의 목표는 Drosophila meiotocytes를 사용하여 살아있는 고정 세포 현미경 검사법에 의해 손상되지 않은 조직에서 세포 분열을 분석하는 것입니다. 이 프로토콜은 Drosophila 유충과 초기 번데기에서 전체, 손상되지 않은 고환을 분리하는 방법과 현미경 검사를 위해 처리하고 장착하는 방법을 보여줍니다.

살아있는, 그대로 조직에서 세포 분열의 분석을 위한 초파리 애벌레와 Pupal 고환의 준비

Experimental analysis of cells dividing in living, intact tissues and organs is essential to our understanding of how cell division integrates with ...

이 프로토콜은 형광 현미경 검사를 사용하여 살아있는, 그대로 조직의 맥락에서 세포 분열의 메커니즘을 분석하는 데 사용할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 세포의 토착 생리 환경이 보존되는 동시에 오랜 과정을 통해 실시간 이미징을 허용한다는 것입니다. 이 기술의 가장 중요한 부분은 해부 또는 장착 중에 고환이 손상되지 않도록 하는 것입니다.이것은 약간의 시간과 연습으로 획득 한 기술입니다. 이 방법의 시각적 데모는 고환을 식별하고 격리하는 방법과 조직을 손상시키지 않고 이미징을 위해 장착하는 방법을 보여 주므로 중요합니다. 원고에 설명된 대로 동물, 도구 및 미디어를 준비합니다.해부를 시작하기 전에 미디어 충전 필터 주사기를 사용하여 유리 슬라이드의 상단, 중간 및 하단에 있는 50마이크로리터마다 3방울의 미디어를 배출합니다. 해부 프로브를 사용하여 5-10세 인스타 애벌레 또는 초기 강아지를 슬라이드에서 미디어 상단 으로 옮기십시오. 해부 프로브로 애벌레와 강아지를 부드럽게 교반하여 음식이나 이물질을 제거합니다.해부 프로브를 사용하여 단일 애벌레 또는 강아지를 옆으로 돌립니다. 신체의 후방 세 번째에 반투명 타원형 구조로 나타나는 두 가지 양자 고환을 찾습니다. 고환이 부족한 동물은 여성이며 버려야합니다.남성 애벌레 또는 강아지가 발견되고 깨끗할 때, 미디어의 두 번째 방울로 이동합니다. 3~4개의 수컷 애벌레 또는 푸파가 두 번째 미디어 드롭으로 옮겨질 때까지 반복한다. 그런 다음 미디어의 두 번째 드롭에서 작업, 그 중간 지역에서 집게의 쌍으로 하나의 동물을 잡아, 단지 고환에 전방.두 번째 집게를 사용하여 동물을 반으로 부드럽게 찢습니다. 한 쌍의 집게를 사용하여 동물의 뒤쪽 끝을 유리 슬라이드에 누십시오. 집게 바로 옆에서 시작하여 메스 가장자리를 사용하여 큐티클을 누른다.메스를 동물의 절단 끝으로 이동합니다. 이것은 창 자, 뚱뚱한 바디 및 고환을 포함하는 동물의 내부 기관을 추방할 것입니다. 고환은 무색및 지방 체의 리본에 내장된 거의 투명한 타원형 기관입니다.나머지 장기에서 고환을 부드럽게 따로 떼어냅니다. 고환을 한 번에 하나씩 옮기려면, 지방 체 아래에 메스의 가장자리를 삽입하고, 미디어에서 조직을 들어 올리고, 신속하게 세 번째 드롭으로 이동합니다. 아직 고환에 부착된 지방체가 충분하지 않으면 메스로 조직을 들어 올릴 수 있는 유리 파스퇴르 파이펫을 사용하여 해부 배지로 미리 습식된 유리 파스퇴르 파이펫을 사용한다.매체의 세 번째 드롭에서 작업, 부드럽게 고환에서 여분의 지방 몸을 슬라이스 메스의 날카로운 끝을 사용하여, 가장자리 주위에 지방 몸의 단지 작은 테두리를 떠나. 먼저 필터 주사기를 사용하여 슈나이더의 배지 한 방울을 약 30마이크로리터를 50mm 가스 투과성 배양 접시의 중앙에 증정합니다. 메스 도구 또는 미리 습식 된 파스퇴르 파이펫을 사용하여 준비 된 고환 의 최대 5 개까지 접시에 드롭합니다.다음으로 메스 도구를 사용하여 고환을 가스 투과성 멤브레인에 부드럽게 밀어 넣고 중간 낙하의 중심으로 밀어 넣습니다. 1 밀리리터 주사기를 사용하여 중간 크기의 낙하를 둘러싼 가스 투과성 멤브레인에 할로카본 오일 4방울을 놓습니다. 방울의 위치는 22밀리미터 클래스 커버슬립의 네 모서리에 해당해야 합니다.그런 다음 22mm 유리 커버슬립의 모서리를 할로카본 오일 4방울과 정렬하고 커버슬립을 미디어와 오일에 부드럽게 낮춥춥시게 합니다. 커버슬립이 정착하도록 허용하고, 고환을 포함하는 매체의 경우 오일 방울 사이에 확산을 허용합니다. 배양 접시를 해부 현미경 아래에 놓습니다.과도한 용지를 제거하려면 커버슬립 아래에 섬세한 작업 지우기의 모서리를 삽입합니다. 유리 커버슬립을 위한 충분한 매체를 멀리 하여 가장 큰 고환표면과 접촉할 수 있습니다. 너무 많은 미디어를 제거하고 커버 슬립을 너무 멀리 낮추지 마십시오.이것은 고환에 압력을 가하고 파열하는 원인이 될 수 있습니다. 마지막으로, 고환 바로 위에 유리 커버슬립에 침지 오일 한 방울을 놓습니다. 접시를 뒤집어 현미경 단계에 놓습니다.40 또는 60 X 현미경 목표를 고환 바로 아래에 때까지 오일로 이동합니다. 전송된 빛을 사용하여 단일 고환을 찾아 초점으로 가져옵니다. PBSTx에 8%의 파라포름알데히드의 0.5 밀리리터를 9개의 잘 해부하는 요리 중 한 곳에 놓습니다.유리 파스퇴르 파이펫을 사용하여 고환 의 10개까지 우물로 옮기. 고환이 우물 바닥에 누워 있는지 확인합니다. 20 분 후, PBSTx의 0.5 밀리리터를 포함하는 우물로 고환을 전송합니다.5분간 부드럽게 교반하여 고환을 씻으십시오. 신선한 PBSTx로 새로운 우물에서 두 번 더 세척하십시오. 원고에 설명된 바와 같이 1.5 밀리리터 미세 원심 분리기 튜브에서 1 차 항체의 희석을 준비한다.그런 다음 9 개의 잘 유리 해부 접시에서 튜브로 고환을 옮김시합니다. 부드러운 흔들거나 견과류와 함께 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 튜브를 배양하십시오. 이차 항체로 고환을 염색하는 절차는 유사하다.자세한 내용은 원고를 참조하십시오. 먼저 파스퇴르 파이펫을 사용하여 9개의 웰 플레이트에서 유리 현미경 슬라이드로 고환을 옮김합니다. 필요한 경우 메스 가장자리를 사용하여 고환을 슬라이드 표면으로 밀어 넣습니다.다음으로, 섬세한 작업 닦기의 모서리를 사용하여 고환에서 여분의 액체를 심지하십시오. 가능한 한 많은 액체를 제거하십시오. 그런 다음 고환에 미세 크기 장착 매체의 30~ 50 마이크로리터 드롭을 적용한다.마지막으로, 22mm 커버슬립을 장착 매체의 드롭에 놓습니다. 커버슬립이 정착하도록 하고 장착 매체가 커버슬립 아래에 퍼질 수 있습니다. 필요한 경우 커버슬립에 부드러운 압력을 가하여 과도한 장착 매체를 짜내고 커버슬립이 고환 표면에 놓일 수 있도록 하십시오.이 프로토콜이 성공적으로 실행되면 고환의 셀룰러 조직이 보존되고, 고환의 한쪽 끝에서 다른 쪽 끝으로 세포 분화의 진행이 표시됩니다. 심마세포는 meiosis를 시작하기 위하여 대략 및 메타Phase에 있는 그 확인될 수 있습니다. 이 프로토콜을 사용하여 준비된 고환에서, 살아있는 화상 진찰 분석은 정자 세포를 분할에 있는 폐장 망상 및 마이크로 tubules의 동적 재구성을 보여줍니다.프로토콜에 설명된 바와 같이, 고환이 파열되는 압력을 가하지 않도록 주의를 기울여야 합니다. 정자 세포의 낭종은 파열 된 고환에서 급속히 흐르고, 라이브 타임 경과 이미징을 어렵게 만듭니다. 이 프로토콜은 살아있는, 그대로 조직에 있는 정자를 나누는 화상 진찰에 최적화됩니다.따라서 해부 또는 장착 중에 고환이 손상되지 않는 것이 필수적입니다. 우리의 방법은 또한 세포 분열을 통제하는 동적 세포 프로세스에 새로운 통찰력을 제공하는 구조화된 조명 현미경 검사법과 같은 초해상도 화상 진찰 기술에 적합해야 합니다.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

의 라이브 영상<em&gt; 초파리</em&gt; 번데기 눈

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track ...

연구

발생학

Preparation of Mitochondrial Enriched Fractions for Metabolic Analysis in Drosophila

Preparation of Mitochondrial Enriched Fractions for Metabolic Analysis in Drosophila

대사 분석을위한 미토콘드리아 농축 분획의 제조<em&gt; 초파리</em

Since mitochondria play roles in amino acid metabolism, carbohydrate metabolism and fatty acid oxidation, defects in mitochondrial function often ...

Observing Mitotic Division and Dynamics in a Live Zebrafish Embryo

라이브 Zebrafish의 배아에서 유사 분열 부문 및 역학을 관찰

Mitosis is critical for organismal growth and differentiation. The process is highly dynamic and requires ordered events to accomplish proper chromatin ...

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

생체 외에서 라이브 셀 이미징의 접합 자 양극 화와 애기 thaliana 패터 닝 태아 난 재배

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

Mouse Secondary Palate Fusion의 라이브 이미징

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue

Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue

라이브 초파리 난소 조직에 여 포 줄기 세포 계보의 이미징 세포내 pH에 대 한 방법

Changes in intracellular pH (pHi) play important roles in the regulation of many cellular functions, including metabolism, proliferation, and ...

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

해 부와 초파리 번데기 난소의 얼룩

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a ...

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

Immunohistochemistry, 서쪽 분석 및 RNA 격리에 대 한 초파리 번데기 망막의 해 부

The Drosophila pupal retina provides an excellent model system for the study of morphogenetic processes during development. In this paper, we present a ...

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

초파리 배아에서 근육 수축의 라이브 이미징 및 분석

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits ...

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

푸팔 단계 동안 개발 초파리 에피텔리아에서 조직 방향 과 성장 역학의 이미징 및 분석

Within multicellular organisms, mature tissues and organs display high degrees of order in the spatial arrangements of their constituent cells. A ...