Name: preparation of drosophila larval and pupal testes for analysis of cell division in live, intact tissue
Uploaded: 2020-05-19T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av Forsvarsdepartementets oppstartsmidler til J.T.S.

1. Klargjør dyr, verktøy og medier for disseksjon
<ol><li>Cross mannlige og kvinnelige fluer for å få avkom av ønsket genotype. Nyttige transgene markører for identifisering og iscenesettelse av meiotiske spermatocytter inkluderer GFP-tubulin for å merke meiotisk spindel og RFP-histone 2A for å merke krosomer8. Bruk fem til ti hunner per kors og vedlikehold kors på standard flymat i hetteglass i en 25 °C inkubator til tredje instar larver begynner å krype opp på sidene av hetteglasse...

<ol>
	<li>Khodjakov, A., Rieder, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+division+process+in+living+tissue+culture+cells.">Imaging the division process in living tissue culture cells.</a> Methods. 38 (1), 2-16 (2006).</li><li>Ong, J. Y., Torres, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+mechanisms+of+cell+division.">Dissecting the mechanisms of cell division.</a> The Journal of Biological Chemistry. 294 (30), 11382-11390 (2019).</li><li>Levine, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cycling+through+development.">Cell cycling through development.</a> Development. 131 (10), 2241-2246 (2004).</li><li>Gross, S. M., Rotwein, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unraveling+Growth+Factor+Signaling+and+Cell+Cycle+Progression+in+Individual+Fibroblasts.">Unraveling Growth Factor Signaling and Cell Cycle Progression in Individual Fibroblasts.</a> The Journal of Biological Chemistry. 291 (28), 14628-14638 (2016).</li><li>Mittelman, D., Wilson, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fractured+genome+of+HeLa+cells.">The fractured genome of HeLa cells.</a> Genome Biology. 14 (4), 111 (2013).</li><li>Bury, L., Coelho, P. A., Glover, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+Meiosis+to+Mitosis:+The+Astonishing+Flexibility+of+Cell+Division+Mechanisms+in+Early+Mammalian+Development.">From Meiosis to Mitosis: The Astonishing Flexibility of Cell Division Mechanisms in Early Mammalian Development.</a> Current Topics in Developmental Biology. 120, 125-171 (2016).</li><li>Giansanti, M. G., Fuller, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+Drosophila+spermatocytes+tell+us+about+the+mechanisms+underlying+cytokinesis.">What Drosophila spermatocytes tell us about the mechanisms underlying cytokinesis.</a> Cytoskeleton. 69 (11), 869-881 (2012).</li><li>Karabasheva, D., Smyth, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel,+dynein-independent+mechanism+focuses+the+endoplasmic+reticulum+around+spindle+poles+in+dividing+Drosophila+spermatocytes.">A novel, dynein-independent mechanism focuses the endoplasmic reticulum around spindle poles in dividing Drosophila spermatocytes.</a> Scientific Reports. 9 (1), 12456 (2019).</li><li>Polevoy, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+roles+for+the+Drosophila+PI+4-kinase+four+wheel+drive+in+localizing+Rab11+during+cytokinesis.">Dual roles for the Drosophila PI 4-kinase four wheel drive in localizing Rab11 during cytokinesis.</a> Journal of Cell Biology. 187 (6), 847-858 (2009).</li><li>Rebollo, E., Llamazares, S., Reina, J., Gonzalez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+noncentrosomal+microtubules+to+spindle+assembly+in+Drosophila+spermatocytes.">Contribution of noncentrosomal microtubules to spindle assembly in Drosophila spermatocytes.</a> PLoS Biology. 2 (1), 8 (2004).</li><li>Smyth, J. T., Schoborg, T. A., Bergman, Z. J., Riggs, B., Rusan, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proper+symmetric+and+asymmetric+endoplasmic+reticulum+partitioning+requires+astral+microtubules.">Proper symmetric and asymmetric endoplasmic reticulum partitioning requires astral microtubules.</a> Open Biology. 5 (8), (2015).</li><li>Demarco, R. S., Eikenes, &. #. 1. 9. 7. ;. H., Haglund, K., Jones, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+spermatogenesis+in+Drosophila+melanogaster.">Investigating spermatogenesis in Drosophila melanogaster.</a> Methods. 68 (1), 218-227 (2014).</li><li>Fuller, M. T., Bate, M., Martinez-Arias, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Development of Drosophila melanogaster. , 71-147 (1993).</li><li>Dunleavy, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cell+Cycle+Timing+of+Centromeric+Chromatin+Assembly+in+Drosophila+Meiosis+Is+Distinct+from+Mitosis+Yet+Requires+CAL1+and+CENP-C.">The Cell Cycle Timing of Centromeric Chromatin Assembly in Drosophila Meiosis Is Distinct from Mitosis Yet Requires CAL1 and CENP-C.</a> PLOS Biology. 10 (12), 1001460 (2012).</li><li>Fabian, L., Brill, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+spermiogenesis:+Big+things+come+from+little+packages.">Drosophila spermiogenesis: Big things come from little packages.</a> Spermatogenesis. 2 (3), 197-212 (2012).</li><li>Ramm, S. A., Scharer, L., Ehmcke, J., Wistuba, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sperm+competition+and+the+evolution+of+spermatogenesis.">Sperm competition and the evolution of spermatogenesis.</a> Molecular Human Reproduction. 20 (12), 1169-1179 (2014).</li><li>Savoian, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopy+Methods+for+Analysis+of+Spindle+Dynamics+in+Meiotic+Drosophila+Spermatocytes.">Microscopy Methods for Analysis of Spindle Dynamics in Meiotic Drosophila Spermatocytes.</a> Methods in Molecular Biology. 1471, 265-276 (2017).</li><li>Sitaram, P., Hainline, S. G., Lee, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytological+analysis+of+spermatogenesis:+live+and+fixed+preparations+of+Drosophila+testes.">Cytological analysis of spermatogenesis: live and fixed preparations of Drosophila testes.</a> Journal of Visualized Experiments. (83), e51058 (2014).</li><li>Zamore, P. D., Ma, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Drosophila+melanogaster+testes.">Isolation of Drosophila melanogaster testes.</a> Journal of Visualized Experiments. (51), (2011).</li><li>Lerit, D. A., Plevock, K. M., Rusan, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+Drosophila+larval+neuroblasts.">Live imaging of Drosophila larval neuroblasts.</a> Journal of Visualized Experiments. (89), (2014).</li><li>Belloni, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+Cog7+affect+Golgi+structure,+meiotic+cytokinesis+and+sperm+development+during+Drosophila+spermatogenesis.">Mutations in Cog7 affect Golgi structure, meiotic cytokinesis and sperm development during Drosophila spermatogenesis.</a> Journal of Cell Science. 125 (22), 5441-5452 (2012).</li><li>Harel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistence+of+major+nuclear+envelope+antigens+in+an+envelope-like+structure+during+mitosis+in+Drosophila+melanogaster+embryos.">Persistence of major nuclear envelope antigens in an envelope-like structure during mitosis in Drosophila melanogaster embryos.</a> Journal of Cell Science. 94 (3), 463-470 (1989).</li><li>Katsani, K. R., Karess, R. E., Dostatni, N., Doye, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+dynamics+of+Drosophila+nuclear+envelope+components.">In vivo dynamics of Drosophila nuclear envelope components.</a> Mol Biol Cell. 19 (9), 3652-3666 (2008).</li><li>Tates, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cytodifferentiation during spermatogenesis in Drosophila melanogaster: An electron microscope study. , (1971).</li><li>Gartner, S. M., Rathke, C., Renkawitz-Pohl, R., Awe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+culture+of+Drosophila+pupal+testis+and+single+male+germ-line+cysts:+dissection,+imaging,+and+pharmacological+treatment.">Ex vivo culture of Drosophila pupal testis and single male germ-line cysts: dissection, imaging, and pharmacological treatment.</a> Journal of Visualized Experiments. (91), 51868 (2014).</li><li>Ohkura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiosis:+an+overview+of+key+differences+from+mitosis.">Meiosis: an overview of key differences from mitosis.</a> Cold Spring Harbor perspectives in biology. 7 (5), (2015).</li><li>Friedman, J. R., Webster, B. M., Mastronarde, D. N., Verhey, K. J., Voeltz, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ER+sliding+dynamics+and+ER-mitochondrial+contacts+occur+on+acetylated+microtubules.">ER sliding dynamics and ER-mitochondrial contacts occur on acetylated microtubules.</a> Journal of Cell Biology. 190 (3), 363-375 (2010).</li><li>Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methanol-acetone+fixation+of+Drosophila+testes.">Methanol-acetone fixation of Drosophila testes.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (10), 1270-1272 (2011).</li><li>Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paraformaldehyde+fixation+of+Drosophila+testes.">Paraformaldehyde fixation of Drosophila testes.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (1), 102-104 (2012).</li></ol>

Vi har beskrevet en protokoll for fremstilling av larval eller tidlig pupal Drosophila testiklene, optimalisert for langsiktig, levende avbildning av spermatocyte celledeling. Dette er en kraftig metode for analyse av celledeling i den fysiologiske konteksten av intakt vev. Kraften i denne metoden utvides ytterligere når den kombineres med drosofilgenetiske verktøy, for eksempel spesifikke genmutasjoner, vevsspesifikk RNAi-mediert undertrykkelse og fluorescerende merkede protein- og organellemarkører...

Celledeling studeres ofte ved hjelp av cellelinjer dyrket i kultur1. Mens vi har fått et vell av uvurderlig innsikt og forståelse av grunnleggende mekanismer fra disse studiene2, celler dyrket i kultur kan ikke fullt ut rekapitulere fysiologien til celledeling som det oppstår i intakt, levende vev. For eksempel, i intakt vev og organer, celler må dele på rett sted og til rett tid slik at avkom celler er riktig plassert i vevet, slik at de kan gjennomgå passende differensiering eller funksjonelle programmer, og slik at cellespredning er riktig koordinert med vevvekst eller homeostase3. For celler dyrket i kultur derimot, er celledeling generelt regulert av vekstfaktorer i kulturmediet4, og dermed kan vi ikke lære av disse cellene hvordan vivo miljøfaktorer som vevarkitektur eller utviklingssignaler påvirker divisjonsprosessen. Det er også viktig å merke seg at mange av cellelinjene som brukes til å studere celledeling, som HeLa og U2OS-celler, ble avledet fra metastatiske svulster5. Derfor har mange aspekter ved den grunnleggende fysiologien til disse kreftcellene, som cellesyklusregulatoriske mekanismer og kromosomstabilitet, sannsynligvis blitt endret sammenlignet med friske celler. Fullstendig forståelse av celledelingsfysiologi avhenger derfor av vår evne til å studere skilleceller i sitt opprinnelige, in vivo-miljøer som bevarer fysiologiske regulatoriske mekanismer og vevsarkitektur.
Fremskritt i å forstå hvordan celledeling opererer innenfor intakt vev og organer er hemmet av vanskeligheter som er iboende for in vivo eller ex vivo analyse. For det første kan det være vanskelig eller umulig å få tilgang til skilleceller for mikroskopisk analyse i store organer eller tykt vev. For det andre er det ofte vanskelig å forutsi når individuelle celler vil dele seg in vivo. For det tredje kan vevsfysiologi raskt forverres under ex vivo-kulturen. I denne protokollen beskriver vi lett tilgjengelige metoder for levende og fast analyse av Drosophila melanogaster spermatocytes som de gjennomgår meiotiske celledivisjoner innenfor helt intakte testikler. Disse cellene er ideelle for live, ex vivo analyse fordi de er lett tilgjengelig med standard optiske metoder som konfokal mikroskopi, de deler seg på forutsigbare tider og steder, og intakte testiklene kan opprettholdes i ex vivo kultur for opptil ca 24 timer. I tillegg er Drosophila spermatocytes store runde celler (ca. 20–30 μm i diameter) som ikke endrer form når de deler seg, noe som gjør dem ideelle for høy oppløsning, tidsforløpsavbildning av cellulære komponenter som spindelapparatet og cytoplasmatiske organeller. Selv om disse cellene gjennomgår meiose i motsetning til mitose, er mange av de essensielle celledelingsprosessene svært like mellom disse to celledelingsmekanismene6. Disse fordelene, kombinert med kraftige Drosophila genetiske verktøy, har gjort Drosophila spermatocytes en mye brukt modell for ex vivo analyse av essensielle celledeling prosesser inkludert spindel dannelse og regulering, cytokinese, og organelle remodeling og partisjonering7,8,9,10,11.
Spermatocytter er celler som er på det meiotiske stadiet av spermatogenese. I Drosophilabegynner spermatogenese med en gruppe kimline stamceller som ligger i en liten region eller "hub" på en pol av testis12,13. Disse cellene deler seg ved en asymmetrisk mitose, noe som gir opphav til et enkelt differensiert spermatogonium. Spermatogonia gjennomgår deretter fire synkrone mitoseer for å produsere en gruppe på 16 celler som forblir nært forbundet i en enkelt cyste. På dette stadiet, cellene overgang fra en mitotisk til en meiotisk celle syklus og er referert til som spermatocytes. Spermatocytter tilbringer omtrent to til tre dager i et utvidet G2-stadium av cellesyklusen, der de vokser dramatisk og gjennomgår cytologiske endringer i forberedelse til de to meiotiske divisjonene og påfølgende spermiogenese13,14. Hele gruppen av 16 spermatocytter i en enkelt cyste går deretter inn i den første meiotiske divisjonen samtidig. Dermed kan flere meiotiske spermatocytter avbildes samtidig som de fortsetter gjennom celledeling. Den første meiotiske divisjonen fortsetter for ca 1,5 timer og følges nesten umiddelbart av den andre meiotiske divisjonen, noe som gir 64 totale spermatider som fortsetter å differensiere til modne spermatozoa.
En unik fordel ved å bruke spermatocytter til å studere celledeling i levende, intakt vev er at grupper eller cyster av celler stadig utvikler seg gjennom de forskjellige stadiene av spermatogenese, og celler i alle stadier av spermatogenese kan vanligvis identifiseres i en gitt testis (se figur 3A). Derfor er det relativt enkelt å finne meiotiske celler i hele testiklene. Vi fokuserer generelt våre analyser på den første i motsetning til andre meiose fordi disse cellene er mye større og mer mottagelige for høyoppløselig bildebehandling, men hele prosessen som omfatter begge meiotiske divisjoner kan bli avbildet. Det bør også bemerkes at den generelle protokollen for testis forberedelse og kultur kan brukes til å analysere andre prosesser av spermatogenese også, for eksempel den tidligere mitotiske stamcelle eller spermatogonial divisjoner eller cytologiske endringer som oppstår som spermatids modnes i spermatozoa15. Mange av disse aspektene av spermatogenese er svært bevart mellom Drosophila og mennesker16.
Drosophila spermatocytes begynner å nå den meiotiske fasen av spermatogenese under den tredje instar larval stadium av Drosophila utvikling13. Derfor kan testiklene isolert fra livssyklusstadier som begynner med tredje instar larver og inkludert pupper og voksne brukes til analyse av å dele spermatocytter. Flere gode protokoller er tilgjengelige for utvinning av testiklene fra voksne mannlige fluer for levende og fast analyse av spermatogenese17,18,19. Disse protokollene kan være å foretrekke for å studere sene stadier av spermatogenese eller hvis genetiske markører som bare er synlige hos voksne, må brukes. Protokollen fokuserer i stedet på testis forberedelse fra larver og tidlig pupae, fordi testiklene på disse stadiene har flere fordeler som er spesielt relevant for celledelinganalyse ved høy oppløsning, tidsforløpmikroskopi. For det første er testiklene fra larver og pupper mindre enn de fra voksne, og cellene i orgelet er mindre overfylte. På grunn av dette kan deling av spermatocytter ofte avbildes nær den ytre overflaten av larvetestikler, uten å måtte trenge gjennom flere lag med lysspredningsvev. For det andre beveger voksne testikler seg rytmisk på grunn av sammentrekninger av de vedlagte tilbehørsorganene, og disse bevegelsene gjør tidsforløpsavbildning av individuelle celler utfordrende. Og for det tredje er larvaltestiklere fordelaktige når de studerer genmutasjoner som forårsaker pupal eller voksen dødelighet. Våre metoder er optimalisert for langsiktig kultur av testikler på mikroskopstadiet, noe som gjør det mulig å bilde av flere runder med celledeling eller utviklingen av individuelle celler gjennom flere stadier av spermatogenese i samme preparat. Vi beskriver også en protokoll for fiksering og immunfarging av hele testikler. Samlet sett er våre protokoller spesielt nyttige for de som er interessert i å studere celledeling i intakt vev, og evnen til å kombinere spermatocytteranalyse med svært tractable Drosophila genetiske verktøy gjør dette til en spesielt kraftig tilnærming.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>5&#34; Dissecting Probe</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-965-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5.75&#34; Glass Pasteur Pipet</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-678-20A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP9703-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-20</td>
			<td>Straight forcepts with fine tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frosted Microscope Slides</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-544-2</td>
			<td>Slides for mounting fixed tissue, with frosted writing surface</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halocarbon oil 700</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H8898-100 mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lumox Dish 50</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>SAR946077410</td>
			<td>Gas-permeable tissue culture dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Cover Glass</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-541-B</td>
			<td>22x22 mm, #1.5 glass coverslip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minutien Pins</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26002-15</td>
			<td>Insect pins used to make scalpel tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nickel Plated Pin Holder</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26018-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 32% Solution, EM Grade</td>
			<td>Electron Microsocopy Sciences</td>
			<td>15714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plan Beveled Edge Microscope Slides</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-549-5</td>
			<td>Slides used for dissections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PYREX Spot Plates</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-748B</td>
			<td>9-well glass dissecting dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schneider&#39;s Drosophila medium</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>21720-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Filter, 0.22 &#181;m</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>SLGS033SB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP151-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>H-1000</td>
			<td>Microscopy mounting medium</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of drosophila larval and pupal testes for analysis of cell division in live, intact tissue

Eksperimentell analyse av celler som deler seg i levende, intaktvev og organer er avgjørende for vår forståelse av hvordan celledeling integreres med utvikling, vev homeostase og sykdomsprosesser. Drosophila spermatocytes som gjennomgår meiose er ideelle for denne analysen fordi (1) hele Drosophila testiklene som inneholder spermatocytter er relativt lett å forberede seg på mikroskopi, (2) spermatocytes store størrelse gjør dem godt egnet for høyoppløselig bildebehandling, og (3) kraftige Drosophila genetiske verktøy kan integreres med in vivo analyse. Her presenterer vi en lett tilgjengelig protokoll for fremstilling av hele testikler fra Drosophila tredje instar larver og tidlig pupper. Vi beskriver hvordan du identifiserer meiotic spermatocytes i forberedt hele testiklene og hvordan å bilde dem leve av time-lapse mikroskopi. Protokoller for fiksering og immunfarging av hele testiklene er også gitt. Bruken av larval testiklene har flere fordeler fremfor tilgjengelige protokoller som bruker voksne testiklene for spermatocytter analyse. Viktigst, larval testiklene er mindre og mindre overfylt med celler enn voksne testiklene, og dette forenkler i stor grad høyoppløselig avbildning av spermatocytter. For å demonstrere disse fordelene og anvendelsene av protokollene presenterer vi resultater som viser omfordelingen av endoplasmatisk reticulum med hensyn til spindelmikrotubuli under celledeling i en enkelt spermatocyte avbildet av tidsforløp konfokal mikroskopi. Protokollene kan kombineres med uttrykk for en rekke fluorescerende merkede proteiner eller organelle markører, samt genmutasjoner og andre genetiske verktøy, noe som gjør denne tilnærmingen spesielt kraftig for analyse av celledelingmekanismer i den fysiologiske konteksten av hele vev og organer.

Når denne protokollen utføres, vil testiklene forbli helt intakte for avbildning av konfokal mikroskopi eller andre fluorescensmikroskopimetoder. Som sett i figur 3A, er den cellulære organiseringen av testiklene bevart, og utviklingen av celledifferensiering fra den ene enden av testis til den andre, inkludert spermatogoni, spermatocytter og haploid spermatids er synlig. GFP-tubulin er en nyttig markør for å identifisere skille spermatocytter og for levende avbildning av utviklingen av...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue at JoVE.com

Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

Målet med denne protokollen er å analysere celledeling i intakt vev ved levende og fast cellemikroskopi ved hjelp av Drosophila meiotic spermatocytes. Protokollen demonstrerer hvordan man isolerer hele, intakte testikler fra Drosophila larver og tidlig pupae, og hvordan du behandler og monterer dem for mikroskopi.

Utarbeidelse av Drosophila Larval og Pupal Testiklene for analyse av celledivisjon i Live, intakt vev

Experimental analysis of cells dividing in living, intact tissues and organs is essential to our understanding of how cell division integrates with ...

Denne protokollen kan brukes til å analysere mekanismene for celledeling i sammenheng med levende, intakt vev ved hjelp av fluorescensmikroskopi. Den største fordelen med denne teknikken er at cellenes innfødte fysiologiske miljøer bevares, samtidig som det tillater levende avbildning over lange tidskurs. Den viktigste delen av denne teknikken er å sørge for at testiklene ikke blir skadet under disseksjon eller montering.Dette er en ferdighet som er ervervet med litt tid og praksis. Visuell demonstrasjon av denne metoden er kritisk, fordi den viser hvordan man identifiserer og isolerer testiklene, og hvordan du monterer dem for avbildning uten å skade vevet. Forbered dyr, verktøy og medier som beskrevet i manuskriptet.Før du begynner disseksjonen, bruk den mediefylte filtersprøyten til å utvise tre dråper medier hver 50 mikroliter øverst, midt i og nederst på et glasssklie. Ved hjelp av en dissekeringssonde, overfør fem til 10 tredje instar larver eller tidlig pupper til den øverste dråpe medier på lysbildet. Rør forsiktig larver og pupper i media med disseksjonsproben for å fjerne mat eller rusk.Bruk disseksjonssonden til å slå en enkelt larver eller pupper på siden. Se etter de to bilaterale testiklene som vises som gjennomskinnelige ovale strukturer på den bakre tredjedelen av kroppen. Dyr som mangler testiklene er kvinnelige, og bør kastes.Når en mannlig larver eller pupper er funnet og er ren, flytt den til den andre mediedråpen. Gjenta til tre eller fire mannlige larver eller pupper har blitt overført til den andre mediedråpen. Deretter arbeider i den andre dråpe medier, ta tak i et enkelt dyr med et par tang på midten av regionen, bare fremre til testiklene.Bruk et par tang til å rive dyret forsiktig i to. Bruk et par tang, hold den bakre enden av dyret nede på glasslysbildet. Starter like ved siden av tangen, trykk ned på skjellaget ved hjelp av kanten av skalpellen.Flytt skalpellen mot den kuttede enden av dyret. Dette vil utvise dyrets indre organer, som inkluderer guts, fett kropper, og testiklene. Testiklene er fargeløse og nesten gjennomsiktige ovale organer innebygd i bånd av fettkropp.Erte forsiktig testiklene fra resten av organene. For å overføre testiklene en om gangen, sett kanten av skalpell under fettkroppen, løft vevet ut av media, og flytt det raskt til den tredje dråpen. Hvis det ikke er nok fett kropp fortsatt festet til testiklene for å løfte vevet med skalpell bruke et glass Pasteur pipette som har blitt prewetted med disseksjon medium.Arbeider i den tredje dråpe medium, bruk den skarpe enden av skalpellen til å forsiktig skjære bort overflødig fettkropp fra testiklene, og etterlater bare en liten kant fettkropp rundt kantene. Bruk først filtersprøyten til å deponere en enkelt dråpe Schneiders medium om lag 30 mikroliter på midten av en 50 millimeter gassgjennomtrengelig kulturrett. Bruk skalpellen verktøyet eller en forwetted Pasteur pipette overføre opptil fem av de forberedte testiklene til dråpe på parabolen.Deretter bruker du skalpellverktøyet til å forsiktig skyve testiklene ned på gassgjennomtrengelig membran, og inn i midten av dråpen av medium. Bruk en en milliliter sprøyte, legg fire dråper halokarbonolje på gassgjennomtrengelig membran rundt dråpe medium. Plasseringen av dråpene skal tilsvare de fire hjørnene av en 22 millimeter klasse coverlip.Juster deretter hjørnene på en 22 millimeter glassdeksler med de fire dråpene halokarbonolje og senk forsiktig dekkglasset på media og olje. La dekkslipsen bosette seg, og for mediene som inneholder testiklene, sprer du seg mellom oljedråpene. Plasser kulturretten under et dissekerende mikroskop.For å fjerne overflødige medier, sett inn hjørnet av en delikat oppgave tørk under dekkslippen. Vek bort nok medier til glassdekslepperen til å bare komme i kontakt med overflaten av de største testisene. Ikke fjern for mye media og senk dekkglasset for langt.Dette vil utøve press på testiklene og kan føre til at de brister. Til slutt legger du en dråpe nedsenkingsolje på glassdeksleglasset like over testiklene. Snu parabolen, og legg den på mikroskopstadiet.Flytt 40- eller 60 X-mikroskopmålet inn i oljen til det er like under testiklene. Bruk overført lys for å finne en enkelt testis og bringe den i fokus. Plasser 0,5 milliliter med 8% paraformaldehyd i PBSTx i en brønn av en ni godt dissekere tallerken.Bruk et glass Pasteur pipette for å overføre opptil 10 av testiklene til brønnen. Sørg for at testiklene ligger på bunnen av brønnen. Etter 20 minutter overfører du testiklene til en brønn som inneholder 0,5 milliliter PBSTx.Vask testiklene ved å røre forsiktig i fem minutter. Vask to ganger til i nye brønner med fersk PBSTx. Forbered en fortynning av primærantistoffet i et 1,5 milliliter mikrocentrifugerør som beskrevet i manuskriptet.Deretter overføre testiklene fra ni brønnglass dissekere parabolen til røret. Inkuber røret over natten ved fire grader Celsius med mild gynge eller nutation. Prosedyren for farging av testiklene med det sekundære antistoffet er lik.Se manuskriptet for detaljer. Først, ved hjelp av en Pasteur pipette, overføre testiklene fra ni brønnplaten til et glassmikroskopisklie. Bruk om nødvendig kanten av skalpellen til å skyve testiklene ned på overflaten av lysbildet.Deretter bruker du hjørnet av en delikat oppgavesletting for å transportere bort overflødig væske fra testiklene. Fjern så mye væske som mulig. Påfør deretter en 30 til 50 mikroliter dråpe mikroskopimonteringsmedium til testiklene.Til slutt, plasser en 22 millimeter dekkerlip på dråpe monteringsmedium. La dekksglasset sette seg, og monteringsmediet sprer seg under dekkslippen. Om nødvendig, påfør forsiktig trykk på dekkslipsen for å klemme ut overflødig monteringsmedium og la dekkglasset hvile på overflaten av testiklene.Når denne protokollen utføres, beholdes den cellulære organiseringen av testiklene, og utviklingen av cellediensiasjon fra den ene enden av testisen til den andre er synlig. Spermatocytter i ferd med å begynne meiose og de i metafase kan identifiseres. I testiklene utarbeidet ved hjelp av denne protokollen, viser live imaging analyse den dynamiske omorganiseringen av endoplasmaisk reticulum og mikrotubuli i å dele spermatocytter.Som beskrevet i protokollen, må det være stor forsiktighet å ikke bruke trykk som fører til at testiklene brister. Cyster av spermatocytter strømmer raskt ut av en sprukket testis, noe som gjør live tid bortfalle avbildning vanskelig. Denne protokollen er optimalisert for bildeavbildning som deler spermatocytter i levende, intakt vev.Derfor er det viktig at testiklene ikke blir skadet under disseksjon eller montering. Vår metode bør også være egnet for superoppløsningsbildeteknikker, for eksempel strukturert belysningsmikroskopi, som gir ny innsikt i dynamiske subcellulære prosesser som styrer celledeling.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Live-avbildning av<em&gt; Drosophila</em&gt; Pupal Eye

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track ...

Preparation of Mitochondrial Enriched Fractions for Metabolic Analysis in Drosophila

Preparation of Mitochondrial Enriched Fractions for Metabolic Analysis in Drosophila

Utarbeidelse av mitokondriell beriket Fraksjoner for Metabolsk analyse i<em&gt; Drosophila</em

Since mitochondria play roles in amino acid metabolism, carbohydrate metabolism and fatty acid oxidation, defects in mitochondrial function often ...

Observing Mitotic Division and Dynamics in a Live Zebrafish Embryo

Observerer Mitotisk divisjon og Dynamics i en Live Sebrafisk Embryo

Mitosis is critical for organismal growth and differentiation. The process is highly dynamic and requires ordered events to accomplish proper chromatin ...

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

In Vitro Ovule dyrking for Live-celle Imaging av zygoten polarisering og Embryo mønstre Arabidopsis thaliana

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue

Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue

Metoder for Imaging intracellulær pH i hårsekken stamcelleforskningen slektslinje i Live Drosophila Ovarian vev

Changes in intracellular pH (pHi) play important roles in the regulation of many cellular functions, including metabolism, proliferation, and ...

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

Disseksjon og flekker av Drosophila Pupal eggstokkene

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a ...

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

Disseksjon av Drosophila Pupal netthinnen for Immunohistochemistry, Western analyse og RNA isolasjon

The Drosophila pupal retina provides an excellent model system for the study of morphogenetic processes during development. In this paper, we present a ...

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Live Imaging og analyse av muskelsammentrekninger i Drosophila embryo

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits ...