Name: preparation of drosophila larval and pupal testes for analysis of cell division in live, intact tissue
Uploaded: 2020-05-19T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado por fundos iniciais do Departamento de Defesa para J.T.S.

1. Prepare animais, ferramentas e mídia para dissecação
<ol><li>Cruze moscas machos e fêmeas para obter a descendência do genótipo desejado. Marcadores transgênicos úteis para identificação e estadiamento de espermatocitos meióticos incluem gfp-tubulina para rotular o fuso meiótico e rfp-histona 2A para rotular cromossomos8. Use de cinco a dez fêmeas por cruz e mantenha cruzes em alimentos de mosca padrão em frascos em uma incubadora de 25 °C até que as larvas instar terceiros co...

<ol>
	<li>Khodjakov, A., Rieder, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+division+process+in+living+tissue+culture+cells.">Imaging the division process in living tissue culture cells.</a> Methods. 38 (1), 2-16 (2006).</li><li>Ong, J. Y., Torres, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+mechanisms+of+cell+division.">Dissecting the mechanisms of cell division.</a> The Journal of Biological Chemistry. 294 (30), 11382-11390 (2019).</li><li>Levine, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cycling+through+development.">Cell cycling through development.</a> Development. 131 (10), 2241-2246 (2004).</li><li>Gross, S. M., Rotwein, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unraveling+Growth+Factor+Signaling+and+Cell+Cycle+Progression+in+Individual+Fibroblasts.">Unraveling Growth Factor Signaling and Cell Cycle Progression in Individual Fibroblasts.</a> The Journal of Biological Chemistry. 291 (28), 14628-14638 (2016).</li><li>Mittelman, D., Wilson, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fractured+genome+of+HeLa+cells.">The fractured genome of HeLa cells.</a> Genome Biology. 14 (4), 111 (2013).</li><li>Bury, L., Coelho, P. A., Glover, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+Meiosis+to+Mitosis:+The+Astonishing+Flexibility+of+Cell+Division+Mechanisms+in+Early+Mammalian+Development.">From Meiosis to Mitosis: The Astonishing Flexibility of Cell Division Mechanisms in Early Mammalian Development.</a> Current Topics in Developmental Biology. 120, 125-171 (2016).</li><li>Giansanti, M. G., Fuller, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+Drosophila+spermatocytes+tell+us+about+the+mechanisms+underlying+cytokinesis.">What Drosophila spermatocytes tell us about the mechanisms underlying cytokinesis.</a> Cytoskeleton. 69 (11), 869-881 (2012).</li><li>Karabasheva, D., Smyth, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel,+dynein-independent+mechanism+focuses+the+endoplasmic+reticulum+around+spindle+poles+in+dividing+Drosophila+spermatocytes.">A novel, dynein-independent mechanism focuses the endoplasmic reticulum around spindle poles in dividing Drosophila spermatocytes.</a> Scientific Reports. 9 (1), 12456 (2019).</li><li>Polevoy, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+roles+for+the+Drosophila+PI+4-kinase+four+wheel+drive+in+localizing+Rab11+during+cytokinesis.">Dual roles for the Drosophila PI 4-kinase four wheel drive in localizing Rab11 during cytokinesis.</a> Journal of Cell Biology. 187 (6), 847-858 (2009).</li><li>Rebollo, E., Llamazares, S., Reina, J., Gonzalez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+noncentrosomal+microtubules+to+spindle+assembly+in+Drosophila+spermatocytes.">Contribution of noncentrosomal microtubules to spindle assembly in Drosophila spermatocytes.</a> PLoS Biology. 2 (1), 8 (2004).</li><li>Smyth, J. T., Schoborg, T. A., Bergman, Z. J., Riggs, B., Rusan, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proper+symmetric+and+asymmetric+endoplasmic+reticulum+partitioning+requires+astral+microtubules.">Proper symmetric and asymmetric endoplasmic reticulum partitioning requires astral microtubules.</a> Open Biology. 5 (8), (2015).</li><li>Demarco, R. S., Eikenes, &. #. 1. 9. 7. ;. H., Haglund, K., Jones, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+spermatogenesis+in+Drosophila+melanogaster.">Investigating spermatogenesis in Drosophila melanogaster.</a> Methods. 68 (1), 218-227 (2014).</li><li>Fuller, M. T., Bate, M., Martinez-Arias, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Development of Drosophila melanogaster. , 71-147 (1993).</li><li>Dunleavy, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cell+Cycle+Timing+of+Centromeric+Chromatin+Assembly+in+Drosophila+Meiosis+Is+Distinct+from+Mitosis+Yet+Requires+CAL1+and+CENP-C.">The Cell Cycle Timing of Centromeric Chromatin Assembly in Drosophila Meiosis Is Distinct from Mitosis Yet Requires CAL1 and CENP-C.</a> PLOS Biology. 10 (12), 1001460 (2012).</li><li>Fabian, L., Brill, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+spermiogenesis:+Big+things+come+from+little+packages.">Drosophila spermiogenesis: Big things come from little packages.</a> Spermatogenesis. 2 (3), 197-212 (2012).</li><li>Ramm, S. A., Scharer, L., Ehmcke, J., Wistuba, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sperm+competition+and+the+evolution+of+spermatogenesis.">Sperm competition and the evolution of spermatogenesis.</a> Molecular Human Reproduction. 20 (12), 1169-1179 (2014).</li><li>Savoian, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopy+Methods+for+Analysis+of+Spindle+Dynamics+in+Meiotic+Drosophila+Spermatocytes.">Microscopy Methods for Analysis of Spindle Dynamics in Meiotic Drosophila Spermatocytes.</a> Methods in Molecular Biology. 1471, 265-276 (2017).</li><li>Sitaram, P., Hainline, S. G., Lee, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytological+analysis+of+spermatogenesis:+live+and+fixed+preparations+of+Drosophila+testes.">Cytological analysis of spermatogenesis: live and fixed preparations of Drosophila testes.</a> Journal of Visualized Experiments. (83), e51058 (2014).</li><li>Zamore, P. D., Ma, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Drosophila+melanogaster+testes.">Isolation of Drosophila melanogaster testes.</a> Journal of Visualized Experiments. (51), (2011).</li><li>Lerit, D. A., Plevock, K. M., Rusan, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+Drosophila+larval+neuroblasts.">Live imaging of Drosophila larval neuroblasts.</a> Journal of Visualized Experiments. (89), (2014).</li><li>Belloni, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+Cog7+affect+Golgi+structure,+meiotic+cytokinesis+and+sperm+development+during+Drosophila+spermatogenesis.">Mutations in Cog7 affect Golgi structure, meiotic cytokinesis and sperm development during Drosophila spermatogenesis.</a> Journal of Cell Science. 125 (22), 5441-5452 (2012).</li><li>Harel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistence+of+major+nuclear+envelope+antigens+in+an+envelope-like+structure+during+mitosis+in+Drosophila+melanogaster+embryos.">Persistence of major nuclear envelope antigens in an envelope-like structure during mitosis in Drosophila melanogaster embryos.</a> Journal of Cell Science. 94 (3), 463-470 (1989).</li><li>Katsani, K. R., Karess, R. E., Dostatni, N., Doye, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+dynamics+of+Drosophila+nuclear+envelope+components.">In vivo dynamics of Drosophila nuclear envelope components.</a> Mol Biol Cell. 19 (9), 3652-3666 (2008).</li><li>Tates, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cytodifferentiation during spermatogenesis in Drosophila melanogaster: An electron microscope study. , (1971).</li><li>Gartner, S. M., Rathke, C., Renkawitz-Pohl, R., Awe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+culture+of+Drosophila+pupal+testis+and+single+male+germ-line+cysts:+dissection,+imaging,+and+pharmacological+treatment.">Ex vivo culture of Drosophila pupal testis and single male germ-line cysts: dissection, imaging, and pharmacological treatment.</a> Journal of Visualized Experiments. (91), 51868 (2014).</li><li>Ohkura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiosis:+an+overview+of+key+differences+from+mitosis.">Meiosis: an overview of key differences from mitosis.</a> Cold Spring Harbor perspectives in biology. 7 (5), (2015).</li><li>Friedman, J. R., Webster, B. M., Mastronarde, D. N., Verhey, K. J., Voeltz, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ER+sliding+dynamics+and+ER-mitochondrial+contacts+occur+on+acetylated+microtubules.">ER sliding dynamics and ER-mitochondrial contacts occur on acetylated microtubules.</a> Journal of Cell Biology. 190 (3), 363-375 (2010).</li><li>Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methanol-acetone+fixation+of+Drosophila+testes.">Methanol-acetone fixation of Drosophila testes.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (10), 1270-1272 (2011).</li><li>Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paraformaldehyde+fixation+of+Drosophila+testes.">Paraformaldehyde fixation of Drosophila testes.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (1), 102-104 (2012).</li></ol>

Descrevemos um protocolo para a preparação de testículos de Drosophila larval ou pupal precoce, otimizados para imagens ao vivo de longo prazo da divisão celular de espermatocitos. Este é um poderoso método de análise da divisão celular no contexto fisiológico do tecido intacto. O poder deste método é ainda mais expandido quando combinado com ferramentas genéticas de Drosophila, como mutações genéticas específicas, supressão mediada por RNAi específica do tecido, e marcadores de prote?...

A divisão celular é frequentemente estudada usando linhas celulares cultivadas na cultura1. Embora tenhamos adquirido uma riqueza de insights inestimáveis e compreensão de mecanismos fundamentais a partir desses estudos2, as células cultivadas na cultura não podem recapitular totalmente a fisiologia da divisão celular como ocorre em tecido vivo intacto. Por exemplo, em tecidos e órgãos intactos, as células devem se dividir no lugar certo e no momento certo para que as células prole estejam adequadamente situadas dentro do tecido, para que possam se submeter a programas de diferenciação ou funcionais adequados, e para que a proliferação celular seja devidamente coordenada com o crescimento tecidual ou a homeostase3. Para as células cultivadas na cultura, por outro lado, a divisão celular é geralmente regulada por fatores de crescimento no meio de cultura4, e, portanto, não podemos aprender com essas células como fatores ambientais in vivo, como arquitetura tecidual ou sinalização de desenvolvimento, influenciam o processo de divisão. Também é importante notar que muitas das linhas celulares usadas para estudar a divisão celular, como as células HeLa e U2OS, foram derivadas de tumores metastáticos5. Portanto, muitos aspectos da fisiologia básica dessas células cancerosas, como mecanismos de regulação do ciclo celular e estabilidade cromossômica, provavelmente foram alterados em comparação com células saudáveis. A compreensão completa da fisiologia da divisão celular, portanto, depende de nossa capacidade de estudar células divisórias em seus ambientes nativos, in vivo, que preservam mecanismos regulatórios fisiológicos e arquitetura tecidual.
Os avanços na compreensão de como a divisão celular opera dentro de tecidos e órgãos intactos são dificultados por dificuldades inerentes à análise in vivo ou ex vivo. Primeiro, pode ser difícil ou impossível acessar células divisórias para análise microscópica dentro de órgãos grandes ou tecidos grossos. Em segundo lugar, muitas vezes é difícil prever quando as células individuais se dividirão in vivo. Em terceiro lugar, a fisiologia do tecido pode se deteriorar rapidamente durante a cultura ex vivo. Neste protocolo, descrevemos métodos facilmente acessíveis para análise viva e fixa de espermatocitos drosophila melanogaster à medida que eles se submetem a divisões de células meióticas dentro de testículos totalmente intactos. Essas células são ideais para análise viva, ex vivo, pois são facilmente acessíveis com métodos ópticos padrão, como microscopia confocal, se dividem em momentos e locais previsíveis, e testículos intactos podem ser mantidos na cultura ex vivo por até cerca de 24h. Além disso, os espermatocitos drosophila são células redondas grandes (aproximadamente 20-30 μm de diâmetro) que não mudam de forma quando se dividem, tornando-os ideais para imagens de alta resolução e lapso de tempo de componentes celulares, como o aparelho de fuso e organelas citoplasmáticas. Embora essas células sejam submetidas à meiose em oposição à mitose, muitos dos processos essenciais de divisão celular são muito semelhantes entre esses dois mecanismos de divisão celular6. Essas vantagens, combinadas com poderosas ferramentas genéticas drosophila, tornaram drosophila espermatocitos um modelo amplamente utilizado para a análise ex vivo de processos essenciais de divisão celular, incluindo formação e regulação de fuso, citocinese e remodelação de organela77,8,9,10,11.
Spermatocitos são células que estão no estágio meioático da espermatogênese. Em Drosophila,a espermatogênese começa com um grupo de células-tronco germinais que estão localizadas em uma pequena região ou "hub" em um pólo do testículo12,13. Essas células se dividem por uma mitose assimétrica, dando origem a um único espermatogonium diferenciado. A espermatogonia então se submete a quatro mitoses síncronas para produzir um grupo de 16 células que permanecem intimamente associadas dentro de um único cisto. Nesta fase, as células transitam de um ciclo mitótico para um ciclo celular meiótico e são referidas como espermatocitos. Os espermatocitos passam cerca de dois a três dias em um estágio G2 prolongado do ciclo celular, durante o qual crescem dramaticamente e sofrem alterações citológicas na preparação para as duas divisões meióticas e posterior esperetriogênese13,14. Todo o grupo de 16 espermatocitos dentro de um único cisto então entram na primeira divisão meiotica ao mesmo tempo. Assim, vários espermatocitos meióticos meioticos podem ser imagemao mesmo, à medida que prosseguem através da divisão celular. A primeira divisão meiótica prossegue por aproximadamente 1,5 h e é seguida quase imediatamente pela segunda divisão meiotica, produzindo 64 espermatozóides totais que passam a se diferenciar em espermatozoides maduros.
Uma vantagem única do uso de espermatocitos para estudar a divisão celular em tecido vivo e intacto é que grupos ou cistos de células progridem constantemente através dos diferentes estágios da espermatogênese, e as células em todos os estágios da espermatogênese geralmente podem ser identificadas em qualquer determinado testículo (ver Figura 3A). Portanto, é relativamente fácil encontrar células meióticas em testículos inteiros. Geralmente focamos nossas análises na primeira em oposição à segunda meiose porque essas células são muito maiores e mais acessíveis a imagens de alta resolução, mas todo o processo que abrange ambas as divisões meióticas pode ser visto com sucesso. Deve-se notar também que o protocolo geral para preparação e cultura de testículos pode ser usado para analisar outros processos de espermatogênese também, como as divisões mitóticas anteriores ou as formas espermagogoniais ou as alterações citológicas que ocorrem à medida que os espermatids amadurecem em espermatozoides15. Muitos desses aspectos da espermatogênese são altamente conservados entre drosophila e humanos16.
Os espermatocitos drosophila começam a atingir a fase meiótica da espermatogênese durante o terceiro estágio larval instar do desenvolvimento da Drosophila 13. Portanto, testículos isolados dos estágios do ciclo de vida começando com a terceira larva instar e incluindo pupas e adultos podem ser usados para análise de espermatocitos divisórias. Vários protocolos excelentes estão disponíveis para extração de testículos de moscas machos adultas para análise viva e fixa da espermatogênese17,18,19. Esses protocolos podem ser preferíveis para estudar estágios tardios da espermatogênese ou se marcadores genéticos que só são visíveis em adultos devem ser usados. O protocolo se concentra, em vez disso, na preparação de testículos de larvas e pupas precoces, pois os testículos nessas fases têm várias vantagens que são especificamente pertinentes à análise de divisão celular por microscopia de alta resolução e lapso de tempo. Primeiro, os testículos de larvas e pupas são menores do que os de adultos, e as células dentro do órgão são menos aglomeradas. Por causa disso, a divisão de espermatocitos pode muitas vezes ser imagem próxima da superfície externa dos testículos larvais, sem ter que penetrar através de múltiplas camadas de tecido disperso de luz. Em segundo lugar, os testículos adultos se movem ritmicamente devido a contrações dos órgãos acessórios ligados, e esses movimentos tornam a imagem de lapso de tempo de células individuais desafiadora. E terceiro, os testículos larvais são vantajosos ao estudar mutações genéticas que causam letalidade pupal ou adulta. Nossos métodos são otimizados para a cultura de longo prazo dos testículos no estágio do microscópio, permitindo a imagem de múltiplas rodadas de divisão celular ou a progressão de células individuais através de múltiplos estágios de espermatogênese na mesma preparação. Também descrevemos um protocolo de fixação e imunocoloração de testículos inteiros. No geral, nossos protocolos são particularmente úteis para os interessados em estudar a divisão celular em tecido intacto, e a capacidade de combinar análise de espermatocitos com ferramentas genéticas drosophila altamente tratáveis faz desta uma abordagem especialmente poderosa.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>5&#34; Dissecting Probe</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-965-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5.75&#34; Glass Pasteur Pipet</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-678-20A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP9703-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-20</td>
			<td>Straight forcepts with fine tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frosted Microscope Slides</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-544-2</td>
			<td>Slides for mounting fixed tissue, with frosted writing surface</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halocarbon oil 700</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H8898-100 mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lumox Dish 50</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>SAR946077410</td>
			<td>Gas-permeable tissue culture dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Cover Glass</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-541-B</td>
			<td>22x22 mm, #1.5 glass coverslip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minutien Pins</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26002-15</td>
			<td>Insect pins used to make scalpel tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nickel Plated Pin Holder</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26018-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 32% Solution, EM Grade</td>
			<td>Electron Microsocopy Sciences</td>
			<td>15714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plan Beveled Edge Microscope Slides</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-549-5</td>
			<td>Slides used for dissections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PYREX Spot Plates</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-748B</td>
			<td>9-well glass dissecting dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schneider&#39;s Drosophila medium</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>21720-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Filter, 0.22 &#181;m</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>SLGS033SB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP151-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>H-1000</td>
			<td>Microscopy mounting medium</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of drosophila larval and pupal testes for analysis of cell division in live, intact tissue

A análise experimental das células que se dividem em tecidos e órgãos vivos e intactos é essencial para nossa compreensão de como a divisão celular se integra com o desenvolvimento, homeostase tecidual e processos de doenças. Os espermatocitos drosophila submetidos a meiose são ideais para esta análise porque (1) testículos de Drosophila inteiros contendo espermatocitos são relativamente fáceis de preparar para a microscopia, (2) o tamanho grande dos espermatocitos os torna adequados para imagens de alta resolução, e (3) poderosas ferramentas genéticas drosophila podem ser integradas com análise viva. Aqui, apresentamos um protocolo facilmente acessível para a preparação de testículos inteiros de larvas de Drosophila terceira instar e pupas precoces. Descrevemos como identificar espermatocitos meióticos em testículos inteiros preparados e como imaginá-los vivendo por microscopia de lapso de tempo. Também são fornecidos protocolos de fixação e imunocoloração de testículos inteiros. O uso de testículos larvais tem várias vantagens sobre os protocolos disponíveis que usam testículos adultos para análise de espermatocitos. Mais importante, os testículos larvais são menores e menos cheios de células do que testículos adultos, e isso facilita muito a imagem de alta resolução de espermatocitos. Para demonstrar essas vantagens e as aplicações dos protocolos, apresentamos resultados mostrando a redistribuição do retículo endoplasmático em relação aos microtúbulos do fuso durante a divisão celular em um único espermatocito, imagem por microscopia confocal de lapso de tempo. Os protocolos podem ser combinados com a expressão de qualquer número de proteínas ou marcadores de organela fluorescentemente marcados, bem como mutações genéticas e outras ferramentas genéticas, tornando esta abordagem especialmente poderosa para a análise de mecanismos de divisão celular no contexto fisiológico de tecidos e órgãos inteiros.

Quando este protocolo for executado com sucesso, os testículos permanecerão totalmente intactos para a imagem por microscopia confocal ou outros métodos de microscopia de fluorescência. Como visto na Figura 3A,a organização celular dos testículos é preservada, e a progressão da diferenciação celular de uma extremidade do testículo para a outra, incluindo espermatogonia, espermatocitos e espermatides haplóides é visível. GFP-tubbulin é um marcador útil para identificar esperm...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue at JoVE.com

Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

O objetivo deste protocolo é analisar a divisão celular em tecido intacto por microscopia celular viva e fixa usando espermatocitos meióticos drosophila. O protocolo demonstra como isolar testículos inteiros e intactos das larvas de Drosophila e pupas primitivas, e como processá-los e montá-los para microscopia.

Preparação de Drosophila Larval e Pupal Testes para Análise de Divisão Celular em Tecido Vivo e Intacto

Experimental analysis of cells dividing in living, intact tissues and organs is essential to our understanding of how cell division integrates with ...

Este protocolo pode ser usado para analisar os mecanismos de divisão celular no contexto do tecido vivo e intacto usando microscopia de fluorescência. A principal vantagem dessa técnica é que os ambientes fisiológicos nativos das células são preservados, ao mesmo tempo em que permitem imagens vivas ao longo de cursos de longa data. A parte mais importante desta técnica é garantir que os testículos não sejam danificados durante a dissecção ou montagem.Esta é uma habilidade que é adquirida com um pouco de tempo e prática. A demonstração visual desse método é fundamental, pois mostra como identificar e isolar os testículos, e como montá-los para imagens sem danificar o tecido. Prepare animais, ferramentas e mídia como descrito no manuscrito.Antes de iniciar a dissecção, use a seringa de filtro preenchida à mídia para expulsar três gotas de mídia cada 50 microliters na parte superior, média e inferior de um slide de vidro. Usando uma sonda dissecando, transfira de 5 a 10 terceiros larvas instar ou pupas precoces para a gota superior de mídia no slide. Agitar suavemente as larvas e pupas na mídia com a sonda dissecando para remover qualquer alimento ou detrito.Use a sonda dissecando para girar uma única larva ou pupae de lado. Procure os dois testículos bilaterais que aparecem como estruturas ovais translúcidas no terço posterior do corpo. Animais que não têm testículos são fêmeas e devem ser descartados.Quando uma larva macho ou pupaé é encontrada e está limpa, mova-a para a segunda gota de mídia. Repita até que três ou quatro larvas machos ou pupas tenham sido transferidas para a segunda gota de mídia. Em seguida, trabalhando na segunda gota de mídia, agarrar um único animal com um par de fórceps em sua região média, apenas antes dos testículos.Use um segundo par de fórceps para arrancar suavemente o animal ao meio. Usando um par de fórceps, segure a extremidade posterior do animal no escorregador de vidro. Começando ao lado dos fórceps, empurre para baixo na cutícula usando a borda do bisturi.Mova o bisturi para a extremidade cortada do animal. Isso expulsará os órgãos internos do animal, que incluem tripas, corpos gordos e testículos. Os testículos são órgãos ovais incolores e quase transparentes embutidos em fitas de corpo gordo.Provoque suavemente os testículos do resto dos órgãos. Para transferir os testículos um de cada vez, insira a borda do bisturi sob o corpo de gordura, levante o tecido para fora da mídia e mova-o rapidamente para a terceira gota. Se não houver corpo de gordura suficiente ainda preso aos testículos para levantar o tecido com o bisturi use uma pipeta pasteur de vidro que foi pré-enfeitigueda com meio de dissecção.Trabalhando na terceira gota de média, use a extremidade afiada do bisturi para cortar suavemente o excesso de gordura do corpo dos testículos, deixando apenas uma pequena borda de corpo gordo ao redor das bordas. Primeiro, use a seringa do filtro para depositar uma única gota do meio de Schneider cerca de 30 microliters no centro de um prato de cultura permeável de 50 milímetros. Usando a ferramenta bisturi ou uma pipeta Pasteur pré-enlatado transfira até cinco dos testículos preparados para a queda no prato.Em seguida, use a ferramenta bisturi para empurrar suavemente os testículos para baixo na membrana permeável do gás, e para o centro da gota de meio. Usando uma seringa de um mililitro, coloque quatro gotas de óleo de halocarbono na membrana permeável do gás em torno da gota de médio. Os locais das gotas devem corresponder aos quatro cantos de uma tampa de classe de 22 milímetros.Em seguida, alinhe os cantos de uma tampa de vidro de 22 milímetros com as quatro gotas de óleo de halocarboneto e abaixe suavemente a mancha de cobertura na mídia e óleo. Deixe que a tampa se instale, e para a mídia que contém os testículos a propagação entre as gotas de óleo. Coloque o prato de cultura sob um microscópio dissecando.Para remover o excesso de mídia, insira o canto de uma tarefa delicada limpar sob a mancha de cobertura. Afasta a mídia suficiente para a tampa de vidro para fazer contato com a superfície do maior testis. Não remova muita mídia e abaixe o deslizamento de tampas muito longe.Isso exercerá pressão sobre os testículos e pode causar a ruptura. Por fim, coloque uma gota de óleo de imersão na tampa de vidro logo acima dos testículos. Vire o prato e coloque-o no palco do microscópio.Mova o objetivo do microscópio de 40 ou 60 X para o óleo até que ele esteja logo abaixo dos testículos. Use a luz transmitida para encontrar um único testis e trazê-lo em foco. Coloque 0,5 mililitros de 8% de paraformaldeído em PBSTx em um poço de um prato de nove bem dissecando.Use uma pipeta pasteur de vidro para transferir até 10 dos testículos para o poço. Certifique-se de que os testículos estão deitados na parte inferior do poço. Após 20 minutos, transfira os testículos para um poço contendo 0,5 mililitros de PBSTx.Lave os testículos agitando suavemente por cinco minutos. Lave mais duas vezes em novos poços com PBSTx fresco. Prepare uma diluição do anticorpo primário em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro, conforme descrito no manuscrito.Em seguida, transfira os testículos do prato de dissecação de vidro de nove poços para o tubo. Incubar o tubo durante a noite a quatro graus Celsius com balanço suave ou nozes. O procedimento para coloração dos testículos com o anticorpo secundário é semelhante.Veja o manuscrito para obter detalhes. Primeiro, usando uma pipeta Pasteur, transfira os testículos da placa de nove poços para um slide de microscopia de vidro. Se necessário, use a borda do bisturi para empurrar os testículos para baixo na superfície do slide.Em seguida, use o canto de uma delicada limpeza de tarefas para afastar o excesso de líquido dos testículos. Remova o máximo de líquido possível. Em seguida, aplique uma gota de 30 a 50 microliter de microscopia de montagem média para os testículos.Por fim, coloque um deslizamento de cobertura de 22 milímetros sobre a gota do meio de montagem. Deixe que a mancha de cobertura se instale e o meio de montagem se espalhe sob a mancha de cobertura. Se necessário, aplique uma pressão suave na tampa para espremer o excesso de montagem média e permitir que a mancha de cobertura repouse sobre a superfície dos testículos.Quando este protocolo é executado com sucesso, a organização celular dos testículos é preservada, e a progressão da diferenciação celular de uma extremidade do test é para a outra é visível. Os espermatotozóides prestes a começar a meiose e os da metafásia podem ser identificados. Em testes preparados por meio deste protocolo, a análise de imagem ao vivo mostra a reorganização dinâmica do ânticulo endoplasmático e micro túbulos na divisão dos espermatocitotas.Como descrito no protocolo, deve-se tomar muito cuidado para não aplicar pressão que faz com que os testículos explodam. Cistos de espermatototos fluem rapidamente de um testíase rompido, dificultando a imagem do lapso de tempo ao vivo. Este protocolo é otimizado para imagens que dividem espermatototas em tecido vivo e intacto.Portanto, é essencial que os testículos não sejam danificados durante a dissecção ou montagem. Nosso método também deve ser adequado para técnicas de imagem de super resolução, como microscopia de iluminação estruturada, fornecendo novas percepções sobre processos subcelulares dinâmicos que regem a divisão celular.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Vivo-imaging da<em&gt; Drosophila</em&gt; Pupal Eye

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track ...

Biologia do Desenvolvimento

Preparation of Mitochondrial Enriched Fractions for Metabolic Analysis in Drosophila

Preparation of Mitochondrial Enriched Fractions for Metabolic Analysis in Drosophila

Preparação de mitocondriais frações enriquecidas para Análise metabólica em<em&gt; Drosophila</em

Since mitochondria play roles in amino acid metabolism, carbohydrate metabolism and fatty acid oxidation, defects in mitochondrial function often ...

Observing Mitotic Division and Dynamics in a Live Zebrafish Embryo

Observando mitótico Division e Dinâmica em um embrião de peixe-zebra ao vivo

Mitosis is critical for organismal growth and differentiation. The process is highly dynamic and requires ordered events to accomplish proper chromatin ...

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

In Vitro Ovule cultivo para viver-pilha de imagem do zigoto polarização e padronização do embrião em Arabidopsis thaliana

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

Imagem ao vivo do mouse Fusão do palato secundário

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue

Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue

Métodos para o pH intracelular Imaging da linhagem de células-tronco do folículo em tecido ovariano de Drosophila

Changes in intracellular pH (pHi) play important roles in the regulation of many cellular functions, including metabolism, proliferation, and ...

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

Dissecção e coloração dos ovários Pupal drosófila

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a ...

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

Dissecação da Retina Pupal drosófila para imuno-histoquímica, análise ocidental e isolamento de RNA

The Drosophila pupal retina provides an excellent model system for the study of morphogenetic processes during development. In this paper, we present a ...

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Imagens ao vivo e análise de contrações musculares no embrião de Drosophila

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits ...