Name: preparation of drosophila larval and pupal testes for analysis of cell division in live, intact tissue
Uploaded: 2020-05-19T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue at JoVE.com

Este trabajo fue apoyado por fondos iniciales del Departamento de Defensa para J.T.S.

1. Preparar animales, herramientas y medios para la disección
<ol><li>Cruz a las moscas macho y hembra para obtener progenie del genotipo deseado. Los marcadores transgénicos útiles para la identificación y puesta en escena de los espermatocitos meióticos incluyen GFP-tubulina para etiquetar el husillo meiotico y RFP-histone 2A para etiquetar los cromomasomas8. Utilice de cinco a diez hembras por cruz y mantenga cruces en alimentos de mosca estándar en viales en una incubadora de 25 oC has...

<ol>
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G., Cenci, G., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paraformaldehyde+fixation+of+Drosophila+testes.">Paraformaldehyde fixation of Drosophila testes.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (1), 102-104 (2012).</li></ol>

Hemos descrito un protocolo para la preparación de testículos de Drosophila pupálida larvales o tempranas, optimizado para imágenes en vivo a largo plazo de la división celular de los espermatozoides. Este es un método poderoso para el análisis de la división celular en el contexto fisiológico del tejido intacto. El poder de este método se expande aún más cuando se combina con herramientas genéticas drosofílicas, como mutaciones genéticas específicas, supresión mediada por ARN específi...

La división celular se estudia a menudo utilizando líneas celulares cultivadas en el cultivo1. Si bien hemos obtenido una gran cantidad de información y comprensión inestimables de los mecanismos fundamentales de estos estudios2, las células cultivadas en el cultivo no pueden recapitular completamente la fisiología de la división celular como ocurre en el tejido vivo intacto. Por ejemplo, en los tejidos y órganos intactos, las células deben dividirse en el lugar correcto y en el momento adecuado para que las células de la progenie estén adecuadamente situadas dentro del tejido, de modo que puedan someterse a una adecuada diferenciación o programas funcionales, y para que la proliferación celular esté adecuadamente coordinada con el crecimiento tisular o la homeostasis3. En el caso de las células cultivadas en cultivo, por otro lado, la división celular está generalmente regulada por factores de crecimiento en el medio de cultivo4,y por lo tanto no podemos aprender de estas células cómo factores ambientales in vivo como la arquitectura de tejidos o la señalización del desarrollo influyen en el proceso de división. También es importante tener en cuenta que muchas de las líneas celulares utilizadas para estudiar la división celular, como las células HeLa y U2OS, se derivaron de tumores metastásicos5. Por lo tanto, muchos aspectos de la fisiología básica de estas células cancerosas, como los mecanismos reguladores del ciclo celular y la estabilidad cromosómica, probablemente han sido alterados en comparación con las células sanas. La comprensión completa de la fisiología de la división celular, por lo tanto, depende de nuestra capacidad para estudiar células divisorias en sus entornos nativos in vivo que preservan los mecanismos reguladores fisiológicos y la arquitectura de los tejidos.
Los avances en la comprensión de cómo funciona la división celular dentro de los tejidos y órganos intactos se ven obstaculizados por dificultades inherentes al análisis in vivo o ex vivo. En primer lugar, puede ser difícil o imposible acceder a las células divisorias para el análisis microscópico dentro de órganos grandes o tejidos gruesos. En segundo lugar, a menudo es difícil predecir cuándo las células individuales se dividirán in vivo. En tercer lugar, la fisiología tisular puede deteriorarse rápidamente durante el cultivo ex vivo. En este protocolo, describimos métodos fácilmente accesibles para el análisis en vivo y fijo de los espermatocitos Drosophila melanogaster a medida que se someten a divisiones celulares meióticas dentro de testículos totalmente intactos. Estas células son ideales para el análisis vivo y ex vivo porque son fácilmente accesibles con métodos ópticos estándar como la microscopía confocal, se dividen en momentos y ubicaciones predecibles, y los testículos intactos se pueden mantener en cultivo ex vivo durante aproximadamente 24 horas. Además, los espermatocitos Drosophila son células redondas grandes (aproximadamente de 20 a 30 m de diámetro) que no cambian de forma cuando se dividen, por lo que son ideales para imágenes de alta resolución y lapso de tiempo de componentes celulares como el aparato del husillo y los orgánulos citoplasma. Aunque estas células sufren meiosis en comparación con la mitosis, muchos de los procesos esenciales de división celular son muy similares entre estos dos mecanismos de división celular6. Estas ventajas, combinadas con potentes herramientas genéticas Drosophila, han hecho de los espermatocitos Drosophila un modelo ampliamente utilizado para el análisis ex vivo de procesos esenciales de división celular incluyendo la formación y regulación de husillos, la citokinesis, y la remodelación y partición de orgánulos7,,8,9,,10,11.
Los espermacitos son células que se encuentran en la etapa meiótica de la espermatogénesis. En Drosophila,la espermatogénesis comienza con un grupo de células madre germinales que se encuentran en una pequeña región o "hub" en un polo del testículo12,,13. Estas células se dividen por una mitosis asimétrica, dando lugar a un solo espermatogonio diferenciado. Luego, la espermatogonia se somete a cuatro mitosis síncronas para producir un grupo de 16 células que permanecen estrechamente asociadas dentro de un solo quiste. En esta etapa, las células pasan de un ciclo celular mitético a un ciclo celular meiótico y se conocen como espermatocitos. Los espermacitos pasan alrededor de dos a tres días en una etapa G2 extendida del ciclo celular, durante la cual crecen dramáticamente y experimentan cambios citológicos en la preparación para las dos divisiones meióticas y posterior espermiogénesis13,,14. Todo el grupo de 16 espermatocitos dentro de un solo quiste entonces entra en la primera división meiótica al mismo tiempo. Por lo tanto, varios esperamorcitos meióticos se pueden crear imágenes simultáneamente a medida que avanzan a través de la división celular. La primera división meiótica continúa durante aproximadamente 1,5 h y es seguida casi inmediatamente por la segunda división meiótica, produciendo 64 espermatozoides totales que pasan a diferenciarse en espermatozoides maduros.
Una ventaja única de usar espermacitos para estudiar la división celular en vivo, tejido intacto es que los grupos o quistes de las células progresan constantemente a través de las diferentes etapas de la espermatogénesis, y las células en todas las etapas de la espermatogénesis generalmente se pueden identificar en cualquier testículo dado (ver Figura 3A). Por lo tanto, es relativamente fácil encontrar células meióticas en testículos enteros. Por lo general, centramos nuestros análisis en la primera en lugar de la segunda meiosis porque estas células son mucho más grandes y más susceptibles a las imágenes de alta resolución, pero todo el proceso que abarca ambas divisiones meióticas se puede tomar imágenes con éxito. También debe tenerse en cuenta que el protocolo general para la preparación y el cultivo de testículos se puede utilizar para analizar otros procesos de espermatogénesis, así, como la célula madre mitotica anterior o divisiones espermatogoniales o los cambios citológicos que se producen a medida que los espermatozoides maduran en espermatozoides15. Muchos de estos aspectos de la espermatogénesis están muy conservados entre Drosophila y los seres humanos16.
Los espermatocitos drosófilos comienzan a alcanzar la fase meiótica de la espermatogénesis durante la tercera etapa larval instar del desarrollo de Drosophila 13. Por lo tanto, los testículos aislados de las etapas del ciclo de vida a partir de larvas de tercera estrella e incluyendo pupas y adultos se pueden utilizar para el análisis de la división de espermacitos. Varios protocolos excelentes están disponibles para la extracción de testículos de moscas macho adultas para análisis vivos y fijos de espermatogénesis17,18,19. Estos protocolos pueden ser preferibles para estudiar etapas tardías de la espermatogénesis o si se deben utilizar marcadores genéticos que solo son visibles en adultos. El protocolo se centra en cambio en la preparación de testículos a partir de larvas y pupae tempranas, porque los testículos en estas etapas tienen varias ventajas que son específicamente pertinentes para el análisis de la división celular por microscopía de lapso de tiempo de alta resolución. En primer lugar, los testículos de larvas y pusias son más pequeños que los de adultos, y las células dentro del órgano están menos llenas. Debido a esto, los espermismocitos divisorios a menudo se pueden tomar imágenes cerca de la superficie externa de los testículos larvales, sin tener que penetrar a través de múltiples capas de tejido de dispersión de luz. En segundo lugar, los testículos adultos se mueven rítmicamente debido a las contracciones de los órganos accesorios conectados, y estos movimientos hacen que la toma de imágenes de lapso de tiempo de células individuales sea un desafío. Y en tercer lugar, los testículos larvales son ventajosos cuando se estudian mutaciones genéticas que causan letalidad pupal o adulta. Nuestros métodos están optimizados para el cultivo a largo plazo de testículos en la etapa del microscopio, lo que permite la toma de imágenes de múltiples rondas de división celular o la progresión de células individuales a través de múltiples etapas de espermatogénesis en la misma preparación. También describimos un protocolo para la fijación y la inmunomanchación de testículos enteros. En general, nuestros protocolos son particularmente útiles para aquellos interesados en estudiar la división celular en tejido intacto, y la capacidad de combinar el análisis de espermatocitos con herramientas genéticas Drosophila altamente manejables hace de este un enfoque especialmente poderoso.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>5&#34; Dissecting Probe</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-965-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5.75&#34; Glass Pasteur Pipet</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-678-20A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP9703-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-20</td>
			<td>Straight forcepts with fine tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frosted Microscope Slides</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-544-2</td>
			<td>Slides for mounting fixed tissue, with frosted writing surface</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halocarbon oil 700</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H8898-100 mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lumox Dish 50</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>SAR946077410</td>
			<td>Gas-permeable tissue culture dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Cover Glass</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-541-B</td>
			<td>22x22 mm, #1.5 glass coverslip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minutien Pins</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26002-15</td>
			<td>Insect pins used to make scalpel tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nickel Plated Pin Holder</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26018-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 32% Solution, EM Grade</td>
			<td>Electron Microsocopy Sciences</td>
			<td>15714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plan Beveled Edge Microscope Slides</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-549-5</td>
			<td>Slides used for dissections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PYREX Spot Plates</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-748B</td>
			<td>9-well glass dissecting dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schneider&#39;s Drosophila medium</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>21720-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Filter, 0.22 &#181;m</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>SLGS033SB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP151-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>H-1000</td>
			<td>Microscopy mounting medium</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of drosophila larval and pupal testes for analysis of cell division in live, intact tissue

El análisis experimental de las células que se dividen en tejidos y órganos vivos y intactos es esencial para nuestra comprensión de cómo la división celular se integra con el desarrollo, la homeostasis tisular y los procesos de la enfermedad. Los espermatocitos drosofílicos sometidos a meiosis son ideales para este análisis porque (1) los testículos enteros de Drosophila que contienen espermatocitos son relativamente fáciles de preparar para la microscopía, (2) el gran tamaño de los espermatocitos los hace muy adecuados para imágenes de alta resolución, y (3) potentes herramientas genéticas de Drosophila se pueden integrar con el análisis in vivo. Aquí, presentamos un protocolo de fácil acceso para la preparación de testículos enteros de larvas drosophila tercera instar y pupupas tempranas. Describimos cómo identificar esperamorcitos meióticos en testículos enteros preparados y cómo imaginarlos vivir por microscopía de lapso de tiempo. También se proporcionan protocolos para la fijación e inmunostainización de testículos enteros. El uso de testículos larvales tiene varias ventajas sobre los protocolos disponibles que utilizan testículos adultos para el análisis de espermatocitos. Lo más importante es que los testículos larvales son más pequeños y menos llenos de células que los testículos adultos, y esto facilita en gran medida la toma de imágenes de alta resolución de los espermatocitos. Para demostrar estas ventajas y las aplicaciones de los protocolos, presentamos resultados que muestran la redistribución del retículo endoplasmático con respecto a los microtúbulos del husillo durante la división celular en un solo espertacito que se muestra mediante microscopía confocal de lapso de tiempo. Los protocolos se pueden combinar con la expresión de cualquier número de proteínas etiquetadas fluorescentes u marcadores de orgánulos, así como mutaciones genéticas y otras herramientas genéticas, haciendo que este enfoque sea especialmente potente para el análisis de los mecanismos de división celular en el contexto fisiológico de tejidos y órganos enteros.

Cuando este protocolo se ejecuta con éxito, los testículos permanecerán completamente intactos para la toma de imágenes mediante microscopía confocal u otros métodos de microscopía de fluorescencia. Como se ve en la Figura 3A,se preserva la organización celular de los testículos, y la progresión de la diferenciación celular de un extremo del testículo al otro incluyendo espermatogonia, espermatocitos, y espermicidas haploides es visible. La GFP-tubulina es un marcador útil para ...

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Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

El objetivo de este protocolo es analizar la división celular en tejido intacto mediante microscopía celular viva y fija utilizando esperamorcitos meióticos Drosophila. El protocolo demuestra cómo aislar testículos enteros e intactos de larvas de Drosophila y pusias tempranas, y cómo procesarlos y montarlos para microscopía.

Preparación de pruebas de larvas y pupales de Drosophila para el análisis de la división celular en vivo, tejido intacto

Experimental analysis of cells dividing in living, intact tissues and organs is essential to our understanding of how cell division integrates with ...

Este protocolo se puede utilizar para analizar los mecanismos de división celular en el contexto del tejido vivo e intacto utilizando microscopía de fluorescencia. La principal ventaja de esta técnica es que se conservan los entornos fisiológicos nativos de las células, al tiempo que se permiten imágenes en vivo durante cursos de mucho tiempo. La parte más importante de esta técnica es asegurarse de que los testículos no están dañados durante la disección o montaje.Esta es una habilidad que se adquiere con un poco de tiempo y práctica. La demostración visual de este método es crítica, ya que muestra cómo identificar y aislar los testículos, y cómo montarlos para la toma de imágenes sin dañar el tejido. Preparar animales, herramientas y medios como se describe en el manuscrito.Antes de comenzar la disección, utilice la jeringa de filtro llena de medios para expulsar tres gotas de soporte cada 50 microlitros en la parte superior, media e inferior de un portaobjetos de vidrio. Usando una sonda de disección, transfiera de cinco a 10 larvas instar o pupas tempranas a la gota superior de medios en el portaobjetos. Agitar suavemente las larvas y pupas en los medios con la sonda de disección para eliminar cualquier alimento o escombros.Utilice la sonda de disección para girar una sola larva o pupae de lado. Busque los dos testículos bilaterales que aparecen como estructuras ovaladas translúcidas en el tercio posterior del cuerpo. Los animales que carecen de testículos son hembras y deben desecharse.Cuando se encuentre una larva o pupa macho y esté limpio, muévalo a la segunda gota de medios. Repita hasta que tres o cuatro larvas masculinas o pupas hayan sido transferidas a la segunda gota de medios. Luego, trabajando en la segunda gota de medios, agarra un solo animal con un par de fórceps en su región media, justo antes de los testículos.Use un segundo par de fórceps para desgarrar suavemente al animal por la mitad. Usando un par de fórceps, sostenga el extremo posterior del animal hacia abajo en el portaobjetos de vidrio. Comenzando justo al lado de los fórceps, empuje hacia abajo en la cutícula usando el borde del bisturí.Mueva el bisturí hacia el extremo cortado del animal. Esto expulsará los órganos internos del animal, que incluyen las tripas, los cuerpos gordos y los testículos. Los testículos son órganos ovalados incoloros y casi transparentes incrustados en cintas de cuerpo graso.Separe suavemente los testículos del resto de los órganos. Para transferir los testículos de uno en uno, inserte el borde del bisturí debajo del cuerpo graso, levante el tejido fuera del medio y muévalo rápidamente a la tercera gota. Si no hay suficiente cuerpo de grasa todavía unido a los testículos para levantar el tejido con el bisturí, utilice una pipeta Pasteur de vidrio que se ha prewetted con medio de disección.Trabajando en la tercera gota de medio, utilice el extremo afilado del bisturí para cortar suavemente el exceso de grasa del cuerpo de los testículos, dejando sólo un pequeño borde de cuerpo de grasa alrededor de los bordes. En primer lugar, utilice la jeringa del filtro para depositar una sola gota del medio de Schneider alrededor de 30 microlitros en el centro de un plato de cultivo permeable al gas de 50 milímetros. Usando la herramienta de bisturí o una pipeta Pasteur preequipada transfiera hasta cinco de los testículos preparados a la gota en el plato.A continuación, utilice la herramienta de bisturí para empujar suavemente los testículos hacia abajo sobre la membrana permeable al gas, y en el centro de la gota de medio. Con una jeringa de un mililitro, coloque cuatro gotas de aceite de halocarbono en la membrana permeable al gas que rodea la caída del medio. Las ubicaciones de las gotas deben corresponder a las cuatro esquinas de un cubreobjetos de clase de 22 milímetros.A continuación, alinee las esquinas de un cubreobjetos de vidrio de 22 milímetros con las cuatro gotas de aceite de halocarbono y baje suavemente el cubreobjetos sobre el medio y el aceite. Deje que el cubreobjetos se asiente, y para los medios que contienen los testículos el spread entre las gotas de aceite. Coloque el plato de cultivo bajo un microscopio de disección.Para eliminar el exceso de medios, inserte la esquina de una delicada limpieza de tareas debajo del cubreobjetos. Wick lejos suficientes medios para el cubreobjetos de vidrio para simplemente hacer contacto con la superficie de los testículos más grandes. No retire demasiados medios y baje el cubreobjetos demasiado lejos.Esto ejercerá presión sobre los testículos y puede hacer que se rompan. Por último, coloque una gota de aceite de inmersión en el cubreobjetos de vidrio justo encima de los testículos. Dé la vuelta al plato y colóquelo en la etapa del microscopio.Mueva el objetivo del microscopio de 40 o 60 X al aceite hasta que esté justo debajo de los testículos. Utilice la luz transmitida para encontrar un solo testículo y enfocarlo en el foco. Coloque 0,5 mililitros de 8%paraformaldehído en PBSTx en un pozo de un plato de nueve pozos diseccionados.Utilice una pipeta Pasteur de vidrio para transferir hasta 10 de los testículos al pozo. Asegúrese de que los testículos están acostados en la parte inferior del pozo. Después de 20 minutos, transfiera los testículos a un pozo que contenga 0,5 mililitros de PBSTx.Lave los testículos agitando suavemente durante cinco minutos. Lavar dos veces más en nuevos pozos con PBSTx fresco. Preparar una dilución del anticuerpo primario en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros como se describe en el manuscrito.A continuación, transfiera los testículos de la placa de disección de vidrio de nueve pozos al tubo. Incubar el tubo durante la noche a cuatro grados centígrados con suave balanceo o nuez. El procedimiento para tinr los testículos con el anticuerpo secundario es similar.Consulte el manuscrito para obtener más información. En primer lugar, con una pipeta Pasteur, transfiera los testículos de la placa de nueve pozos a un portaobjetos de vidrio. Si es necesario, utilice el borde del bisturí para empujar los testículos hacia abajo sobre la superficie de la diapositiva.A continuación, utilice la esquina de una delicada toallita de tarea para eliminar el exceso de líquido de los testículos. Retire la mayor cantidad de líquido posible. A continuación, aplique una caída de 30 a 50 microlitros del medio de montaje de la microscopía a los testículos.Por último, coloque un cubreobjetos de 22 milímetros en la caída del medio de montaje. Deje que el cubreobjetos se asiente, y el medio de montaje se extienda debajo del cubreobjetos. Si es necesario, aplique una presión suave en el cubreobjetos para exprimir el exceso de medio de montaje y deje reposar el cubreobjetos sobre la superficie de los testículos.Cuando este protocolo se ejecuta correctamente, se conserva la organización celular de los testículos y la progresión de la diferenciación celular de un extremo del testículo al otro es visible. Los esperocitos a punto de comenzar la meiosis y los de la metafase pueden ser identificados. En los testículos preparados con este protocolo, el análisis de imágenes en vivo muestra la reorganización dinámica del retículo endoplasmático y los micro túbulos en la división de los esperatocitos.Como se describe en el protocolo, se debe tener mucho cuidado de no aplicar presión que haga que los testículos estallen. Los quistes de espermatozoides fluyen rápidamente de un testículo roto, lo que dificulta la toma de imágenes de lapso de tiempo en vivo. Este protocolo está optimizado para la división de imágenes de espermatozoides en tejido vivo e intacto.Por lo tanto, es esencial que los testículos no se dañen durante la disección o montaje. Nuestro método también debe ser adecuado para técnicas de imágenes de superrescía, como la microscopía de iluminación estructurada, proporcionando nuevos conocimientos sobre los procesos subcelulares dinámicos que rigen la división celular.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

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Live-proyección de imagen de la<em&gt; Drosophila</em&gt; Pupal Ojo

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Investigación

Biología del Desarrollo

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Preparación de mitocondriales enriquecidos fracciones de Análisis metabólico en<em&gt; Drosophila</em

Since mitochondria play roles in amino acid metabolism, carbohydrate metabolism and fatty acid oxidation, defects in mitochondrial function often ...

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Mitosis is critical for organismal growth and differentiation. The process is highly dynamic and requires ordered events to accomplish proper chromatin ...

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