Name: preparation of drosophila larval and pupal testes for analysis of cell division in live, intact tissue
Uploaded: 2020-05-19T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue at JoVE.com

Bu çalışma Savunma Bakanlığı'nın J.T.S.'ye verdiği başlangıç fonları tarafından desteklendi.

1. Diseksiyon için Hayvanları, Araçları ve Medyayı Hazırlayın
<ol><li>Çapraz erkek ve kadın istenilen genotip atasını elde etmek için uçar. Meyotik spermatositlerin tanımlanması ve evrelemesi için yararlı transgenik belirteçler, kromozomlarıetiketlemekiçin GFP-tubulin ve rfp-histon 2A'yı etiketlemek için kromozom8 içerir. Çapraz başına beş ila on kadın kullanın ve üçüncü yıldız larvaları şişenin kenarlarında (4-5 gün) sürünmeye başlayana kadar 25 °C'li...

<ol>
	<li>Khodjakov, A., Rieder, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+division+process+in+living+tissue+culture+cells.">Imaging the division process in living tissue culture cells.</a> Methods. 38 (1), 2-16 (2006).</li><li>Ong, J. Y., Torres, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+mechanisms+of+cell+division.">Dissecting the mechanisms of cell division.</a> The Journal of Biological Chemistry. 294 (30), 11382-11390 (2019).</li><li>Levine, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cycling+through+development.">Cell cycling through development.</a> Development. 131 (10), 2241-2246 (2004).</li><li>Gross, S. M., Rotwein, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unraveling+Growth+Factor+Signaling+and+Cell+Cycle+Progression+in+Individual+Fibroblasts.">Unraveling Growth Factor Signaling and Cell Cycle Progression in Individual Fibroblasts.</a> The Journal of Biological Chemistry. 291 (28), 14628-14638 (2016).</li><li>Mittelman, D., Wilson, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fractured+genome+of+HeLa+cells.">The fractured genome of HeLa cells.</a> Genome Biology. 14 (4), 111 (2013).</li><li>Bury, L., Coelho, P. A., Glover, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+Meiosis+to+Mitosis:+The+Astonishing+Flexibility+of+Cell+Division+Mechanisms+in+Early+Mammalian+Development.">From Meiosis to Mitosis: The Astonishing Flexibility of Cell Division Mechanisms in Early Mammalian Development.</a> Current Topics in Developmental Biology. 120, 125-171 (2016).</li><li>Giansanti, M. G., Fuller, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+Drosophila+spermatocytes+tell+us+about+the+mechanisms+underlying+cytokinesis.">What Drosophila spermatocytes tell us about the mechanisms underlying cytokinesis.</a> Cytoskeleton. 69 (11), 869-881 (2012).</li><li>Karabasheva, D., Smyth, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel,+dynein-independent+mechanism+focuses+the+endoplasmic+reticulum+around+spindle+poles+in+dividing+Drosophila+spermatocytes.">A novel, dynein-independent mechanism focuses the endoplasmic reticulum around spindle poles in dividing Drosophila spermatocytes.</a> Scientific Reports. 9 (1), 12456 (2019).</li><li>Polevoy, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+roles+for+the+Drosophila+PI+4-kinase+four+wheel+drive+in+localizing+Rab11+during+cytokinesis.">Dual roles for the Drosophila PI 4-kinase four wheel drive in localizing Rab11 during cytokinesis.</a> Journal of Cell Biology. 187 (6), 847-858 (2009).</li><li>Rebollo, E., Llamazares, S., Reina, J., Gonzalez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+noncentrosomal+microtubules+to+spindle+assembly+in+Drosophila+spermatocytes.">Contribution of noncentrosomal microtubules to spindle assembly in Drosophila spermatocytes.</a> PLoS Biology. 2 (1), 8 (2004).</li><li>Smyth, J. T., Schoborg, T. A., Bergman, Z. J., Riggs, B., Rusan, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proper+symmetric+and+asymmetric+endoplasmic+reticulum+partitioning+requires+astral+microtubules.">Proper symmetric and asymmetric endoplasmic reticulum partitioning requires astral microtubules.</a> Open Biology. 5 (8), (2015).</li><li>Demarco, R. S., Eikenes, &. #. 1. 9. 7. ;. H., Haglund, K., Jones, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+spermatogenesis+in+Drosophila+melanogaster.">Investigating spermatogenesis in Drosophila melanogaster.</a> Methods. 68 (1), 218-227 (2014).</li><li>Fuller, M. T., Bate, M., Martinez-Arias, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Development of Drosophila melanogaster. , 71-147 (1993).</li><li>Dunleavy, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cell+Cycle+Timing+of+Centromeric+Chromatin+Assembly+in+Drosophila+Meiosis+Is+Distinct+from+Mitosis+Yet+Requires+CAL1+and+CENP-C.">The Cell Cycle Timing of Centromeric Chromatin Assembly in Drosophila Meiosis Is Distinct from Mitosis Yet Requires CAL1 and CENP-C.</a> PLOS Biology. 10 (12), 1001460 (2012).</li><li>Fabian, L., Brill, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+spermiogenesis:+Big+things+come+from+little+packages.">Drosophila spermiogenesis: Big things come from little packages.</a> Spermatogenesis. 2 (3), 197-212 (2012).</li><li>Ramm, S. A., Scharer, L., Ehmcke, J., Wistuba, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sperm+competition+and+the+evolution+of+spermatogenesis.">Sperm competition and the evolution of spermatogenesis.</a> Molecular Human Reproduction. 20 (12), 1169-1179 (2014).</li><li>Savoian, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopy+Methods+for+Analysis+of+Spindle+Dynamics+in+Meiotic+Drosophila+Spermatocytes.">Microscopy Methods for Analysis of Spindle Dynamics in Meiotic Drosophila Spermatocytes.</a> Methods in Molecular Biology. 1471, 265-276 (2017).</li><li>Sitaram, P., Hainline, S. G., Lee, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytological+analysis+of+spermatogenesis:+live+and+fixed+preparations+of+Drosophila+testes.">Cytological analysis of spermatogenesis: live and fixed preparations of Drosophila testes.</a> Journal of Visualized Experiments. (83), e51058 (2014).</li><li>Zamore, P. D., Ma, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Drosophila+melanogaster+testes.">Isolation of Drosophila melanogaster testes.</a> Journal of Visualized Experiments. (51), (2011).</li><li>Lerit, D. A., Plevock, K. M., Rusan, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+Drosophila+larval+neuroblasts.">Live imaging of Drosophila larval neuroblasts.</a> Journal of Visualized Experiments. (89), (2014).</li><li>Belloni, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+Cog7+affect+Golgi+structure,+meiotic+cytokinesis+and+sperm+development+during+Drosophila+spermatogenesis.">Mutations in Cog7 affect Golgi structure, meiotic cytokinesis and sperm development during Drosophila spermatogenesis.</a> Journal of Cell Science. 125 (22), 5441-5452 (2012).</li><li>Harel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistence+of+major+nuclear+envelope+antigens+in+an+envelope-like+structure+during+mitosis+in+Drosophila+melanogaster+embryos.">Persistence of major nuclear envelope antigens in an envelope-like structure during mitosis in Drosophila melanogaster embryos.</a> Journal of Cell Science. 94 (3), 463-470 (1989).</li><li>Katsani, K. R., Karess, R. E., Dostatni, N., Doye, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+dynamics+of+Drosophila+nuclear+envelope+components.">In vivo dynamics of Drosophila nuclear envelope components.</a> Mol Biol Cell. 19 (9), 3652-3666 (2008).</li><li>Tates, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cytodifferentiation during spermatogenesis in Drosophila melanogaster: An electron microscope study. , (1971).</li><li>Gartner, S. M., Rathke, C., Renkawitz-Pohl, R., Awe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+culture+of+Drosophila+pupal+testis+and+single+male+germ-line+cysts:+dissection,+imaging,+and+pharmacological+treatment.">Ex vivo culture of Drosophila pupal testis and single male germ-line cysts: dissection, imaging, and pharmacological treatment.</a> Journal of Visualized Experiments. (91), 51868 (2014).</li><li>Ohkura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiosis:+an+overview+of+key+differences+from+mitosis.">Meiosis: an overview of key differences from mitosis.</a> Cold Spring Harbor perspectives in biology. 7 (5), (2015).</li><li>Friedman, J. R., Webster, B. M., Mastronarde, D. N., Verhey, K. J., Voeltz, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ER+sliding+dynamics+and+ER-mitochondrial+contacts+occur+on+acetylated+microtubules.">ER sliding dynamics and ER-mitochondrial contacts occur on acetylated microtubules.</a> Journal of Cell Biology. 190 (3), 363-375 (2010).</li><li>Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methanol-acetone+fixation+of+Drosophila+testes.">Methanol-acetone fixation of Drosophila testes.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (10), 1270-1272 (2011).</li><li>Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paraformaldehyde+fixation+of+Drosophila+testes.">Paraformaldehyde fixation of Drosophila testes.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (1), 102-104 (2012).</li></ol>

Spermatosit hücre bölünmesinin uzun süreli canlı görüntülemesi için optimize edilmiş larva veya erken pupal Drosophila testislerinin hazırlanması için bir protokol tanımladık. Bu bozulmamış doku fizyolojik bağlamında hücre bölünmesi analizi için güçlü bir yöntemdir. Bu yöntemin gücü, spesifik gen mutasyonları, dokuya özgü RNAi aracılı baskılama ve floresan olarak etiketlenmiş protein ve organel belirteçleri gibi Drosophila genetik araçlarıyla birleştirildiğinde ...

Hücre bölünmesi genellikle kültür1yetiştirilen hücre hatları kullanılarak incelenir. Biz bu çalışmalardan temel mekanizmaların paha biçilmez bir anlayış ve anlayış zenginliği kazanmış olsa da2, kültürde yetiştirilen hücreler tam olarak bozulmamış, canlı doku oluşur gibi hücre bölünmesi fizyolojisi özetlemek olamaz. Örneğin, bozulmamış doku ve organlarda, hücreler doğru yerde ve doğru zamanda bölmek gerekir, böylece döl hücreleri düzgün doku içinde yer, böylece uygun farklılaşma veya fonksiyonel programlar geçirebilir, ve böylece hücre çoğalması düzgün doku büyüme veya homeostaz ile koordine edilir3. Öte yandan kültürde yetişen hücreler için hücre bölünmesi genellikle kültür ortamı4'tekibüyüme faktörleri tarafından düzenlenir ve bu nedenle doku mimarisi veya gelişimsel sinyalizasyon gibi canlı çevresel faktörlerin bölünme sürecini nasıl etkilediğini bu hücrelerden öğrenemeyiz. HeLa ve U2OS hücreleri gibi hücre bölünmesini incelemek için kullanılan hücre hatlarının birçoğunun metastatik tümörlerden elde edildiğini belirtmek de önemlidir5. Bu nedenle, bu kanser hücrelerinin temel fizyolojisi birçok yönü, hücre döngüsü düzenleyici mekanizmalar ve kromozomal stabilite gibi, büyük olasılıkla sağlıklı hücrelere göre değiştirilmiştir. Hücre bölünmesi fizyolojisinin tam olarak anlaşılması, bu nedenle, fizyolojik düzenleyici mekanizmaları ve doku mimarisini koruyan, yerli, in vivo ortamlarda bölen hücreleri inceleme yeteneğimize bağlıdır.
Hücre bölünmesinin bozulmamış doku ve organlar da nasıl işlediğini anlamadaki gelişmeler, in vivo veya ex vivo analizine doğal zorluklar nedeniyle engellenir. İlk olarak, büyük organlar veya kalın dokular içinde mikroskobik analiz için bölen hücrelere erişmek zor veya imkansız olabilir. İkinci olarak, genellikle tek tek hücrelerin in vivo bölmek ne zaman tahmin etmek zordur. Üçüncü olarak, doku fizyolojisi hızla ex vivo kültür sırasında bozulabilir. Bu protokolde, Drosophila melanogaster spermatositlerin tam bozulmamış testisler içinde meyotik hücre bölünmeleri geçirerek canlı ve sabit analizi için kolayca erişilebilir yöntemleri açıklıyoruz. Bu hücreler canlı, ex vivo analiz için idealdir çünkü konfokal mikroskopi gibi standart optik yöntemlerle kolayca erişilebilirler, öngörülebilir zamanlarda ve konumlarda bölünürler ve bozulmamış testisler ex vivo kültüründe yaklaşık 24 saate kadar muhafaza edilebilir. Buna ek olarak, Drosophila spermatositler büyük yuvarlak hücrelerdir (yaklaşık 20-30 μm çapında) bölündüklerinde şekil değiştirmeyen, onları yüksek çözünürlükte, mil aparatı ve sitoplazmik organeller gibi hücresel bileşenlerin hızlandırılmış görüntülemesi için ideal hale getirir. Bu hücreler mitoz yerine meyozis geçmesine rağmen, temel hücre bölünmesi süreçlerinin çoğu bu iki hücre bölünmesi mekanizmaları arasında çok benzer6. Bu avantajlar, güçlü Drosophila genetik araçları ile birlikte, Drosophila spermatositler mil oluşumu ve düzenleme, sitokinenzis ve organel remodeling ve bölümleme7dahil olmak üzere temel hücre bölünmesi süreçlerinin ex vivo analizi için yaygın olarak kullanılan bir model yaptık7 ,8,9,10,11.
Spermatositler spermatogenezin meyotik evresinde olan hücrelerdir. Drosophilayılında, spermatogenez testis bir kutup küçük bir bölgede veya "hub" bulunan germline kök hücrelerin bir grup ile başlar12,13. Bu hücreler asimetrik bir mitoz bölünme, tek bir farklılaştırılmış spermatogonium yol açan. Spermatogonia sonra tek bir kist içinde yakından ilişkili kalır 16 hücrebir grup üretmek için dört senkron mitoz geçmesi. Bu aşamada hücreler mitotikten meyotik hücre döngüsüne geçiş tevesyetik olarak adlandırılırlar. Spermatositler hücre döngüsünün genişletilmiş bir G2 aşamasında yaklaşık iki ila üç gün geçirmek, sırasında onlar dramatik büyümek ve iki meiyotik bölünmeler ve sonraki spermiyogenez için hazırlık sitolojik değişikliklere uğrar13,14. Tek bir kist içinde 16 spermatosit tüm grup daha sonra aynı anda ilk meyotik bölünme girin. Böylece, birkaç meyotik spermatosit hücre bölünmesi ile devam ederken aynı anda görüntülenebilir. İlk meyotik bölünme yaklaşık 1,5 saat devam eder ve hemen ikinci meyotik bölünme tarafından takip edilir, olgun spermatozoa içine ayırt etmek için devam 64 toplam spermatidler verim.
Canlı hücre bölünmesi ni incelemek için spermatosit kullanmanın eşsiz bir avantajı, bozulmamış doku grupları nın veya hücrelerin kistlerinin spermatogenezin farklı aşamalarında sürekli ilerlemeleri dir ve spermatogenezin tüm aşamalarındaki hücreler genellikle herhangi bir testiste tanımlanabilir (Bkz. Şekil 3A). Bu nedenle, tüm testislerde meyotik hücreleri bulmak nispeten kolaydır. Bu hücreler yüksek çözünürlüklü görüntülemeye çok daha büyük ve daha elverişli olduğu için genellikle analizlerimizi ikinci meyozisyerine ilkine odaklarız, ancak her iki meyyotik bölümü de kapsayan tüm süreç başarılı bir şekilde görüntülenebilir. Ayrıca testis hazırlık ve kültür için genel protokol spermatogenez diğer süreçleri analiz etmek için de kullanılabilir unutulmamalıdır, önceki mitotik kök hücre veya spermatogonial bölünmeler veya spermatidler spermatozoa içine olgun olarak meydana gelen sitolojik değişiklikler gibi15. Spermatogenezbu yönlerinin çoğu drosophila ve insanlar arasında son derece korunur16.
Drosophila spermatositler Drosophila gelişiminin üçüncü instar larva evresi sırasında spermatogenezin meziyotik fazulaşmaya başlar13. Bu nedenle, üçüncü instar larvaları ile başlayan ve pupa ve yetişkinler de dahil olmak üzere yaşam döngüsü aşamalarından izole testisler spermatositlerin bölünmesi analizi için kullanılabilir. Spermatogenez17,18,,19canlı ve sabit analiz için yetişkin erkek sinekler testislerinin çıkarılması için çeşitli mükemmel protokoller mevcuttur. Bu protokoller spermatogenezin geç evrelerinin incelenmesi veya sadece yetişkinlerde görülebilen genetik belirteçlerin kullanılması gerekiyorsa tercih edilebilir. Protokol bunun yerine larvave erken pupadan testis hazırlığına odaklanır, çünkü bu aşamalarda testislerin özellikle yüksek çözünürlüklü, hızlandırılmış mikroskopi ile hücre bölünmesi analizine uygun çeşitli avantajları vardır. İlk olarak, larva ve pupa testisleri yetişkinlerden daha küçüktür ve organ içindeki hücreler daha az kalabalıktır. Bu nedenle, spermatositlerin bölünmesi genellikle larva testislerinin dış yüzeyine yakın, ışık saçılma dokusunun birden fazla katmanından nüfuz etmek zorunda kalmadan görüntülenebilir. İkinci olarak, erişkin testisler bağlı aksesuar organların kasılmaları nedeniyle ritmik hareket, ve bu hareketler bireysel hücrelerin zaman atlamalı görüntüleme zor olun. Ve üçüncüsü, larva testisleri pupal veya erişkin öldürücüye neden olan gen mutasyonlarını incelerken avantajlıdır. Yöntemlerimiz mikroskop aşamasında testislerin uzun vadeli kültür için optimize edilmiştir, hücre bölünmesi birden fazla tur görüntüleme veya aynı hazırlık spermatogenez birden fazla aşamada bireysel hücrelerin ilerlemesi için izin. Ayrıca tüm testislerin fiksasyonu ve immünboyması için bir protokol uyguluyoruz. Genel olarak, protokollerimiz özellikle bozulmamış dokuda hücre bölünmesi eğitimi almak isteyenler için yararlıdır ve spermatosit analizini yüksek derecede çekici Drosophila genetik araçlarıyla birleştirme yeteneği bu özellikle güçlü bir yaklaşım dır.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>5&#34; Dissecting Probe</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-965-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5.75&#34; Glass Pasteur Pipet</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-678-20A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP9703-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-20</td>
			<td>Straight forcepts with fine tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frosted Microscope Slides</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-544-2</td>
			<td>Slides for mounting fixed tissue, with frosted writing surface</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halocarbon oil 700</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H8898-100 mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lumox Dish 50</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>SAR946077410</td>
			<td>Gas-permeable tissue culture dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Cover Glass</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-541-B</td>
			<td>22x22 mm, #1.5 glass coverslip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minutien Pins</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26002-15</td>
			<td>Insect pins used to make scalpel tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nickel Plated Pin Holder</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26018-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 32% Solution, EM Grade</td>
			<td>Electron Microsocopy Sciences</td>
			<td>15714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plan Beveled Edge Microscope Slides</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-549-5</td>
			<td>Slides used for dissections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PYREX Spot Plates</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-748B</td>
			<td>9-well glass dissecting dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schneider&#39;s Drosophila medium</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>21720-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Filter, 0.22 &#181;m</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>SLGS033SB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP151-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>H-1000</td>
			<td>Microscopy mounting medium</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of drosophila larval and pupal testes for analysis of cell division in live, intact tissue

Hücre bölünmesinin canlı, bozulmamış doku ve organlarda bölünmesi, hücre bölünmesinin gelişim, doku homeostazları ve hastalık süreçleri ile nasıl bütünleşiştüğünün anlaşılması için deneysel analizler gereklidir. (1) spermatosit içeren tüm Drosophila testisleri nispeten mikroskopi için hazırlamak kolay, çünkü meyozis geçiren Drosophila spermatositler bu analiz için idealdir, (2) spermatositlerin büyük boyutu onları iyi yüksek çözünürlüklü görüntüleme için uygun hale getirir, ve (3) güçlü Drosophila genetik araçları in vivo analizi ile entegre edilebilir. Burada, Drosophila üçüncü instar larvaları ve erken pupa tüm testislerin hazırlanması için kolayca erişilebilir bir protokol sıyoruz. Hazırlanan tüm testislerde meyotik spermatositlerin nasıl tanımlanabileceğimizi ve zaman atlamalı mikroskopi ile nasıl görüntülenebileceğimizi anlatıyoruz. Fiksasyon ve immünboyama tüm testisler için protokoller de sağlanmaktadır. Larva testislerinin kullanımı, spermatosit analizi nde yetişkin testislerini kullanan mevcut protokollere göre çeşitli avantajlara sahiptir. En önemlisi, larva testisleri erişkin testislere göre hücrelerle daha küçük ve daha az kalabalıktır ve bu spermatositlerin yüksek çözünürlüklü görüntülemesini büyük ölçüde kolaylaştırır. Bu avantajları ve protokollerin uygulamalarını göstermek için, zaman atlamalı konfokal mikroskopi ile görüntülenmiş tek bir spermatositte hücre bölünmesi sırasında iğ mikrotübüllerine göre endoplazmik retikulumun yeniden dağılımını gösteren sonuçlar sayılmaktadır. Protokoller floresan etiketli proteinler veya organel belirteçleri herhangi bir sayı ifadesi ile kombine edilebilir, yanı sıra gen mutasyonları ve diğer genetik araçlar, bu yaklaşım özellikle tüm doku ve organların fizyolojik bağlamında hücre bölünmesi mekanizmalarının analizi için güçlü hale.

Bu protokol başarıyla yürütüldüğünde, testisler konfokal mikroskopi veya diğer floresan mikroskopi yöntemleri ile görüntüleme için tamamen bozulmadan kalacaktır. Şekil 3A'dagörüldüğü gibi testislerin hücresel organizasyonu korunur ve hücre farklılaşmasının testisin bir ucundan spermatogonia, spermatositler ve haploid spermatidler gibi diğer ucuna ilerlemesi görülebilir. GFP-tubulin spermatositlerin bölünmesini belirlemek ve hücrelerin meyozis yoluyla ilerleme...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue at JoVE.com

Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

Bu protokolün amacı, Drosophila meyozetik spermatositler kullanarak canlı ve sabit hücre mikroskobu ile bozulmamış dokudaki hücre bölünmesini analiz etmektir. Protokol, Drosophila larvaları ve erken pupalardan bütün, bozulmamış testislerin nasıl izole edilip, mikroskopi için nasıl işleyip monte edilebildiğini gösteriyor.

Drosophila Larval ve Pupal Testislerinin Canlı, Sağlam Dokuda Hücre Bölünmesi Analizi İçin Hazırlanması

Experimental analysis of cells dividing in living, intact tissues and organs is essential to our understanding of how cell division integrates with ...

Bu protokol, floresan mikroskopi kullanılarak canlı, bozulmamış doku bağlamında hücre bölünmesi mekanizmalarıanaliz etmek için kullanılabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, hücrelerin doğal fizyolojik ortamlarının korunması ve aynı zamanda uzun süreli kurslar da canlı görüntülemeye olanak sağlamasıdır. Bu tekniğin en önemli parçası, testislerin diseksiyon veya montaj sırasında zarar görmemesini sağlamaktır.Bu zaman ve uygulama biraz elde edilen bir beceridir. Bu yöntemin görsel gösterimi çok önemlidir, çünkü testislerin nasıl tanımlanıp izole edilebildiğini ve dokuya zarar vermeden görüntüleme için nasıl monte edilebildiğini gösterir. El yazmasında açıklandığı gibi hayvanları, araçları ve medyayı hazırlayın.Diseksiyonu başlamadan önce, cam bir kaydıraktan her biri 50 mikrolitre lik üç damla medya çıkarmak için ortam dolu filtre şırıngasını kullanın. Bir diseksiyon sondası kullanarak, beş ila 10 üçüncü instar larvaları veya erken pupa slayt üzerinde medya üst damla aktarın. Hafifçe herhangi bir gıda veya enkaz kaldırmak için diseksiyon sondası ile medyada larva ve pupa çalkalayın.Tek bir larva veya pupa yan açmak için diseksiyon sondası kullanın. Vücudun arka üçüncü yarı saydam oval yapılar olarak görünen iki çift taraflı testisler arayın. Testisleri olmayan hayvanlar dişidir ve atılmalıdır.Bir erkek larva veya pupa bulunduğunda ve temiz olduğunda, medyanın ikinci damlasına taşıyın. Üç veya dört erkek larva veya pupa medyanın ikinci damlasına aktarılana kadar tekrarlayın. Sonra medyanın ikinci damlasında çalışırken, orta bölgesinde bir çift forceps ile tek bir hayvan kavramak, sadece testisler için ön.Hayvanı yavaşça ikiye ayırmak için ikinci bir çift forceps kullanın. Bir çift forceps kullanarak, cam slayt üzerinde hayvanın arka ucunu basılı tutun. Forceps hemen yanında başlayarak, neşter kenarını kullanarak mite aşağı itin.Neşteri hayvanın kesilen ucuna doğru hareket ettirin. Bu bağırsaklar, yağ organları ve testisler dahil hayvanın iç organları, dışarı atacaktır. Testisler renksiz ve neredeyse şeffaf oval organlar yağ vücut şeritler gömülü.Testisleri diğer organlardan ayırın. Testisleri teker teker aktarmak için, neşterin kenarını yağ gövdesinin altına yerleştirin, dokuyu ortamdan kaldırın ve hızlı bir şekilde üçüncü damlaya taşıyın. Yeterli yağ vücut hala neşter ile doku kaldırmak için testisler bağlı değilse diseksiyon orta ile önceden aşınmış olan bir cam Pasteur pipet kullanın.Orta üçüncü damla çalışma, yavaşça testislerden aşırı yağ vücut dilim lemek için neşter keskin ucunu kullanın, kenarlarında yağ vücut sadece küçük bir jant bırakarak. İlk olarak, 50 milimetrelik gaz geçirilebilir kültür çanak merkezine Yaklaşık 30 mikrolitre Schneider orta tek bir damla yatırmak için filtre şırınga kullanın. Neşter aracını veya önceden ıslanmış pasteur pipetini kullanarak hazırlanan testislerden beşine kadar çanak taki damlasına aktarılır.Daha sonra, testisleri gaz geçirilebilir membranın üzerine ve orta daki damlanın ortasına yavaşça itmek için neşter aracını kullanın. Bir mililitrelik şırınga kullanarak, orta damla çevreleyen gaz geçirilebilir membran üzerinde halokarbon yağı dört damla yerleştirin. Damlaların yerleri 22 milimetrelik bir kapak fişinin dört köşesine karşılık gelir.Daha sonra 22 milimetrelik cam kapak lı bir kapağın köşelerini dört damla halokarbon yağıyla hizalayın ve coverslip'i hafifçe ortama ve yağa indirin. Coverslip yerleşmek için izin verin ve testisler içeren medya için yağ damlaları arasında yayıldı. Kültür çanasını bir kesme mikroskobunun altına yerleştirin.Fazla ortamı kaldırmak için, kapak altına hassas bir görev silme nin köşesini takın. Sadece en büyük testis yüzeyi ile temas yapmak için cam coverslip için yeterli medya wick uzakta. Çok fazla ortam çıkarmayın ve kapak kaymasını çok fazla düşürün.Bu testisler üzerinde baskı uygulayacak ve onları yırtılma neden olabilir. Son olarak, testislerin hemen üzerinde cam kapak üzerine daldırma yağı bir damla yerleştirin. Tabağı ters çevirin ve mikroskop aşamasına yerleştirin.Testislerin hemen altında olana kadar 40 veya 60 X mikroskop hedefini yağa taşıyın. Tek bir testis bulmak ve odak haline getirmek için iletilen ışığı kullanın. PBSTx'te 0,5 mililitre %8 paraformaldehiti dokuz iyi diseksiyon kabının bir kuyusu içinde yerleştirin.Testislerden 10'a kadarını kuyuya aktarmak için cam bir Pasteur pipeti kullanın. Testislerin kuyunun dibinde olduğundan emin olun. 20 dakika sonra testisleri 0,5 mililitre PBSTx içeren bir kuyuya aktarın.Beş dakika hafifçe çalkalayarak testisleri yıkayın. Taze PBSTx ile yeni kuyularda iki kez daha yıkayın. El yazmasında açıklandığı gibi 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpünde birincil antikor seyreltme hazırlayın.Daha sonra testisleri dokuz kuyu cam kesme çanaktan tüpe aktarın. Tüp gece boyunca dört santigrat derecede hafif sallanma veya fındık ile tüp kuluçka. Testislerin ikincil antikorla boyanma prosedürü benzerdir.Ayrıntılar için el yazmasına bakın. İlk olarak, pasteur pipetkullanarak, testisleri dokuz kuyu plakasından cam mikroskopi slaytına aktarın. Gerekirse, testisleri slayt yüzeyine itmek için neşterin kenarını kullanın.Daha sonra, testislerden fazla sıvıyı uzaklaştırmak için hassas bir görev silme nin köşesini kullanın. Mümkün olduğunca çok sıvı çıkarın. Daha sonra testislere 30-50 mikrolitrelik mikroskoper montaj ortamı uygulayın.Son olarak, montaj ortamının damlaüzerine 22 milimetrelik bir kapak kayması yerleştirin. Coverslip yerleşmek için izin ve montaj orta coverslip altında yaymak için. Gerekirse, fazla montaj ortamını sıkmak için kapak kaymasına hafif basınç uygulayın ve örtü kaymanın testislerin yüzeyinde dinlenmesine izin verin.Bu protokol başarıyla yürütüldüğünde, testislerin hücresel organizasyonu korunur ve hücre farklılaşmasının testisin bir ucundan diğer ucuna ilerlemesi görünür. Meyozis ve metafazdaki spermatositler tespit edilebilir. Bu protokol kullanılarak hazırlanan testislerde canlı görüntüleme analizi, spermatositlerin bölünmesinde endoplazmik retikulum ve mikro tübüllerin dinamik olarak yeniden yapılandırıcılığı göstermektedir.Protokolde açıklandığı gibi, testislerin patlamasına neden olan basıncı uygulamamaya özen gerekir. Spermatosit kistleri yırtık bir testisten hızla dışarı akar ve bu da canlı zaman atlamalı görüntülemeyi zorlaştırır. Bu protokol, spermatositlerin canlı, bozulmamış dokuda bölünmesini görüntülemek için optimize edilebiyi optimize edemeye yöneliktir.Bu nedenle, testislerin diseksiyon veya montaj sırasında zarar görmemesi esastır. Yöntemimiz aynı zamanda, hücre bölünmesini yöneten dinamik alt hücresel süreçlere yeni bakış açısı sağlayan yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu gibi süper çözünürlüklü görüntüleme teknikleri için de uygun olmalıdır.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Canlı-görüntüleme<em&gt; Drosophila</em&gt; Pupa Göz

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track ...

Preparation of Mitochondrial Enriched Fractions for Metabolic Analysis in Drosophila

Preparation of Mitochondrial Enriched Fractions for Metabolic Analysis in Drosophila

Metabolik Analiz Mitokondriyal Zenginleştirilmiş Kesirler Hazırlanması<em&gt; Drosophila</em

Since mitochondria play roles in amino acid metabolism, carbohydrate metabolism and fatty acid oxidation, defects in mitochondrial function often ...

Observing Mitotic Division and Dynamics in a Live Zebrafish Embryo

Canlı Zebra balığı Embriyo Mitotik Bölümü ve Dinamikleri gözlemleme

Mitosis is critical for organismal growth and differentiation. The process is highly dynamic and requires ordered events to accomplish proper chromatin ...

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

Vitro Zigot polarizasyon, Live-hücre görüntüleme ve Arabidopsis thaliana embriyo desenlendirme için ovule ekimi

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

Fare İkincil Palin Füzyonunun Canlı Görüntüsü

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue

Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue

Canlı Drosophila yumurtalık dokusu içinde folikül kök hücre soyundan Imaging hücre içi pH için yöntemleri

Changes in intracellular pH (pHi) play important roles in the regulation of many cellular functions, including metabolism, proliferation, and ...

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

Diseksiyon ve Drosophila pupa yumurtalık boyama

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a ...

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

Drosophila pupa Retina diseksiyon immünhistokimya, Batı analiz ve RNA izolasyon için

The Drosophila pupal retina provides an excellent model system for the study of morphogenetic processes during development. In this paper, we present a ...

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Canlı görüntüleme ve Drosophila embryo kas kasılmaları Analizi

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits ...