Name: tmt sample preparation for proteomics facility submission and subsequent data analysis
Uploaded: 2020-06-08T14:00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about TMT Sample Preparation for Proteomics Facility Submission and Subsequent Data Analysis at JoVE.com

Wir möchten die UF-ICBR Proteomics-Anlage für die Verarbeitung unserer Proben würdigen. Diese Arbeit wurde teilweise von den National Institutes of Health R01 HL136759-01A1 (CAP) unterstützt.

Das Institutional Animal Care and Use Committee von der University of Florida genehmigte alle Tierstudien.
1. Herstellung von Reagenzien
<ol><li>ChapS Lysis Buffer (150 mM KCl, 50 mM HEPES pH = 7,4, 0,1% CHAPS und 1 Protease-Hemmer-Cocktailtablette pro 50 ml Puffer) vorbereiten. Puffer ohne Proteaseinhibitoren können bis zu 6 Monate bei 4 °C oder mit Proteaseinhibitor bei -20 °C bis zu einem Jahr gespeichert werden.</li>
	<li>100 mM Triethylammoniumbicarbonat (TEAB) vorbereiten: 500 l von 1 M TEAB zu 4,5 ml Reinstwasser hinzufügen.</li>
	<li>200 mM Tris (2-Carboxyethyl)-Phosphinhydrochlorid (TCEP) vorbereiten: 70 l 0,5 M TCEP, ein denaturierendes Reagenz, auf 70 l Reinstwasser hinzufügen. Fügen Sie dann 35 L des 1 M TEAB hinzu.</li>
	<li>5 % Hydroxylamin vorbereiten: 50 l 50 % Hydroxylamin zu 450 l von 100 mM TEAB hinzufügen.</li>
</ol>2. Proteinextraktion
<ol><li>Isolieren Quadrizeps Muskel von einer eingeschläferten Maus nach einem IACUC genehmigten Protokoll. Einfrieren und halten Sie bei -80 °C oder fahren Sie mit dem Protokoll für die sofortige Verwendung fort.</li>
	<li>Schneiden Sie, um etwa 10 mg frisches oder gefrorenes Quadrizeps-Mausgewebe zu isolieren. Trennen Sie Fasern mit Pinzette bei der Arbeit mit Skelettmuskel. Wenn Sie mit Zellkulturen arbeiten, setzen Sie auch 3 x 106 Zellen in 300 L CHAPS-Lysepuffer wieder auf, und fahren Sie mit Schritt 2.4 fort.</li>
	<li>Homogenisieren Sie gewebe mit einem Perlenstörer mit 2 ml-Rohren, gefüllt mit ca. 200 l 1 mm Zirkonia/Kieselsäureperlen und 500 l CHAPS-Lysepuffer. Skalieren Sie je nach Bedarf nach oben oder unten (z. B. 5 mg Gewebe in 250 l CHAPS-Lysepuffer).</li>
	<li>Ultraschall (10x für 10 s mit je 50% Amplitude und 30 s Intervallen auf Eis) durchführen, um Protein freizusetzen, das an die DNA gebunden ist. Die gleichen DNA-Abbauergebnisse können entweder mit Spritzenlyse erreicht werden, indem das Lysat 10x durch eine 21 G Nadel, die an einer 1 ml Spritze befestigt ist, oder durch Benzonase-Inkubation (44 U/ml) bei 37 °C für 30 min übergeben wird.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie das Lysat bei 16.000 x g für 10 min bei 4 °C und übertragen Sie den Überstand auf ein neues Zentrifugenrohr.</li>
</ol>3. Proteinmessung
<ol><li>Bestimmen Sie die Proteinkonzentration des Überstandes anhand etablierter Protokolle (siehe Materialtabelle). HINWEIS: Es ist am besten, Proben mit einem Durchmesser von 2 g/l zu verwenden, aber es können auch weniger konzentrierte Proben verwendet werden. Bei Verwendung einer weniger konzentrierten Probe ist es erforderlich, die Volumina der Reduktions-/Alkylierungsreagenzien in Schritt 5.1 angemessen anzupassen.</li>
	<li>Bereiten Sie eine BSA-Standardkurvenverdünnung mithilfe des CHAPS-Lysepuffers vor.</li>
	<li>Befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers, und lesen Sie nach 15 min die Absorption bei 750 nm.</li>
</ol>4. Reduktions-/Alkylierungs-Reagenzbehandlung
<ol><li>Übertragen Sie 200 g Protein pro Zustand in ein neues Zentrifugenrohr und stellen Sie sich mit dem CHAPS-Lysepuffer auf ein Endvolumen von 100 l ein. Bei zu geringer Proteinkonzentration ist es möglich, bis zu 200 l zu skalieren, aber vergessen Sie nicht, das Volumen des Reduktions-/Alkylierungsreagenzes angemessen einzustellen.</li>
	<li>Fügen Sie 5 l des 200 mM TCEP hinzu und inkubieren Sie Proben bei 55 °C für 1 h.</li>
	<li>Unmittelbar vor der Anwendung 375 mM Iodoacetamid vorbereiten, indem Sie eine Röhre Mitiodoacetamid (d. h. 9 mg) in 132 l von 100 mM TEAB auflösen. Schützen Sie diese Lösung vor Licht.</li>
	<li>Fügen Sie der Probe 5 l 375 mM Iodoacetamid hinzu und brüten Sie 30 min bei Raumtemperatur (RT) vor Licht geschützt.</li>
</ol>5. Methanol/Chloroform Niederschlag20
<ol><li>Fügen Sie jeweils 400 l Methanol zu 100 l Protein und kurz Wirbelproben hinzu.</li>
	<li>Zentrifuge bei 9.000 x g für 10 s bei RT. Dabei sollen Flüssigkeiten enthalten sein, die sich an den Seiten des Probenrohrs ablagern.</li>
	<li>Fügen Sie dem Gemisch 100 l Chloroform hinzu und wirbeln Sie kurz. Verwenden Sie 200 l Chloroform, wenn die Probe eine hohe Konzentration von Phospholipiden aufweist.</li>
	<li>Zentrifuge bei 9.000 x g für 10 s bei RT. Dabei sollen Flüssigkeiten enthalten sein, die sich an den Seiten des Probenrohrs ablagern.</li>
	<li>300 L Wasser und Wirbel kräftig hinzufügen. Es ist wichtig, eine homogene Lösung zu finden.</li>
	<li>Zentrifuge bei 9.000 x g für 1 min bei RT. Achten Sie bei der Übertragung des Rohres auf ein Rack sehr darauf, die Schichten nicht zu stören. HINWEIS: Das Rohr sollte nun drei Phasen enthalten: 1) Deckschicht (d. h. Überstand), eine Mischung aus Wasser und Methanol; 2) Mittlere Schicht (d. h. Interphase), weißes gefälltes Protein; und 3) Unterschicht (d. h. untere Phase), Chloroform.</li>
	<li>Entfernen Sie vorsichtig den Überstand.</li>
	<li>Fügen Sie der verbleibenden Interphase und der unteren Phase 300 l Methanol hinzu. Wirbel kräftig.</li>
	<li>Zentrifuge bei 9.000 x g für 2 min bei RT. Achten Sie bei der Übertragung des Rohres auf ein Rack sehr darauf, die Schichten nicht zu stören.</li>
	<li>Entfernen Sie vorsichtig den Überstand.</li>
	<li>Unter einem Luftstrom (z.B. mit einem Vakuumkonzentrator) bei RT vorsichtig so viel Flüssigkeit wie möglich ansaugen, bis das Pellet etwas feucht ist (ca. 10 min). Da die erforderliche Zeit für jede Probe unterschiedlich sein kann, überprüfen Sie alle 2 min, um zu bewerten. Lagern Sie das Pellet bei -80 °C bis zur Weiterverarbeitung.</li>
</ol>6. Proteinverdauung
<ol><li>Setzen Sie das ausgefällte Proteinpellet in 100 L TEAB-Lysepuffer wieder auf. HINWEIS: Es ist optional, die Proteinkonzentration in diesem Schritt zu messen.</li>
	<li>Bereiten Sie unmittelbar vor der Anwendung 1 g/l Trypsin vor, indem Sie 100 l der Trypsin-Speicherlösung (50 mM Essigsäure) an den Boden der 100-g-Trypsin-Glasdurchstechflasche aufbereiten und 5 min bei RT inkubieren. Bewahren Sie das restliche Reagenz in Einzeldosis bei -80 °C auf.</li>
	<li>Fügen Sie 2,5 l Trypsin pro 100 g Protein hinzu. Verdauen Sie die Probe über Nacht bei 37 °C. Dieser Schritt ist entscheidend für die vollständige Löslichkeit des Proteins; diese Bedingungen nicht ändern. Nach der Verdauung ist es optional, die Proteinkonzentration mit Standard-Protein-Assays zu messen.</li>
</ol>7. Peptid-Etikettierung
<ol><li>Gleichvor der Anwendung die TMT-Etiketten-Kit-Reagenzien mit RT ausstatten.</li>
	<li>Lösen Sie jede der 0,8 mg TMT-Tag-Fläschchen durch Zugabe von 41 l wasserfreiem Acetonitril zu jedem Röhrchen auf. Inkubieren Sie das Reagenz für 5 min bei RT mit gelegentlichem Wirbeln. Kurz zentrieren Sie die Rohre. HINWEIS: Eine Konzentration von 0,8 mg TMT-Tag reicht in der Regel aus, um zwei Sätze zu kennzeichnen. Andere Prüfer haben jedoch nachgewiesen, dass diese Konzentration weiter reduziert werden kann und dennoch zuverlässige Daten liefern15.</li>
	<li>Fügen Sie jeder 100-L-Probe vorsichtig 41 L des TMT-Etikettenreagenzes hinzu.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Reaktion für 1 h bei RT.</li>
	<li>Fügen Sie der Probe 8 l 5% Hydroxylamin hinzu und inkubieren Sie 15 min, um die Reaktion zu löschen.</li>
	<li>Die Proben in einem neuen Zentrifugenrohr in gleiche Mengen aufteilen und bei -80 °C lagern. HINWEIS: In diesem Schritt sind die Proben stabil und können zur Massenspektroskopie eingereicht werden. Es ist optional, die Konzentration an dieser Stelle mit Standard-Protein-Assays zu messen.</li>
</ol>8. Massenspektroskopie
<ol><li>Reichen Sie die Proben an eine Proteomik-Anlage (diese Studie verwendete die UF ICBR Proteomics Core-Anlage), wo alle Proben mit C18-Spinspalten kombiniert und gereinigt werden. HINWEIS: Besprechen Sie mit der Kerneinrichtung, wie Sie die Proben einreichen, bevor Sie sie vorbereiten, um die genauen Schritte zu bestätigen, die sie für Einreichungen bevorzugen.</li>
	<li>Fordern Sie die folgenden Verfahren pro kombinierter Multiplex-Probe an: Festphasenextraktion, HPLC (SCX, SE), Zip-Spitze und LC-MS/MS (2 h Gradient für Protein-ID, wenn >10QE Plus).</li>
	<li>Sobald die Daten gesammelt sind, verarbeitet die Kerneinrichtung RAW-Dateien mit vom Hersteller gelieferter Software zur Proteinidentifikation.</li>
</ol>9. Datenanalyse
<ol><li>Daten werden in der Regel vom Kern zurück an den Benutzer im 7z-Format übermittelt, was pro Dataset etwa 16 GB Speicherplatz erfordern kann (in diesem Fall 11 Samples). Stellen Sie für die Datenverarbeitung sicher, dass ein Computer verfügbar ist, der mindestens 3,4 GHz beträgt.</li>
	<li>Extrahieren Sie Dateien mit 7-Zip File Manager. Diese extrahierten Dateien enthalten RAW-Daten, pdStudy-Format-Datei, und pdResultView-Format-Datei. Speichern Sie alle Dateien für weitere Analysen.</li>
	<li>Öffnen Sie die Datei mit proteome Discovery 2.2 Software. HINWEIS: Das Dateiformat ist "File name.pdStudy". Wenn die "Datei name.pdResultView" geöffnet wird, ist es nicht möglich, das Steuerelementbeispiel auszuwählen.</li>
	<li>Wählen Sie Die Steuerelementbeispiele im Bedienfeld"Samples" aus.</li>
	<li>Öffnen Sie das Ergebnis, indem Sie die ID im Bedienfeld"Analyseergebnisse" auswählen.</li>
	<li>Exportieren sie in Tabellenkalkulationssoftware.</li>
	<li>Rohdaten speichern (alle identifizierten Proteine).</li>
	<li>Öffnen Sie die Tabellenkalkulationssoftwaredatei. Dies wird alle identifizierten Proteine enthalten.</li>
	<li>In der Tabellenkalkulation Software-Datei verwenden Sie die "Filter" Funktion , um zu screenen "Protein FDR Confidence: Combined" in high (Spalte B), "#Unique Peptide" höher als 2 (Spalte K), und entweder eine von " AbundanceRatio" leer ausschließlich (Spalte S bis W).</li>
	<li>Einfügen einer Spalte für die "p-Wert" Berechnung mit der Funktion =TTEST(Kontrollgruppe, Versuchsgruppe, Schwänze, Typ)</li>
	<li>Einfügen einer Spalte für "Statistische Signifikanz" mit der Funktion =IF(p-wert<0.05, "Significance","NS")</li>
	<li>Verwenden Sie die Funktion "Filter", um "Statistische Signifikanz" zu zeigen, die "Signifikanz" anzeigt. Das Ergebnis zeigt die analysierten Proteine mit der statistischen Signifikanz in der Kontrollgruppe und der Versuchsgruppe.</li>
	<li>Bestimmen Sie eine signifikant höhere oder niedrigere Proteinexpressionshäufigkeit in der experimentellen Gruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe, fügen Sie eine Spalte für "Regulation" mit der Funktion ein. =IF(AVERAGE(controlgroup)>AVERAGE(experimentalgroup),"Upregulated","Downregulated")</li>
</ol>10. Methoden zur Bewertung signifikanter Treffer
<ol><li>Um Protein-Protein-Wechselwirkungen zwischen den signifikanten Treffern zu identifizieren, die in den TMT-Studien identifiziert wurden, verwenden Sie search Tool for the Retrieval of Interacting Genes/Proteins (STRING) Version 11.021: <a href="https://string-db.org/" target="_blank">https://string-db.org/</a>
</li>
	<li>Um nach Gruppen (d.h. molekulare Funktion, biologische Prozesse und Proteinklassen) zu klassifizieren, verwenden Sie Proteinanalyse durch Evolutionäre Beziehungen (PANTHER) Ontologie-Klassifizierungssoftware22: <a href="http://www.pantherdb.org/" target="_blank">http://www.pantherdb.org/</a>
</li>
	<li>Um Protein-Wechselwirkungen in einer Vielzahl von Wegen zu identifizieren, verwenden Sie die Pfadanalyse-Software23.</li>
</ol>11. Proteomischer Daten-Upload in eine Repository-Bank
<ol><li>Um proteomische Daten an die Proteomics IDEntificantions Database (PRIDE) oder Mass Spectrometry Interactive Virtual Environment (MassIVE) zu übermitteln, enthalten die folgenden Informationen: die Peak-List-Dateien (verarbeitete Massenspektrumdateien in einem Standardformat wie mzXML, mzML oder MGF), Ergebnisdateien (Spektrum-Identifikationen in einem Standardformat wie mzIdentML oder mzTab) und Rohspektrumdateien (Roh-Massenspektrum-Dateien in einem nicht standardmäßigen oder Instrument-spezifischen Format). RAW-Dateien oder . WIFF-Dateien).</li>
	<li>Um zu übermitteln, erstellen Sie ein Konto und fügen Sie Informationen wie Zugehörigkeits- und Projektdetails ein. Wählen Sie dann die in Schritt 11.1 aufgeführten Dateien aus und laden Sie sie hoch.</li>
	<li>Um ein offizielles Dataset zu erstellen, führen Sie einen Übermittlungsworkflow für diese hochgeladenen Dateien aus. HINWEIS: Nach der Übermittlung ist das Dataset in der Repository-Bank privat. Mit der privaten Option stehen die Daten nur autorisierten Benutzern zur Verfügung. Es gibt zwei zusätzliche Optionen: 1) Freigegebenes Dataset, das Den zugriff auf Journalprüfer und Mitarbeiter bietet; oder 2) Öffentliches Dataset, das in öffentlichen Datensatzsuchen angezeigt wird. Ein weiteres wichtiges Merkmal dieser Repositorys ist die Möglichkeit, die hochgeladenen Daten zu aktualisieren und nachfolgende Publikationen dem vorhandenen Dataset zuzuordnen.</li>
</ol>

<ol>
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Die Autoren haben nichts zu verraten.

Um Proben für die proteomische Analyse mit TMT-basierten isobaric stabilen Isotopen-Etikettierungsmethoden erfolgreich vorzubereiten, ist es wichtig, Proteinextraktionen bei 4 °C sehr sorgfältig durchzuführen und einen Lysepuffer zu verwenden, der einen Protease-Inhibitor-Cocktailenthält 24,25. Der Proteasehemmer-Cocktail ist ein entscheidendes Reagenz, um einen unerwarteten Proteinabbau während der Proteinverdauung zu vermeiden. Ein wesentlicher Unterschied zwischen unserem Protokoll und dem aktuellen, der vom Anbieter bereitgestellt wird, besteht darin, dass wir die Verwendung eines CHAPS-Lysepuffers auf der Grundlage unserer Erfahrungen mit Säugetierzellen und -geweben dringend empfehlen. Wir empfehlen auch die Verwendung eines Methanol/Chloroform-Protein-Fällansatzes sowohl für Zellpellets als auch für Gewebe.
Idealerweise werden am selben Tag Proteinextraktion, Messung, Reduktions-/Alkylierungsreagenzbehandlungen und Methanol/Chloroform-Fällungen durchgeführt. Nach dieser Empfehlung ergeben sich genauere Proteinkonzentrationen für die anschließende Etikettierung. Der Proteinfällschritt ist wichtig für die Entfernung von Reagenzien, die die Tandem-Massenspektrometrie stören. Die Einbeziehung des Niederschlagsschritts erhöht die Auflösung von TMT26erheblich. Zusammenfassend sind die Hauptvorteile unseres TMT-Protokolls die hohe Kennzeichnungseffizienz für verschiedene Probentypen, seine Reproduzierbarkeit und die zuverlässigen Daten.
Da sich die Multiplex-Natur dieser ungezielten Proteomik-Strategie von TMT weiter ausdehnt, wird sie die Fähigkeit von Forschern in einer Vielzahl von Bereichen, neue Entdeckungen zu machen, schrittweise verbessern. Insbesondere im biomedizinischen Bereich haben wir und andere diese Technologie in Studien zur Erforschung neuer Wirkmechanismen bei Krankheiten und relativen Auswirkungen verschiedener Therapeutika zunehmend informativ gefunden. Aus all diesen Gründen ergänzt diese leistungsstarke Technologie das Repertoire anderer OMICS-Ansätze, die in modernen Forschungsstudien verwendet werden, und liefert wichtige Informationen, die die weitere therapeutische Entwicklung leiten können.

Der Begriff "Proteomik" wurde zuerst definiert als die großflächige Charakterisierung des gesamten Proteinkomplements einer Zelle, eines Gewebes oder eines Organismus1. Proteomische Analysen ermöglichen die Untersuchung von Mechanismen und zellulären Prozessen, die an der Krankheitsentwicklung, therapeutischen Bahnen und gesunden Systemen beteiligt sind, mit Techniken zur relativen Quantifizierung der Proteinexpressionsniveaus2. Die ersten Beschreibungen solcher Studien wurden 1975 veröffentlicht und zeigten die Verwendung der zweidimensionalen Polyacrylamid-Gelelektrophorese (2D-PAGE) zu diesem Zweck1,3. Die 2D-Methode trennt Proteine auf Ladungbasis (isoelektrische Fokussierung, IEF) und Molekularmasse (Natriumdodecylsulfat Polyacrylamid-Gelelektrophorese, oder SDS-PAGE)4. Jahrelang war die Kombination von 2D-PAGE und anschließender Tandem-Massenspektrometrie, die an jeder Gelkomponente durchgeführt wurde, die häufigste durchgeführte ungezielte Proteinexpressionsanalysetechnik und identifizierte zahlreiche bisher unbekannte Proteinexpressionsprofile5,6. Allgemeine Nachteile des 2D-PAGE-Ansatzes sind, dass er zeitaufwändig ist, für hydrophobe Proteine nicht gut funktioniert und es Einschränkungen in der Gesamtzahl der Proteine gibt, die aufgrund der geringen Empfindlichkeit bewertet werden7,8.
Die stabile Isotopenkennzeichnung durch Aminosäuren in der Zellkultur (SILAC) Wurde der nächste beliebte Ansatz, um die Proteinfülle in Proben9zu identifizieren und zu quantifizieren. Es besteht aus metabolischer Kennzeichnung von Zellen, die in Medium ohne eine Standard-Essentielle Aminosäure inkubiert und mit einer Isotop-markierten Version dieser spezifischen Aminosäure10ergänzt werden. Der Vorteil dieser Technik ist ihre Effizienz und präzise Etikettierung9. Die Hauptbeschränkung auf den SILAC-Ansatz ist in erster Linie die reduzierte Zellwachstumsrate, die durch die Isotop-Etiketten-Inkorporation verursacht wird, die bei relativ empfindlichen Zelllinien, die menschliche Krankheiten modellieren, besonders anspruchsvoll sein kann11.
Im Jahr 2003 wurde eine neuartige und robuste Proteomik-Technik mit Tandem-Massen-Tag (TMT) isobaric-Etiketten in das Feld12eingeführt. Die TMT-Kennzeichnung ist aufgrund ihrer erhöhten Empfindlichkeit zum Nachweis relativer Proteinexpressionsniveaus und posttranslationaler Modifikationen eine leistungsfähige Methode13. Zum Zeitpunkt dieser Veröffentlichung wurden TMT-Kits entwickelt, die gleichzeitig 6, 10, 11 oder 16 Samples beschriften können. Als Ergebnis ist es möglich, Peptid-Überfluss in mehreren Bedingungen mit biologischen Repliken zur gleichen Zeit14,15,16zu messen. Wir haben vor kurzem TMT verwendet, um das kardiale proteomische Profil eines Mausmodells des Barth-Syndroms (BTHS)17zu charakterisieren. Auf diese Weise konnten wir eine weit verbreitete Verbesserung der Herzprofile von BTHS-Mäusen nachweisen, die mit Einer Gentherapie behandelt wurden, und neuartige Proteine identifizieren, die von BTHS beeinflusst wurden und neuartige therapeutische Wege zeigten, die an Kardiomyopathien beteiligt sind.
Hier beschreiben wir eine detaillierte Methode zur Durchführung von Multiplex-TMT-Quantitativen Proteomik-Analysen mit Gewebeproben oder Zellpellets. Es kann von Vorteil sein, die Probenvorbereitung und -kennzeichnung vor der Abgabe an einen Kern durchzuführen, da die beschrifteten tryptischen Peptide stabiler sind als rohgefrorene Proben, nicht alle Kerne Haben Erfahrung mit der Handhabung aller Probentypen, und die Vorbereitung von Proben in einem Labor kann Zeit für Kerne sparen, die oft lange Rückstände aufweisen. Ausführliche Beschreibungen des Massenspektroskopie-Teils dieses Prozesses finden Sie unter Kirshenbaum et al. und Perumal et al.18,19.
Das Probenvorbereitungsprotokoll besteht aus den folgenden Hauptschritten: Extraktion, Quantifizierung, Niederschlag, Verdauung und Kennzeichnung. Die Hauptvorteile dieses optimierten Protokolls sind, dass es die Kosten für die Etikettierung senkt, die Proteinextraktion verbessert und konsistent qualitativ hochwertige Daten generiert. Darüber hinaus beschreiben wir, wie TMT-Daten analysiert werden, um Tausende von Proteinen in kurzer Zeit zu überprüfen. Wir hoffen, dass dieses Protokoll andere Forschungsgruppen ermutigt, zu erwägen, diese leistungsfähige Methodik in ihre Studien aufzunehmen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 M Triethylammonium bicarbonate (TEAB), 50 mL</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>90114</td>
			<td>Reagent for protein labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50% Hydroxylamine, 5 mL</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>90115</td>
			<td>Reagent for protein labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6283</td>
			<td>Reagent for protein digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anhydrous acetonitrile, LC-MS Grade</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>51101</td>
			<td>Reagent for protein labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonaze nuclease</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E1014</td>
			<td>DNA shearing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bond-Breaker TCEP solution, 5 mL</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>77720</td>
			<td>Reagent for protein labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA standard</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>23209</td>
			<td>Reagent for protein measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHAPS</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>28300</td>
			<td>Reagent for protein extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1145-1</td>
			<td>Reagent for protein precipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Tablet</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4693132001</td>
			<td>Reagent for protein extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC Protein Assay</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>500-0116</td>
			<td>Reagent for protein measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>Microsoft Office</td>
			<td></td>
			<td>Software for data analyses</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat block</td>
			<td>VWR analog</td>
			<td>12621-104</td>
			<td>Equipment for protein digestion incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>RDD002</td>
			<td>Reagent for protein extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A452-4</td>
			<td>Reagent for protein precipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Trypsin Protease, MS Grade</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>90058</td>
			<td>Reagent for protein digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>46436</td>
			<td>Reagent for protein extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sigma Plot 14.0</td>
			<td>Sigma Plot 14.0</td>
			<td></td>
			<td>Software for data analyses</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB120</td>
			<td>DNA shearing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectra Max i3x Multi-Mode Detection Platform</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td>Plate reader for protein measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>23275</td>
			<td>Reagent for protein measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Pierce Quantitative Fluorescent Peptide Assay</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>23290</td>
			<td>Reagent for protein measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Proteome Discoverer Software</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>OPTON-30945</td>
			<td>Software for data analyses</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMT 10plex Isobaric Label Reagent Set 0.8 mg, sufficient reagents for one 10plex isobaric experiment</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>90110</td>
			<td>Reagent for protein labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMT11-131C Label Reagent 5 mg</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A34807</td>
			<td>Reagent for protein labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water, LC-MS Grade</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>51140</td>
			<td>Reagent for protein extraction</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tmt sample preparation for proteomics facility submission and subsequent data analysis

Proteomische Technologien sind leistungsstarke Methoden, die unser Verständnis von Wirkmechanismen in biologischen Systemen unterstützen können, indem sie einen globalen Überblick über die Auswirkungen einer Krankheit, Behandlung oder anderer Bedingungen auf das Proteom als Ganzes bieten. Dieser Bericht enthält ein detailliertes Protokoll für die Extraktion, Quantifizierung, Niederschlagung, Verdauung, Kennzeichnung und anschließende Datenanalyse von Proteinproben. Unser optimiertes TMT-Etikettierungsprotokoll erfordert eine geringere Tag-Label-Konzentration und erreicht konstant zuverlässige Daten. Wir haben dieses Protokoll verwendet, um Proteinexpressionsprofile in einer Vielzahl von Mausgeweben (z. B. Herz, Skelettmuskel und Gehirn) sowie in vitro kultivierten Zellen zu bewerten. Darüber hinaus zeigen wir, wie Tausende von Proteinen aus dem resultierenden Datensatz ausgewertet werden.

Gesunde und kranke Zellen wurden im CHAPS-Puffer lysiert, wie in unserer TMT-Etikettierungsmethode detailliert vorbereitet und dem University of Florida Interdisciplinary Center for Biotechnology Research (UF-ICBR) Proteomics Core for Liquid Chromatography mit Tandem-Massenspektrometrie vorgelegt. Nach der Datenerfassung und -bereitstellung aus dem Kern wurde der Datensatz in herstellergeführter Software geöffnet und die folgenden Cutoff-Filter angewendet: 2 einzigartige Peptide, Reporterionen für jede Proteinprobe, die in allen Kanälen vorhanden sind, und enthalten nur signifikant veränderte Proteine (p- 0,05). Tabelle 1 fasst die Daten zusammen: 39.653 Gesamtpeptide, von denen 7.211 gleich oder größer als zwei eindeutige Peptide sind und 3.829 Reporterionen für alle Kanäle enthalten. Die p-Werte für diese 3.829 Peptide wurden durch den T-Test des Schülers berechnet und p 0,05 wurde als signifikant angesehen. Darüber hinaus wurde ein Faltwechsel-Cutoff verwendet, um die relative Verteilung von Proteinen von erkrankten im Vergleich zu gesunden Zellen zu bestimmen: downreguliert (blau) oder upreguliert (rot) (Abbildung 1).
Die Liste der signifikant dysregulierten Proteinexpression wurde mit dem PANTHER Ontology Klassifikationssystem und STRING-Analysen bewertet. Panther-Analysen zeigten eine kategorisierte Liste von Proteinen, die auf deutlich niedrigeren (Abbildung 2A) oder einer höheren Häufigkeit in erkrankten Zellen basierend auf molekularer Funktion basierten (Abbildung 2B). String-Analysen von Proteinen von deutlich niedrigerer (Abbildung 2C) und höher (Abbildung 2D) Häufigkeit identifiziert mehrere Wechselwirkungen und starke Assoziationen zwischen Proteinen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60970/60970fig1.jpg"> Abbildung 1: Vulkandiagramm mit Proteinen, deren Häufigkeit nicht signifikant verändert (schwarz), signifikant gesenkt (blau) oder signifikant erhöht (rot) in kranken vs. gesunden Kontrollzellen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60970/60970fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60970/60970fig2.jpg"> Abbildung 2: Repräsentative Auswertungen von signifikant dysregulierten Treffern, die von PANTHER (A, B) und String (C, D) von deutlich niedrigeren oder höherreichen Proteinen identifiziert wurden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60970/60970fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Gesamtpeptide</td>
			<td>Insgesamt identifiziert</td>
			<td>2 einzigartige Peptide</td>
			<td>Quantifizierte Proteine</td>
			<td colspan="2">Deutlich veränderte Proteine</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Niedrig</td>
			<td>Hoch</td>
		</tr>
<tr>
<td>39653</td>
			<td>7211</td>
			<td>4457</td>
			<td>3829</td>
			<td>296</td>
			<td>108</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 1: Repräsentative Tabelle der quantifizierten Proteine pro Datensatzanalyse.

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TMT Sample Preparation for Proteomics Facility Submission and Subsequent Data Analysis

Wir präsentieren ein optimiertes Tandem-Massen-Tag-Etikettierungsprotokoll (TMT), das detaillierte Informationen für jeden der folgenden Schritte enthält: Proteinextraktion, Quantifizierung, Niederschlag, Verdauung, Etikettierung, Einreichung an eine Proteomik-Anlage und Datenanalysen.

TMT-Beispielvorbereitung für proteomics Facility Submission und nachfolgende Datenanalyse

Proteomic technologies are powerful methodologies that can aid our understanding of mechanisms of action in biological systems by providing a global view ...

Die Hauptvorteile dieses Protokolls sind, dass es die Kosten für die Etikettierung senkt, die Proteinextraktion verbessert und qualitativ hochwertige Daten generiert. Die Hauptvorteile unseres Protokolls sind die hohe Kennzeichnungseffizienz für die verschiedenen Probentypen, seine Reproduzierbarkeit und die zuverlässige Datenerfassung. Nach der Isolierung Quadrizeps Muskelgewebe Proben von einer eingeschläferten Maus nach einem IACUC genehmigten Protokoll, wiegen 10 Milligramm Muskelgewebe und verwenden Pinzette, um die Muskelfasern zu trennen.Um ein Lysat zu erstellen, übertragen Sie die getrennte Gewebeprobe in ein Zwei-Milliliter-Rohr mit 200 Mikrolitern eines Millimeters von einem Millimeter Zirkonia Kieselsäureperlen und 500 Mikroliter CHAPS-Lysepuffer. Platzieren Sie die Samples in einem Perlenstörer und führen Sie zwei sequenzielle 45-Sekunden-Durchläufe durch. Nach dem zweiten Zyklus, um das DNA-gebundene Protein freizugeben, beschallen Sie die Probe 10 Mal für 10 Sekunden pro Beschallung bei einer 50%amplitude mit 30-Sekunden-Intervallen auf Eis.Nach der letzten Beschallung zentrieren Sie das Lysat und übertragen Sie den Überstand in ein neues Zentrifugenrohr. Zur Reduktion/Alkylierung reagenzbehandlung 200 Mikrogramm Protein pro Zustand in neue Zentrifugenröhrchen übertragen und mit frischem CHAPS-Lysepuffer das Endvolumen in jedem Rohr auf bis zu 100 Mikroliter bringen. Als nächstes fügen Sie fünf Mikroliter TCEP zu jeder Röhre hinzu und brüten die Proben bei 55 Grad Celsius für eine Stunde.Am Ende der Inkubation neun Milligramm Iodoacetamid in 132 Mikrolitern von 100 Millimolar TEAB auflösen und die resultierende 375 Millimolar-Iodoacetamid-Lösung vor Licht schützen. Dann fügen Sie fünf Mikroliter Iodoacetamid zu jeder Probe und inkubieren für 30 Minuten bei Raumtemperatur vor Licht geschützt. Für Methanol/Chlorform-Fällung 400 Mikroliter Methanol zu je 100 Mikroliter Protein hinzufügen und die Proben kurz wirbeln.Um die an den Seiten der Probenröhrchen abgelagerten Flüssigkeiten zu integrieren, zentrieren Sie die Proben kurz und fügen Sie jedem Rohr 100 Mikroliter Chloroform hinzu. Nach einem kurzen Wirbeln die Rohre schnell wieder zentrifugieren, um die Flüssigkeit an den Seiten der Rohre zu sammeln und 300 Mikroliter Wasser in die Proben zu geben. Wirbel kräftig, um homogene Lösungen zu erhalten und zentrifugieren Sie die Proben für eine Minute unter den gleichen Zentrifugenbedingungen.Am Ende der Zentrifuge die Rohre vorsichtig in ein Rack geben, ohne die Schichten zu stören, und den Überstand vorsichtig entfernen. 300 Mikroliter Methanol in die verbleibenden Zwischen- und Unterphasen geben und die Proben wieder kräftig wirbeln. Zentrifugieren Sie die Proben für zwei Minuten und aspirieren Sie die Überstande sorgfältig.Dann vorsichtig so viel Flüssigkeit wie möglich aus jeder Probe unter einem Luftstrom ansaugen, bis die Pellets nur ein wenig feucht sind. Bewerten Sie die Hydratation alle zwei Minuten für ca. 10 Minuten. Bei Bedarf können die Pellets bis zur Weiterverarbeitung bei minus 80 Grad Celsius gelagert werden.Um das Protein zu verdauen, setzen Sie das gefällte Pellet in 100 Mikroliter TEAB-Lysepuffer wieder auf und fügen Sie 100 Mikroliter Trypsin-Speicherlösung auf den Boden einer 100-Mikrogramm-Trypsin-Glas-Flasche. Nach fünf Minuten bei Raumtemperatur 2,5 Mikroliter der frisch zubereiteten Trypsinlösung pro 100 Mikrogramm Protein in jede Probe geben und die Proben über Nacht bei 37 Grad Celsius bebrüten. Für die Peptidkennzeichnung jede 0,8 Milligramm TMT-Tag-Durchstechflasche mit 41 Mikrolitern wasserfreiem Acetonitril pro Tag auflösen und die Reagenzien bei Raumtemperatur fünf Minuten lang bei gelegentlichem Wirbeln inkubieren und dabei die Etiketten vor Licht schützen.Am Ende der Inkubation die Fläschchen kurz zentrifugieren und 41 Mikroliter TMT-Etikettenreagenz vorsichtig zu jeder 100-Mikroliter-Probe für eine einstündige Inkubation bei Raumtemperatur hinzufügen. Am Ende der Inkubation, löschen Sie die Reaktionen mit der Zugabe von acht Mikroliter von 5%Hydroxylamin für 15 Minuten bei Raumtemperatur. Dann teilen Sie die Proben in gleiche Aliquots in neuen Zentrifugenrohren für die Lagerung bei minus 80 Grad Celsius auf.In dieser repräsentativen Datenerfassung wurden 39 653 Gesamtpeptide analysiert, von denen 4 457 gleich oder größer als zwei eindeutige Peptide und 3, 829 Reporterionen für alle Kanäle enthielten. Ein Faltenwechsel-Cutoff wurde verwendet, um die relative Verteilung von Proteinen von erkrankten im Vergleich zu gesunden Zellen mit 296 Proteinen mit deutlich geringerer Häufigkeit und 108 Proteinen mit signifikant höherer Häufigkeit zu bestimmen. Die PANTHER-Analyse zeigte eine kategorisierte Liste von Proteinen, die auf einer deutlich geringeren oder höheren Häufigkeit kranker Zellen basierend auf ihrer molekularen Funktion basieren.Die String-Analyse der Proteine mit signifikant niedrigerer oder höherer Häufigkeit identifizierte weiter mehrere Wechselwirkungen und starke Assoziationen zwischen Proteinen. Zusätzliche Methoden können durchgeführt werden, um Protein-zu-Protein-Wechselwirkungen zu identifizieren, die Wechselwirkungen nach Gruppen zu klassifizieren und die Wechselwirkungen in einer Vielzahl von Pfaden zu identifizieren. Proteomics-Techniken sind leistungsstarke Werkzeuge in den biomedizinischen Forschungsbereichen, um die Mechanismen der Krankheitsentwicklung zu verstehen, indem detaillierte Proteinüberflussinformationen zur Verfügung gestellt werden.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Lipid Droplet Isolation for Quantitative Mass Spectrometry Analysis

Lipid Droplet Isolierung für die quantitative Massenspektrometrie-Analyse

Lipid droplets are vital to the replication of a variety of different pathogens, most prominently the Hepatitis C Virus (HCV), as the putative site of ...

Forschung

Biochemie

Optimal Preparation of Formalin Fixed Samples for Peptide Based Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Imaging Workflows

Optimale Vorbereitung von Formalin fixiert Proben für Peptid-Matrix basierten Assisted Laser Desorption/Ionisierung Massenspektrometrie Imaging-Workflows

The use of matrix-assisted laser desorption/ionization, mass spectrometry imaging (MALDI MSI) has rapidly expanded, since this technique analyzes a host ...

Preparation of Chloroplast Sub-compartments from Arabidopsis for the Analysis of Protein Localization by Immunoblotting or Proteomics

Vorbereitung der Chloroplasten Sub Fächer von Arabidopsis für die Analyse von Protein-Lokalisierung durch Immunoblotting oder Proteomics

Chloroplasts are major components of plant cells. Such plastids fulfill many crucial functions, such as assimilation of carbon, sulfur and nitrogen as ...

Fully Autonomous Characterization and Data Collection from Crystals of Biological Macromolecules

Völlig autonom Charakterisierung und Datenerfassung aus Kristallen von biologischen Makromolekülen

High-brilliance X-ray beams coupled with automation have&#160;led to the use of synchrotron-based macromolecular X-ray crystallography (MX) beamlines for ...

Sample Preparation for Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Probenvorbereitung für Probe Elektrospray-Ionen-Massenspektrometrie

Mass spectrometry (MS) is a powerful tool in analytical chemistry because it provides very accurate information about molecules, such as mass-to-charge ...

Analysis of SEC-SAXS data via EFA deconvolution and Scatter

Analyse von SEC-SAXS-Daten über EFA-Dekonvolution und Streuung

BioSAXS is a popular technique used in molecular and structural biology to determine the solution structure, particle size and shape, surface-to-volume ...

A Sample Preparation Pipeline for Microcrystals at the VMXm Beamline

Eine Probenvorbereitungspipeline für Mikrokristalle an der VMXm-Beamline

The mounting of microcrystals (&#60;10 &#181;m) for single crystal cryo-crystallography presents a non-trivial challenge. Improvements in data quality ...

Preparation of High-Temperature Sample Grids for Cryo-EM

Vorbereitung von Hochtemperatur-Probengittern für Kryo-EM

The sample grids for cryo-electron microscopy (cryo-EM) experiments are usually prepared at a temperature optimal for the storage of biological samples, ...

Shotgun Proteomics Sample Processing Automated by an Open-Source Lab Robot

Shotgun Proteomics Probenverarbeitung automatisiert durch einen Open-Source-Laborroboter

Mass spectrometry-based shotgun proteomics experiments require multiple sample preparation steps, including enzymatic protein digestion and clean-up, ...

Single-Particle Cryo-EM Data Collection with Stage Tilt using Leginon

Einzelpartikel-Kryo-EM-Datenerfassung mit Stage Tilt unter Verwendung von Leginon

Single-particle analysis (SPA) by cryo-electron microscopy (cryo-EM) is now a mainstream technique for high-resolution structural biology. Structure ...