Name: tmt sample preparation for proteomics facility submission and subsequent data analysis
Uploaded: 2020-06-08T14:00:00
Duration: 7 min 44 s
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हम अपने नमूनों के प्रसंस्करण के लिए यूएफ-आईसीबीआर प्रोटेओमिक्स सुविधा को स्वीकार करना चाहते हैं। इस काम को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थानR01 HL136759-01A1 (कैप) द्वारा समर्थित किया गया था ।

<ol>
	<li>Graves, P. R., Haystead, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+biologist's+guide+to+proteomics.">Molecular biologist's guide to proteomics.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 66 (1), 39-63 (2002).</li><li>Erdjument-Bromage, H., Huang, F. K., Neubert, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+Preparation+for+Relative+Quantitation+of+Proteins+Using+Tandem+Mass+Tags+(TMT)+and+Mass+Spectrometry+(MS).">Sample Preparation for Relative Quantitation of Proteins Using Tandem Mass Tags (TMT) and Mass Spectrometry (MS).</a> Methods in Molecular Biology. 1741, 135-149 (2018).</li><li>O'Farrell, P. 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E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+isotope+labeling+by+amino+acids+in+cell+culture,+SILAC,+as+a+simple+and+accurate+approach+to+expression+proteomics.">Stable isotope labeling by amino acids in cell culture, SILAC, as a simple and accurate approach to expression proteomics.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 1 (5), 376-386 (2002).</li><li>Anderson, N. G., Anderson, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Twenty+years+of+two-dimensional+electrophoresis:+Past,+present+and+future.">Twenty years of two-dimensional electrophoresis: Past, present and future.</a> Electrophoresis. 17 (3), 443-453 (1996).</li><li>Haynes, P. A., Yates, J. 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A., Hoffert, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+Labeling+Using+Isobaric+Tagging+Reagents+for+Quantitative+Phosphoproteomics.">Peptide Labeling Using Isobaric Tagging Reagents for Quantitative Phosphoproteomics.</a> Methods in Molecular Biology. 1355, 53-70 (2016).</li><li>Navarrete-Perea, J., Yu, Q., Gygi, S. P., Paulo, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streamlined+Tandem+Mass+Tag+(SL-TMT)+Protocol:+An+Efficient+Strategy+for+Quantitative+(Phospho)proteome+Profiling+Using+Tandem+Mass+Tag-Synchronous+Precursor+Selection-MS3.">Streamlined Tandem Mass Tag (SL-TMT) Protocol: An Efficient Strategy for Quantitative (Phospho)proteome Profiling Using Tandem Mass Tag-Synchronous Precursor Selection-MS3.</a> Journal of Proteome Research. 17 (6), 2226-2236 (2018).</li><li>Zecha, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TMT+Labeling+for+the+Masses:+A+Robust+and+Cost-efficient,+In-solution+Labeling+Approach.">TMT Labeling for the Masses: A Robust and Cost-efficient, In-solution Labeling Approach.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 18 (7), 1468-1478 (2019).</li><li>Bachor, R., Waliczek, M., Stefanowicz, P., Szewczuk, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trends+in+the+Design+of+New+Isobaric+Labeling+Reagents+for+Quantitative+Proteomics.">Trends in the Design of New Isobaric Labeling Reagents for Quantitative Proteomics.</a> Molecules. 24 (4), E701 (2019).</li><li>Suzuki-Hatano, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAV9-TAZ+Gene+Replacement+Ameliorates+Cardiac+TMT+Proteomic+Profiles+in+a+Mouse+Model+of+Barth+Syndrome.">AAV9-TAZ Gene Replacement Ameliorates Cardiac TMT Proteomic Profiles in a Mouse Model of Barth Syndrome.</a> Molecular Therapy - Methods &amp; Clinical Development. 13, 167-179 (2019).</li><li>Kirshenbaum, N., Michaelevski, I., Sharon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+large+protein+complexes+by+structural+mass+spectrometry.">Analyzing large protein complexes by structural mass spectrometry.</a> Journal of Visualized Experiments. (40), e1954 (2010).</li><li>Perumal, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+Preparation+for+Mass-spectrometry-based+Proteomics+Analysis+of+Ocular+Microvessels.">Sample Preparation for Mass-spectrometry-based Proteomics Analysis of Ocular Microvessels.</a> Journal of Visualized Experiments. (144), e59140 (2019).</li><li>Wessel, D., Fl&#252;gge, U. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+the+quantitative+recovery+of+protein+in+dilute+solution+in+the+presence+of+detergents+and+lipids.">A method for the quantitative recovery of protein in dilute solution in the presence of detergents and lipids.</a> Analytical Biochemistry. 138, 141-143 (1984).</li><li>Jensen, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STRING+8--a+global+view+on+proteins+and+their+functional+interactions+in+630+organisms.">STRING 8--a global view on proteins and their functional interactions in 630 organisms.</a> Nucleic Acids Research. 37, D412-D416 (2009).</li><li>Mi, H., Muruganujan, A., Casagrande, J. T., Thomas, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+gene+function+analysis+with+the+PANTHER+classification+system.">Large-scale gene function analysis with the PANTHER classification system.</a> Nature Protocols. 8 (8), 1551-1566 (2013).</li><li>Cirillo, E., Parnell, L. D., Evelo, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Review+of+Pathway-Based+Analysis+Tools+That+Visualize+Genetic+Variants.">A Review of Pathway-Based Analysis Tools That Visualize Genetic Variants.</a> Frontiers in Genetics. 8, 174 (2017).</li><li>Plaxton, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avoiding+Proteolysis+during+the+Extraction+and+Purification+of+Active+Plant+Enzymes.">Avoiding Proteolysis during the Extraction and Purification of Active Plant Enzymes.</a> Plant and Cell Physiology. 60 (4), 715-724 (2019).</li><li>Ryan, B. J., Henehan, G. T., Walls, D., Loughran, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Protein Chromatography: Methods and Protocols. , 53-69 (2017).</li><li>Fic, E., Kedracka-Krok, S., Jankowska, U., Pirog, A., Dziedzicka-Wasylewska, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+protein+precipitation+methods+for+various+rat+brain+structures+prior+to+proteomic+analysis.">Comparison of protein precipitation methods for various rat brain structures prior to proteomic analysis.</a> Electrophoresis. 31 (21), 3573-3579 (2010).</li></ol>

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

टीएमटी आधारित आइसोबेरिक स्थिर आइसोटोप लेबलिंग पद्धतियों का उपयोग करके प्रोटेओमिक विश्लेषण के लिए नमूने सफलतापूर्वक तैयार करने के लिए, 4 डिग्री सेल्सियस पर प्रोटीन निष्कर्षण बहुत सावधानी से करना और एक लाइसिस बफर का उपयोग करना महत्वपूर्ण है जिसमें एक प्रोटीज़ अवरोधक कॉकटेल24,,25शामिल है। प्रोटीन पाचन के दौरान अप्रत्याशित प्रोटीन क्षरण से बचने के लिए प्रोटीज़ अवरोधक कॉकटेल एक महत्वपूर्ण अभिकर्ता है। हमारे प्रोटोकॉल और विक्रेता द्वारा प्रदान की गई वर्तमान एक के बीच एक महत्वपूर्ण अंतर यह है कि हम स्तनधारी कोशिकाओं और ऊतकों के साथ हमारे अनुभव के आधार पर चैप्स लिसिस बफर के उपयोग की दृढ़ता से सलाह देते हैं। हम कोशिका छर्रों और ऊतकों दोनों के लिए मेथनॉल/क्लोरोफॉर्म प्रोटीन वर्षा दृष्टिकोण का उपयोग करने का भी सुझाव देते हैं ।
आदर्श रूप में, प्रोटीन निष्कर्षण, माप, कम करने/alkylating अभिकर्मक उपचार, और मेथनॉल/क्लोरोफॉर्म वर्षा सभी एक ही दिन किया जाता है । इस सिफारिश के बाद बाद लेबलिंग के लिए और अधिक सटीक प्रोटीन सांद्रता में परिणाम होगा । प्रोटीन वर्षा कदम अभिकर्मकों को हटाने के लिए महत्वपूर्ण है जो मिलकर बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री में हस्तक्षेप करेगा। वर्षा चरण सहित टीएमटी26के संकल्प को काफी बढ़ाता है । संक्षेप में, हमारे टीएमटी प्रोटोकॉल के प्रमुख फायदे विभिन्न प्रकार के नमूनों, इसकी प्रजनन क्षमता और प्राप्त विश्वसनीय डेटा के लिए उच्च लेबलिंग क्षमता हैं।
चूंकि इस टीएमटी अनलक्षित प्रोटेओमिक्स रणनीति की मल्टीप्लेक्स प्रकृति का विस्तार जारी है, इसलिए यह उपन्यास खोजों को बनाने के लिए विभिन्न क्षेत्रों में शोधकर्ताओं की क्षमता को उत्तरोत्तर बढ़ाएगा । विशेष रूप से जैव चिकित्सा क्षेत्र में, हमने और अन्य लोगों ने इस तकनीक को रोग में कार्रवाई के उपन्यास तंत्र और विभिन्न चिकित्सीय के सापेक्ष प्रभावों की खोज करने वाले अध्ययनों में तेजी से जानकारीपूर्ण पाया है। इन सभी कारणों से, यह शक्तिशाली तकनीक आधुनिक अनुसंधान अध्ययनों में उपयोग किए जाने वाले अन्य OMICS दृष्टिकोणों के प्रदर्शनों की सूची का पूरक है और महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान करती है जो आगे चिकित्सीय विकास का मार्गदर्शन कर सकती है।

"प्रोटेओमिक्स" शब्द को पहले कोशिका, ऊतक या जीव1के पूरे प्रोटीन पूरक के बड़े पैमाने पर लक्षण वर्णन के रूप में परिभाषित किया गया था। प्रोटेओमिक विश्लेषण प्रोटीन अभिव्यक्ति स्तर2के सापेक्ष मात्रा प्रदर्शन करने के लिए तकनीकों का उपयोग करके रोग विकास, चिकित्सीय रास्ते और स्वस्थ प्रणालियों में शामिल तंत्र और सेलुलर प्रक्रियाओं की जांच को सक्षम करते हैं। इस तरह के अध्ययनों के प्रारंभिक विवरण 1 9 75 में प्रकाशित किए गए थे और इस उद्देश्य1,,3 के लिए दो-आयामी पॉलीएक्रिलामाइड जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस (2डी-पेज) के उपयोगकाप्रदर्शन किया। 2डी विधि चार्ज (आइसोइलेक्ट्रिक फोकसिंग, आईईएफ) और आणविक द्रव्यमान (सोडियम डोडेसिल सल्फेट पॉलीएक्रिलैमाइड जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस, या एसडीएस-पेज)4के आधार पर प्रोटीन को अलग करती है। वर्षों के लिए, प्रत्येक जेल घटक पर किए गए 2D-PAGE और बाद में मिलकर मास स्पेक्ट्रोमेट्री का संयोजन सबसे आम अलक्षित प्रोटीन अभिव्यक्ति विश्लेषण तकनीक थी और कई पहले से अज्ञात प्रोटीन अभिव्यक्ति प्रोफाइल5,,6की पहचान की गई थी। 2D-PAGE दृष्टिकोण के सामान्य नुकसान यह हैं कि यह समय लेने वाला है, हाइड्रोफोबिक प्रोटीन के लिए अच्छी तरह से काम नहीं करता है, और कम संवेदनशीलता7,,8के कारण मूल्यांकन किए गए प्रोटीन की कुल संख्या में सीमाएं हैं।
सेल कल्चर (SILAC) विधि में अमीनो एसिड द्वारा स्थिर आइसोटोप लेबलिंग नमूनों9में प्रोटीन बहुतायत की पहचान करने और मात्रा निर्धारित करने के लिए अगला लोकप्रिय दृष्टिकोण बन गया। इसमें कोशिकाओं की मेटाबोलिक लेबलिंग होती है जो मध्यम में एक मानक आवश्यक अमीनो एसिड की कमी होती है और उस विशिष्ट अमीनो एसिड10के आइसोटोप लेबल वाले संस्करण के साथ पूरक होती है। इस तकनीक का लाभ इसकी दक्षता और सटीक लेबलिंग9है । SILAC दृष्टिकोण के लिए मुख्य सीमा मुख्य रूप से कम सेल विकास दर आइसोटोप लेबल समावेश की वजह से है, जो विशेष रूप से अपेक्षाकृत संवेदनशील सेल लाइनों में चुनौतीपूर्ण हो सकता है मानवरोगों मॉडलिंग 11।
2003 में, एक उपन्यास और मजबूत प्रोटेओमिक्स तकनीक जिसमें टैंडेम मास टैग (टीएमटी) आइसोबेरिक लेबल शामिल हैं, जिसे12क्षेत्र में पेश किया गया था। टीएमटी लेबलिंग एक शक्तिशाली तरीका है क्योंकि इसकी बढ़ी हुई संवेदनशीलता है ताकि सापेक्ष प्रोटीन अभिव्यक्ति के स्तर और पोस्टट्रांसलेशनलसंशोधनों कापता लगाया जा सके । इस प्रकाशन की तारीख के रूप में, टीएमटी किट विकसित की गई है जो एक साथ 6, 10, 11 या 16 नमूनों को लेबल कर सकती है। नतीजतन,14,,15,,16में जैविक प्रतिकृति के साथ कई परिस्थितियों में पेप्टाइड बहुतायत को मापना संभव है। हमने हाल ही में बार्थ सिंड्रोम (बीटीटीएस)17के माउस मॉडल के कार्डियक प्रोटेओमिक प्रोफाइल की विशेषता के लिए टीएमटी का उपयोग किया था। ऐसा करने में, हम जीन थेरेपी के साथ इलाज BTHS चूहों के हृदय प्रोफाइल में व्यापक सुधार प्रदर्शित करने में सक्षम थे और BTHS द्वारा प्रभावित उपन्यास प्रोटीन की पहचान है कि उपन्यास चिकित्सकीय कार्डियोमायोपैथी में शामिल रास्ते से पता चला ।
यहां, हम ऊतक नमूनों या सेल छर्रों का उपयोग करमल्टीप्लेक्स टीएमटी मात्रात्मक प्रोटेओमिक्स विश्लेषण करने के लिए एक विस्तृत विधि का वर्णन करते हैं। यह नमूना तैयारी और लेबलिंग एक कोर करने के लिए प्रस्तुत करने से पहले प्रदर्शन करने के लिए फायदेमंद हो सकता है क्योंकि लेबल ट्राइप्टिक पेप्टाइड्स कच्चे जमे हुए नमूनों की तुलना में अधिक स्थिर हैं, नहीं सभी कोर सभी नमूना प्रकार से निपटने का अनुभव है, और एक प्रयोगशाला में नमूने तैयार करने कोर के लिए समय बचा सकता है, जो अक्सर लंबे बैकलॉग है । इस प्रक्रिया के द्रव्यमान स्पेक्ट्रोस्कोपी भाग के विस्तृत विवरण के लिए कृपया किरशेनबॉम एट अल और पेरुमल एट अल18,,19देखें।
नमूना तैयारी प्रोटोकॉल में निम्नलिखित प्रमुख कदम होते हैं: निष्कर्षण, मात्रा, वर्षा, पाचन और लेबलिंग। इस अनुकूलित प्रोटोकॉल के प्रमुख लाभ यह हैं कि यह लेबलिंग की लागत को कम करता है, प्रोटीन निष्कर्षण में सुधार करता है, और लगातार उच्च गुणवत्ता वाले डेटा उत्पन्न करता है। इसके अलावा, हम कम समय में हजारों प्रोटीन को स्क्रीन करने के लिए टीएमटी डेटा का विश्लेषण करने का वर्णन करते हैं। हमें उम्मीद है कि यह प्रोटोकॉल अन्य शोध समूहों को अपने अध्ययन में इस शक्तिशाली पद्धति को शामिल करने पर विचार करने के लिए प्रोत्साहित करता है ।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 M Triethylammonium bicarbonate (TEAB), 50 mL</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>90114</td>
			<td>Reagent for protein labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50% Hydroxylamine, 5 mL</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>90115</td>
			<td>Reagent for protein labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6283</td>
			<td>Reagent for protein digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anhydrous acetonitrile, LC-MS Grade</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>51101</td>
			<td>Reagent for protein labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonaze nuclease</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E1014</td>
			<td>DNA shearing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bond-Breaker TCEP solution, 5 mL</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>77720</td>
			<td>Reagent for protein labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA standard</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>23209</td>
			<td>Reagent for protein measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHAPS</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>28300</td>
			<td>Reagent for protein extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1145-1</td>
			<td>Reagent for protein precipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Tablet</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4693132001</td>
			<td>Reagent for protein extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC Protein Assay</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>500-0116</td>
			<td>Reagent for protein measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>Microsoft Office</td>
			<td></td>
			<td>Software for data analyses</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat block</td>
			<td>VWR analog</td>
			<td>12621-104</td>
			<td>Equipment for protein digestion incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>RDD002</td>
			<td>Reagent for protein extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A452-4</td>
			<td>Reagent for protein precipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Trypsin Protease, MS Grade</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>90058</td>
			<td>Reagent for protein digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>46436</td>
			<td>Reagent for protein extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sigma Plot 14.0</td>
			<td>Sigma Plot 14.0</td>
			<td></td>
			<td>Software for data analyses</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB120</td>
			<td>DNA shearing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectra Max i3x Multi-Mode Detection Platform</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td>Plate reader for protein measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>23275</td>
			<td>Reagent for protein measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Pierce Quantitative Fluorescent Peptide Assay</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>23290</td>
			<td>Reagent for protein measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Proteome Discoverer Software</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>OPTON-30945</td>
			<td>Software for data analyses</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMT 10plex Isobaric Label Reagent Set 0.8 mg, sufficient reagents for one 10plex isobaric experiment</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>90110</td>
			<td>Reagent for protein labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMT11-131C Label Reagent 5 mg</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A34807</td>
			<td>Reagent for protein labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water, LC-MS Grade</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>51140</td>
			<td>Reagent for protein extraction</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tmt sample preparation for proteomics facility submission and subsequent data analysis

प्रोटेओमिक प्रौद्योगिकियां शक्तिशाली तरीके हैं जो पूरे प्रोटेम पर रोग, उपचार या अन्य स्थिति के प्रभाव का वैश्विक दृष्टिकोण प्रदान करके जैविक प्रणालियों में कार्रवाई के तंत्र की हमारी समझ को सहायता कर सकती हैं। यह रिपोर्ट प्रोटीन नमूनों के निष्कर्षण, मात्रा, वर्षा, पाचन, लेबलिंग और बाद में डेटा विश्लेषण के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करती है। हमारे अनुकूलित टीएमटी लेबलिंग प्रोटोकॉल के लिए कम टैग-लेबल एकाग्रता की आवश्यकता होती है और लगातार विश्वसनीय डेटा प्राप्त होता है। हमने विभिन्न प्रकार के माउस ऊतकों (यानी दिल, कंकाल मांसपेशी और मस्तिष्क) के साथ-साथ विट्रो में सुसंस्कृत कोशिकाओं में प्रोटीन अभिव्यक्ति प्रोफाइल का मूल्यांकन करने के लिए इस प्रोटोकॉल का उपयोग किया है। इसके अलावा, हम प्रदर्शित करते हैं कि परिणामी डेटासेट से हजारों प्रोटीन का मूल्यांकन कैसे किया जाता है।

स्वस्थ और रोगग्रस्त कोशिकाओं को चैप्स बफर में चित्रित किया गया था, जिसे हमारे टीएमटी लेबलिंग विधि में विस्तृत रूप में तैयार किया गया था, और हमारे टीएमटी लेबलिंग विधि में विस्तृत रूप से तैयार किया गया था, और हमारे टीएमटी लेबलिंग विधि में विस्तृत रूप से तैयार किया गया था, और एक साथ बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ तरल क्रोमेटोग्राफी के लिए फ्लोरिडा इंटरडिसिप्लिनरी सेंटर फॉर बायोटेक्नोलॉजी रिसर्च (यूएफ-आईसीबीआर) प्रोटेओमिक्स कोर विश्वविद्यालय में प्रस्तुत किया गया था। डेटा अधिग्रहण और कोर से वितरण के बाद, डेटासेट विक्रेता-आपूर्ति सॉफ्टवेयर में खोला गया था और निम्नलिखित कटऑफ फिल्टर लागू किए गए थे: ‧2 अद्वितीय पेप्टाइड्स, सभी चैनलों में मौजूद प्रत्येक प्रोटीन नमूने के लिए रिपोर्टर आयन, और केवल महत्वपूर्ण रूप से परिवर्तित प्रोटीन (पी ♫ 0.05) शामिल हैं। तालिका 1 डेटा का सारांश देता है: 39,653 कुल पेप्टाइड्स, जिनमें से 7,211 में दो अद्वितीय पेप्टाइड्स से बराबर या उससे अधिक हैं, और 3,829 में सभी चैनलों के लिए रिपोर्टर आयन शामिल हैं। इन 3,829 पेप्टाइड्स के लिए पी मान की गणना छात्र टी टेस्ट द्वारा की गई थी और पी 0.05 को महत्वपूर्ण माना जाता था। इसके अलावा, स्वस्थ कोशिकाओं की तुलना में रोगग्रस्त से प्रोटीन के सापेक्ष वितरण का निर्धारण करने के लिए एक गुना-परिवर्तन कटऑफ का उपयोग किया गया था: डाउनरेविनियमित (नीला) या अपरेविनियमित (लाल)(चित्रा 1)।
पैंथर ओंटोलॉजी वर्गीकरण प्रणाली और स्ट्रिंग विश्लेषण का उपयोग करके काफी डिसिकोरेल प्रोटीन अभिव्यक्ति की सूची का आकलन किया गया था। पैंथर विश्लेषण ों ने आणविक कार्य(चित्रा 2बी)के आधार पर रोगग्रस्त कोशिकाओं में काफी कम(चित्रा 2ए)या उच्च बहुतायत के आधार पर प्रोटीन की एक वर्गीकृत सूची दिखाई। काफी कम के प्रोटीन के स्ट्रिंग विश्लेषण(चित्रा 2सी)और उच्च(चित्रा 2डी)बहुतायत प्रोटीन के बीच कई बातचीत और मजबूत संघों की पहचान की ।
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60970/60970fig1.jpg"> चित्रा 1: ज्वालामुखी प्रोटीन जिसकी बहुतायत काफी बदल (काला) नहीं था प्रदर्शित साजिश, काफी कम (नीला), या काफी वृद्धि (लाल) रोगग्रस्त बनाम स्वस्थ नियंत्रण कोशिकाओं में । <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60970/60970fig1large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60970/60970fig2.jpg"> चित्रा 2: पैंथर (ए, बी) और स्ट्रिंग (सी, डी) द्वारा काफी कम या उच्च बहुतायत प्रोटीन की पहचान की काफी डिसविनियमित हिट के प्रतिनिधि मूल्यांकन । <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60970/60970fig2large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>कुल पेप्टाइड्स</td>
			<td>कुल पहचान की गई</td>
			<td>♫ 2 अद्वितीय पेप्टाइड्स</td>
			<td>मात्रानिर्धारित प्रोटीन</td>
			<td colspan="2">काफी बदल प्रोटीन</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>कम</td>
			<td>उच्च</td>
		</tr>
<tr>
<td>39653</td>
			<td>7211</td>
			<td>4457</td>
			<td>3829</td>
			<td>296</td>
			<td>108</td>
		</tr>
</tbody></table>तालिका 1: डेटासेट विश्लेषण प्रति मात्रा निर्धारित प्रोटीन की प्रतिनिधि तालिका।

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TMT Sample Preparation for Proteomics Facility Submission and Subsequent Data Analysis

हम एक अनुकूलित टैंडेम मास टैग (टीएमटी) लेबलिंग प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं जिसमें निम्नलिखित चरणों में से प्रत्येक के लिए विस्तृत जानकारी शामिल है: प्रोटीन निष्कर्षण, मात्रा, वर्षा, पाचन, लेबलिंग, एक प्रोटेओमिक्स सुविधा के लिए प्रस्तुत करना, और डेटा विश्लेषण।

प्रोटेओमिक्स सुविधा सबमिशन और बाद के डेटा विश्लेषण के लिए टीएमटी नमूना तैयारी

Proteomic technologies are powerful methodologies that can aid our understanding of mechanisms of action in biological systems by providing a global view ...

इस प्रोटोकॉल के प्रमुख लाभ यह हैं कि यह लेबलिंग की लागत को कम करता है, प्रोटीन निष्कर्षण में सुधार करता है, और उच्च गुणवत्ता वाले डेटा उत्पन्न करता है। हमारे प्रोटोकॉल के प्रमुख फायदे विभिन्न प्रकार के नमूनों, इसकी प्रजनन क्षमता और विश्वसनीय डेटा अधिग्रहण के लिए उच्च लेबलिंग क्षमताएं हैं। एक IACUC अनुमोदित प्रोटोकॉल के अनुसार एक इच्छामृत्यु माउस से क्वाड्रिसेप्स मांसपेशी ऊतक नमूनों को अलग करने के बाद, मांसपेशियों के ऊतकों के 10 मिलीग्राम का वजन और मांसपेशियों के तंतुओं को अलग करने के लिए चिमटी का उपयोग करें ।लाइसेट बनाने के लिए, अलग किए गए ऊतक नमूने को दो मिलीलीटर ट्यूब में स्थानांतरित करें जिसमें एक मिलीमीटर जिरकोनिया सिलिका मोतियों के 200 माइक्रोलीटर और चैप्स लाइसिस बफर के 500 माइक्रोलीटर शामिल हैं। नमूनों को एक मनका बाधित में रखें और दो अनुक्रमिक 45-सेकंड रन करें। दूसरे चक्र के बाद, डीएनए-बाउंड प्रोटीन को छोड़ने के लिए, बर्फ पर 30 सेकंड के अंतराल के साथ 50% आयाम पर प्रति सोनीसेंस 10 सेकंड के लिए 10 बार नमूना लें।अंतिम सोनीसेंस के बाद, lysate अपकेंद्रित्र और एक नई अपकेंद्रित्र ट्यूब के लिए supernatant हस्तांतरण। कम करने/alkylating अभिवाक् त उपचार के लिए, नई अपकेंद्रित्र ट्यूबों में प्रति स्थिति प्रोटीन के २०० माइक्रोग्राम हस्तांतरण और ताजा CHAPS lysis बफर का उपयोग करने के लिए प्रत्येक ट्यूब में अंतिम मात्रा लाने के लिए १०० माइक्रोलीटर तक । इसके बाद, प्रत्येक ट्यूब में टीसीईपी के पांच माइक्रोलीटर जोड़ें और नमूनों को एक घंटे के लिए 55 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।इनक्यूबेशन के अंत में, 100 मिलीमोलर टीबीबी के 132 माइक्रोलीटर में आइडियोडोएस्टामाइमाइड के नौ मिलीग्राम को भंग करें और परिणामस्वरूप 375 मिलीमोलर इओडोएस्टाटामाइड समाधान को प्रकाश से बचाएं। फिर प्रत्येक नमूने में आयोडोसेटामाइड के पांच माइक्रोलीटर जोड़ें और प्रकाश से संरक्षित कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। मेथनॉल/क्लोरोफॉर्म वर्षा के लिए, प्रोटीन के प्रत्येक 100 माइक्रोलीटर में मेथनॉल के 400 माइक्रोलीटर जोड़ें और नमूनों को संक्षेप में भंवर करें।नमूना ट्यूबों के किनारों पर जमा तरल पदार्थ को शामिल करने के लिए, संक्षेप में नमूनों को अपकेंद्रित्र करें और प्रत्येक ट्यूब में क्लोरोफॉर्म के 100 माइक्रोलीटर जोड़ें। एक संक्षिप्त भंवर के बाद, ट्यूबों के किनारों पर तरल एकत्र करने और नमूनों में पानी के 300 माइक्रोलीटर जोड़ने के लिए फिर से ट्यूबों को जल्दी से अपकेंद्री करें। भंवर तेजी से समरूप समाधान प्राप्त करने के लिए और एक ही अपकेंद्रित्र शर्तों के तहत एक मिनट के लिए नमूनों अपकेंद्रित्र ।अपकेंद्रित्र के अंत में, परतों को परेशान किए बिना ट्यूबों को ध्यान से रैक में स्थानांतरित करें और ध्यान से सुपरनैंट को हटा दें। शेष अंतर और नीचे चरणों में मेथनॉल के 300 माइक्रोलीटर जोड़ें और नमूनों को फिर से सख्ती से भंवर करें। दो मिनट के लिए नमूनों को अपकेंद्रित्र करें और सुपरनेटेंट को सावधानीपूर्वक मानते हैं।फिर धीरे-धीरे हवा की एक धारा के तहत प्रत्येक नमूने से जितना संभव हो उतना तरल करें जब तक कि छर्रों को थोड़ा नम न करें। लगभग 10 मिनट के लिए हर दो मिनट में हाइड्रेशन का आकलन करें। यदि आवश्यक हो, तो छर्रों को आगे की प्रक्रिया तक शून्य से 80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।प्रोटीन को पचाने के लिए, टीबी लाइसिस बफर के 100 माइक्रोलीटर में उपजी गोली को फिर से रखें और 100 माइक्रोग्राम ट्राइप्सिन ग्लास शीशी के नीचे ट्राइप्सिन स्टोरेज समाधान के 100 माइक्रोलीटर जोड़ें। कमरे के तापमान पर पांच मिनट के बाद, प्रत्येक नमूने के लिए प्रोटीन के १०० माइक्रोग्राम प्रति हौसले से तैयार ट्रिप्सिन समाधान के २.५ माइक्रोलीटर जोड़ें और रात भर ३७ डिग्री सेल्सियस पर नमूनों को इनक्यूबेट करें । पेप्टाइड लेबलिंग के लिए, प्रत्येक 0.8 मिलीग्राम टीएमटी टैग शीशी को 41 माइक्रोलीटर के साथ भंग करें जो कि 41 माइक्रोलीटर है और लेबल को प्रकाश से सुरक्षित रखते हुए कभी-कभी भंवर के साथ कमरे के तापमान पर पांच मिनट के लिए अभिकर्मित करता है।इनक्यूबेशन के अंत में, संक्षेप में शीशियों को अपकेंद्रित्र करें और ध्यान से कमरे के तापमान पर एक घंटे की इनक्यूबेशन के लिए प्रत्येक 100 माइक्रोलीटर नमूने के लिए टीएमटी लेबल रिएजेंट के 41 माइक्रोलीटर जोड़ें। इनक्यूबेशन के अंत में, कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए 5% हाइड्रोक्सिलमाइन के आठ माइक्रोलीटर के अलावा प्रतिक्रियाओं को बुझाएं। फिर नमूनों को शून्य से ८० डिग्री सेल्सियस पर भंडारण के लिए नई अपकेंद्रित्र ट्यूबों में बराबर aliquots में विभाजित करें ।इस प्रतिनिधि डेटा अधिग्रहण में, 39, 653 कुल पेप्टाइड्स का विश्लेषण किया गया था, जिनमें से 4, 457 में दो अद्वितीय पेप्टाइड्स से बराबर या अधिक था और 3, 829 में सभी चैनलों के लिए रिपोर्टर आयन शामिल थे। एक गुना परिवर्तन कटऑफ काफी कम बहुतायत के २९६ प्रोटीन और काफी अधिक बहुतायत के १०८ प्रोटीन के साथ स्वस्थ कोशिकाओं की तुलना में रोगग्रस्त से प्रोटीन के सापेक्ष वितरण का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । पैंथर विश्लेषण उनके आणविक समारोह के आधार पर रोगग्रस्त कोशिकाओं की काफी कम या उच्च बहुतायत के आधार पर प्रोटीन की एक वर्गीकृत सूची से पता चला ।काफी कम या उच्च बहुतायत के प्रोटीन के स्ट्रिंग विश्लेषण आगे कई बातचीत और प्रोटीन के बीच मजबूत संघों की पहचान की । प्रोटीन-टू-प्रोटीन इंटरैक्शन की पहचान करने, समूहों द्वारा बातचीत को वर्गीकृत करने और विभिन्न मार्गों में बातचीत की पहचान करने के लिए अतिरिक्त तरीके किए जा सकते हैं। प्रोटेओमिक्स तकनीक विस्तृत प्रोटीन बहुतायत जानकारी प्रदान करके रोग विकास के तंत्र को समझने के लिए जैव चिकित्सा अनुसंधान क्षेत्रों के भीतर शक्तिशाली उपकरण हैं।

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Lipid Droplet Isolation for Quantitative Mass Spectrometry Analysis

मात्रात्मक मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण के लिए लिपिड बूंद अलगाव

Lipid droplets are vital to the replication of a variety of different pathogens, most prominently the Hepatitis C Virus (HCV), as the putative site of ...

Optimal Preparation of Formalin Fixed Samples for Peptide Based Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Imaging Workflows

Formalin की इष्टतम तैयारी के लिए निर्धारित नमूनों पेप्टाइड आधारित मैट्रिक्स असिस्टेड लेजर Desorption/Ionization मास स्पेक्ट्रोमेट्री इमेजिंग वर्कफ़्लोज़

The use of matrix-assisted laser desorption/ionization, mass spectrometry imaging (MALDI MSI) has rapidly expanded, since this technique analyzes a host ...

Preparation of Chloroplast Sub-compartments from Arabidopsis for the Analysis of Protein Localization by Immunoblotting or Proteomics

Immunoblotting या प्रोटियोमिक् द्वारा प्रोटीन स्थानीयकरण के विश्लेषण के लिए Arabidopsis से Chloroplast उप-डिब्बों की तैयारी

Chloroplasts are major components of plant cells. Such plastids fulfill many crucial functions, such as assimilation of carbon, sulfur and nitrogen as ...

Fully Autonomous Characterization and Data Collection from Crystals of Biological Macromolecules

पूरी तरह से स्वायत्त लक्षण वर्णन और जैविक Macromolecules के क्रिस्टल से डेटा संग्रह

High-brilliance X-ray beams coupled with automation have&#160;led to the use of synchrotron-based macromolecular X-ray crystallography (MX) beamlines for ...

Sample Preparation for Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

जांच इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण मास स्पेक्ट्रोमेट्री के लिए नमूना तैयारी

Mass spectrometry (MS) is a powerful tool in analytical chemistry because it provides very accurate information about molecules, such as mass-to-charge ...

Analysis of SEC-SAXS data via EFA deconvolution and Scatter

ईएफए डीकॉन्वोल्यूशन और स्कैटर के माध्यम से एसईसी-एसएक्सएस डेटा का विश्लेषण

BioSAXS is a popular technique used in molecular and structural biology to determine the solution structure, particle size and shape, surface-to-volume ...

A Sample Preparation Pipeline for Microcrystals at the VMXm Beamline

वीएमएक्सएम बीमलाइन में माइक्रोक्रिस्टल के लिए एक नमूना तैयारी पाइपलाइन

The mounting of microcrystals (&#60;10 &#181;m) for single crystal cryo-crystallography presents a non-trivial challenge. Improvements in data quality ...

Preparation of High-Temperature Sample Grids for Cryo-EM

क्रायो-ईएम के लिए उच्च तापमान नमूना ग्रिड की तैयारी

The sample grids for cryo-electron microscopy (cryo-EM) experiments are usually prepared at a temperature optimal for the storage of biological samples, ...

Shotgun Proteomics Sample Processing Automated by an Open-Source Lab Robot

शॉटगन प्रोटिओमिक्स नमूना प्रसंस्करण एक ओपन-सोर्स लैब रोबोट द्वारा स्वचालित

Mass spectrometry-based shotgun proteomics experiments require multiple sample preparation steps, including enzymatic protein digestion and clean-up, ...

Single-Particle Cryo-EM Data Collection with Stage Tilt using Leginon

लेगिनन का उपयोग करके स्टेज टिल्ट के साथ सिंगल-पार्टिकल क्रायो-ईएम डेटा संग्रह

Single-particle analysis (SPA) by cryo-electron microscopy (cryo-EM) is now a mainstream technique for high-resolution structural biology. Structure ...