Name: tmt sample preparation for proteomics facility submission and subsequent data analysis
Uploaded: 2020-06-08T14:00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about TMT Sample Preparation for Proteomics Facility Submission and Subsequent Data Analysis at JoVE.com

Мы хотели бы отметить протеомику UF-ICBR за их обработку наших образцов. Эта работа была частично поддержана Национальными институтами здравоохранения R01 HL136759-01A1 (CAP).

<ol>
	<li>Graves, P. R., Haystead, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+biologist's+guide+to+proteomics.">Molecular biologist's guide to proteomics.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 66 (1), 39-63 (2002).</li><li>Erdjument-Bromage, H., Huang, F. K., Neubert, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+Preparation+for+Relative+Quantitation+of+Proteins+Using+Tandem+Mass+Tags+(TMT)+and+Mass+Spectrometry+(MS).">Sample Preparation for Relative Quantitation of Proteins Using Tandem Mass Tags (TMT) and Mass Spectrometry (MS).</a> Methods in Molecular Biology. 1741, 135-149 (2018).</li><li>O'Farrell, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+two-dimensional+electrophoresis+of+proteins.">High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins.</a> Journal of Biological Chemistry. 250 (10), 4007-4021 (1975).</li><li>Rabilloud, T., Lelong, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-dimensional+gel+electrophoresis+in+proteomics:+a+tutorial.">Two-dimensional gel electrophoresis in proteomics: a tutorial.</a> Journal of Proteomics. 74 (10), 1829-1841 (2011).</li><li>Ong, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+isotope+labeling+by+amino+acids+in+cell+culture,+SILAC,+as+a+simple+and+accurate+approach+to+expression+proteomics.">Stable isotope labeling by amino acids in cell culture, SILAC, as a simple and accurate approach to expression proteomics.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 1 (5), 376-386 (2002).</li><li>Anderson, N. G., Anderson, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Twenty+years+of+two-dimensional+electrophoresis:+Past,+present+and+future.">Twenty years of two-dimensional electrophoresis: Past, present and future.</a> Electrophoresis. 17 (3), 443-453 (1996).</li><li>Haynes, P. A., Yates, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteome+profiling-pitfalls+and+progress.">Proteome profiling-pitfalls and progress.</a> Yeast. 17 (2), 81-87 (2000).</li><li>Bunai, K., Yamane, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effectiveness+and+limitation+of+two-dimensional+gel+electrophoresis+in+bacterial+membrane+protein+proteomics+and+perspectives.">Effectiveness and limitation of two-dimensional gel electrophoresis in bacterial membrane protein proteomics and perspectives.</a> Journal of Chromatography. B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 815 (1-2), 227-236 (2005).</li><li>Sury, M. D., Chen, J. X., Selbach, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SILAC+fly+allows+for+accurate+protein+quantification+in+vivo.">The SILAC fly allows for accurate protein quantification in vivo.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 9 (10), 2173-2183 (2010).</li><li>Zhang, G., Neubert, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+stable+isotope+labeling+by+amino+acids+in+cell+culture+(SILAC)+for+phosphotyrosine+protein+identification+and+quantitation.">Use of stable isotope labeling by amino acids in cell culture (SILAC) for phosphotyrosine protein identification and quantitation.</a> Methods in Molecular Biology. 527, 79-92 (2009).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SILAC-based+quantitative+MS+approach+for+real-time+recording+protein-mediated+cell-cell+interactions.">SILAC-based quantitative MS approach for real-time recording protein-mediated cell-cell interactions.</a> Scientific Reports. 8 (1), 8441 (2018).</li><li>Thompson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tandem+Mass+Tags:+A+Novel+Quantification+Strategy+for+Comparative+Analysis+of+Complex+Protein+Mixtures+by+MS/MS.">Tandem Mass Tags: A Novel Quantification Strategy for Comparative Analysis of Complex Protein Mixtures by MS/MS.</a> Analytical Chemistry. 75, 1895-1904 (2003).</li><li>Cheng, L., Pisitkun, T., Knepper, M. A., Hoffert, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+Labeling+Using+Isobaric+Tagging+Reagents+for+Quantitative+Phosphoproteomics.">Peptide Labeling Using Isobaric Tagging Reagents for Quantitative Phosphoproteomics.</a> Methods in Molecular Biology. 1355, 53-70 (2016).</li><li>Navarrete-Perea, J., Yu, Q., Gygi, S. P., Paulo, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streamlined+Tandem+Mass+Tag+(SL-TMT)+Protocol:+An+Efficient+Strategy+for+Quantitative+(Phospho)proteome+Profiling+Using+Tandem+Mass+Tag-Synchronous+Precursor+Selection-MS3.">Streamlined Tandem Mass Tag (SL-TMT) Protocol: An Efficient Strategy for Quantitative (Phospho)proteome Profiling Using Tandem Mass Tag-Synchronous Precursor Selection-MS3.</a> Journal of Proteome Research. 17 (6), 2226-2236 (2018).</li><li>Zecha, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TMT+Labeling+for+the+Masses:+A+Robust+and+Cost-efficient,+In-solution+Labeling+Approach.">TMT Labeling for the Masses: A Robust and Cost-efficient, In-solution Labeling Approach.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 18 (7), 1468-1478 (2019).</li><li>Bachor, R., Waliczek, M., Stefanowicz, P., Szewczuk, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trends+in+the+Design+of+New+Isobaric+Labeling+Reagents+for+Quantitative+Proteomics.">Trends in the Design of New Isobaric Labeling Reagents for Quantitative Proteomics.</a> Molecules. 24 (4), E701 (2019).</li><li>Suzuki-Hatano, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAV9-TAZ+Gene+Replacement+Ameliorates+Cardiac+TMT+Proteomic+Profiles+in+a+Mouse+Model+of+Barth+Syndrome.">AAV9-TAZ Gene Replacement Ameliorates Cardiac TMT Proteomic Profiles in a Mouse Model of Barth Syndrome.</a> Molecular Therapy - Methods &amp; Clinical Development. 13, 167-179 (2019).</li><li>Kirshenbaum, N., Michaelevski, I., Sharon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+large+protein+complexes+by+structural+mass+spectrometry.">Analyzing large protein complexes by structural mass spectrometry.</a> Journal of Visualized Experiments. (40), e1954 (2010).</li><li>Perumal, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+Preparation+for+Mass-spectrometry-based+Proteomics+Analysis+of+Ocular+Microvessels.">Sample Preparation for Mass-spectrometry-based Proteomics Analysis of Ocular Microvessels.</a> Journal of Visualized Experiments. (144), e59140 (2019).</li><li>Wessel, D., Fl&#252;gge, U. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+the+quantitative+recovery+of+protein+in+dilute+solution+in+the+presence+of+detergents+and+lipids.">A method for the quantitative recovery of protein in dilute solution in the presence of detergents and lipids.</a> Analytical Biochemistry. 138, 141-143 (1984).</li><li>Jensen, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STRING+8--a+global+view+on+proteins+and+their+functional+interactions+in+630+organisms.">STRING 8--a global view on proteins and their functional interactions in 630 organisms.</a> Nucleic Acids Research. 37, D412-D416 (2009).</li><li>Mi, H., Muruganujan, A., Casagrande, J. T., Thomas, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+gene+function+analysis+with+the+PANTHER+classification+system.">Large-scale gene function analysis with the PANTHER classification system.</a> Nature Protocols. 8 (8), 1551-1566 (2013).</li><li>Cirillo, E., Parnell, L. D., Evelo, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Review+of+Pathway-Based+Analysis+Tools+That+Visualize+Genetic+Variants.">A Review of Pathway-Based Analysis Tools That Visualize Genetic Variants.</a> Frontiers in Genetics. 8, 174 (2017).</li><li>Plaxton, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avoiding+Proteolysis+during+the+Extraction+and+Purification+of+Active+Plant+Enzymes.">Avoiding Proteolysis during the Extraction and Purification of Active Plant Enzymes.</a> Plant and Cell Physiology. 60 (4), 715-724 (2019).</li><li>Ryan, B. J., Henehan, G. T., Walls, D., Loughran, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Protein Chromatography: Methods and Protocols. , 53-69 (2017).</li><li>Fic, E., Kedracka-Krok, S., Jankowska, U., Pirog, A., Dziedzicka-Wasylewska, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+protein+precipitation+methods+for+various+rat+brain+structures+prior+to+proteomic+analysis.">Comparison of protein precipitation methods for various rat brain structures prior to proteomic analysis.</a> Electrophoresis. 31 (21), 3573-3579 (2010).</li></ol>

Авторам нечего раскрывать.

Для успешной подготовки образцов для протеомического анализа с использованием TMT основе изобарических изобарических методологий маркировки изотопов, очень важно выполнять извлечения белка очень тщательно при 4 КС и использовать буфер лиза, который содержит коктейль-ингибитор протеазы24,25. Коктейль ингибитора протеазы является важным реагентом, чтобы избежать неожиданной деградации белка во время переваривания белка. Одним из ключевых различий между нашим протоколом и текущим, предоставленным поставщиком, является то, что мы настоятельно рекомендуем использовать буфер лиза CHAPS на основе нашего опыта с клетками млекопитающих и тканями. Мы также предлагаем использовать метанол / хлороформ белка осадков подход как для клеточных гранул и тканей.
В идеале, экстракция белка, измерение, уменьшение /алкилирующие реагенты лечения, и метанол / хлороформ ные те же осадки выполняются в тот же день. После этой рекомендации приведет к более точной концентрации белка для последующей маркировки. Шаг выпадения белка имеет важное значение для удаления реагентов, которые будут мешать тандемной масс-спектрометрии. В том числе шаг осадков значительно повышает разрешение TMT26. В целом, основными преимуществами нашего протокола TMT являются высокая эффективность маркировки различных типов образцов, его воспроизводимость и достоверные данные.
Поскольку мультиплексный характер этой стратегии нецелевой протеомики TMT продолжает расширяться, она будет постепенно повышать способность исследователей в самых различных областях делать новые открытия. В частности, в биомедицинской области, мы и другие обнаружили, что эта технология становится все более информативным в исследованиях, исследуя новые механизмы действия в болезни и относительные последствия различных терапевтических. По всем этим причинам эта мощная технология дополняет репертуар других подходов OMICS, используемых в современных исследованиях, и предоставляет ключевую информацию, которая может служить для дальнейшего терапевтического развития.

Термин "протеомика" был впервые определен как крупномасштабная характеристика всего белкового дополнения клетки, ткани или организма1. Протеомный анализ позволяет иссмотреть механизмы и клеточные процессы, участвующие в развитии болезни, терапевтические пути, и здоровые системы с использованием методов для выполнения относительной количественной оценки уровня экспрессии белка2. Первоначальные описания таких исследований были опубликованы в 1975 году и продемонстрировали использование двухмерного полиакриламида геля электрофорусис (2D-PAGE) для этой цели1,3. 2D метод отделяет белки на основе заряда (изоэлектрическая фокусировка, IEF) и молекулярной массы (натрий dodecyl сульфат полиакриламимид гель электрофорексис, или SDS-PAGE)4. В течение многих лет, сочетание 2D-PAGE и последующего тандема масс-спектрометрии выполняется на каждом компоненте геля был наиболее распространенным нецелевым методом анализа экспрессии белка выполняется и определены многочисленные ранее неизвестные профили экспрессии белка5,6. Общие недостатки 2D-PAGE подход являетсято,что это отнимает много времени, не работает хорошо для гидрофобных белков, и Есть ограничения в общем количестве белков оценивается из-за низкой чувствительности7,8.
Стабильная маркировка изотопов аминокислотами в клеточной культуре (SILAC) стала следующим популярным подходом к выявлению и количественной оценке изобилия белка в образцах9. Она состоит из метаболической маркировки клеток, которые инкубируются в среде, не хватает стандартной незаменимой аминокислоты и дополнены изотоп-маркированной версии этой специфической аминокислоты10. Преимуществом этой техники является ее эффективность и точная маркировка9. Основным ограничением подхода SILAC является в первую очередь снижение темпов роста клеток, вызванных включением изотопных этикеток, что может быть особенно сложным в относительно чувствительных клеточных линиях, моделирующих заболевания человека11.
В 2003 году на поле12была введена новая и надежная техника протеомики с использованием тандемных массовых меток (TMT) изобобариата. TMT маркировки является мощным методом из-за его повышенной чувствительности для обнаружения относительных уровней экспрессии белка и постпереводных модификаций13. На эту дату публикации были разработаны наборы TMT, которые могут одновременно маркировать 6, 10, 11 или 16 образцов. В результате можно измерить изобилие пептидов в нескольких условиях с биологическими репликациями одновременно14,,15,,16. Недавно мы использовали TMT для характеристики сердечного протеомный профиль мыши модели синдрома Барта (BTHS)17. При этом, мы смогли продемонстрировать широкое улучшение в сердечных профилей bTHS мышей, обработанных с помощью генной терапии и определить новые белки, пострадавших от BTHS, которые показали новые терапевтические пути, участвующие в кардиомиопатии.
Здесь мы описываем подробный метод для выполнения мультиплекса TMT количественного протеомики анализов с использованием образцов тканей или клеточных гранул. Это может быть полезно для выполнения подготовки образца и маркировки до представления в ядро, потому что помеченные триптические пептиды являются более стабильными, чем сырые замороженные образцы, не все ядра имеют опыт обработки всех типов образцов, и подготовка образцов в лаборатории может сэкономить время для ядер, которые часто имеют длинные отставания. Для подробного описания масс-спектроскопии часть этого процесса, пожалуйста, см Kirshenbaum и др. и Перумал и др.18,19.
Протокол подготовки выборки состоит из следующих основных шагов: добыча, количественная оценка, осадки, пищеварение и маркировка. Основными преимуществами этого оптимизированного протокола являются то, что он снижает затраты на маркировку, улучшает экстракцию белка и последовательно генерирует высококачественные данные. Кроме того, мы описываем, как анализировать данные TMT для проверки тысяч белков в короткий промежуток времени. Мы надеемся, что этот протокол поощряет другие исследовательские группы рассмотреть вопрос о включении этой мощной методологии в свои исследования.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 M Triethylammonium bicarbonate (TEAB), 50 mL</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>90114</td>
			<td>Reagent for protein labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50% Hydroxylamine, 5 mL</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>90115</td>
			<td>Reagent for protein labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6283</td>
			<td>Reagent for protein digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anhydrous acetonitrile, LC-MS Grade</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>51101</td>
			<td>Reagent for protein labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonaze nuclease</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E1014</td>
			<td>DNA shearing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bond-Breaker TCEP solution, 5 mL</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>77720</td>
			<td>Reagent for protein labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA standard</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>23209</td>
			<td>Reagent for protein measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHAPS</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>28300</td>
			<td>Reagent for protein extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1145-1</td>
			<td>Reagent for protein precipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Tablet</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4693132001</td>
			<td>Reagent for protein extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC Protein Assay</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>500-0116</td>
			<td>Reagent for protein measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>Microsoft Office</td>
			<td></td>
			<td>Software for data analyses</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat block</td>
			<td>VWR analog</td>
			<td>12621-104</td>
			<td>Equipment for protein digestion incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>RDD002</td>
			<td>Reagent for protein extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A452-4</td>
			<td>Reagent for protein precipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Trypsin Protease, MS Grade</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>90058</td>
			<td>Reagent for protein digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>46436</td>
			<td>Reagent for protein extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sigma Plot 14.0</td>
			<td>Sigma Plot 14.0</td>
			<td></td>
			<td>Software for data analyses</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB120</td>
			<td>DNA shearing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectra Max i3x Multi-Mode Detection Platform</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td>Plate reader for protein measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>23275</td>
			<td>Reagent for protein measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Pierce Quantitative Fluorescent Peptide Assay</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>23290</td>
			<td>Reagent for protein measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Proteome Discoverer Software</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>OPTON-30945</td>
			<td>Software for data analyses</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMT 10plex Isobaric Label Reagent Set 0.8 mg, sufficient reagents for one 10plex isobaric experiment</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>90110</td>
			<td>Reagent for protein labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMT11-131C Label Reagent 5 mg</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A34807</td>
			<td>Reagent for protein labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water, LC-MS Grade</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>51140</td>
			<td>Reagent for protein extraction</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tmt sample preparation for proteomics facility submission and subsequent data analysis

Протеомные технологии являются мощными методологиями, которые могут помочь нашему пониманию механизмов действия в биологических системах, предоставляя глобальное представление о воздействии болезни, лечения или других состояний на протеом в целом. В настоящем докладе содержится подробный протокол для извлечения, количественной оценки, осадков, пищеварения, маркировки и последующего анализа данных образцов белков. Наш оптимизированный протокол маркировки TMT требует более низкой концентрации меток метки и обеспечивает стабильно надежные данные. Мы использовали этот протокол для оценки профилей экспрессии белка в различных тканях мыши (т.е. сердце, скелетные мышцы и мозг), а также клетки, культивированные в пробирке. Кроме того, мы демонстрируем, как оценить тысячи белков из полученного набора данных.

Здоровые и больные клетки были лисицированы в буфере CHAPS, подготовлены, как подробно описано в нашем методе маркировки TMT, и представлены в Университете Флориды Междисциплинарный центр биотехнологических исследований (UF-ICBR) Протеомика ядро для жидкой хроматографии с тандемной масс-спектрометрии. После получения и доставки данных из ядра, набор данных был открыт в программном обеспечении, поставляемом поставщиком, и были применены следующие фильтры отсечения: 2 уникальных пептида, ионы репортеров для каждого образца белка, присутствуют во всех каналах, и включают в себя только значительно измененные белки (p 0.05). В таблице 1 приводятся данные: 39 653 пептида, из которых 7211 имеют равные или более двух уникальных пептидов, а 3829 содержат ионы репортеров для всех каналов. Значения p для этих 3829 пептидов были рассчитаны по тесту студента т, и р 0,05 считались значительными. Кроме того, для определения относительного распределения белков от больных по сравнению с здоровыми клетками использовалось сокращение от изменения складок: регулируемых (синий) или upregulated (красный)(рисунок 1).
Список значительно дисрегулируемой экспрессии белка был оценен с помощью системы классификации онтологии PANTHER и анализа STRING. Анализы пантер ы показали категоризированный список белков, основанных на значительно более низком(рисунок 2A)или более высоком изобилии больных клеток на основе молекулярной функции(рисунок 2B). Струнный анализ белков значительно ниже(рисунок 2С)и выше(Рисунок 2D) изобилие определило несколько взаимодействий и сильные ассоциации между белками.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60970/60970fig1.jpg"> Рисунок 1: Вулкан участок отображения белков, изобилие которых не было значительно изменено (черный), значительно снижена (синий), или значительно увеличилось (красный) в больных по сравнению со здоровыми контрольными клетками. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60970/60970fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60970/60970fig2.jpg"> Рисунок 2: Репрезентативные оценки значительно дисрегулируемых хитов, выявленных PANTHER (A, B) и String (C, D) значительно более низких или более высоких белков изобилия. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60970/60970fig2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Всего пептиды</td>
			<td>Всего идентифицировано</td>
			<td>2 уникальных пептида</td>
			<td>Количественные белки</td>
			<td colspan="2">Значительно измененные белки</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Низкой</td>
			<td>Высокой</td>
		</tr>
<tr>
<td>39653</td>
			<td>7211</td>
			<td>4457</td>
			<td>3829</td>
			<td>296</td>
			<td>108</td>
		</tr>
</tbody></table>Таблица 1: Представительная таблица количественных белков на анализ набора данных.

Watch this Scientific Journal Video about TMT Sample Preparation for Proteomics Facility Submission and Subsequent Data Analysis at JoVE.com

TMT Sample Preparation for Proteomics Facility Submission and Subsequent Data Analysis

Мы представляем оптимизированный протокол маркировки тандемной массы (TMT), который включает подробную информацию по каждому из следующих шагов: экстракция белка, количественная оценка, осадки, пищеварение, маркировка, представление на объект протеомики и анализ данных.

TMT Пример ы подготовки к протеомики объекта представления и последующего анализа данных

Proteomic technologies are powerful methodologies that can aid our understanding of mechanisms of action in biological systems by providing a global view ...

Основными преимуществами этого протокола являются то, что он снижает затраты на маркировку, улучшает извлечение белка и генерирует высококачественные данные. Основными преимуществами нашего протокола являются высокая эффективность маркировки для различных типов образцов, его воспроизводимость и надежное получение данных. После изоляции четырехглавой мышечной ткани образцы из усыпляемой мыши в соответствии с IACUC утвержденный протокол, весят 10 миллиграммов мышечной ткани и использовать пинцет, чтобы отделить мышечные волокна.Чтобы создать лизат, перенесите разделенный образец ткани в двухмиллилитровую трубку, содержащую 200 микролитров одного миллиметра zirconia silica beads и 500 микролитров буфера lysis CHAPS. Поместите образцы в разрушитель бисера и выполните два последовательных 45-секундных пробега. После второго цикла, чтобы освободить ДНК-связанный белок, sonicate образца 10 раз в течение 10 секунд на sonication на 50% амплитуды с 30-секундными интервалами на льду.После последней звуковой передачи центрифуга лизировать и перенести супернатант в новую центрифугу трубки. Для уменьшения/алкилации реагентной обработки, перенесите 200 микрограммов белка на состояние в новые центрифуговые трубки и используйте свежий буфер лиза CHAPS, чтобы довести конечный объем в каждой трубке до 100 микролитров. Затем добавьте пять микролитров TCEP к каждой трубке и инкубировать образцы при 55 градусах по Цельсию в течение одного часа.В конце инкубации растворите девять миллиграммов иодоацетамида в 132 микролитров 100 миллимолярный TEAB и защитите полученный 375-миллимолярный иодоацетамидный раствор от света. Затем добавьте пять микролитров иодоацетамида в каждый образец и инкубировать в течение 30 минут при комнатной температуре, защищенной от света. Для высыпания метанола/хлороформа добавьте 400 микролитров метанола к каждому 100 микролитров белка и кратко вихрейте образцы.Для включения жидкостей, депонированных по бокам пробных труб, кратко центрифуга образцов и добавить 100 микролитров хлороформа в каждой трубке. После краткого вихря, быстро центрифуги труб снова собрать жидкость по бокам труб и добавить 300 микролитров воды в образцы. Vortex энергично получить однородные растворы и центрифугировать образцы в течение одной минуты в тех же условиях центрифуги.В конце центрифуги, перенесите трубки тщательно на стойку, не нарушая слоев и тщательно удалить супернатант. Добавьте 300 микролитров метанола в оставшиеся меж- и нижние фазы и вихрь образцы энергично снова. Центрифуга образцов в течение двух минут и тщательно аспирировать supernatants.Затем аккуратно аспирировать как можно больше жидкости из каждого образца, как это возможно под потоком воздуха, пока гранулы просто немного влажной. Оцените гидратацию каждые две минуты в течение примерно 10 минут. При необходимости гранулы можно хранить при температуре минус 80 градусов по Цельсию до дальнейшей обработки.Чтобы переварить белок, повторно усыпите осажденные гранулы в 100 микролитров буфера лиза TEAB и добавьте 100 микролитров раствора хранения трипсина к нижней части 100 микрограммов трипсина стеклянный флакон. Через пять минут при комнатной температуре добавьте 2,5 микролитров свежеприготовленного трипсина раствора на 100 микрограммов белка в каждый образец и инкубировать образцы при температуре 37 градусов по Цельсию за ночь. Для маркировки пептидов растворите каждый 0,8 миллиграмм tMT тег флакон с 41 микролитров ацетонитрила ангидроуса на тег и инкубировать реагенты в течение пяти минут при комнатной температуре с редкими вихрями, сохраняя при этом этикетки защищены от света.В конце инкубации кратко центрифугайте флаконы и аккуратно добавьте 41 микролитер реагента этикетки TMT к каждому 100 микролитровому образцу для часовой инкубации при комнатной температуре. В конце инкубации, утолить реакции с добавлением восьми микролитров 5%гидроксиламин в течение 15 минут при комнатной температуре. Затем разделить образцы на равные aliquots в новых трубок центрифуги для хранения при температуре минус 80 градусов по Цельсию.В этом репрезентативном приобретении данных было проанализировано 39 653 пептида, из которых 4 457 имели равные или более двух уникальных пептидов и 3 829 включали ионы репортеров для всех каналов. Для определения относительного распределения белков от больных было использовано изменение складок по сравнению со здоровыми клетками с 296 белками значительно меньшего изобилия и 108 белками значительно более высокого изобилия. Анализ PANTHER показал классифицированный список белков, основанный на значительно более низком или более высоком изобилии больных клеток на основе их молекулярной функции.Струнный анализ белков значительно более низкого или более высокого изобилия еще больше выявил несколько взаимодействий и сильную связь между белками. Дополнительные методы могут быть выполнены для выявления белково-белковых взаимодействий, классификации взаимодействий по группам и выявления взаимодействий в различных путях. Методы протеомики являются мощными инструментами в биомедицинских областях исследований для понимания механизмов развития болезни путем предоставления подробной информации об изобилии белка.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Lipid Droplet Isolation for Quantitative Mass Spectrometry Analysis

Липидное Выделение капельного для количественной анализа масс-спектрометрии

Lipid droplets are vital to the replication of a variety of different pathogens, most prominently the Hepatitis C Virus (HCV), as the putative site of ...

Optimal Preparation of Formalin Fixed Samples for Peptide Based Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Imaging Workflows

Оптимальная подготовка формалин фиксированной образцы для пептида основан матрицу помогает лазерная десорбция/ионизации масс-спектрометрия визуализации рабочих процессов

The use of matrix-assisted laser desorption/ionization, mass spectrometry imaging (MALDI MSI) has rapidly expanded, since this technique analyzes a host ...

Preparation of Chloroplast Sub-compartments from Arabidopsis for the Analysis of Protein Localization by Immunoblotting or Proteomics

Подготовка хлоропласта суб отсеков от Arabidopsis для анализа белка локализации Immunoblotting или протеомики

Chloroplasts are major components of plant cells. Such plastids fulfill many crucial functions, such as assimilation of carbon, sulfur and nitrogen as ...

Fully Autonomous Characterization and Data Collection from Crystals of Biological Macromolecules

Полностью автономные характеристика и сбора данных от кристаллов биологических макромолекул

High-brilliance X-ray beams coupled with automation have&#160;led to the use of synchrotron-based macromolecular X-ray crystallography (MX) beamlines for ...

Sample Preparation for Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Образец Подготовки для зонда Электроспрей ионизации масс-спектрометрии

Mass spectrometry (MS) is a powerful tool in analytical chemistry because it provides very accurate information about molecules, such as mass-to-charge ...

Analysis of SEC-SAXS data via EFA deconvolution and Scatter

Анализ данных SEC-SAXS с помощью деконволюции и рассеяния EFA

BioSAXS is a popular technique used in molecular and structural biology to determine the solution structure, particle size and shape, surface-to-volume ...

A Sample Preparation Pipeline for Microcrystals at the VMXm Beamline

Конвейер пробоподготовки микрокристаллов на лучевой линии VMXm

The mounting of microcrystals (&#60;10 &#181;m) for single crystal cryo-crystallography presents a non-trivial challenge. Improvements in data quality ...

Preparation of High-Temperature Sample Grids for Cryo-EM

Подготовка высокотемпературных сеток для отбора проб для крио-ЭМ

The sample grids for cryo-electron microscopy (cryo-EM) experiments are usually prepared at a temperature optimal for the storage of biological samples, ...

Shotgun Proteomics Sample Processing Automated by an Open-Source Lab Robot

Обработка образцов протеомики дробовика автоматизирована лабораторным роботом с открытым исходным кодом

Mass spectrometry-based shotgun proteomics experiments require multiple sample preparation steps, including enzymatic protein digestion and clean-up, ...

Single-Particle Cryo-EM Data Collection with Stage Tilt using Leginon

Сбор данных о крио-ЭМ с одной частицей с наклоном ступени с помощью Leginon

Single-particle analysis (SPA) by cryo-electron microscopy (cryo-EM) is now a mainstream technique for high-resolution structural biology. Structure ...