Name: tmt sample preparation for proteomics facility submission and subsequent data analysis
Uploaded: 2020-06-08T14:00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about TMT Sample Preparation for Proteomics Facility Submission and Subsequent Data Analysis at JoVE.com

Vi vill bekräfta UF-ICBR proteomics anläggning för deras bearbetning av våra prover. Detta arbete stöddes delvis av National Institutes of Health R01 HL136759-01A1 (GJP).

Den institutionella Animal Care and Use Committee från University of Florida godkänt alla djurstudier.
1. Beredning av reagenser
<ol><li>Förbered CHAPS Lysis Buffer (150 mM KCl, 50 mM HEPES pH = 7,4, 0,1% CHAPS och 1 proteashämmare cocktail tablett per 50 ml buffert). Buffert utan proteashämmare kan förvaras vid 4 °C i upp till 6 månader eller buffert med proteashämmare lagrad vid -20 °C upp till 1 år.</li>
	<li>Förbered 100 mM triethylammoniumbikarbonat (TEAB): Tillsätt 500 μL 1 M TEAB till 4,5 ml ultrarent vatten.</li>
	<li>Förbered 200 mM tris (2-karboxyetyl) fosfinhydroklorid (TCEP): Tillsätt 70 μL av 0,5 M TCEP, en denaturering reagens, till 70 μL ultrapure vatten. Tillsätt sedan 35 μL av 1 M TEAB.</li>
	<li>Förbered 5% hydroxylamin: Tillsätt 50 μL av 50% hydroxylamin till 450 μL av 100 mM TEAB.</li>
</ol>2. Proteinextraktion
<ol><li>Isolera quadriceps muskel från en avlivad mus enligt en IACUC godkänt protokoll. Frys och håll kvar vid -80 °C eller fortsätt med protokollet för omedelbar användning.</li>
	<li>Klipp för att isolera cirka 10 mg färsk eller fryst quadriceps musvävnad. Separata fibrer med pincett när du arbetar med skelettmuskulaturen. Alternativt, om du arbetar med cellkulturer, återanvända ~3 x 106 celler i 300 μl CHAPS lysis buffert och hoppa till steg 2.4.</li>
	<li>Homogenisera vävnaden med hjälp av en pärla disrupter med 2 ml rör fyllda med ca 200 μL av 1 mm zirkonia/kiselpärlor och 500 μl CHAPS lysis buffert. Skala upp eller ned beroende på vad som är lämpligt (t.ex. 5 mg vävnad i 250 μl CHAPS lysisbuffert).</li>
	<li>Utför ultraljudsbehandling (10x för 10 s vardera med 50% amplitud och 30 s intervall på is) för att frigöra protein bunden till DNA. Samma DNA-nedbrytningsresultat kan uppnås antingen med sprutlys genom att passera lysate 10x genom en 21 G nål fäst vid en 1 ml spruta, eller genom benzonase inkubation (44 U/mL) vid 37 °C i 30 min.</li>
	<li>Centrifugera lysate på 16.000 x g för 10 min vid 4 °C och överföra supernatanten till ett nytt centrifugrör.</li>
</ol>3. Proteinmätning
<ol><li>Bestäm supernatantens proteinkoncentration med hjälp av etablerade protokoll (se Materialregistret). OBS: Det är bäst att använda prover vid ≥2 μg/μL, men mindre koncentrerade prover kan också användas. Om ett mindre koncentrerat prov används kommer det att vara nödvändigt att på lämpligt sätt justera volymerna för de reducerande/alkylerande reagenserna i steg 5.1.</li>
	<li>Förbered en BSA standardkurva utspädning med CHAPS lysis buffert.</li>
	<li>Följ tillverkarens anvisningar och läs absorptionen på 750 nm efter 15 minuter.</li>
</ol>4. Reducering/alkylerande reagensbehandling
<ol><li>Överför 200 μg protein per tillstånd till ett nytt centrifugrör och justera till en slutlig volym på 100 μL med CHAPS lysisbuffert. Det är möjligt att skala upp till 200 μl när proteinkoncentrationen är för låg, men glöm inte att på lämpligt sätt justera volymen av reducerande/alkylerande reagens.</li>
	<li>Tillsätt 5 μl av 200 mM TCEP och inkubera proverna vid 55 °C i 1 h.</li>
	<li>Omedelbart före användning, bered 375 mM iodoacetamid genom att lösa upp ett rör av iodoacetamid (dvs. 9 mg) till 132 μL av 100 mM TEAB. Skydda denna lösning från ljus.</li>
	<li>Tillsätt 5 μL av 375 mM iodoacetamid till provet och inkubera i 30 min vid rumstemperatur (RT) skyddad från ljus.</li>
</ol>5. Metanol/kloroform nederbörd20
<ol><li>Tillsätt 400 μl metanol till varje 100 μL protein och virvelprover.</li>
	<li>Centrifug på 9.000 x g för 10 s på RT. Detta för att införliva vätskor som deponerats på sidorna av provröret.</li>
	<li>Tillsätt 100 μl kloroform till blandningen och virveln kort. Använd 200 μl kloroform om provet har en hög koncentration av fosfolipider.</li>
	<li>Centrifug på 9.000 x g för 10 s på RT. Detta för att införliva vätskor som deponerats på sidorna av provröret.</li>
	<li>Tillsätt 300 μL vatten och virvel kraftigt. Det är viktigt att få en homogen lösning.</li>
	<li>Centrifugera vid 9 000 x g i 1 min vid RT. Var mycket noga med att undvika att störa skikten när du överför röret till ett rack. OBS: Röret bör nu innehålla tre faser: 1) Toppskikt (dvs. supernatant), en blandning av vatten och metanol; 2) Mellanskikt (dvs interfas), vit fällt protein; och 3) Bottenskikt (dvs. bottenfas), kloroform.</li>
	<li>Ta försiktigt bort supernatanten.</li>
	<li>Tillsätt 300 μl metanol till den återstående interfasen och bottenfasen. Vortex kraftigt.</li>
	<li>Centrifugera vid 9 000 x g i 2 min vid RT. Var mycket noga med att undvika att störa skikten när du överför röret till ett rack.</li>
	<li>Ta försiktigt bort supernatanten.</li>
	<li>Sug försiktigt så mycket vätska som möjligt under en ström av luft (t.ex. med hjälp av en vakuumkoncentrator) på RT tills pelleten är bara lite fuktig (~ 10 min). Eftersom den nödvändiga tiden kan vara olika för varje prov, kontrollera varannan minut för att bedöma. Förvara pelleten vid -80 °C tills vidare bearbetning.</li>
</ol>6. Protein matsmältning
<ol><li>Resuspend fällde ut den fällda proteinpelleten i 100 μL TEAB lysisbuffert. OBS: Det är frivilligt att mäta proteinkoncentrationen i detta steg.</li>
	<li>Omedelbart före användning, bered 1 μg/μL trypsin genom att tillsätta 100 μL trypsinlagringslösning (50 mM ättiksyra) till botten av 100 μg trypsinglasflaskan och inkubatet i 5 min vid RT. Förvara kvarvarande reagens i engångsdoser vid -80 °C.</li>
	<li>Tillsätt 2,5 μl trypsin per 100 μg protein. Smält provet över natten vid 37 °C. Detta steg är avgörande för fullständig lösning av proteinet; inte ändra dessa villkor. Efter matsmältningen är det frivilligt att mäta proteinkoncentrationen med hjälp av standardproteinanalyser.</li>
</ol>7. Peptid märkning
<ol><li>Omedelbart före användning, jämvikta Reagenserna för TMT-etikettsats till RT.</li>
	<li>Lös upp var och en av de 0,8 mg TMT tag injektionsflaska genom tillsats av 41 μL vattenfri acetonitril till varje rör. Inkubera reagensen i 5 min vid RT med tillfällig virvel. Kort centrifugera rören. OBS: En koncentration på 0,8 mg TMT-tagg är vanligtvis tillräckligt för att märka två uppsättningar. Andra utredare har dock visat att denna koncentration kan minskas ytterligare och fortfarande ge tillförlitliga uppgifter15.</li>
	<li>Tillsätt försiktigt 41 μl av TMT-etikettreagensen till varje 100 μL-prov.</li>
	<li>Inkubera reaktionen i 1 h vid RT.</li>
	<li>Tillsätt 8 μl 5 % hydroxylamin i provet och inkubera i 15 minuter för att släcka reaktionen.</li>
	<li>Dela upp proverna i lika stora mängder i ett nytt centrifugrör och förvara på -80 °C. OBS: I detta steg är proverna stabila och kan lämnas in för massspektroskopi. Det är frivilligt att mäta koncentrationen vid denna punkt med hjälp av standardproteinanalyser.</li>
</ol>8. Massspektroskopi
<ol><li>Skicka proverna till en proteomik anläggning (denna studie använde UF ICBR Proteomics Core anläggning), där alla prover kombineras och renas med hjälp av C18 spinn kolumner. OBS: Diskutera med kärnfunktionen hur du skickar in proverna innan du förbereder dem för att bekräfta de exakta stegen de föredrar för inlämningar.</li>
	<li>Begär följande procedurer per kombinerat multiplexprov: helfasextraktion, HPLC (SCX, SE), zip-spets och LC-MS/MS (2 h gradient för protein-ID, om >10QE Plus).</li>
	<li>När data samlas in, kommer kärnan anläggningen bearbeta RAW-filer med hjälp av leverantörslevererad programvara för proteinidentifiering.</li>
</ol>9. Dataanalys
<ol><li>Data levereras vanligtvis från kärnan tillbaka till användaren i 7z-format, vilket kan kräva cirka 16 GB diskutrymme per varje datauppsättning (i detta fall 11 exempel). För databehandling kontrollerar du att en dator är tillgänglig som är minst 3,4 GHz.</li>
	<li>Extrahera filer med 7-Zip File Manager. Dessa extraherade filer innehåller RAW-data, pdStudy format fil och pdResultView format fil. Spara alla filer för ytterligare analyser.</li>
	<li>Öppna filen med Proteome Discovery 2.2 Software. Filformatet är "Filnamn.pdStudy". Om "File name.pdResultView" öppnas är det inte möjligt att välja kontrollexemplet.</li>
	<li>Välj kontrollexempel på panelen "Exempel".</li>
	<li>Öppna Resultat genom att välja ID på panelenAnalysresultat.</li>
	<li>Exportera till kalkylprogram.</li>
	<li>Spara rådata (alla proteiner identifierade).</li>
	<li>Öppna kalkylbladsprogramfilen. Detta kommer att innehålla alla proteiner som har identifierats.</li>
	<li>I kalkylbladsprogramfilen används funktionen "Filter" för att screena "Protein FDR Confidence: Combined" in high (kolumn B), "#Unique Peptider" högre än 2 (kolumn K) och antingen en av " AbundanceRatio" tom exklusivt (kolumn S upp till W).</li>
	<li>Infoga en kolumn för "p-value" beräkning med funktionen =TTEST(kontrollgrupp,experimentell grupp, svansar, typ)</li>
	<li>Infoga en kolumn för "Statistisk signifikans" med funktionen =OM(p-värde<0,05, "Signifikans","NS")</li>
	<li>Använd funktionen "Filter" för att visa "statistisk signifikans" som visar "Signifikans". Resultatet visar de analyserade proteinerna med statistisk signifikans i kontrollgruppen och den experimentella gruppen.</li>
	<li>Bestäm signifikant högre eller lägre proteinuttrycksförekomst i den experimentella gruppen jämfört med kontrollgruppen, sätt in en kolumn för "Förordning" med funktionen =OM(MEDEL(kontrollgrupp)>MEDEL(experimentell grupp),"Uppreglerad","Nedreglerad")</li>
</ol>10. Metoder för att utvärdera betydande träffar
<ol><li>För att identifiera protein-proteininteraktioner mellan de betydande träffar som identifierats i TMT-studierna, använd Sökverktyg för hämtning av interagerande gener/proteiner (STRING) version 11.021: <a href="https://string-db.org/" target="_blank">https://string-db.org/</a>
</li>
	<li>För att klassificera efter grupper (dvs. molekylär funktion, biologiska processer och proteinklasser) använder proteinanalys genom evolutionär relationships (PANTHER) ontologiklassificeringsprogram22: <a href="http://www.pantherdb.org/" target="_blank">http://www.pantherdb.org/</a>
</li>
	<li>För att identifiera proteininteraktioner i en mängd olika vägar, använd väg analys programvara23.</li>
</ol>11. Proteomisk dataöverföring till en databasbank
<ol><li>För att skicka proteomiska data till Proteomics IDEntificantions Database (PRIDE) eller Mass Spectrometry Interactive Virtual Environment (MassIVE) innehåller följande information: topplistefilerna (bearbetade massspektrumfiler i ett standardformat som mzXML, mzML, eller MGF), resultatfiler (spektrumidentifieringar i ett standardformat som mzIdentML eller mzTab) och råspektrumfiler (råa massspektrumfiler i ett icke-standard- eller instrumentspecifikt format som . RAW-filer eller . WIFF-filer).</li>
	<li>Om du vill skicka, skapa ett konto och inkludera information som anknytning och projektinformation. Välj sedan de filer som anges i steg 11.1 och ladda upp dem.</li>
	<li>Om du vill skapa en officiell datauppsättning kör du ett arbetsflöde för inlämning på dessa uppladdade filer. Efter inlämningen är datauppsättningen privat i databasbanken. Med det privata alternativet är data endast tillgängliga för behöriga användare. Det finns ytterligare två alternativ: 1) Delad datauppsättning, som ger tillgång till journalgranskare och medarbetare; eller 2) Offentlig datauppsättning, som visas i offentliga datauppsättningsökningar. En annan viktig egenskap i dessa databaser är möjligheten att uppdatera uppladdade data och associera efterföljande publikationer med den befintliga datauppsättningen.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Graves, P. R., Haystead, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+biologist's+guide+to+proteomics.">Molecular biologist's guide to proteomics.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 66 (1), 39-63 (2002).</li><li>Erdjument-Bromage, H., Huang, F. K., Neubert, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+Preparation+for+Relative+Quantitation+of+Proteins+Using+Tandem+Mass+Tags+(TMT)+and+Mass+Spectrometry+(MS).">Sample Preparation for Relative Quantitation of Proteins Using Tandem Mass Tags (TMT) and Mass Spectrometry (MS).</a> Methods in Molecular Biology. 1741, 135-149 (2018).</li><li>O'Farrell, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+two-dimensional+electrophoresis+of+proteins.">High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins.</a> Journal of Biological Chemistry. 250 (10), 4007-4021 (1975).</li><li>Rabilloud, T., Lelong, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-dimensional+gel+electrophoresis+in+proteomics:+a+tutorial.">Two-dimensional gel electrophoresis in proteomics: a tutorial.</a> Journal of Proteomics. 74 (10), 1829-1841 (2011).</li><li>Ong, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+isotope+labeling+by+amino+acids+in+cell+culture,+SILAC,+as+a+simple+and+accurate+approach+to+expression+proteomics.">Stable isotope labeling by amino acids in cell culture, SILAC, as a simple and accurate approach to expression proteomics.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 1 (5), 376-386 (2002).</li><li>Anderson, N. G., Anderson, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Twenty+years+of+two-dimensional+electrophoresis:+Past,+present+and+future.">Twenty years of two-dimensional electrophoresis: Past, present and future.</a> Electrophoresis. 17 (3), 443-453 (1996).</li><li>Haynes, P. A., Yates, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteome+profiling-pitfalls+and+progress.">Proteome profiling-pitfalls and progress.</a> Yeast. 17 (2), 81-87 (2000).</li><li>Bunai, K., Yamane, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effectiveness+and+limitation+of+two-dimensional+gel+electrophoresis+in+bacterial+membrane+protein+proteomics+and+perspectives.">Effectiveness and limitation of two-dimensional gel electrophoresis in bacterial membrane protein proteomics and perspectives.</a> Journal of Chromatography. B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 815 (1-2), 227-236 (2005).</li><li>Sury, M. D., Chen, J. X., Selbach, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SILAC+fly+allows+for+accurate+protein+quantification+in+vivo.">The SILAC fly allows for accurate protein quantification in vivo.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 9 (10), 2173-2183 (2010).</li><li>Zhang, G., Neubert, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+stable+isotope+labeling+by+amino+acids+in+cell+culture+(SILAC)+for+phosphotyrosine+protein+identification+and+quantitation.">Use of stable isotope labeling by amino acids in cell culture (SILAC) for phosphotyrosine protein identification and quantitation.</a> Methods in Molecular Biology. 527, 79-92 (2009).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SILAC-based+quantitative+MS+approach+for+real-time+recording+protein-mediated+cell-cell+interactions.">SILAC-based quantitative MS approach for real-time recording protein-mediated cell-cell interactions.</a> Scientific Reports. 8 (1), 8441 (2018).</li><li>Thompson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tandem+Mass+Tags:+A+Novel+Quantification+Strategy+for+Comparative+Analysis+of+Complex+Protein+Mixtures+by+MS/MS.">Tandem Mass Tags: A Novel Quantification Strategy for Comparative Analysis of Complex Protein Mixtures by MS/MS.</a> Analytical Chemistry. 75, 1895-1904 (2003).</li><li>Cheng, L., Pisitkun, T., Knepper, M. A., Hoffert, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+Labeling+Using+Isobaric+Tagging+Reagents+for+Quantitative+Phosphoproteomics.">Peptide Labeling Using Isobaric Tagging Reagents for Quantitative Phosphoproteomics.</a> Methods in Molecular Biology. 1355, 53-70 (2016).</li><li>Navarrete-Perea, J., Yu, Q., Gygi, S. P., Paulo, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streamlined+Tandem+Mass+Tag+(SL-TMT)+Protocol:+An+Efficient+Strategy+for+Quantitative+(Phospho)proteome+Profiling+Using+Tandem+Mass+Tag-Synchronous+Precursor+Selection-MS3.">Streamlined Tandem Mass Tag (SL-TMT) Protocol: An Efficient Strategy for Quantitative (Phospho)proteome Profiling Using Tandem Mass Tag-Synchronous Precursor Selection-MS3.</a> Journal of Proteome Research. 17 (6), 2226-2236 (2018).</li><li>Zecha, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TMT+Labeling+for+the+Masses:+A+Robust+and+Cost-efficient,+In-solution+Labeling+Approach.">TMT Labeling for the Masses: A Robust and Cost-efficient, In-solution Labeling Approach.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 18 (7), 1468-1478 (2019).</li><li>Bachor, R., Waliczek, M., Stefanowicz, P., Szewczuk, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trends+in+the+Design+of+New+Isobaric+Labeling+Reagents+for+Quantitative+Proteomics.">Trends in the Design of New Isobaric Labeling Reagents for Quantitative Proteomics.</a> Molecules. 24 (4), E701 (2019).</li><li>Suzuki-Hatano, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAV9-TAZ+Gene+Replacement+Ameliorates+Cardiac+TMT+Proteomic+Profiles+in+a+Mouse+Model+of+Barth+Syndrome.">AAV9-TAZ Gene Replacement Ameliorates Cardiac TMT Proteomic Profiles in a Mouse Model of Barth Syndrome.</a> Molecular Therapy - Methods &amp; Clinical Development. 13, 167-179 (2019).</li><li>Kirshenbaum, N., Michaelevski, I., Sharon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+large+protein+complexes+by+structural+mass+spectrometry.">Analyzing large protein complexes by structural mass spectrometry.</a> Journal of Visualized Experiments. (40), e1954 (2010).</li><li>Perumal, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+Preparation+for+Mass-spectrometry-based+Proteomics+Analysis+of+Ocular+Microvessels.">Sample Preparation for Mass-spectrometry-based Proteomics Analysis of Ocular Microvessels.</a> Journal of Visualized Experiments. (144), e59140 (2019).</li><li>Wessel, D., Fl&#252;gge, U. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+the+quantitative+recovery+of+protein+in+dilute+solution+in+the+presence+of+detergents+and+lipids.">A method for the quantitative recovery of protein in dilute solution in the presence of detergents and lipids.</a> Analytical Biochemistry. 138, 141-143 (1984).</li><li>Jensen, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STRING+8--a+global+view+on+proteins+and+their+functional+interactions+in+630+organisms.">STRING 8--a global view on proteins and their functional interactions in 630 organisms.</a> Nucleic Acids Research. 37, D412-D416 (2009).</li><li>Mi, H., Muruganujan, A., Casagrande, J. T., Thomas, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+gene+function+analysis+with+the+PANTHER+classification+system.">Large-scale gene function analysis with the PANTHER classification system.</a> Nature Protocols. 8 (8), 1551-1566 (2013).</li><li>Cirillo, E., Parnell, L. D., Evelo, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Review+of+Pathway-Based+Analysis+Tools+That+Visualize+Genetic+Variants.">A Review of Pathway-Based Analysis Tools That Visualize Genetic Variants.</a> Frontiers in Genetics. 8, 174 (2017).</li><li>Plaxton, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avoiding+Proteolysis+during+the+Extraction+and+Purification+of+Active+Plant+Enzymes.">Avoiding Proteolysis during the Extraction and Purification of Active Plant Enzymes.</a> Plant and Cell Physiology. 60 (4), 715-724 (2019).</li><li>Ryan, B. J., Henehan, G. T., Walls, D., Loughran, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Protein Chromatography: Methods and Protocols. , 53-69 (2017).</li><li>Fic, E., Kedracka-Krok, S., Jankowska, U., Pirog, A., Dziedzicka-Wasylewska, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+protein+precipitation+methods+for+various+rat+brain+structures+prior+to+proteomic+analysis.">Comparison of protein precipitation methods for various rat brain structures prior to proteomic analysis.</a> Electrophoresis. 31 (21), 3573-3579 (2010).</li></ol>

Författarna har inget att avslöja.

För att framgångsrikt förbereda prover för proteomisk analys med TMT-baserade isober stabil isotop märkning metoder, är det viktigt att utföra protein extraktioner mycket noggrant vid 4 ° C och att använda en lysis buffert som innehåller en proteashämmare cocktail24,25. Proteashämmarecocktailen är ett avgörande reagens för att undvika oväntad proteinnedbrytning under proteinnedbrytning. En viktig skillnad mellan vårt protokoll och den nuvarande som tillhandahålls av säljaren är att vi starkt rekommenderar användning av CHAPS lysis buffert baserat på vår erfarenhet av däggdjursceller och vävnader. Vi föreslår också att du använder en metanol/kloroform protein nederbörd strategi för både cell pellets och vävnader.
Helst utförs proteinutvinning, mätning, reducering/alkylerande reagensbehandlingar och metanol/kloroformnederbörd på samma dag. Enligt denna rekommendation kommer att resultera i mer exakta proteinkoncentrationer för efterföljande märkning. Proteinutfällningssteget är viktigt för avlägsnande av reagenser som stör tandemmasspektrometri. Inklusive nederbörden steg avsevärt ökar upplösningen av TMT26. Sammanfattningsvis är de stora fördelarna med vårt TMT-protokoll de höga märkningseffektiviteten för olika typer av prover, dess reproducerbarhet och tillförlitliga data som förvärvats.
Eftersom multiplex karaktär av denna TMT untargeted proteomics strategi fortsätter att expandera, kommer det successivt öka förmågan hos forskare inom en mängd olika områden för att göra nya upptäckter. Specifikt inom det biomedicinska området har vi och andra funnit denna teknik alltmer informativ i studier som utforskar nya verkningsmekanismer vid sjukdomar och relativa effekter av olika terapier. Av alla dessa skäl kompletterar denna kraftfulla teknik repertoaren av andra OMICS-metoder som används i moderna forskningsstudier och ger viktig information som kan vägleda ytterligare terapeutisk utveckling.

Termen "proteomik" definierades först som storskalig karakterisering av hela proteinet komplement av en cell, vävnad eller organism1. Proteomiska analyser möjliggör undersökning av mekanismer och cellulära processer som är involverade i sjukdomsutveckling, terapeutiska vägar och hälsosamma system med hjälp av tekniker för att utföra relativa kvantation av proteinuttrycksnivåer2. De första beskrivningarna av sådana studier publicerades 1975 och visade att tvådimensionell polyakrylamidgelelektrofores (2D-PAGE) användes för detta ändamål1,3. 2D-metoden separerar proteiner baserat på laddning (isoelektrisk fokusering, IEF) och molekylmassa (natriumdykoylsulfat polyakristallidgelelektrofores eller SDS-PAGE)4. För år, kombinationen av 2D-PAGE och efterföljande tandem massa spektrometri utförs på varje gel komponent var den vanligaste oriktade protein uttryck analys teknik utförs och identifierade många tidigare okända protein uttryck profiler5,6. Allmänna nackdelar med 2D-PAGE-metoden är att det är tidskrävande, inte fungerar bra för hydrofoba proteiner, och det finns begränsningar i det totala antalet proteiner som bedöms på grund av låg känslighet7,8.
Den stabila isotopmärkning av aminosyror i cellodling (SILAC) metoden blev nästa populära metod för att identifiera och kvantifiera protein överflöd i prov9. Den består av metabolisk märkning av celler som inkuberas i medium saknar en standard essentiell aminosyra och kompletteras med en isotop-märkt version av den specifika aminosyran10. Fördelen med denna teknik är dess effektivitet och exakta märkning9. Den huvudsakliga begränsningen till SILAC-metoden är främst den minskade celltillväxthastigheten som orsakas av isotopetikettinblandning, vilket kan vara särskilt utmanande i relativt känsliga cellinjer som modellerar sjukdomar hos människor11.
År 2003 introducerades en ny och robust proteomikteknik med tandem masstagg (TMT) isobaric etiketter till fältet12. TMT märkning är en kraftfull metod på grund av dess ökade känslighet för att upptäcka relativa proteinuttryck nivåer och posttranslational modifieringar13. Från och med detta publiceringsdatum har TMT-kit utvecklats som samtidigt kan märka 6, 10, 11 eller 16 prover. Som ett resultat är det möjligt att mäta peptidförekomst i flera förhållanden med biologiska replikat samtidigt14,15,16. Vi använde nyligen TMT för att karakterisera hjärtproteomisk profil av en mus modell av Barth syndrom (BTHS)17. På så sätt kunde vi visa omfattande förbättring i hjärt profiler av BTHS möss behandlas med genterapi och identifiera nya proteiner påverkas av BTHS som visade nya terapeutiska vägar som deltar i kardiomyopatier.
Här beskriver vi en detaljerad metod för att utföra multiplex TMT kvantitativa proteomics analyser med hjälp av vävnadsprover eller cellpellets. Det kan vara fördelaktigt att utföra provberedningen och märkningen innan de lämnas in till en kärna eftersom de märkta tryppptiska peptiderna är stabilare än råfrysta prover, inte alla kärnor har erfarenhet av att hantera alla provtyper, och förbereda prover i ett laboratorium kan spara tid för kärnor, som ofta har långa eftersläpningar. För detaljerade beskrivningar av massspektroskopi delen av denna process se Kirshenbaum et al. och Perumal et al.18,19.
Provberedningsprotokollet består av följande huvudsteg: extraktion, kvantifiering, nederbörd, matsmältning och märkning. De största fördelarna med detta optimerade protokoll är att det minskar kostnaderna för märkning, förbättrar proteinutvinning, och konsekvent genererar högkvalitativa data. Dessutom beskriver vi hur man analyserar TMT-data för att avskärma tusentals proteiner på kort tid. Vi hoppas att detta protokoll uppmuntrar andra forskargrupper att överväga att införliva denna kraftfulla metodik i sina studier.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 M Triethylammonium bicarbonate (TEAB), 50 mL</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>90114</td>
			<td>Reagent for protein labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50% Hydroxylamine, 5 mL</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>90115</td>
			<td>Reagent for protein labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6283</td>
			<td>Reagent for protein digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anhydrous acetonitrile, LC-MS Grade</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>51101</td>
			<td>Reagent for protein labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonaze nuclease</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E1014</td>
			<td>DNA shearing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bond-Breaker TCEP solution, 5 mL</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>77720</td>
			<td>Reagent for protein labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA standard</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>23209</td>
			<td>Reagent for protein measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHAPS</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>28300</td>
			<td>Reagent for protein extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1145-1</td>
			<td>Reagent for protein precipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Tablet</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4693132001</td>
			<td>Reagent for protein extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC Protein Assay</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>500-0116</td>
			<td>Reagent for protein measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>Microsoft Office</td>
			<td></td>
			<td>Software for data analyses</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat block</td>
			<td>VWR analog</td>
			<td>12621-104</td>
			<td>Equipment for protein digestion incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>RDD002</td>
			<td>Reagent for protein extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A452-4</td>
			<td>Reagent for protein precipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Trypsin Protease, MS Grade</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>90058</td>
			<td>Reagent for protein digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>46436</td>
			<td>Reagent for protein extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sigma Plot 14.0</td>
			<td>Sigma Plot 14.0</td>
			<td></td>
			<td>Software for data analyses</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB120</td>
			<td>DNA shearing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectra Max i3x Multi-Mode Detection Platform</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td>Plate reader for protein measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>23275</td>
			<td>Reagent for protein measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Pierce Quantitative Fluorescent Peptide Assay</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>23290</td>
			<td>Reagent for protein measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Proteome Discoverer Software</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>OPTON-30945</td>
			<td>Software for data analyses</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMT 10plex Isobaric Label Reagent Set 0.8 mg, sufficient reagents for one 10plex isobaric experiment</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>90110</td>
			<td>Reagent for protein labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMT11-131C Label Reagent 5 mg</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A34807</td>
			<td>Reagent for protein labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water, LC-MS Grade</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>51140</td>
			<td>Reagent for protein extraction</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tmt sample preparation for proteomics facility submission and subsequent data analysis

Proteomiska tekniker är kraftfulla metoder som kan hjälpa vår förståelse av verkningsmekanismer i biologiska system genom att ge en global bild av effekterna av en sjukdom, behandling eller andra villkor på proteom som helhet. Denna rapport ger ett detaljerat protokoll för utvinning, kvantifiering, nederbörd, matsmältning, märkning och efterföljande dataanalys av proteinprover. Vårt optimerade TMT-märkningsprotokoll kräver en lägre taggetikettkoncentration och uppnår konsekvent tillförlitliga data. Vi har använt detta protokoll för att utvärdera proteinuttrycksprofiler i en mängd olika musvävnader (dvs. hjärta, skelettmuskulatur och hjärna) samt celler som odlas in vitro. Dessutom visar vi hur man utvärderar tusentals proteiner från den resulterande datauppsättningen.

Friska och sjuka celler var lysed i CHAPS buffert, som beskrivs som beskrivs i vår TMT märkning metod, och lämnas till University of Florida tvärvetenskapliga Center for Biotechnology Research (UF-ICBR) Proteomics Core för flytande kromatografi med tandem masspektrometri. Efter datainsamling och dataleverans från kärnan öppnades datauppsättningen i programvara som levereras av leverantörer och följande cutoff-filter tillämpades: ≥2 unika peptider, reporterjoner för varje proteinprov som finns i alla kanaler och omfattar endast väsentligt förändrade proteiner (p ≤ 0,05). Tabell 1 sammanfattar data: 39 653 totala peptider, varav 7 211 har lika med eller större än två unika peptider, och 3 829 inkluderar reporterjoner för alla kanaler. P-värdena för dessa 3 829 peptider beräknades av Students t-test och p ≤ 0,05 ansågs vara signifikanta. Dessutom användes en nedskärning av vikbyten för att bestämma den relativa fördelningen av proteiner från sjuka jämfört med friska celler: nedreglerad (blå) eller uppreglerad (röd) (figur 1).
Listan över signifikant dysregulated protein uttryck bedömdes med hjälp av PANTHER ontology klassificeringssystem och STRING analyser. Panther analyser visade en kategoriserad lista över proteiner baserade på betydligt lägre (figur 2A) eller högre förekomst i sjuka celler baserat på molekylär funktion (figur 2B). Stränganalyser av proteiner med betydligt lägre (figur 2C) och högre (figur 2D) överflöd identifierade flera interaktioner och starka associationer mellan proteiner.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60970/60970fig1.jpg"> Figur 1: Vulkantomt som visar proteiner vars överflöd inte signifikant förändrades (svart), signifikant sänkt (blå) eller signifikant ökat (rött) i sjuka kontra friska kontrollceller. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60970/60970fig1large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60970/60970fig2.jpg"> Figur 2: Representativa utvärderingar av signifikant dysreglerade träffar som identifierats av PANTHER (A, B) och String (C, D) av betydligt lägre eller högre förekomstproteiner. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60970/60970fig2large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Totala peptider</td>
			<td>Totalt identifierat</td>
			<td>≥ 2 unika peptider</td>
			<td>Kvantifierade proteiner</td>
			<td colspan="2">Signifikant förändrade proteiner</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Låg</td>
			<td>Hög</td>
		</tr>
<tr>
<td>39653</td>
			<td>7211</td>
			<td>4457</td>
			<td>3829</td>
			<td>296</td>
			<td>108</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 1: Representativ tabell över kvantifierade proteiner per datamängdsanalys.

Watch this Scientific Journal Video about TMT Sample Preparation for Proteomics Facility Submission and Subsequent Data Analysis at JoVE.com

TMT Sample Preparation for Proteomics Facility Submission and Subsequent Data Analysis

Vi presenterar en optimerad tandem masstagg (TMT) märkning protokoll som innehåller detaljerad information för vart och ett av följande steg: proteinutvinning, kvantifiering, nederbörd, matsmältning, märkning, inlämning till en proteomics anläggning och dataanalyser.

TMT Provberedning för Proteomics Facility Submission och efterföljande dataanalys

Proteomic technologies are powerful methodologies that can aid our understanding of mechanisms of action in biological systems by providing a global view ...

De stora fördelarna med detta protokoll är att det minskar kostnaderna för märkning, förbättrar protein extraktion, och genererar högkvalitativa data. De stora fördelarna med vårt protokoll är de höga märkningseffektiviteterna för de olika typerna av prover, dess reproducerbarhet och det tillförlitliga datainsamlingen. Efter att isolera quadriceps muskel vävnadsprover från en avlivas mus enligt en IACUC godkänt protokoll, väg ut 10 milligram muskelvävnad och använda pincett för att separera muskelfibrerna.För att skapa en lysate, överför det separerade vävnadsprovet till ett två milliliterrör som innehåller 200 mikroliter av en millimeters zirkoniasilicapärlor och 500 mikroliter av CHAPS-lysbuffert. Placera proverna i en pärla disruptor och utföra två sekventiella 45-sekunders körningar. Efter den andra cykeln, för att frigöra DNA-bundet protein, sonikera provet 10 gånger i 10 sekunder per ultraljudsbehandling vid en 50%amplitud med 30-sekunders intervall på is.Efter den sista ultraljudsbehandling, centrifug den lysate och överföra supernatant till en ny centrifug röret. För reducering/alkylering av reagensbehandling, överför 200 mikrogram protein per tillstånd till nya centrifugrör och använd färsk CHAPS-lysbuffert för att få den slutliga volymen i varje rör upp till 100 mikroliter. Därefter lägger du till fem mikroliter TCEP till varje rör och inkubera proverna vid 55 grader Celsius i en timme.Vid slutet av inkubationen, lös nio milligram iodoacetamid i 132 mikroliter på 100 millimolar TEAB och skydda den resulterande 375 millimolen iodoacetamidlösningen från ljus. Tillsätt sedan fem mikroliter iodoacetamid till varje prov och inkubera i 30 minuter vid rumstemperatur skyddad från ljus. För metanol/kloroformutfällning, tillsätt 400 mikroliter metanol till varje 100 mikroliter protein och kort virvelproverna.För att införliva de vätskor som deponeras på sidorna av provrören, kort centrifugera proverna och tillsätt 100 mikroliter kloroform till varje rör. Efter en kort virvelning, snabbt centrifugera rören igen för att samla vätskan på sidorna av rören och tillsätt 300 mikroliter vatten till proverna. Vortex kraftigt för att erhålla homogena lösningar och centrifugera proverna under en minut under samma centrifugförhållanden.I slutet av centrifugen överför du rören försiktigt till ett rack utan att störa lagren och ta försiktigt bort supernatanten. Tillsätt 300 mikroliter metanol till de återstående inter- och bottenfaserna och virvelproverna kraftigt igen. Centrifugera proverna i två minuter och aspirera försiktigt supernatanterna.Sedan försiktigt aspirera så mycket vätska från varje prov som möjligt under en ström av luft tills pellets är bara lite fuktig. Bedöm hydrering varannan minut i ca 10 minuter. Om det behövs kan pelletsen förvaras vid minus 80 grader Celsius tills vidare bearbetning.För att smälta proteinet, resuspend den utfällda pelleten i 100 mikroliter av TEAB lysbuffert och tillsätt 100 mikroliter trypsin lagringslösning till botten av en 100 mikrogram trypsin glasflaska. Efter fem minuter i rumstemperatur, tillsätt 2,5 mikroliter av den nyberedda trypsinlösningen per 100 mikrogram protein till varje prov och inkubera proverna vid 37 grader Celsius över natten. För peptidmärkning, lös varje 0,8 milligram TMT tag injektionsflaska med 41 mikroliter av vattenfri acetonitril per tagg och inkubera reagenserna i fem minuter vid rumstemperatur med tillfällig virvelning samtidigt som etiketterna skyddas från ljus.I slutet av inkubationen centrifugerar du injektionsflaskan kort och tillsätt försiktigt 41 mikroliter av TMT-etikettreagens till varje 100 mikroliterprov för en timmes inkubering vid rumstemperatur. Vid slutet av inkubationen, släck reaktionerna med tillsats av åtta mikroliter av 5%hydroxylamin i 15 minuter vid rumstemperatur. Sedan dela upp proverna i lika alikvoter i nya centrifugrör för förvaring vid minus 80 grader Celsius.I denna representativa data förvärv, 39, 653 totala peptider analyserades, varav 4, 457 hade lika eller större än två unika peptider och 3, 829 ingår reporter joner för alla kanaler. En vik förändring cutoff användes för att bestämma den relativa fördelningen av proteiner från sjuka jämfört med friska celler med 296 proteiner av betydligt lägre överflöd och 108 proteiner av betydligt högre förekomst observerats. PANTHER analys visade en kategoriserad lista över proteiner baserade på betydligt lägre eller högre överflöd av sjuka celler baserat på deras molekylära funktion.Stränganalys av proteinerna av betydligt lägre eller högre överflöd identifierade ytterligare flera interaktioner och starka associationer mellan proteiner. Ytterligare metoder kan utföras för att identifiera protein-till-protein interaktioner, att klassificera interaktionerna efter grupper, och att identifiera interaktionerna i en mängd olika vägar. Proteomik tekniker är kraftfulla verktyg inom de biomedicinska forskningsfälten för att förstå mekanismerna för sjukdomsutveckling genom att tillhandahålla detaljerad information protein överflöd.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Lipid Droplet Isolation for Quantitative Mass Spectrometry Analysis

Lipid Droplet Isolation för Kvantitativ masspektrometri Analys

Lipid droplets are vital to the replication of a variety of different pathogens, most prominently the Hepatitis C Virus (HCV), as the putative site of ...

Optimal Preparation of Formalin Fixed Samples for Peptide Based Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Imaging Workflows

Optimal förberedelse av formalinbeständiga prover för peptid baserat Matrix assisterad Laser Desorption/jonisering masspektrometri Imaging arbetsflöden

The use of matrix-assisted laser desorption/ionization, mass spectrometry imaging (MALDI MSI) has rapidly expanded, since this technique analyzes a host ...

Preparation of Chloroplast Sub-compartments from Arabidopsis for the Analysis of Protein Localization by Immunoblotting or Proteomics

Beredning av kloroplast sub fack från Arabidopsis för analys av Protein lokalisering av Immunoblotting eller proteomik

Chloroplasts are major components of plant cells. Such plastids fulfill many crucial functions, such as assimilation of carbon, sulfur and nitrogen as ...

Fully Autonomous Characterization and Data Collection from Crystals of Biological Macromolecules

Helt självständigt karakterisering och datainsamling från kristaller av biologiska makromolekyler

High-brilliance X-ray beams coupled with automation have&#160;led to the use of synchrotron-based macromolecular X-ray crystallography (MX) beamlines for ...

Sample Preparation for Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Provberedning för probe electrospray jonisering Masspektrometri

Mass spectrometry (MS) is a powerful tool in analytical chemistry because it provides very accurate information about molecules, such as mass-to-charge ...

Analysis of SEC-SAXS data via EFA deconvolution and Scatter

Analys av SEC-SAXS-data via EFA-deconvolution och Scatter

BioSAXS is a popular technique used in molecular and structural biology to determine the solution structure, particle size and shape, surface-to-volume ...

A Sample Preparation Pipeline for Microcrystals at the VMXm Beamline

En provförberedande pipeline för mikrokritaler vid VMXm Beamline

The mounting of microcrystals (&#60;10 &#181;m) for single crystal cryo-crystallography presents a non-trivial challenge. Improvements in data quality ...

Preparation of High-Temperature Sample Grids for Cryo-EM

Beredning av högtemperaturprovgaller för kryo-EM

The sample grids for cryo-electron microscopy (cryo-EM) experiments are usually prepared at a temperature optimal for the storage of biological samples, ...

Shotgun Proteomics Sample Processing Automated by an Open-Source Lab Robot

Hagelgevär Proteomics provbehandling automatiserad av en labbrobot med öppen källkod

Mass spectrometry-based shotgun proteomics experiments require multiple sample preparation steps, including enzymatic protein digestion and clean-up, ...

Single-Particle Cryo-EM Data Collection with Stage Tilt using Leginon

Single-Particle Cryo-EM-datainsamling med steglutning med Leginon

Single-particle analysis (SPA) by cryo-electron microscopy (cryo-EM) is now a mainstream technique for high-resolution structural biology. Structure ...