Name: high-frequency ultrasound echocardiography to assess zebrafish cardiac function
Uploaded: 2020-03-12T15:00:00
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フレッド・ロバーツの技術サポートと原稿の改訂に感謝します。

ゼブラフィッシュに関するすべての手続きは、当社の制度的動物管理および使用委員会によって承認され、USDA動物福祉法に準拠しています。
1. 実験的なセットアップ
<ol><li>
画像取得用プラットフォームの設定
	<ol>
<li>小さいはさみやメスを使用すると、スキャン中に魚を保持するために12時の位置でスポンジの切開を行います。スポンジをガラス容器に入?...

<ol>
	<li>Santoriello, C., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hooked!+Modeling+human+disease+in+zebrafish.">Hooked! Modeling human disease in zebrafish.</a> Journal of Clinical Investigation. 122 (7), 2337-2343 (2012).</li><li>Verkerk, A. O., Remme, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish:+a+novel+research+tool+for+cardiac+(patho)electrophysiology+and+ion+channel+disorders.">Zebrafish: a novel research tool for cardiac (patho)electrophysiology and ion channel disorders.</a> Frontiers in Physiology. 3, 255 (2012).</li><li>Bakkers, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+as+a+model+to+study+cardiac+development+and+human+cardiac+disease.">Zebrafish as a model to study cardiac development and human cardiac disease.</a> Cardiovascular research. 91 (2), 279-288 (2011).</li><li>Poon, K. L., Brand, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+model+system+in+cardiovascular+research:+A+tiny+fish+with+mighty+prospects.">The zebrafish model system in cardiovascular research: A tiny fish with mighty prospects.</a> Global Cardiology Science and Practise. 2013 (1), 9-28 (2013).</li><li>Jopling, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+heart+regeneration+occurs+by+cardiomyocyte+dedifferentiation+and+proliferation.">Zebrafish heart regeneration occurs by cardiomyocyte dedifferentiation and proliferation.</a> Nature. 464 (7288), 606-609 (2010).</li><li>Mishra, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+model+of+amyloid+light+chain+cardiotoxicity:+regeneration+versus+degeneration.">Zebrafish model of amyloid light chain cardiotoxicity: regeneration versus degeneration.</a> American Journal of Physiology Heart Circulatory Physiology. 316 (5), H1158-H1166 (2019).</li><li>Shin, J. T., Pomerantsev, E. V., Mably, J. D., MacRae, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+cardiovascular+function+confirms+functional+orthology+of+myocardial+contractility+pathways+in+zebrafish.">High-resolution cardiovascular function confirms functional orthology of myocardial contractility pathways in zebrafish.</a> Physiologycal Genomics. 42 (2), 300-309 (2010).</li><li>Mishra, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+amyloidogenic+light+chain+proteins+result+in+cardiac+dysfunction,+cell+death,+and+early+mortality+in+zebrafish.">Human amyloidogenic light chain proteins result in cardiac dysfunction, cell death, and early mortality in zebrafish.</a> American Journal of Physiology Heart Circulatory Physiology. 305 (1), H95-H103 (2013).</li><li>Ernens, I., Lumley, A. I., Devaux, Y., Wagner, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Coronary+Ultrasound+Imaging+to+Evaluate+Ventricular+Function+in+Adult+Zebrafish.">Use of Coronary Ultrasound Imaging to Evaluate Ventricular Function in Adult Zebrafish.</a> Zebrafish. 13 (6), 477-480 (2016).</li><li>Gonz&#225;lez-Rosa, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Echocardiography+Reveals+Reestablishment+of+Ventricular+Pumping+Efficiency+and+Partial+Ventricular+Wall+Motion+Recovery+upon+Ventricular+Cryoinjury+in+the+Zebrafish.">Use of Echocardiography Reveals Reestablishment of Ventricular Pumping Efficiency and Partial Ventricular Wall Motion Recovery upon Ventricular Cryoinjury in the Zebrafish.</a> PLoS One. 9 (12), (2014).</li><li>Huang, C. C., Su, T. H., Shih, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+tissue+Doppler+imaging+of+the+zebrafish+heart+during+its+regeneration.">High-resolution tissue Doppler imaging of the zebrafish heart during its regeneration.</a> Zebrafish. 12 (1), 48-57 (2015).</li><li>Kang, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-frequency+dual+mode+pulsed+wave+Doppler+imaging+for+monitoring+the+functional+regeneration+of+adult+zebrafish+hearts.">High-frequency dual mode pulsed wave Doppler imaging for monitoring the functional regeneration of adult zebrafish hearts.</a> Journal of the Royal Society Interface. 12 (103), (2015).</li><li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemodynamics+and+ventricular+function+in+a+zebrafish+model+of+injury+and+repair.">Hemodynamics and ventricular function in a zebrafish model of injury and repair.</a> Zebrafish. 11 (5), 447-454 (2014).</li><li>Sun, L., Lien, C. L., Xu, X., Shung, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+Cardiac+Imaging+of+Adult+Zebrafish+Using+High+Frequency+Ultrasound+(45-75+MHz).">In Vivo Cardiac Imaging of Adult Zebrafish Using High Frequency Ultrasound (45-75 MHz).</a> Ultrasound in Medicine and Biology. 34 (1), 31-39 (2008).</li><li>Wang, L. W., Kesteven, S. H., Huttner, I. G., Feneley, M. P., Fatkin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Frequency+Echocardiography-+Transformative+Clinical+and+Research+Applications+in+Humans,+Mice,+and+Zebrafish.">High-Frequency Echocardiography- Transformative Clinical and Research Applications in Humans, Mice, and Zebrafish.</a> Circulation Journal. 82 (3), 620-628 (2018).</li><li>Wang, L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardized+echocardiographic+assessment+of+cardiac+function+in+normal+adult+zebrafish+and+heart+disease+models.">Standardized echocardiographic assessment of cardiac function in normal adult zebrafish and heart disease models.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 10 (1), 63 (2017).</li><li>Lee, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Assessment+of+Cardiac+Responses+of+Adult+Zebrafish+(Danio+rerio)+to+Acute+and+Chronic+Temperature+Change+Using+High-Resolution+Echocardiography.">Functional Assessment of Cardiac Responses of Adult Zebrafish (Danio rerio) to Acute and Chronic Temperature Change Using High-Resolution Echocardiography.</a> PLOS ONE. 11 (1), e0145163 (2016).</li><li>Genge, C. E., et al., Nilius, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Reviews of Physiology, Biochemistry and Pharmacology. 171, 99-136 (2016).</li></ol>

我々は、成体ゼブラフィッシュにおける心エコー画像と心機能評価の体系的な方法を説明する。心エコー検査は、生きた成魚の心臓イメージングおよび機能分析のための唯一の非侵襲的かつ最も堅牢な方法であり、ゼブラフィッシュ心血管研究でますます人気が高まっています。必要な時間は短く、ハイスループットと縦方向の研究が可能です。しかし、採用された方法論とデータ分析には?...

ゼブラフィッシュ(Danio rerio)は、発達過程とヒト疾患の研究のための確立された脊椎動物モデルである1.ゼブラフィッシュは、ヒト(70%)と高い遺伝的類似性を有し、遺伝的な難解性、高い胎児性、および胚発生中の光学的透明性を有し、心臓を含む器官および組織の直接的な視覚分析を可能にする。アトリウムと1つの心室を有するだけにもかかわらず、ゼブラフィッシュの心臓(図1)は哺乳類の四張心と生理学的に類似している。重要なのは、ゼブラフィッシュの心拍数、心電図形態、及び作用電位形状は、マウス種2よりもヒトのものに似ている。これらの特徴は、ゼブラフィッシュを心血管研究のための優れたモデルにし、,心臓発達3、4、4再生5、および動脈硬化症、心筋症、不整脈、先天性心疾患、アミロイド軽鎖心毒性1、4、6を6含む病理学的状態31,41、3、4に関する主要な洞察を提供してきた。4高速ビデオ顕微鏡7,8を用いた直接ビデオ分析を通じて、胚期(受精後1日間)の間に8心機能の評価が可能であった。しかし、ゼブラフィッシュは胚性期を超えて透明性を失い、正常な成熟した心臓および遅発性心状態の機能的評価を制限する。この制限を克服するために、心エコー検査は、成体ゼブラフィッシュ心拍,機能,,,99、10、11、12、13、14、15,15を評価する高解像度、リアルタイム、非侵襲的イメージング代替手段としてうまく採用されている,10。11121314
ゼブラフィッシュでは、心臓は心室に後ろ側に位置するアトリウムを持つエラの直ちに後部の胸腔に腹腔に位置する。心房は静脈内の血液を静脈内静脈から採取し、心室に移し、そこでさらに球根動脈に送り込まれる(図1)。ここでは、30μmの解像度でBモードイメージングのための50MHzの中心周波数を有する線形アレイ超音波プローブを用いた非侵襲的心エコー検査により、成人ゼブラフィッシュの心機能を評価する生理学的、水中のプロトコルについて述べた。超音波は簡単に水を通過することができるので、魚と水中の走査プローブの間に近接保つことは、超音波ゲルを必要としない心臓検出のための十分な接触面を提供し、全体的に魚にとってストレスが少ない。代替ゼブラフィッシュ心エコーシステムは、いくつかの著者によって報告されました99,12,,13,ここでは、動物の高周波超音波に適用される一般的かつ最も一般的に使用されるセットアップを提示します.
この方法により、成体ゼブラフィッシュ心臓の高解像度イメージング、心臓構造のトレース、ドップラー血流測定からのピーク速度の定量が可能になります。我々は、駆出率(EF)、分面積変化(FAC)、心室血流および流出速度、心拍数(HR)、心拍出量(CO)などの重要な収縮期および拡張期のパラメータを生体内で確実に定量化することを示す。病理状態をより正確に評価できるように、正常な健康な成体ゼブラフィッシュ心臓機能および次元パラメータの信頼できる範囲の確立に貢献する。全体として、ゼブラフィッシュの心機能を評価するための堅牢な方法を提供し、ゼブラフィッシュ心疾患モデル66、16、16心臓損傷および回復10、13、および再生11、12の確立および検証に11非常に有用であることが証明されており、12潜在的な薬物を評価するためにさらに使用することができる。13

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Double sided tape</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fish net</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass container - 100 inch high</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High frequency transducer</td>
			<td>Fujifilm/VisualSonics</td>
			<td>MX700</td>
			<td>Band width 29-71 MHz, Centre transmit 50 MHz, Axial resolution 30 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic teaspoon</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel or scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small fish tanks</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sponge (kitchen sponge)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipets (graduated 3 mL)</td>
			<td>Samco Scientific</td>
			<td>212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine (MS-222)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vevo 3100 Imaging system and imaging station</td>
			<td>Fujifilm/VisualSonics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vevo LAB sofware v 1.7.1</td>
			<td>Fujifilm/VisualSonics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-frequency ultrasound echocardiography to assess zebrafish cardiac function

ゼブラフィッシュ(Danio rerio)は、ヒトの心疾患を含む心血管研究において非常に人気のあるモデル生物となっており、その主な原因は、その胚の透明性、遺伝的な難解性、および迅速で高いスループットの研究へのアメニティに起因する。しかし、透明性の喪失は成人期の心臓機能分析を制限し、年齢に関連する心臓病のモデリングを複雑にする。このような制限を克服するために、ゼブラフィッシュにおける高周波超音波心エコー検査が実行可能な選択肢として浮上している。ここでは、高周波超音波を用いた非侵襲性心エコー検査により成体ゼブラフィッシュの心機能を評価するための詳細なプロトコルを提示する。この方法により、ゼブラフィッシュの心臓次元の可視化と分析、心拍数、脳卒中量、心拍出量、放出分率などの重要な機能パラメータの定量化が可能になります。この方法では、魚は麻酔を受けて水中に保たれ、処置後に回収することができる。高周波超音波は高価な技術ですが、同じイメージングプラットフォームは、異なるトランスデューサを適応させることによって、異なる種(例えば、マウスとゼブラフィッシュ)に使用することができます。ゼブラフィッシュ心エコー検査は、心臓のフェノタイピングのための堅牢な方法です, 疾患モデルの検証と特性評価に有用です, 特に遅発性疾患;薬物スクリーン;心臓の損傷、回復、および再生能力の研究。

記載されたプロトコルは、ヒトおよび動物の心エコー検査に用いられる技術に類似した、重要な心次元および機能的パラメータの測定を可能にする。Bモード画像は、収縮期および拡張期(図5)における心室内壁の追跡およびチャンバーおよび壁寸法などの次元データの取得、心拍数、脳卒中量、心拍出量などの機能データ、ならびに心室収縮率な...

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High-Frequency Ultrasound Echocardiography to Assess Zebrafish Cardiac Function

高周波心エコーを用いて成体ゼブラフィッシュの心臓形態と機能を評価するプロトコルについて述べている。この方法は、心拍数(HR)、心拍出量(CO)、分画領域変化(FAC)、放出分率(EF)、および血液流入および流出速度などの機能的パラメータの心臓およびその後の定量化を可視化することを可能にする。

ゼブラフィッシュ心臓機能を評価する高周波超音波心エコー検査

The zebrafish (Danio rerio) has become a very popular model organism in cardiovascular research, including human cardiac diseases, largely due to its ...

このプロトコルは、非侵襲的で高解像度の表現と成体ゼブラフィッシュ心臓機能の分析を可能にする。この方法は、成人の心臓病モデルおよび潜在的な薬物スクリーンの検証に使用することができる。この技術は正確で、再生可能な結果を提供する正しいイメージ投射のための魚の急速な位置を可能にする。それは非侵襲的であり、魚の急速な回復を可能にする水中で行われる。画像取得用のプラットフォームを設定するには、小さいはさみやメスを使用して、12時位置のスポンジを切開します。スポンジをガラス容器に入れます。両面テープを使用して、超音波プラットフォーム上にスポンジを含むガラス容器を貼付します。ガラス容器がプラットフォームの中央にあり、しっかりと取り付けられていることを確認します。プラットフォームホルダーの左側にあるノブを使用して、プラットフォームを約30度前方に傾けます。ガラス容器に約200ミリリットルの魚系水を充填し、1ミリリットルトリカインメタンスルホン酸塩あたり0.2ミリグラムを含みます。オペレータに向かってトランスデューサのノッチを回す作業レールのマイクロマニピュレータホルダー内にトランスデューサを挿入します。ステージに対して作業側の縦方向で、アレイを地面に平行に保ちます。X軸とy軸に沿って移動するために、現在接続されているトランスデューサレールシステムのために両側に約10センチメートルの十分なスペースを残します。コントロールソフトウェアにログインし、マウスの小さな血管を選択します。新しい研究だけでなく、研究で誘発された各動物のための新しいシリーズを作成します。ブラウザページの画面左下にある新しいスタディボタンを押します。ビューは B モードで開始されます。魚網を使用して,トリケーヌのミリリットル当たり0.2ミリグラムのシステム水を含む小さなタンクに魚を移す。魚が完全に麻酔されるまで待ちますが、動きもタッチに対する反応もありません。スポンジで魚をガラス容器に素早く移し、魚の腹側を上に向けて以前に作られた切開に移します。レールシステムのハンドルを使用してトランスデューサを縦方向に静かに下げ、オペレータに面したトランスデューサのノッチで魚の腹側を閉じます。魚から2〜3ミリメートルのクリアランスを残します。魚の心臓が視覚化されるまで、3つの軸すべてでマイクロマニピュレータを使用してトランスデューサに対してプラットフォームを調整します。心臓を局所化した直後に、Bモードで選択または滞在し、ズームインして心臓を詳しく見てフィールドを減らします。必要に応じて、ダイナミックレンジを45~50デシベルに設定して、画像の品質またはコントラストを高めます。[詳細] コントロール オプションの B モード コントロールに移動し、その後、モードプリセットに変更を保存します。タップモードプリセットを使用して、新しいシリーズのイメージを開始する前に毎回最適化された画像取得設定を選択します。長軸平面で必要な数の画像を撮影します。次に、血流検出と取得用のカラードップラーに切り替えます。タッチスクリーンを使用して、房口を房室弁の上に置き、赤色信号で区別される流入を局地化します。フレームレートを上げるには、可能な限り四分の一領域を小さくします。パルス波ドップラーを活性化して、サンプル心室血流速度に移動します。サンプルの容積ゲートを房室弁の中心に置き、最大流速を検出します。赤い色の信号はより黄色がかった。指を使って画面上の脈波の角度を調整し、血流の方向に合わせます。開始または更新を押して、心室に流れ込む血液の速度のサンプリングを開始します。心室と球根の間の接合部に色ドップラー象限を配置して流出速度を決定し、流れを局所化します。これは青い色の信号によって区別されます。サンプルの体積ゲートを心室球根接合の直前に配置し、血流の方向に合わせて角度補正線を調整します。信号のピークを完全に検出してトレースするために、フロー速度パネルでベースラインを上げるのを調整します。画像の取得が完了するとすぐに, ティースプーンを使用し、トリケーヌの自由な通常のシステム気泡水に魚を転送し、魚を回復させます.回復を助けるために、水と酸素移動の通過を促進するために移管ピペットを使用してエラの上に繰り返し水を噴出。通常、ギルの動きと水泳を再開するのに30秒から2分かかります。画像解析ソフトウェアを開きます。画像を選択し、画像処理アイコンをクリックします。画像の明るさとコントラストを調整して、心室壁や血流パターンを明確に視覚化できるようにします。Bモード画像を使用して、心臓パッケージ測定のパラスターン長軸オプションからドロップダウンリストを開きます。LVトレースを選択し、収縮期および拡張期の心室内壁を追跡して、収縮期および拡張期および拡張期容積および終部収縮期容積の心室領域を得る。本研究では、Bモード画像は、収縮期および拡張期における心室内壁の追跡およびチャンバーおよび壁寸法などの次元データの取得を可能にした。また、心拍数、脳卒中量、心拍出量、ならびに分面積変化および駆出率を含む心室収縮期機能のパラメータなどの機能データも得られた。色ドップラーモード画像を用いた房室弁のレベルでの測定はまた、心室の流入および流出の血流速度を提供した。パルス波ドップラー画像に基づいて、3つの連続した大動脈流れピークをトレースすることによって心拍数値を生成した。最も重要なことは、正確なイメージングのために超音波プラットフォームと魚を正しく配置し、トリカインへの魚の暴露を最小限に抑えることです。この手順をサポートする追加の方法には、不整脈のような心臓機能不全の迅速な検出のための魚心電図または心臓組織構造または細胞死を評価する組織学的方法が含まれる。これらの技術は、ゼブラフィッシュの心臓機能の評価を可能にし、ゼブラフィッシュ心臓病モデルにおける心臓表現型を確立する。また、新薬をテストすることができます, 心臓の損傷と再生能力を研究.トリケーヌMS-222は、皮膚、眼、および呼吸刺激性である。トリケーヌ溶液を調製する際には、防護具には、ダストマスク、アイシールド、手袋を含める必要があります。

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

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