Name: in situ detection of ribonucleoprotein complex assembly in the c. elegans germline using proximity ligation assay
Uploaded: 2020-05-05T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Situ Detection of Ribonucleoprotein Complex Assembly in the C. elegans Germline using Proximity Ligation Assay at JoVE.com

تم توفير بعض سلالات النيماتودا المستخدمة في هذه الدراسة من قبل مركز علم الوراثة Caenorhabditis الممولمن المعاهد القومية للصحة (P40OD010440). تم إجراء الفحص المجهري Confocal في مختبر الأبحاث الأساسية في جامعة مونتانا الذي تم تشغيله بدعم من جوائز NIH P20GM103546 و S10OD021806. وقد تم دعم هذا العمل جزئيا من قبل منحة المعاهد القومية للصحة GM109053 إلى E.V. ، زمالة جمعية القلب الأمريكية 18PRE34070028 إلى X.W.، وجائزة أكاديمية مونتانا للعلوم إلى X.W. ولم يشارك الممولون في تصميم الدراسة أو كتابة التقرير. ونشكر م. إلينبيكر على المناقشة.

ملاحظة: يستخدم هذا البروتوكول سلالات C. elegans التي يتم فيها وضع علامات على كل من الشركاء التفاعل المحتملين. يوصى بشدة باستخدام سلالة تحكم سلبية ، حيث لا يتوقع أن يتفاعل بروتين واحد مع علامة مع شريك آخر للتفاعل المرشح الموسوم. هنا، تم استخدام GFP وحده كتحكم سلبي لتقييم الخلفية، حيث لا يتوق?...

<ol>
	<li>Bergg&#229;rd, T., Linse, S., James, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+the+detection+and+analysis+of+protein-protein+interactions.">Methods for the detection and analysis of protein-protein interactions.</a> Proteomics. 7 (16), 2833-2842 (2007).</li><li>Nooren, I. M., Thornton, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+of+protein-protein+interactions.">Diversity of protein-protein interactions.</a> EMBO Journal. 22 (14), 3486-3492 (2003).</li><li>Patil, A., Kinosselecta, K., Nakamura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hub+promiscuity+in+protein-protein+interaction+networks.">Hub promiscuity in protein-protein interaction networks.</a> International Journal of Molecular Science. 11 (4), 1930-1943 (2010).</li><li>De Las Rivas, J., Fontanillo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-protein+interactions+essentials:+key+concepts+to+building+and+analyzing+interactome+networks.">Protein-protein interactions essentials: key concepts to building and analyzing interactome networks.</a> PLoS Computational Biology. 6 (6), e1000807 (2010).</li><li>Pazdernik, N., Schedl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+to+germ+cell+development+in+Caenorhabditis+elegans.">Introduction to germ cell development in Caenorhabditis elegans.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 757, 1-16 (2013).</li><li>Nousch, M., Eckmann, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+control+in+the+Caenorhabditis+elegans+germ+line.">Translational control in the Caenorhabditis elegans germ line.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 757, 205-247 (2013).</li><li>Vangindertael, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+introduction+to+optical+super-resolution+microscopy+for+the+adventurous+biologist.">An introduction to optical super-resolution microscopy for the adventurous biologist.</a> Methods and Applications in Fluorescence. 6 (2), 022003 (2018).</li><li>Veeraraghavan, R., Gourdie, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+optical+reconstruction+microscopy-based+relative+localization+analysis+(STORM-RLA)+for+quantitative+nanoscale+assessment+of+spatial+protein+organization.">Stochastic optical reconstruction microscopy-based relative localization analysis (STORM-RLA) for quantitative nanoscale assessment of spatial protein organization.</a> Molecular Biology of the Cell. 27 (22), 3583-3590 (2016).</li><li>Thymiakou, E., Episkopou, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+signaling+effector-complexes+downstream+of+bmp4+using+PLA,+a+proximity+ligation+assay.">Detection of signaling effector-complexes downstream of bmp4 using PLA, a proximity ligation assay.</a> Journal of Visualized Experiments. (49), (2011).</li><li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+in+situ+protein-protein+complexes+at+the+Drosophila+larval+neuromuscular+junction+using+proximity+ligation+assay.">Detection of in situ protein-protein complexes at the Drosophila larval neuromuscular junction using proximity ligation assay.</a> Journal of Visualized Experiments. (95), 52139 (2015).</li><li>Algar, W. R., Hildebrandt, N., Vogel, S. S., Medintz, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FRET+as+a+biomolecular+research+tool+-+understanding+its+potential+while+avoiding+pitfalls.">FRET as a biomolecular research tool - understanding its potential while avoiding pitfalls.</a> Nature Methods. 16 (9), 815-829 (2019).</li><li>Kodama, Y., Hu, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bimolecular+fluorescence+complementation+(BiFC):+a+5-year+update+and+future+perspectives.">Bimolecular fluorescence complementation (BiFC): a 5-year update and future perspectives.</a> Biotechniques. 53 (5), 285-298 (2012).</li><li>Piston, D. W., Kremers, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+protein+FRET:+the+good,+the+bad+and+the+ugly.">Fluorescent protein FRET: the good, the bad and the ugly.</a> Trends in Biochemical Science. 32 (9), 407-414 (2007).</li><li>Hiatt, S. M., Shyu, Y. J., Duren, H. M., Hu, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bimolecular+fluorescence+complementation+(BiFC)+analysis+of+protein+interactions+in+Caenorhabditis+elegans.">Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) analysis of protein interactions in Caenorhabditis elegans.</a> Methods. 45 (3), 185-191 (2008).</li><li>S&#246;derberg, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+proteins+and+their+interactions+in+cells+and+tissues+using+the+in+situ+proximity+ligation+assay.">Characterizing proteins and their interactions in cells and tissues using the in situ proximity ligation assay.</a> Methods. 45 (3), 227-232 (2008).</li><li>Wilson, M. J., Salata, M. W., Susalka, S. J., Pfister, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+chains+of+mammalian+cytoplasmic+dynein:+identification+and+characterization+of+a+family+of+LC8+light+chains.">Light chains of mammalian cytoplasmic dynein: identification and characterization of a family of LC8 light chains.</a> Cell Motility and Cytoskeleton. 49 (4), 229-240 (2001).</li><li>Erd&#337;s, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+linear+motif+filtering+protocol+reveals+the+role+of+the+LC8+dynein+light+chain+in+the+Hippo+pathway.">Novel linear motif filtering protocol reveals the role of the LC8 dynein light chain in the Hippo pathway.</a> PLoS Computational Biology. 13 (12), e1005885 (2017).</li><li>Navarro-L&#233;rida, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+identification+of+brain+proteins+that+interact+with+dynein+light+chain+LC8.">Proteomic identification of brain proteins that interact with dynein light chain LC8.</a> Proteomics. 4 (2), 339-346 (2004).</li><li>Rapali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DYNLL/LC8:+a+light+chain+subunit+of+the+dynein+motor+complex+and+beyond.">DYNLL/LC8: a light chain subunit of the dynein motor complex and beyond.</a> FEBS Journal. 278 (17), 2980-2996 (2011).</li><li>Rapali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+reveals+the+binding+motif+preference+of+the+LC8/DYNLL+hub+protein+and+predicts+large+numbers+of+novel+binders+in+the+human+proteome.">Directed evolution reveals the binding motif preference of the LC8/DYNLL hub protein and predicts large numbers of novel binders in the human proteome.</a> PLoS One. 6 (4), e18818 (2011).</li><li>Clark, S. A., Jespersen, N., Woodward, C., Barbar, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multivalent+IDP+assemblies:+Unique+properties+of+LC8-associated,+IDP+duplex+scaffolds.">Multivalent IDP assemblies: Unique properties of LC8-associated, IDP duplex scaffolds.</a> FEBS Letters. 589 (19 Pt A), 2543-2551 (2015).</li><li>Jespersen, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+identification+of+recognition+motifs+for+the+hub+protein+LC8.">Systematic identification of recognition motifs for the hub protein LC8.</a> Life Science Alliance. 2 (4), (2019).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynein+light+chain+DLC-1+promotes+localization+and+function+of+the+PUF+protein+FBF-2+in+germline+progenitor+cells.">Dynein light chain DLC-1 promotes localization and function of the PUF protein FBF-2 in germline progenitor cells.</a> Development. 143 (24), 4643-4653 (2016).</li><li>Dorsett, M., Schedl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+dynein+in+the+inhibition+of+germ+cell+proliferative+fate.">A role for dynein in the inhibition of germ cell proliferative fate.</a> Molecular Biology of the Cell. 29 (22), 6128-6139 (2009).</li><li>Ellenbecker, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynein+Light+Chain+DLC-1+Facilitates+the+Function+of+the+Germline+Cell+Fate+Regulator+GLD-1+in+Caenorhabditis+elegans.">Dynein Light Chain DLC-1 Facilitates the Function of the Germline Cell Fate Regulator GLD-1 in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 211 (2), 665-681 (2019).</li><li>Day, N. J., Ellenbecker, M., Voronina, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+DLC-1+associates+with+ribonucleoprotein+complexes+to+promote+mRNA+regulation.">Caenorhabditis elegans DLC-1 associates with ribonucleoprotein complexes to promote mRNA regulation.</a> FEBS Letters. 592 (22), 3683-3695 (2018).</li><li>Detwiler, M. R., Reuben, M., Li, X., Rogers, E., Lin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+zinc+finger+proteins,+OMA-1+and+OMA-2,+are+redundantly+required+for+oocyte+maturation+in+C.+elegans.">Two zinc finger proteins, OMA-1 and OMA-2, are redundantly required for oocyte maturation in C. elegans.</a> Developmental Cell. 1 (2), 187-199 (2001).</li><li>Spike, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+control+of+the+oogenic+program+by+components+of+OMA+ribonucleoprotein+particles+in+Caenorhabditis+elegans.">Translational control of the oogenic program by components of OMA ribonucleoprotein particles in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 198 (4), 1513-1533 (2014).</li><li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cer&#243;n, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Caenorhabditis+elegans+methods:+synchronization+and+observation.">Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation.</a> Journal of Visualized Experiments. (64), (2012).</li><li>Gervaise, A. L., Arur, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+Temporal+Analysis+of+Active+ERK+in+the+C.+elegans+Germline.">Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline.</a> Journal of Visualized Experiments. (117), (2016).</li><li>Duerr, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+staining+in+C.+elegans+using+"freeze-cracking".">Antibody staining in C. elegans using "freeze-cracking".</a> Journal of Visualized Experiments. (80), (2013).</li><li>Crittenden, S., Kimble, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+immunolabeling+of+Caenorhabditis+elegans.">Preparation and immunolabeling of Caenorhabditis elegans.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (5), (2009).</li></ol>

عند دراسة PPIs في خط الجراثيم C. elegans ، فإن الدقة الأعلى التي يقدمها جيش التحرير الشعبي مقارنة بالاستمناة المشتركة تسمح بالتصور والتقدير الكمي للمواقع التي تحدث فيها التفاعلات في الخط الجرثومي. وأفيد سابقا أن DLC-1 يتفاعل مباشرة مع OMA-1 باستخدام في المختبر ضريبة السلع والخدمات السحب م?...

ويقدر أن أكثر من 80٪ من البروتينات لديها تفاعلات مع الجزيئات الأخرى1، مما يؤكد على مدى أهمية PPIs لتنفيذ وظائف بيولوجية محددة في الخلية2. تعمل بعض البروتينات كمحاور تسهل تجميع المجمعات الأكبر الضرورية لبقاء الخلية1. هذه المحاور التوسط PPIs متعددة وتساعد على تنظيم البروتينات في شبكة تسهل وظائف محددة في الخلية3. كما يتأثر تكوين مجمعات البروتين بالسياق البيولوجي، مثل وجود أو عدم وجود شركاء محددين يتفاعلون4،وأحداث إشارات الخلايا، ومرحلة نمو الخلية.
C. يستخدم الإيغانك ككائن حي نموذجي لمجموعة متنوعة من الدراسات، بما في ذلك التنمية. يتكون التشريح البسيط لهذا الحيوان من عدة أعضاء ، بما في ذلك الغدد التناسلية والأمعاء وبشرة شفافة ، مما يسهل تحليل تطور الدودة. الخط الجرثومي المقيم في الغدد التناسلية هو أداة عظيمة لدراسة كيفية نضج الخلايا الجذعية الجرثومية إلى gametes5 التي تتطور إلى أجنة وفي نهاية المطاف الجيل القادم من ذرية. تحتوي منطقة الطرف المنفّر من الخط الجرثومي على مجموعة من الخلايا الجذعية المجددة ذاتيًا(الشكل 1). كما الخلايا الجذعية ترك مكانة، فإنها تتقدم إلى pachytene meiotic وتتطور في نهاية المطاف إلى البويضات في مرحلة الكبار الشباب(الشكل 1). يتم تنظيم هذا البرنامج من التنمية في خط الجراثيم بإحكام من خلال آليات مختلفة، بما في ذلك شبكة تنظيمية ما بعد النسخ التي تسهلها البروتينات الملزمة الحمض النووي الريبي (RBPs)6. وتتسم مؤشرات أسعار الشراكة بين القطاعين العام والخاص بأهمية هذا النشاط التنظيمي، حيث ترتبط الممارسات التجارية التقييدية بعوامل مساعدة أخرى لممارسة وظائفها.
هناك العديد من النهج التي يمكن استخدامها للتحقيق في PPIs في الدودة ، ولكن كل منها له قيود فريدة من نوعها. في الامطار المناعية على الجسم الحي (IP) يمكن استخدامها لعزل المجمعات البروتين البروتينمن مقتطفات دودة كاملة; ومع ذلك، لا يشير هذا الأسلوب إلى مكان حدوث مؤشر أسعار المنتجين في الفيروس المتنقل. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن يصعب استرداد مجمعات البروتين العابرة وتتشكل فقط خلال مرحلة محددة من التطور أو في عدد محدود من الخلايا عن طريق الترسيب المناعي المشترك. وأخيرا، تحتاج تجارب الملكية الفكرية إلى معالجة مخاوف إعادة الفرز المعقدة البروتينية بعد الانزل والاحتفاظ غير محددة من البروتينات على مصفوفة تقارب.
النهج البديلة للكشف في الموقع من PPIs هي المناعة المشتركة، نقل الطاقة صدى Förster (FRET)، ومكملات الفلورسيان ثنائي الجزيئية (BiFC). يعتمد المناعي المشترك على الكشف المتزامن عن بروتينين مهتمين بأنسجة الديدان الثابتة وقياس مدى التوطين المشترك للإشارة. استخدام المجهر فائقة الدقة، والتي توفر تفاصيل أكبر من المجهر القياسي7،ويساعد على اختبار أكثر صرامة توطين البروتين المشترك وراء حاجز حيود محدودة من 200-300 نانومتر8. ومع ذلك ، فإن المناعة المشتركة باستخدام كل من المجهر التقليدي وفائق الدقة يعمل بشكل أفضل للبروتينات ذات أنماط التعريب المحددة جيدًا. وعلى النقيض من ذلك، يصبح أقل إفادة بكثير بالنسبة للشركاء المتفاعلين الموزعين توزيعاً. قياس لتوطين مشترك للإشارات على أساس التداخل لا يوفر معلومات دقيقة حول ما إذا كانت البروتينات في معقدة مع بعضها البعض9,10.
وعلاوة على ذلك، فإن الترسيب المناعي المشترك والمناعة المشتركة لمجمعات البروتين البروتينليست كمية، مما يجعل من الصعب تحديد ما إذا كانت هذه التفاعلات كبيرة. FRET و BiFC كلاهما تقنيات تستند إلى الفلورسنت. تعتمد FRET على وضع علامات على البروتينات ذات الأهمية مع البروتينات الفلورية (FPs) التي تتداخل الطيفية التي يتم فيها نقل الطاقة من FP واحد (المانح) إلى FP آخر (مقبول)11. وينتج عن هذا النقل غير الإشعاعي للطاقة الفلورسية للFP المقبول التي يمكن اكتشافها عند الطول الموجي للانبعاثات. ويستند BiFC على إعادة تشكيل بروتين الفلورسنت في الجسم الحي. فإنه ينطوي على تقسيم GFP إلى اثنين من شظايا تكميلية، مثل الحلزون1-10 والحلزون 1112،والتي تنصهر بعد ذلك إلى اثنين من البروتينات ذات الفائدة. إذا تفاعل هذان البروتينان، تصبح الأجزاء التكميلية من GFP قريبة بما يكفي من القرب لطيها وتجميعها، مما يعيد تشكيل فلوروفور GFP. ثم يلاحظ GFP المعاد تشكيله مباشرة على أنه فلورسين ويشير إلى مكان حدوث مؤشر أسعار المنتجين.
على هذا النحو ، يعتمد كل من FRET و BiFC على العلامات الفلورية الكبيرة التي يمكن أن تعطل وظيفة البروتين الموسوم. بالإضافة إلى ذلك ، يتطلب FRET و BiFC تعبيرًا وفيرًا وقابلًا للبروتينات الموسومة للحصول على بيانات دقيقة. قد لا تكون FRET مناسبة للتجارب حيث يكون أحد الشريكين أكثر من الآخر ، مما قد يؤدي إلى خلفية عالية13. يجب أيضًا تجنب التعبير المفرط في تجارب BiFC ، لأن هذا يمكن أن يؤدي إلى تجميع غير محدد14 يؤدي إلى زيادة الخلفية. تتطلب كلتا التقنيتين تحسين ظروف التعبير والتصوير للبروتينات الموسومة ، والتي قد تطيل الوقت اللازم لإكمال التجارب.
إن فحص ربط القرب (PLA) هو نهج بديل يمكن أن يعالج قيود التقنيات المذكورة أعلاه. يستفيد جيش التحرير الشعبي من الأجسام المضادة الأولية التي تتعرف على البروتينات ذات الأهمية (أو علاماتها). ثم يتم ربط هذه الأجسام المضادة الأولية بواسطة الأجسام المضادة الثانوية التي تحتوي على تحقيقات oligonucleotide التي يمكن أن تهجين مع بعضها البعض عندما ضمن مسافة 40 نانومتر (أو أقصر)15. يتم تضخيم الحمض النووي الهجين الناتج عن ذلك من خلال تفاعل PCR ، والذي يتم اكتشافه بواسطة المسابير التي تكمل الحمض النووي. وهذا يؤدي إلى بؤر التي يتم تصورها بواسطة المجهر. يمكن لهذه التكنولوجيا الكشف عن PPIs في الموقع في الأنسجة المعقدة (أي الغدد التناسلية دودة)، والتي يتم تنظيمها كخط تجميع يحتوي على خلايا في مراحل مختلفة من التطور والتمايز. مع جيش التحرير الشعبي، يمكن تصور PPIs مباشرة في الغدد التناسلية دودة ثابتة، وهو أمر مفيد للتحقيق في ما إذا كان PPIs تحدث خلال مرحلة محددة من التنمية. يقدم جيش التحرير الشعبي دقة أكبر لمؤشرات أسعار التطبيقات مقارنة بالمقالات القائمة على التعريب المشترك ، وهو مثالي لإجراء قياسات دقيقة. إذا ما استخدمت، المجهري ة فائقة الدقة لديه القدرة على توفير تفاصيل أدق حول موقع بؤر جيش التحرير الشعبى الصينى داخل الخلية. ميزة أخرى هي أن بؤر الناتجة عن ردود فعل جيش التحرير الشعبي يمكن أن تحسب من قبل سير عمل تحليل ImageJ المستندة إلى، مما يجعل هذه التقنية الكمية.
تم وصف عائلة LC8 من سلاسل الضوء الدينين لأول مرة بأنها وحدة فرعية لمجمع محركات dynein16 وافترض أنها بمثابة محول بضائع. منذ اكتشافه الأولي، تم العثور على LC8 في مجمعات البروتين متعددة بالإضافة إلى مجمع محركات الدينين17،18،19،20. المسح الضوئي لتسلسل البروتين التي تحتوي على التفاعل LC8 عزر19 يشير إلى أن LC8 قد يكون لها العديد من التفاعلات مع مجموعة واسعة من البروتينات المختلفة17،18،,19،20،21،22. ونتيجة لذلك، تعتبر الآن البروتينات العائلية LC8 المحاور التي تساعد على تعزيز تجميع مجمعات البروتين اتّفا ً19،22، مثل تجميع البروتينات المفككة بشكل جوهري21.
واحد C. elegans LC8-الأسرة البروتين، dynein سلسلة الضوء-1 (DLC-1)، وأعرب على نطاق واسع عبر العديد من الأنسجة وليس المخصب في هياكل محددة تحت الخلوية23،,24. وبالتالي، فإن تحديد الصلة بيولوجيا ً في الحياة العضوية في الشركاء في DLC-1 في C. elegans يشكل تحدياً لعدد من الأسباب: 1) عدم هطول المناعة المشتركة يشير إلى مصدر الأنسجة حيث يحدث التفاعل؛ (2) لا يشير الهطول المناعي المشترك إلى مصدر الأنسجة الذي يحدث فيه التفاعل؛ (2) لا يشير الهطول المناعي المشترك إلى مصدر الأنسجة الذي يحدث فيه التفاعل؛ (2) لا يشير الهطول المناعي المشترك إلى مصدر الأنسجة الذي يحدث فيه التفاعل؛ (2) لا يشير إلى مصدر الأنسجة الذي يحدث فيه التفاعل؛ (2) لا يشير الهطول المناعي المشترك إلى مصدر الأنسجة الذي يحدث فيه التفاعل؛ (2) لا يشير الهطول المناعي المشترك إلى مصدر الأنسجة الذي يحدث فيه 2) التعبير المحدود عن شركاء معينين أو تفاعلات عابرة قد تعيق القدرة على الكشف عن التفاعل عن طريق الترسيب المناعي المشترك؛ و 3) توزيع منتشر من DLC-1 يؤدي إلى تداخل غير محدد مع البروتينات الشريك المحتملة عن طريق المناعة المشتركة. وبناء على هذه التحديات، جيش التحرير الشعبي هو نهج مثالي لاختبار في تفاعلات الجسم الحي مع DLC-1.
وقد أفيد سابقا أن DLC-1 يتفاعل مباشرة مع ويعمل كعامل مساعد للبروتينات الحمض النووي الريبي ملزمة23 (RBPs) FBF-23 وGLD-125. يدعم عملنا نموذج DLC-1 الذي يعمل كبروتين محوري ويشير إلى أن DLC-1 يسهل شبكة التفاعل التي تمتد إلى ما بعد dynein19،22. باستخدام تقسيم السحب GST, تم التعرف على RBP DLC-1 التفاعل الجديد اسمه OMA-126. OMA-1 مهم لنمو البويضات والنضج الميوطي27 ويعمل بالتزامن مع عدد من المكبوتات والمنشطات المترجمة28. في حين يتم التعبير عن FBF-2 و GLD-1 في الخلايا الجذعية ومناطق pachytene meiotic ، على التوالي ، يتم التعبير عن OMA-1 بشكل منتشر في الخط الجرثومي من pachytene meiotic من خلال البويضات27 (الشكل 1). وهذا يشير إلى أن DLC-1 تشكل مجمعات مع RBPs في مناطق مختلفة من الغدد التناسلية. كما تبين أن التفاعل المباشر بين DLC-1 و OMA-1 الذي لوحظ في المختبر لا يتم استرداده بواسطة IP في الجسم الحي. وقد استخدم جيش التحرير الشعبى الصينى بنجاح كنهج بديل لمزيد من دراسة هذا التفاعل في خط الجراثيم C. elegans، وتشير النتائج إلى أنه يمكن استخدام جيش التحرير الشعبي للتحقيق في العديد من PPIs الأخرى في الدودة.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>16% paraformaldehyde solution</td>
			<td>Electron Microscopy services</td>
			<td>15710</td>
			<td>used to make 4% working solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M KH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0662</td>
			<td>Prepare a 1M working stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x M9</td>
			<td>various</td>
			<td>various</td>
			<td>prepared as 10x stock used at 1x; see wormbook.org for protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x PBS</td>
			<td>various</td>
			<td>various</td>
			<td>see wormbook.org for protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26.5 Gauge Needle</td>
			<td>Exel International</td>
			<td>26402</td>
			<td>Needles used for dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Lampire</td>
			<td>7500802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tubes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>05-529C</td>
			<td>50ml Oak ridge centrifuge tube used for synchronization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin Jar</td>
			<td>PolyLab</td>
			<td>62101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip to Freeze Sample</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>1411-10</td>
			<td>22x40mm, No. 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip to Seal Slide</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>1404-15</td>
			<td>22x22mm, No. 1.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI Mounting Medium for Immunofluorescence</td>
			<td>Vector</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ligase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO82029</td>
			<td>Duolink 1x Ligase, Comes as part of the Duolink In Situ Detection Reagents Red kit DUO92008</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplification red buffer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO82011</td>
			<td>Duolink 5x Amplification Red buffer, Comes as part of the Duolink In Situ Detection Reagents Red kit DUO92008</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ligation Buffer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO82009</td>
			<td>Duolink 5x Ligation buffer, Comes as part of the Duolink In Situ Detection Reagents Red kit DUO92008</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody Diluent</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO82008</td>
			<td>Duolink antibody diluent,Comes with DUO92004 and DUO92002, Note: A 1x PBS/1% BSA solution can also be used as a substitute to dilute the antibody.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO82007</td>
			<td>Duolink blocking solution, Comes with DUO92004 and DUO92002</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting Medium for PLA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO82040</td>
			<td>Duolink In Situ mounting medium with DAPI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MINUS Probe</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO92004</td>
			<td>Duolink In Situ Probe Anti-Mouse MINUS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLUS Probe</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO92002</td>
			<td>Duolink In Situ Probe Anti-Rabbit PLUS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash Buffer A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO82046</td>
			<td>Duolink In Situ wash Buffer A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash Buffer B</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO82048</td>
			<td>Duolink In Situ wash Buffer B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polymerase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO82030</td>
			<td>Duolink Polymerase, Comes as part of the Duolink In Situ Detection Reagents Red kit DUO92008</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescent Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>DFC300G camera, DM5500B microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse Alexa 594</td>
			<td>JacksonImmuno</td>
			<td>115-585-146</td>
			<td>Use at 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit Alexa 488</td>
			<td>JacksonImmuno</td>
			<td>111-545-144</td>
			<td>Use at 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Processing Software</td>
			<td>Adobe</td>
			<td></td>
			<td>Adobe Photoshop + Illsutrator CS3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pipette</td>
			<td>Corning</td>
			<td>7095B-5X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Levamisole</td>
			<td>ACROS Organics</td>
			<td>187870100</td>
			<td>Prepare a 250mM working stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-FLAG</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F1804</td>
			<td>Use at 1:1000 for immunofluorescence and PLA, pre-block with normal goat serum recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nailpolish</td>
			<td>L.A. colors</td>
			<td>CNP195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nematode Growth Medium (NGM)</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
			<td>See wormbook.org for protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum</td>
			<td>JacksonImmuno</td>
			<td>005-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene Pasteur Pipette</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>135030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1524</td>
			<td>Prepared as 0.1% stock solution in water, stored at -20C, and diluted 1:100 in water to coat slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dishes</td>
			<td>Tritech</td>
			<td>PD7060</td>
			<td>60 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-GFP</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>G10362</td>
			<td>Use at 1:200 for immunofluorescence, 1:4000 for PLA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slides</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>30-2066A-Brown</td>
			<td>Three-square 14x14mm autoclavable slides with bars are custom-ordered through Fisher Scientific. Poly-L-Lysine added to slides in the lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hypochlorite solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SS290-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>task wipes</td>
			<td>Kimtech</td>
			<td>34120</td>
			<td>4.4x8.4 inch task wipes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trays (242x241x20mm)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>240845</td>
			<td>Used to make humid chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>ACROS Organics</td>
			<td>327372500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure water</td>
			<td>Milli-Q</td>
			<td></td>
			<td>Ultrapure water obtained from Milli-Q Integral Water Purification System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Watchglass</td>
			<td>Carolina Biological</td>
			<td>742300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-20 &#176;C freezer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-80 &#176;C freezer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum Foil</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OP50 strain E. coli</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital Shaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tape</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nematode strains used in this study (both available upon request)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mntSi13[pME4.1] II; unc-119(ed3) III; teIs1 [pRL475]</td>
			<td></td>
			<td>UMT 376</td>
			<td>dlc-1 prom::3xFLAG::dlc-1::dlc-1 3&#39;UTR; oma-1 prom::oma-1::GFP; Reference 24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mntSi13[pME4.1] II; mntSi21[pXW6.22] unc-119(ed3) III</td>
			<td></td>
			<td>UMT 422</td>
			<td>dlc-1 prom::3xFLAG::dlc-1::dlc-1 3&#39;UTR; gld-1 prom::ceGFP::fbf-1 3&#39;UTR + unc-119(+); Reference: this study</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in situ detection of ribonucleoprotein complex assembly in the c. elegans germline using proximity ligation assay

إن فهم متى وأين تحدث التفاعلات بين البروتين والبروتين (PPIs) أمر بالغ الأهمية لفهم وظيفة البروتين في الخلية وكيفية تأثر العمليات الأوسع مثل التنمية. إن خط كريات الإيجان اتّصال Caenorhabditis elegans هو نظام نموذجي رائع لدراسة مؤشرات أسعار الصفحات المرتبطة بتنظيم الخلايا الجذعية وداء الميوس والتنمية. هناك مجموعة متنوعة من التقنيات المتطورة التي تسمح بالموسومة البروتينات ذات الأهمية للاعتراف بها من قبل الأجسام المضادة القياسية ، مما يجعل هذا النظام مفيدًا لتفاعلات تقدير الربط القربي (PLA). ونتيجة لذلك، فإن جيش التحرير الشعبي قادر على إظهار أين تحدث مؤشرات أسعار الشراكة بين القطاعين العام والخاص بطريقة مكانية وزمنية في الخطوط الجرثومية على نحو أكثر فعالية من النهج البديلة. يوصف هنا هو بروتوكول لتطبيق وتقدير هذه التكنولوجيا للتحقيق PPIs في خط الجراثيم C. elegans.

المناعة المشتركة لكل من 3xFLAG::DLC-1; GFP و 3xFLAG: :DLC-1; كشفت OMA-1::GFP germlines مع الأجسام المضادة العلم وGFP أنماط التعبير في خط الجراثيم(الشكل 3Aii-iii, 3Bii-iii). في حين تم التعبير عن GFP في جميع أنحاء خط الجراثيم(الشكل 3Aiii)، تم تقييد التعبير OMA-1::GFP ...

Watch this Scientific Journal Video about In Situ Detection of Ribonucleoprotein Complex Assembly in the C. elegans Germline using Proximity Ligation Assay at JoVE.com

In Situ Detection of Ribonucleoprotein Complex Assembly in the C. elegans Germline using Proximity Ligation Assay

يوضح هذا البروتوكول استخدام فحص ربط القرب للتحقيق في التفاعلات بين البروتين والبروتين في الموقع في خط ج. elegans الجرثومي.

في الكشف عن الموقع من التجمع مجمع Ribonucleoprotein في C. elegans Germline باستخدام القرب الربط اساي

Understanding when and where protein-protein interactions (PPIs) occur is critical to understanding protein function in the cell and how broader processes ...

يسمح تحليل الربط القربي للمستخدمين باكتشاف التفاعلات البروتينية والبروتينية في الموقع ، مما يكشف عن الأنماط المكانية والزمانية للتفاعلات. هذه التقنية يمكن أن تساعد في الإجابة على أسئلة هامة حول تنظيم تطوير C.elegans. هذه التقنية توفر حساسية مماثلة للكشف عن التفاعلات البروتينية البروتينية دون تعقيد تقنيات أخرى، مثل فريت وBiFC.الأفراد الذين لم تشريح الديدان لاطلاق سراح السناد قد النضال مع هذه الخطوة. ممارسة تشريح الديدان، واستخدامها لflufluorescence لإتقان تقنيات المعالجة وتشريح قبل الانتقال إلى جيش التحرير الشعبي. للبدء، اختر 30 إلى 40 ديدان البالغين الشباب في طبق زجاجي ساعة تحتوي على 500 ميكرولترات من 1x M9 وlevamisole.بعد جمع الديدان، وإزالة بعناية وتجاهل معظم وسائل الإعلام لإزالة البكتيريا التي يتم نقلها جنبا إلى جنب مع الديدان. إضافة في 500 ميكرولترات جديدة من 1x M9 وlevamisole، واستخدام ماصة لرسم بلطف والاستغناء عن وسائل الإعلام لشطف الديدان. قم بإزالة معظم الوسائط وتجاهلها بعناية.كرر غسل مرتين إلى ثلاث مرات. بعد يغسل، وترك الديدان في حوالي 100 ميكرولترات من وسائل الإعلام لمدة لا تزيد عن ثماني دقائق. باستخدام ماصة من الزجاج أو البولي إيثيلين، نقل الديدان إلى شريحة مجهر 25 ملليمترا في 75 ملليمتر المغلفة مع 001٪ بولي-L-ليسين.إزالة الوسائط الزائدة بحيث يبقى ما يقرب من 15 ميكرولترات من الوسائط على الشريحة. إزالة العازلة الزائدة أمر بالغ الأهمية لضمان أن الديدان تشريح والسناد سوف تلتزم الشريحة. تحت مجهر تشريح، مع اثنين من 26 1/2-قياس الإبر، ووضع إبرة واحدة على الآخر بحيث ينتهي شكل زوج من مقص.باستخدام الإبر الموجهة في هذا الشكل، وقطع الديدان وراء البلعوم لإطلاق الجراثيم. تشريح كل الديدان في غضون خمس دقائق. بعد أن يتم تشريح جميع الديدان، ضع بلطف غطاء 22 ملليمترًا في 40 ملليمترًا فوق الشريحة بحيث يكون عموديًا على الشريحة.يجب أن تتعطل نهايات الغطاء من الشريحة. تجميد الشرائح على كتلة الألومنيوم المبردة مسبقا الحفاظ على الجليد الجاف لمدة 20 دقيقة على الأقل. ضع قلم رصاص مبرد بلطف فوق الغطاء لمنع الغطاء من أن يصبح فضفاضًا بسبب توسع الجليد.عندما تكون جاهزة للتهيّم، افض الغبار قبالة الأغطية مع قلم رصاص، وتراجع على الفور الشريحة في جرة تحتوي على الطازجة، والميثانول الجليد الباردة لمدة دقيقة واحدة. ثم مسح بلطف حواف الشريحة المحيطة العينة، وتطبيق 150 ميكرولترات من الفورمالديهايد تثبيت في درجة حرارة الغرفة لإصلاح لمدة خمس دقائق. المس الشريحة إلى منشفة ورقية بزاوية عمودية 90 درجة للسماح للتركيل بالركض من الشريحة وامتصاصها في منشفة ورقية.كتلة الشرائح مرتين لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في جرة كوبلين مع 50 ملليلتر من PBT / BSA. ثم منع الشرائح مع حل PBT / BSA التي تحتوي على مصل الماعز العادي 10٪. قم بمسح الحواف التي تحيط بالشريحة بلطف، ثم قم بتطبيق 100 ميكرولترات من الحل على كل شريحة.وتهيج بلطف الشريحة للمساعدة في نشر الحل. احتضان لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة في غرفة رطبة. ضع الشريحة على منشفة ورقية للسماح للحل بالهرب من الشريحة، ومسح الحواف برفق.لمنع الشرائح، قم بتطبيق قطرة واحدة من كاشف الحجب على المساحة 14-millimeter-14--millimeter. احتضان الشرائح لمدة ساعة واحدة في 37 درجة مئوية في غرفة رطبة. ضع الشرائح على منشفة ورقية للسماح للحجب تشغيل كاشف قبالة الشريحة، ومسح حواف بلطف.استخدم جسم الجسم المضاد لتخفيف الأجسام المضادة الأولية. تطبيق 40 ميكرولترات من محلول الأجسام المضادة الأولية المخففة لكل مساحة 14-14 ميليمتر على الشرائح. ضع الشرائح في غرفة رطبة، وحضنها بين عشية وضحاها عند أربع درجات مئوية.في الصباح، وغسل الشرائح مرتين لمدة خمس دقائق، مع كل 50 ملليلتر من 1x غسل العازلة في درجة حرارة الغرفة في جرة كوبلين. تعيين جرة كوبلين على مجموعة شاكر المدارية إلى 60 دورة في الدقيقة. ضع الشرائح على منشفة ورقية للسماح للتخزين المؤقت بالهرب من الشريحة، ومسح الحواف برفق.إعداد حل 40 ميكرولتر تحتوي على تحقيقات زائد وناقص. أضف الحل إلى كل مساحة 14-14 مليمتر. احتضان الشرائح في غرفة رطبة لمدة ساعة واحدة في 37 درجة مئوية.غسل الشرائح مرتين لمدة خمس دقائق لكل من مع 50 ملليلتر من 1x غسل العازلة A في درجة حرارة الغرفة في جرة كوبلين. تعيين جرة كوبلين على مجموعة شاكر المدارية إلى 60 دورة في الدقيقة. تمييع العازلة ربط واحد إلى خمسة مع المياه فائقة الخطورة.استخدم هذا المخزن المؤقت لتمييع الرباط من 40 إلى 40 لإعداد مخزون عامل من حل الربط. ضع الشريحة على منشفة ورقية للسماح للمخزن المؤقت للغسيل بالهرب من الجانبين، ومسح الحواف برفق. أضف 40 ميكروليتر من محلول الربط لكل مساحة 14 في 14 ملليمتر.احتضان الشرائح في غرفة رطبة لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية. بعد غسل وتجفيف الشرائح كما سبق وصفها، إضافة 40 ميكرولترات من حل تضخيم الطازجة، محمية من الضوء، إلى كل مساحة 14-by-14 ملليمتر. احتضان الشرائح في غرفة رطبة، مظلمة لمدة ساعة واحدة و 40 دقيقة في 37 درجة مئوية.غسل الشرائح مرتين لمدة 10 دقائق لكل من 50 ملليلتر من 1x غسل العازلة B، وغسل الشرائح مرة واحدة لمدة دقيقة واحدة مع 50 ملليلتر من 01x غسل العازلة B.After تجفيف محيط المغلفة الايبوكسي من الشريحة، إضافة 10 ميكرولترات من متوسطة التركيب لكل عينة، ووضع بلطف غطاء على رأس، مما يسمح للواسطة تصاعد للانتشار. الطلاء حول حافة غطاء مع طلاء الأظافر لختم الغطاء والشريحة. تجنب تحريك غطاء الأغطية.دع طلاء الأظافر يصلب لمدة 20 دقيقة على الأقل في درجة حرارة الغرفة، ومحمية من الضوء. كشف الالضمان المشترك للمناعة من الجراثيم مع الأجسام المضادة العلم وGFP نمطها التعبير في الخط الجرثومي. في حين تم التعبير عن GFP في جميع أنحاء الخط الجرثومي، كان التعبير OMA-1:GFP يقتصر على الباسيتين المتأخر والبويضات.يظهر الالمائي في FLAG أن 3xFLAG:DLC-1 تم التعبير عنه في جميع أنحاء الخط الجرثومي في كل من السلالات. المنطقة ذات الأهمية لـ PLA quantification في الخط الجرثومي شملت الباسيتين المتأخر من خلال البويضات في جميع الجراثيم. هذه هي منطقة التعبير OMA-1.3xFLAG: DLC-1، OMA-1: GFP يبدو أن لديها كمية أكبر من بؤر جيش التحرير الشعبي داخل هذه المنطقة مقارنة مع 3xFLAG:DLC-1، GFP خطوط الجرثومية. تأكد من وجود ما يكفي من المياه لرفع الرطوبة في الغرفة. أيضا، تأكد من أن الشرائح هي مستوى داخل الغرفة لمنع الجريان السطحي من الكواشف.بعد قياس التقارب، يمكن تصوير الغدد الصماء المقذوفة على مجهر confocal وتحديد كمي باستخدام فيجي، سير عمل ImageJ. ويمكن أن يساعد هذا القياس الكمي في تحديد ما إذا كان التفاعل ذا أهمية إحصائية. جيش التحرير الشعبى الصينى سمح لنا بتقييم التفاعلات في الموقع بين المنظمين الحرجة للتنمية الوراثية الخيطية.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

In Situ Detection of Ribonucleoprotein Complex Assembly in the C. elegans Germline using Proximity Ligation Assay

Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

فهم توالد المبكر باستخدام المبسطة<em&gt; في الموقع</em&gt; بروتوكول التهجين في<em&gt; القيطم</em

Organogenesis is the study of how organs are specified and then acquire their specific shape and functions during development.  The Xenopuslaevis embryo ...

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

تقييم شامل من سلالة الجرثومية الكيماوية السمية باستخدام نيماتودا<em&gt; انواع معينة ايليجانس</em

Identifying the reproductive toxicity of the thousands of chemicals present in our environment has been one of the most tantalizing challenges in the ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

تحليل الزرد اليرقات الهيكل العظمي النزاهة العضلات مع ايفانز الأزرق صبغ

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

تحليل المكاني والزماني لأحدث إرك في<em&gt; C. ايليجانس</em&gt; الخط الجرثومي

The evolutionarily conserved&#160;extracellular signal transducing RTK-RAS-ERK pathway is an important kinase-signaling cascade that controls multiple ...

The Power of Simplicity: Sea Urchin Embryos as in Vivo Developmental Models for Studying Complex Cell-to-cell Signaling Network Interactions

The Power of Simplicity: Sea Urchin Embryos as in Vivo Developmental Models for Studying Complex Cell-to-cell Signaling Network Interactions

قوة البساطة: قنفذ البحر الأجنة كما<em&gt; في فيفو</em&gt; نماذج التنموية لدراسة مجمع خلية الى خلية اشارة شبكة التفاعلات

Remarkably few cell-to-cell signal transduction pathways are necessary during embryonic development to generate the large variety of cell types and ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

تشريح وتلطيخ إيممونوفلوريسسينت للفطر الجسم وعلم الخلايا العصبية في أدمغة البالغين melanogaster المورفولوجية

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

تطبيق [رني] والحرارة الناجمة عن صدمة "التعبير عامل النسخ" إلى "إعادة برمجة الخلايا الجرثومية" إلى الخلايا العصبية في C. ايليجانس

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

التحليل الحسابي ل Germline ايليجانس كاينورهابديتيس دراسة توزيع الأنوية، والبروتينات، وسيتوسكيليتون

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

تصور بالعقدة ولوحة نوتوتشوردال في جاسترولاتينج الأجنة الماوس باستخدام الميكروسكوب الإلكتروني المسح وكله جبل الفلورة

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Cell Cycle Analysis in the C. elegans Germline with the Thymidine Analog EdU

Cell Cycle Analysis in the C. elegans Germline with the Thymidine Analog EdU

تحليل دورة الخلية في Germline C. ايليجانس مع إيدو التناظرية Thymidine

Cell cycle analysis in eukaryotes frequently utilizes chromosome morphology, expression and/or localization of gene products required for various phases ...