Name: in situ detection of ribonucleoprotein complex assembly in the c. elegans germline using proximity ligation assay
Uploaded: 2020-05-05T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Situ Detection of Ribonucleoprotein Complex Assembly in the C. elegans Germline using Proximity Ligation Assay at JoVE.com

Nogle nematode stammer, der anvendes i denne undersøgelse blev leveret af Caenorhabditis Genetics Center finansieret af NIH (P40OD010440). Konfokal mikroskopi blev udført på University of Montana BioSpectroscopy Core Research Laboratory drives med støtte fra NIH Awards P20GM103546 og S10OD021806. Dette arbejde blev delvist støttet af NIH tilskud GM109053 til E.V., American Heart Association Fellowship 18PRE34070028 til X.W., og Montana Academy of Sciences pris til X.W. Finansieringsgiverne var ikke involveret i studiedesign eller udarbejdelse af rapporten. Vi takker M. Ellenbecker for diskussionen.

BEMÆRK: Denne protokol bruger C. elegans stammer, hvor potentielle interagerende partnere er begge mærket. Det anbefales på det kraftigste, at der anvendes en negativ kontrolstamme, hvor et mærket protein ikke forventes at interagere med en anden kodet kandidatinteraktionspartner. Her blev GFP alene brugt som en negativ kontrol til at vurdere baggrunden, da DLC-1 ikke forventes at interagere med GFP i ormen. GFP-mærket OMA-1 blev brugt som den eksperimentelle stamme, da foreløbige data tyder på en interak...

<ol>
	<li>Bergg&#229;rd, T., Linse, S., James, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+the+detection+and+analysis+of+protein-protein+interactions.">Methods for the detection and analysis of protein-protein interactions.</a> Proteomics. 7 (16), 2833-2842 (2007).</li><li>Nooren, I. M., Thornton, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+of+protein-protein+interactions.">Diversity of protein-protein interactions.</a> EMBO Journal. 22 (14), 3486-3492 (2003).</li><li>Patil, A., Kinosselecta, K., Nakamura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hub+promiscuity+in+protein-protein+interaction+networks.">Hub promiscuity in protein-protein interaction networks.</a> International Journal of Molecular Science. 11 (4), 1930-1943 (2010).</li><li>De Las Rivas, J., Fontanillo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-protein+interactions+essentials:+key+concepts+to+building+and+analyzing+interactome+networks.">Protein-protein interactions essentials: key concepts to building and analyzing interactome networks.</a> PLoS Computational Biology. 6 (6), e1000807 (2010).</li><li>Pazdernik, N., Schedl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+to+germ+cell+development+in+Caenorhabditis+elegans.">Introduction to germ cell development in Caenorhabditis elegans.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 757, 1-16 (2013).</li><li>Nousch, M., Eckmann, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+control+in+the+Caenorhabditis+elegans+germ+line.">Translational control in the Caenorhabditis elegans germ line.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 757, 205-247 (2013).</li><li>Vangindertael, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+introduction+to+optical+super-resolution+microscopy+for+the+adventurous+biologist.">An introduction to optical super-resolution microscopy for the adventurous biologist.</a> Methods and Applications in Fluorescence. 6 (2), 022003 (2018).</li><li>Veeraraghavan, R., Gourdie, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+optical+reconstruction+microscopy-based+relative+localization+analysis+(STORM-RLA)+for+quantitative+nanoscale+assessment+of+spatial+protein+organization.">Stochastic optical reconstruction microscopy-based relative localization analysis (STORM-RLA) for quantitative nanoscale assessment of spatial protein organization.</a> Molecular Biology of the Cell. 27 (22), 3583-3590 (2016).</li><li>Thymiakou, E., Episkopou, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+signaling+effector-complexes+downstream+of+bmp4+using+PLA,+a+proximity+ligation+assay.">Detection of signaling effector-complexes downstream of bmp4 using PLA, a proximity ligation assay.</a> Journal of Visualized Experiments. (49), (2011).</li><li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+in+situ+protein-protein+complexes+at+the+Drosophila+larval+neuromuscular+junction+using+proximity+ligation+assay.">Detection of in situ protein-protein complexes at the Drosophila larval neuromuscular junction using proximity ligation assay.</a> Journal of Visualized Experiments. (95), 52139 (2015).</li><li>Algar, W. R., Hildebrandt, N., Vogel, S. S., Medintz, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FRET+as+a+biomolecular+research+tool+-+understanding+its+potential+while+avoiding+pitfalls.">FRET as a biomolecular research tool - understanding its potential while avoiding pitfalls.</a> Nature Methods. 16 (9), 815-829 (2019).</li><li>Kodama, Y., Hu, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bimolecular+fluorescence+complementation+(BiFC):+a+5-year+update+and+future+perspectives.">Bimolecular fluorescence complementation (BiFC): a 5-year update and future perspectives.</a> Biotechniques. 53 (5), 285-298 (2012).</li><li>Piston, D. W., Kremers, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+protein+FRET:+the+good,+the+bad+and+the+ugly.">Fluorescent protein FRET: the good, the bad and the ugly.</a> Trends in Biochemical Science. 32 (9), 407-414 (2007).</li><li>Hiatt, S. M., Shyu, Y. J., Duren, H. M., Hu, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bimolecular+fluorescence+complementation+(BiFC)+analysis+of+protein+interactions+in+Caenorhabditis+elegans.">Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) analysis of protein interactions in Caenorhabditis elegans.</a> Methods. 45 (3), 185-191 (2008).</li><li>S&#246;derberg, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+proteins+and+their+interactions+in+cells+and+tissues+using+the+in+situ+proximity+ligation+assay.">Characterizing proteins and their interactions in cells and tissues using the in situ proximity ligation assay.</a> Methods. 45 (3), 227-232 (2008).</li><li>Wilson, M. J., Salata, M. W., Susalka, S. J., Pfister, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+chains+of+mammalian+cytoplasmic+dynein:+identification+and+characterization+of+a+family+of+LC8+light+chains.">Light chains of mammalian cytoplasmic dynein: identification and characterization of a family of LC8 light chains.</a> Cell Motility and Cytoskeleton. 49 (4), 229-240 (2001).</li><li>Erd&#337;s, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+linear+motif+filtering+protocol+reveals+the+role+of+the+LC8+dynein+light+chain+in+the+Hippo+pathway.">Novel linear motif filtering protocol reveals the role of the LC8 dynein light chain in the Hippo pathway.</a> PLoS Computational Biology. 13 (12), e1005885 (2017).</li><li>Navarro-L&#233;rida, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+identification+of+brain+proteins+that+interact+with+dynein+light+chain+LC8.">Proteomic identification of brain proteins that interact with dynein light chain LC8.</a> Proteomics. 4 (2), 339-346 (2004).</li><li>Rapali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DYNLL/LC8:+a+light+chain+subunit+of+the+dynein+motor+complex+and+beyond.">DYNLL/LC8: a light chain subunit of the dynein motor complex and beyond.</a> FEBS Journal. 278 (17), 2980-2996 (2011).</li><li>Rapali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+reveals+the+binding+motif+preference+of+the+LC8/DYNLL+hub+protein+and+predicts+large+numbers+of+novel+binders+in+the+human+proteome.">Directed evolution reveals the binding motif preference of the LC8/DYNLL hub protein and predicts large numbers of novel binders in the human proteome.</a> PLoS One. 6 (4), e18818 (2011).</li><li>Clark, S. A., Jespersen, N., Woodward, C., Barbar, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multivalent+IDP+assemblies:+Unique+properties+of+LC8-associated,+IDP+duplex+scaffolds.">Multivalent IDP assemblies: Unique properties of LC8-associated, IDP duplex scaffolds.</a> FEBS Letters. 589 (19 Pt A), 2543-2551 (2015).</li><li>Jespersen, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+identification+of+recognition+motifs+for+the+hub+protein+LC8.">Systematic identification of recognition motifs for the hub protein LC8.</a> Life Science Alliance. 2 (4), (2019).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynein+light+chain+DLC-1+promotes+localization+and+function+of+the+PUF+protein+FBF-2+in+germline+progenitor+cells.">Dynein light chain DLC-1 promotes localization and function of the PUF protein FBF-2 in germline progenitor cells.</a> Development. 143 (24), 4643-4653 (2016).</li><li>Dorsett, M., Schedl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+dynein+in+the+inhibition+of+germ+cell+proliferative+fate.">A role for dynein in the inhibition of germ cell proliferative fate.</a> Molecular Biology of the Cell. 29 (22), 6128-6139 (2009).</li><li>Ellenbecker, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynein+Light+Chain+DLC-1+Facilitates+the+Function+of+the+Germline+Cell+Fate+Regulator+GLD-1+in+Caenorhabditis+elegans.">Dynein Light Chain DLC-1 Facilitates the Function of the Germline Cell Fate Regulator GLD-1 in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 211 (2), 665-681 (2019).</li><li>Day, N. J., Ellenbecker, M., Voronina, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+DLC-1+associates+with+ribonucleoprotein+complexes+to+promote+mRNA+regulation.">Caenorhabditis elegans DLC-1 associates with ribonucleoprotein complexes to promote mRNA regulation.</a> FEBS Letters. 592 (22), 3683-3695 (2018).</li><li>Detwiler, M. R., Reuben, M., Li, X., Rogers, E., Lin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+zinc+finger+proteins,+OMA-1+and+OMA-2,+are+redundantly+required+for+oocyte+maturation+in+C.+elegans.">Two zinc finger proteins, OMA-1 and OMA-2, are redundantly required for oocyte maturation in C. elegans.</a> Developmental Cell. 1 (2), 187-199 (2001).</li><li>Spike, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+control+of+the+oogenic+program+by+components+of+OMA+ribonucleoprotein+particles+in+Caenorhabditis+elegans.">Translational control of the oogenic program by components of OMA ribonucleoprotein particles in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 198 (4), 1513-1533 (2014).</li><li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cer&#243;n, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Caenorhabditis+elegans+methods:+synchronization+and+observation.">Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation.</a> Journal of Visualized Experiments. (64), (2012).</li><li>Gervaise, A. L., Arur, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+Temporal+Analysis+of+Active+ERK+in+the+C.+elegans+Germline.">Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline.</a> Journal of Visualized Experiments. (117), (2016).</li><li>Duerr, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+staining+in+C.+elegans+using+"freeze-cracking".">Antibody staining in C. elegans using "freeze-cracking".</a> Journal of Visualized Experiments. (80), (2013).</li><li>Crittenden, S., Kimble, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+immunolabeling+of+Caenorhabditis+elegans.">Preparation and immunolabeling of Caenorhabditis elegans.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (5), (2009).</li></ol>

Når man studerer PPI i C. elegans germline, den højere opløsning, der tilbydes af PLA i forhold til co-immunfarvning tillader visualisering og kvantificering af steder, hvor interaktioner forekommer i kønsceller. Det blev tidligere rapporteret, at DLC-1 direkte interagerer med OMA-1 ved hjælp af en in vitro GST pulldown assay26; Denne interaktion blev dog ikke genoprettet ved en in vivo-pulldown. Den fluorescerende co-immunfarvning af 3xFLAG::DLC-1; OMA-1::GFP-germlines vise...

Over 80 % af proteinerne skønnes at have interaktioner med andre molekyler1, hvilket understreger , hvor vigtige PPI er for udførelsen af specifikke biologiske funktioner i cellen2. Nogle proteiner fungerer som hubs, der letter samling af større komplekser, der er nødvendige for celleoverlevelse1. Disse hubs formidler flere PPI'er og hjælper med at organisere proteiner i et netværk, der letter bestemte funktioner i en celle3. Dannelse af proteinkomplekser påvirkes også af biologisk kontekst, såsom tilstedeværelse eller fravær af specifikke interagerende partnere4,cellesignaleringshændelser og udviklingsstadiet af en celle.
C. elegans er almindeligt anvendt som en model organisme for en række undersøgelser, herunder udvikling. Den enkle anatomi af dette dyr består af flere organer, herunder gonade, tarm, og gennemsigtig neglebånd, som letter analysen af orm udvikling. Den germline bosat i gonade er et fantastisk værktøj til at studere, hvordan germline stamceller modnes i gameter5, der udvikler sig til embryoner og i sidste ende den næste generation af afkom. Kimlinens distale spidsregion indeholder en pulje af selvfornyende stamceller (figur 1). Som stamceller forlade niche, de fremskridt i meiotic pachytene og i sidste ende udvikle sig til oocytter i den unge voksne fase (Figur 1). Dette udviklingsprogram i germline er stramt reguleret gennem forskellige mekanismer, herunder en post-transskriptionel regulerende netværk faciliteret af RNA-bindende proteiner (RFP' er)6. PPI er vigtige for denne regulerende aktivitet, da ropp'er forbinder med andre cofaktorer for at udøve deres funktioner.
Der er flere tilgange, der kan bruges til at sonde for PPI i ormen, men hver har unikke begrænsninger. In vivo immunnedbør (IP) kan bruges til at isolere protein-protein komplekser fra hele ormen ekstrakter; Denne fremgangsmåde angiver dog ikke, hvor PPI forekommer i ormen. Desuden kan proteinkomplekser, der er forbigående og kun dannes i et bestemt udviklingstrin eller i et begrænset antal celler, være vanskelige at genvinde ved co-immunudfældning. Endelig skal IP-eksperimenter tage fat på problemerne ved proteinkompleks resortiment efter lysis og ikke-specifik retention af proteiner på affinitetsmatrixen.
Alternative tilgange til in situ-påvisning af PPI er co-immunfarvning, Förster resonans energioverførsel (FRET) og bimolekylær fluorescens komplementation (BiFC). Co-immunfarvning er afhængig af samtidig påvisning af to proteiner af interesse i fast ormvæv og måling af omfanget af signalkolokalisering. Brug af mikroskopi med superopløsning, som giver flere detaljer end standardmikroskopi7, bidrager til strengere test af proteinkolokalisering ud over den diffraktionsbegrænsede barriere på 200-300 nm8. Co-immunfarvning ved hjælp af både konventionel og superopløsningsmikroskopi fungerer dog bedst for proteiner med veldefinerede lokaliseringsmønstre. Derimod bliver det langt mindre informativt for diffust distribuerede interagerende partnere. Måling med henblik på samlokalisering af signaler baseret på overlapning giver ikke nøjagtige oplysninger om , hvorvidt proteinerne er komplekse med hinanden9,10.
Desuden er co-immunudfældning og co-immunfarvning af protein-protein komplekser ikke kvantitative, hvilket gør det udfordrende at afgøre, om sådanne interaktioner er betydelige. FRET og BiFC er begge fluorescerende teknikker. FRET er afhængig af mærkning af proteiner af interesse med fluorescerende proteiner (FPs), der har spektral overlapning, hvor energi fra en FP (donor) overføres til et andet FP (acceptor)11. Denne ikke-radiative overførsel af energi resulterer i fluorescens af acceptorFP, som kan detekteres ved dens respektive emissionsbølgelængde. BiFC er baseret på rekonstitution af et fluorescerende protein in vivo. Det indebærer opdeling GFP i to komplementære fragmenter, såsom helices 1-10 og helix 1112, som derefter smeltes til to proteiner af interesse. Hvis disse to proteiner interagerer, bliver de komplementære fragmenter af GFP tæt nok i nærheden til at folde og samle, hvilket genudgør GFP fluorophore. Rekonstitueret gfp observeres derefter direkte som fluorescens og angiver, hvor der er forekommet en PPI.
Som sådan er både FRET og BiFC afhængige af store fluorescerende tags, der kan forstyrre funktionen af det mærkede protein. Desuden kræver FRET og BiFC rigelige og sammenlignelige udtryk for de mærkede proteiner for at opnå nøjagtige data. FRET er muligvis ikke egnet til forsøg, hvor den ene partner overstiger den anden, hvilket kan føre til høj baggrund13. Overekspression i BiFC-forsøg bør også undgås, da dette kan fremkalde uspecifik samling14, der resulterer i øget baggrund. Begge teknikker kræver optimering af de mærkede proteiners ekspressions- og billeddannelsesforhold, hvilket kan forlænge den tid, det tager at fuldføre eksperimenter.
Nærhedligation assay (PLA) er en alternativ tilgang, der kan løse begrænsningerne af de teknikker, der er nævnt ovenfor. PLA udnytter primære antistoffer, der genkender de proteiner af interesse (eller deres tags). Disse primære antistoffer bindes derefter af sekundære antistoffer, der indeholder oligonukleotidsonder, der kan hybridisere med hinanden, når der inden for en afstand på 40 nm (eller kortere)15. Den resulterende hybridiserede DNA forstærkes gennem en PCR-reaktion, som detekteres af sonder, der supplerer DNA'et. Dette resulterer i foci, der visualiseres af et mikroskop. Denne teknologi kan detektere PPI in situ i komplekse væv (dvs. ormen gonade), som er organiseret som en samlebånd, der indeholder celler på forskellige stadier af udvikling og differentiering. Med PLA kan PPI visualiseres direkte i en fast ormgode, hvilket er fordelagtigt for at undersøge, om PPI forekommer i en bestemt udviklingsfase. PLA tilbyder større opløsning af PPI i modsætning til co-lokaliseringsbaserede analyser, som er ideel til at foretage præcise målinger. Hvis det bruges, super-opløsning mikroskopi har potentiale til at give finere detaljer om placeringen af PLA foci i en celle. En anden fordel er, at foci som følge af PLA reaktioner kan tælles af en ImageJ-baseret analyse workflow, hvilket gør denne teknik kvantitativ.
LC8-familien af dynein-lyskæder blev først beskrevet som en underenhed af dynein motorkomplekset16 og en hypotese til at fungere som en lastadapter. Siden sin første opdagelse, LC8 er blevet fundet i flere proteinkomplekser ud over dynein motor kompleks17,18,19,20. Scanning efter proteinsekvenser , der indeholder LC8 interaktionsmotivet19 , tyder på , at LC8 kan have mange interaktioner med en bred vifte af forskellige proteiner17,18,19,20,21,22. Som et resultat, LC8 familie proteiner er nu betragtes som knudepunkter, der bidrager til at fremme samling af større protein komplekser19,22, såsom samlinger af iboende uordnede proteiner21.
En C. elegans LC8-familie protein, dynein lyskæde-1 (DLC-1), er bredt udtrykt på tværs af mange væv og ikke beriget i specifikke subcellulære strukturer23,24. Derfor er identifikation af biologisk relevante in vivo-partnere for DLC-1 i C. elegans udfordrende af en række årsager: 1) co-immunudfældning angiver ikke den vævskilde, hvor interaktionen finder sted. 2) begrænset ekspression af bestemte partnere eller forbigående interaktioner kan hindre evnen til at påvise en interaktion ved co-immunoudfældning; og 3) diffus distribution af DLC-1 fører til ikke-specifik overlapning med potentielle partnerproteiner ved co-immunfarvning. Baseret på disse udfordringer er PLA en ideel tilgang til test af in vivo interaktioner med DLC-1.
Det er tidligere blevet rapporteret, at DLC-1 interagerer direkte med og fungerer som en cofaktor for RNA-bindende proteiner (RBC' er) FBF-223 og GLD-125. Vores arbejde understøtter modellen af DLC-1, der fungerer som et hubprotein, og foreslår, at DLC-1 letter et interaktionsnetværk, der strækker sig ud over dynein19,,22. Ved hjælp af en GST pulldown analyse, en ny DLC-1-interagerende RBP opkaldt OMA-1 er blevet identificeret26. OMA-1 er vigtig for oocytvækst og meiotisk modning27 og fungerer sammen med en række translationelle repressorer og aktivatorer28. Mens FBF-2 og GLD-1 udtrykkes i henholdsvis stamceller og meiotiske pachytenregioner, udtrykkes OMA-1 diffust udtrykt i kimen fra meiotisk pachyten gennem oocytterne27 (Figur 1). Dette tyder på, at DLC-1 former komplekser med RAS i forskellige regioner af gonade. Det er også blevet konstateret, at den direkte interaktion mellem DLC-1 og OMA-1 observeret in vitro ikke er inddrevet af en in vivo IP. PLA er med succes blevet brugt som en alternativ tilgang til yderligere undersøgelse af denne interaktion i C. elegans germline, og resultaterne tyder på, at PLA kan bruges til at sonde mange andre PPI i ormen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>16% paraformaldehyde solution</td>
			<td>Electron Microscopy services</td>
			<td>15710</td>
			<td>used to make 4% working solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M KH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0662</td>
			<td>Prepare a 1M working stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x M9</td>
			<td>various</td>
			<td>various</td>
			<td>prepared as 10x stock used at 1x; see wormbook.org for protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x PBS</td>
			<td>various</td>
			<td>various</td>
			<td>see wormbook.org for protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26.5 Gauge Needle</td>
			<td>Exel International</td>
			<td>26402</td>
			<td>Needles used for dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Lampire</td>
			<td>7500802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tubes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>05-529C</td>
			<td>50ml Oak ridge centrifuge tube used for synchronization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin Jar</td>
			<td>PolyLab</td>
			<td>62101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip to Freeze Sample</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>1411-10</td>
			<td>22x40mm, No. 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip to Seal Slide</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>1404-15</td>
			<td>22x22mm, No. 1.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI Mounting Medium for Immunofluorescence</td>
			<td>Vector</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ligase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO82029</td>
			<td>Duolink 1x Ligase, Comes as part of the Duolink In Situ Detection Reagents Red kit DUO92008</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplification red buffer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO82011</td>
			<td>Duolink 5x Amplification Red buffer, Comes as part of the Duolink In Situ Detection Reagents Red kit DUO92008</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ligation Buffer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO82009</td>
			<td>Duolink 5x Ligation buffer, Comes as part of the Duolink In Situ Detection Reagents Red kit DUO92008</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody Diluent</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO82008</td>
			<td>Duolink antibody diluent,Comes with DUO92004 and DUO92002, Note: A 1x PBS/1% BSA solution can also be used as a substitute to dilute the antibody.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO82007</td>
			<td>Duolink blocking solution, Comes with DUO92004 and DUO92002</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting Medium for PLA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO82040</td>
			<td>Duolink In Situ mounting medium with DAPI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MINUS Probe</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO92004</td>
			<td>Duolink In Situ Probe Anti-Mouse MINUS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLUS Probe</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO92002</td>
			<td>Duolink In Situ Probe Anti-Rabbit PLUS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash Buffer A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO82046</td>
			<td>Duolink In Situ wash Buffer A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash Buffer B</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO82048</td>
			<td>Duolink In Situ wash Buffer B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polymerase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO82030</td>
			<td>Duolink Polymerase, Comes as part of the Duolink In Situ Detection Reagents Red kit DUO92008</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescent Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>DFC300G camera, DM5500B microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse Alexa 594</td>
			<td>JacksonImmuno</td>
			<td>115-585-146</td>
			<td>Use at 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit Alexa 488</td>
			<td>JacksonImmuno</td>
			<td>111-545-144</td>
			<td>Use at 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Processing Software</td>
			<td>Adobe</td>
			<td></td>
			<td>Adobe Photoshop + Illsutrator CS3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pipette</td>
			<td>Corning</td>
			<td>7095B-5X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Levamisole</td>
			<td>ACROS Organics</td>
			<td>187870100</td>
			<td>Prepare a 250mM working stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-FLAG</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F1804</td>
			<td>Use at 1:1000 for immunofluorescence and PLA, pre-block with normal goat serum recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nailpolish</td>
			<td>L.A. colors</td>
			<td>CNP195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nematode Growth Medium (NGM)</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
			<td>See wormbook.org for protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum</td>
			<td>JacksonImmuno</td>
			<td>005-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene Pasteur Pipette</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>135030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1524</td>
			<td>Prepared as 0.1% stock solution in water, stored at -20C, and diluted 1:100 in water to coat slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dishes</td>
			<td>Tritech</td>
			<td>PD7060</td>
			<td>60 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-GFP</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>G10362</td>
			<td>Use at 1:200 for immunofluorescence, 1:4000 for PLA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slides</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>30-2066A-Brown</td>
			<td>Three-square 14x14mm autoclavable slides with bars are custom-ordered through Fisher Scientific. Poly-L-Lysine added to slides in the lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hypochlorite solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SS290-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>task wipes</td>
			<td>Kimtech</td>
			<td>34120</td>
			<td>4.4x8.4 inch task wipes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trays (242x241x20mm)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>240845</td>
			<td>Used to make humid chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>ACROS Organics</td>
			<td>327372500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure water</td>
			<td>Milli-Q</td>
			<td></td>
			<td>Ultrapure water obtained from Milli-Q Integral Water Purification System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Watchglass</td>
			<td>Carolina Biological</td>
			<td>742300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-20 &#176;C freezer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-80 &#176;C freezer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum Foil</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OP50 strain E. coli</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital Shaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tape</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nematode strains used in this study (both available upon request)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mntSi13[pME4.1] II; unc-119(ed3) III; teIs1 [pRL475]</td>
			<td></td>
			<td>UMT 376</td>
			<td>dlc-1 prom::3xFLAG::dlc-1::dlc-1 3&#39;UTR; oma-1 prom::oma-1::GFP; Reference 24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mntSi13[pME4.1] II; mntSi21[pXW6.22] unc-119(ed3) III</td>
			<td></td>
			<td>UMT 422</td>
			<td>dlc-1 prom::3xFLAG::dlc-1::dlc-1 3&#39;UTR; gld-1 prom::ceGFP::fbf-1 3&#39;UTR + unc-119(+); Reference: this study</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in situ detection of ribonucleoprotein complex assembly in the c. elegans germline using proximity ligation assay

Forståelse af, hvornår og hvor protein-protein interaktioner (PPI) opstår, er afgørende for at forstå protein funktion i cellen, og hvordan bredere processer såsom udvikling påvirkes. Den Caenorhabditis elegans germline er en stor model system til undersøgelse af PPI, der er relateret til regulering af stamceller, meiose, og udvikling. Der er en række veludviklede teknikker, der gør det muligt proteiner af interesse at blive mærket for anerkendelse af standard antistoffer, hvilket gør dette system fordelagtigt for nærhed ligation assay (PLA) reaktioner. Som følge heraf er PLA i stand til at vise, hvor PPI forekommer på en rumlig og tidsmæssig måde i germlines mere effektivt end alternative tilgange. Beskrevet her er en protokol for anvendelse og kvantificering af denne teknologi til sonde PPI i C. elegans germline.

Co-immunfarvning af både 3xFLAG::DLC-1; GFP og 3xFLAG::DLC-1; OMA-1::GFP-germlines med FLAG- og GFP-antistoffer afslørede deres udtryksmønstre i kimen (figur 3Aii-iii,3Bii-iii). Mens GFP blev udtrykt i hele germline (Figur 3Aiii), OMA-1::GFP udtryk var begrænset til den sene pachyten og oocytter (Figur 3Biii)27. FLAG immun...

Watch this Scientific Journal Video about In Situ Detection of Ribonucleoprotein Complex Assembly in the C. elegans Germline using Proximity Ligation Assay at JoVE.com

In Situ Detection of Ribonucleoprotein Complex Assembly in the C. elegans Germline using Proximity Ligation Assay

Denne protokol viser brugen af nærhedligation assay at sonde for protein-protein interaktioner in situ i C. elegans germline.

In Situ Påvisning af Ribonucleoprotein Complex Assembly i C. elegans Germline ved hjælp af Nærhed Ligation Assay

Understanding when and where protein-protein interactions (PPIs) occur is critical to understanding protein function in the cell and how broader processes ...

Nærhed ligation assay giver brugerne mulighed for at opdage protein-protein interaktioner in situ, afslørende rumlige og tidsmæssige mønstre af interaktioner. Denne teknik kan hjælpe med at besvare vigtige spørgsmål om regulering af C.elegans udvikling. Denne teknik giver sammenlignelig følsomhed for påvisning af protein-protein interaktioner uden kompleksiteten af andre teknikker, såsom FRET og BiFC.Personer, der aldrig har dissekeret orme til at frigive gonader kan kæmpe med dette trin. Øv dem dissekere orme, og brug dem til immunfluorescens til at perfektionere håndterings- og dissektionsteknikkerne, før du går videre til PLA. Til at begynde, vælge 30 til 40 unge voksne orme i et ur glas fad, der indeholder 500 mikroliter af 1x M9 og levamisole.Efter indsamling af orme, omhyggeligt fjerne og kassere de fleste af medierne for at fjerne bakterier, der overføres sammen med orme. Tilføj i friske 500 mikroliter af 1x M9 og levamisole, og brug pipetten til forsigtigt at udarbejde og dispensere medierne til at skylle ormene. Fjern og kassér forsigtigt de fleste medier.Gentag vasken to til tre gange. Efter vask, lad ormene i omkring 100 mikroliter af medier i højst otte minutter. Ved hjælp af et glas eller polyethylen pipette, overføre orme til en 25-millimeter-by-75-millimeter mikroskop dias belagt med 001% poly-L-lysin.Fjern det overskydende medie, så ca. 15 mikroliter medier forbliver på sliden. Fjernelse af overskydende buffer er afgørende for at sikre, at de dissekeret orme og gonader vil overholde diaset. Under et dissekerende mikroskop, med to 26 1/2-gauge nåle, skal du placere den ene nål over den anden, så enderne danner en saks.Brug nåle orienteret på denne måde, skære orme bag svælg at frigive kønspine. Dissekere alle ormene inden for fem minutter. Når alle orme er dissekeret, forsigtigt placere en 22-millimeter-by-40-millimeter coverslip over diaset, så det er vinkelret på diaset.Enderne af dækslæbet skal hænge diaset af. Frys dias på en pre-kølet aluminium blok opretholdes på tøris i mindst 20 minutter. Læg forsigtigt en kølet blyant oven på dækslet for at forhindre, at dækslet løsner sig på grund af isudvidelse.Når du er klar til fiksering, svirp ud coverslips med en blyant, og straks dyppe dias i en krukke, der indeholder frisk, iskold methanol i et minut. Tør derefter forsigtigt kanterne af diaset omkring prøven, og anvende 150 mikroliter formaldehydativ ved stuetemperatur til at fastsætte i fem minutter. Tryk på sliden til en køkkenrulle vinkelret 90 graders vinkel for at lade det fiksative løbe fra diaset og absorbere i køkkenrullen.Bloker objektglassene to gange i 15 minutter ved stuetemperatur i en Coplin-krukke med 50 milliliter PBT/BSA. Bloker derefter objektglassene med en PBT/BSA-opløsning, der indeholder 10 % normalt gedeserum. Tør forsigtigt de kanter, der omgiver diaset, og anvend forsigtigt opløsningens 100 mikroliter på hvert dias.Og ryst forsigtigt diaset for at hjælpe med at sprede opløsningen. Inkuberes i en time ved stuetemperatur i et fugtigt kammer. Placer rutsjebanen på en køkkenrulle for at lade opløsningen løbe af rutsjebanen, og tør forsigtigt kanterne.Hvis du vil blokere diasene, skal du anvende en dråbe af blokeringsgenageet på det 14 millimeter store mellemrum. Inkuber diasene i en time ved 37 grader Celsius i et fugtigt kammer. Placer objektglassene på en køkkenrulle, så blokering af reagensen løber af rutsjebanen, og tør forsigtigt kanterne.Brug antistoffets fortyndingstyndingsstof til at fortynde de primære antistoffer. Påfør 40 mikroliter af den fortyndede primære antistofopløsning pr. 14 gange 14 millimeter plads på objektglassene. Placer dias i et fugtigt kammer, og inkubere natten over ved fire grader Celsius.Om morgenen vaskes objektglassene to gange i fem minutter, hver med 50 milliliter 1x vaskepude A ved stuetemperatur i en Coplin-krukke. Indstil Coplin krukken på en orbital shaker sat til 60 rpm. Placer dias på en køkkenrulle for at lade vaske buffer løbe ud af dias, og forsigtigt tørre kanterne.Forbered en 40-mikroliter opløsning, der indeholder plus og minus sonder. Tilføj løsningen til hvert 14 gange 14 millimeter mellemrum. Inkuber rutsjebanerne i et fugtigt kammer i en time ved 37 grader Celsius.Vask objektglassene to gange i fem minutter hver med 50 milliliter 1x vaskepude A ved stuetemperatur i en Coplin-krukke. Indstil Coplin krukken på en orbital shaker sat til 60 rpm. Fortynd ligationsbufferen en til fem med ultrarent vand.Brug denne buffer til at fortynde ligasen en til 40 til at forberede en arbejdsbestand af ligationsopløsning. Placer rutsjebanen på en køkkenrulle for at lade vaskebufferen løbe ud af siderne, og tør forsigtigt kanterne. Tilsæt 40 mikroliter af ligationsopløsningen til hvert 14 gange 14 millimeter rum.Inkuber rutsjebanerne i et fugtigt kammer i 30 minutter ved 37 grader Celsius. Efter vask og tørring af dias som tidligere beskrevet, tilsættes 40 mikroliter frisklavet forstærkningsopløsning, beskyttet mod lys, til hver 14-by-14-millimeter rum. Inkuber rutsjebanerne i det fugtige, mørke kammer i en time og 40 minutter ved 37 grader Celsius.Slides to gange i 10 minutter hver med 50 milliliter 1x vaskepude B, og vask rutsjebanerne én gang i et minut med 50 milliliter 01x vaskepude B.Efter tørring af rutsjebanens epoxybelagte omkreds skal der tilsættes 10 mikroliter monteringsmedium til hver prøve, og der forsigtigtlægges en dækslede på toppen, så monteringsmediet kan spredes ud. Mal rundt om kanten af dækslæb med neglelak for at forsegle dækslæbet og glide. Undgå at flytte dækslæbet.Lad neglelakken hærde i mindst 20 minutter ved stuetemperatur, beskyttet mod lys. Co-immunostaining af kimen med FLAG og GFP antistoffer afslørede deres mønster af udtryk i kimen. Mens GFP blev udtrykt i hele kimen, OMA-1:GFP udtryk var begrænset til den sene pachytene og oocytter.FLAG immunostaining viser, at 3xFLAG:DLC-1 blev udtrykt i hele kimen i begge stammer. Den region af interesse for PLA kvantificering i kimen omfattede den sene pachytene gennem oocytter i alle kønsceller. Dette er regionen OMA-1 udtryk.3xFLAG:DLC-1, OMA-1:GFP kimlinjer syntes at have en større mængde PLA foci inden for denne region sammenlignet med 3xFLAG:DLC-1, GFP kimlinjer. Sørg for, at der er vand nok til at øge luftfugtigheden i kammeret. Sørg også for, at dias er i niveau inde i kammeret for at forhindre afstrømning af reagenser.Efter nærhed ligation assay, kan ekstruderet gonader afbildes på en konfokal mikroskop og kvantificeres ved hjælp af Fiji, ImageJ workflow. Denne kvantificering kan være med til at afgøre, om interaktionen er statistisk signifikant. PLA gav os mulighed for at vurdere in situ interaktioner mellem kritiske regulatorer af nematode germline udvikling.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

In Situ Detection of Ribonucleoprotein Complex Assembly in the C. elegans Germline using Proximity Ligation Assay

Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

Forståelse Tidlig Organogenesis efter en forenklet<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridization protokol<em&gt; Xenopus</em

Organogenesis is the study of how organs are specified and then acquire their specific shape and functions during development.  The Xenopuslaevis embryo ...

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

Omfattende vurdering af Kimcellelinje kemiske toksicitet Brug nematoden<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Identifying the reproductive toxicity of the thousands of chemicals present in our environment has been one of the most tantalizing challenges in the ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Analyse af zebrafisk Larver Skeletmuskel Integritet med Evans blå farvestof

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

Rumlig og tidsmæssig analyse af Active ERK i<em&gt; C. elegans</em&gt; Kimcellelinje

The evolutionarily conserved&#160;extracellular signal transducing RTK-RAS-ERK pathway is an important kinase-signaling cascade that controls multiple ...

The Power of Simplicity: Sea Urchin Embryos as in Vivo Developmental Models for Studying Complex Cell-to-cell Signaling Network Interactions

The Power of Simplicity: Sea Urchin Embryos as in Vivo Developmental Models for Studying Complex Cell-to-cell Signaling Network Interactions

The Power of Simplicity: Søpindsvin embryoner som<em&gt; I Vivo</em&gt; Developmental modeller til undersøgelser Complex celle-til-cellesignalering netværksinteraktioner

Remarkably few cell-to-cell signal transduction pathways are necessary during embryonic development to generate the large variety of cell types and ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissektion og immunfluorescent farvning af champignon krop og fotoreceptor neuroner i voksen Drosophila melanogaster hjerner

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Anvendelse af RNAi og Heat-shock-induceret transskription faktor udtryk til at omprogrammere kønsceller til neuroner i C. elegans

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Beregningsmæssige analyse af Caenorhabditis elegans kønscelleoverførsel at studere Distribution kerner, proteiner og cytoskelettet

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Visualisere Node og Notochordal plade i Gastrulating mus embryoner ved hjælp af Scanning elektronmikroskopi og hele Mount immunfluorescens

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Cell Cycle Analysis in the C. elegans Germline with the Thymidine Analog EdU

Cell Cycle Analysis in the C. elegans Germline with the Thymidine Analog EdU

Cellecyklus analyse i C. elegans kønscelleoverførsel med Thymidine Analog EdU

Cell cycle analysis in eukaryotes frequently utilizes chromosome morphology, expression and/or localization of gene products required for various phases ...