Name: in situ detection of ribonucleoprotein complex assembly in the c. elegans germline using proximity ligation assay
Uploaded: 2020-05-05T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Situ Detection of Ribonucleoprotein Complex Assembly in the C. elegans Germline using Proximity Ligation Assay at JoVE.com

Certaines souches de nématodes utilisées dans cette étude ont été fournies par le Caenorhabditis Genetics Center financé par les NIH (P40OD010440). La microscopie confocale a été réalisée au Laboratoire de recherche de base biospectroscopy de l’Université du Montana, exploité avec le soutien des NIH Awards P20GM103546 et S10OD021806. Ce travail a été soutenu en partie par la subvention des NIH GM109053 à E.V., American Heart Association Fellowship 18PRE34070028 à X.W., et le Montana Academy of Sciences Award à X.W. Les bailleurs de fonds n’ont pas participé à la conception ou à la rédaction du rapport. Nous remercions M. Ellenbecker pour la discussion.

REMARQUE : Ce protocole utilise des souches C. elegans dans lesquelles les partenaires potentiels d’interaction sont tous deux étiquetés. Il est fortement recommandé d’utiliser une souche de contrôle négatif, dans laquelle on ne s’attend pas à ce qu’une protéine étiquetée interagit avec un autre partenaire d’interaction candidat marqué. Ici, GFP seul a été utilisé comme un contrôle négatif pour évaluer le fond, comme DLC-1 ne devrait pas interagir avec GFP dans le ver. L’OMA-1 étique...

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Lors de l’étude des IPP dans la lignée germinale C. elegans, la résolution plus élevée offerte par l’APL par rapport à la co-immunostaining permet la visualisation et la quantification des endroits où les interactions se produisent dans la lignée germinale. Il a déjà été signalé que DLC-1 interagit directement avec OMA-1 à l’aide d’un essai in vitro de retrait de la TPS26; cependant, cette interaction n’a pas été récupérée par un retrait in vivo. La c...

On estime que plus de 80 % des protéines ont des interactions avec d’autres molécules1, ce qui souligne l’importance des IPP pour l’exécution de fonctions biologiques spécifiques dans la cellule2. Certaines protéines fonctionnent comme des plaques tournantes facilitant l’assemblage de plus grands complexes qui sont nécessaires pour la survie cellulaire1. Ces moyeux médiateur plusieurs IPP et aider à organiser des protéines dans un réseau qui facilite des fonctions spécifiques dans une cellule3. La formation de complexes protéiques est également affectée par le contexte biologique, comme la présence ou l’absence de partenaires interagissant spécifiques4,les événements de signalisation cellulaire et le stade de développement d’une cellule.
C. elegans est couramment utilisé comme organisme modèle pour une variété d’études, y compris le développement. La simple anatomie de cet animal est composée de plusieurs organes, dont le gonad, l’intestin et la cuticule transparente, ce qui facilite l’analyse du développement du ver. La lignée germinale résidant dans le gonad est un excellent outil pour étudier comment les cellules souches germinales mûrissent engamètes 5 qui se développent en embryons et éventuellement la prochaine génération de progéniture. La région de pointe distale de la lignée germinale contient un bassin de cellules souches auto-renouvelées(figure 1). Au fur et à mesure que les cellules souches quittent la niche, elles se transforment en pachytène méiotique et finissent par se transformer en oocytes au stade des jeunes adultes(figure 1). Ce programme de développement dans la lignée germinale est étroitement réglementé par différents mécanismes, y compris un réseau de réglementation post-transcriptionnelle facilité par des protéines liant l’ARN (RBP)6. Les IPP sont importantes pour cette activité réglementaire, car les RBP s’associent à d’autres cofacteurs pour exercer leurs fonctions.
Il existe plusieurs approches qui peuvent être utilisées pour sonder les IPP dans le ver, mais chacune a des limites uniques. L’immunoprécipitation in vivo (IP) peut être utilisée pour isoler les complexes protéiques-protéines des extraits de vers entiers; cependant, cette approche n’indique pas où l’IPP se produit dans le ver. En outre, les complexes protéiques qui sont transitoires et ne se forment qu’à un stade spécifique de développement ou dans un nombre limité de cellules peuvent être difficiles à récupérer par co-immunoprécipitation. Enfin, les expériences de propriété intellectuelle doivent répondre aux préoccupations du réassorignement complexe en protéines après lyse et de la rétention non spécifique des protéines sur la matrice d’affinité.
Les approches alternatives pour la détection in situ des IPP sont la co-immunostaining, le transfert d’énergie de résonance de la résonance (FRET) et la compléments de fluorescence bimoléculaire (BiFC). La co-immunostaining repose sur la détection simultanée de deux protéines d’intérêt dans le tissu ver fixe et la mesure de l’étendue de la colocalisation du signal. L’utilisation de la microscopie super-résolution, qui offre plus de détails que la microscopiestandard 7, aide à tester plus rigoureusement la colocalisation des protéines au-delà de la barrière limitée à la diffraction de 200-300 nm8. Cependant, la co-immunostaining utilisant la microscopie conventionnelle et super-résolution fonctionne mieux pour des protéines avec des modèles bien définis de localisation. En revanche, il devient beaucoup moins instructif pour les partenaires en interaction distribués de façon diffuse. Mesurer la co-localisation des signaux en fonction du chevauchement ne fournit pas d’informations précises sur la question de savoir si les protéines sont en complexitéles unesavec les autres 9,10.
En outre, la co-immunoprecipitation et la co-immunostaining des complexes protéines-protéines ne sont pas quantitatives, ce qui rend difficile de déterminer si de telles interactions sont significatives. FRET et BiFC sont deux techniques fluorescentes. FRET s’appuie sur le marquage des protéines d’intérêt avec des protéines fluorescentes (FP) qui ont chevauchement spectral à laquelle l’énergie d’un FP (donneur) est transférée à un autre FP (accepteur)11. Ce transfert nonradiatif d’énergie entraîne la fluorescence de l’accepteur FP qui peut être détectée à sa longueur d’onde respective d’émission. BiFC est basé sur la reconstitution d’une protéine fluorescente in vivo. Il s’agit de diviser GFP en deux fragments complémentaires, tels que les hélies 1-10 et l’hélice 1112, qui sont ensuite fusionnés à deux protéines d’intérêt. Si ces deux protéines interagissent, les fragments complémentaires de GFP deviennent assez proches à proximité pour se coucher et assembler, reconstituant le fluorophore GFP. Le GFP reconstitué est alors directement observé comme fluorescence et indique où un IPP s’est produit.
En tant que tel, FRET et BiFC dépendent de grandes étiquettes fluorescentes qui peuvent perturber la fonction de la protéine étiquetée. En outre, FRET et BiFC ont besoin d’une expression abondante et comparable des protéines étiquetées pour obtenir des données précises. FRET peut ne pas convenir à des expériences où l’un des partenaires est au-dessus de l’autre, ce qui peut conduire à un arrière-plan élevé13. La surexpression dans les expériences BiFC devrait également être évitée, car cela peut induire l’assemblage non spécifique14 qui a comme conséquence l’arrière-plan accru. Les deux techniques nécessitent l’optimisation des conditions d’expression et d’imagerie des protéines étiquetées, ce qui peut prolonger le temps nécessaire pour terminer les expériences.
L’essai de ligation de proximité (PLA) est une approche alternative qui peut répondre aux limites des techniques mentionnées ci-dessus. L’APL tire parti des anticorps primaires qui reconnaissent les protéines d’intérêt (ou leurs étiquettes). Ces anticorps primaires sont ensuite liés par des anticorps secondaires contenant des sondes d’oligoucléotide qui peuvent s’hybrider les uns avec les autres lorsqu’ils se trouvent à une distance de 40 nm (ou plus courte)15. L’ADN hybride qui en résulte est amplifié par une réaction de PCR, qui est détectée par des sondes qui complètent l’ADN. Il en résulte des foyers qui sont visualisés par un microscope. Cette technologie permet de détecter les IPP in situ dans les tissus complexes (c’est-à-dire le gonad ver), qui est organisé comme une chaîne d’assemblage contenant des cellules à divers stades de développement et de différenciation. Avec l’APL, les IPP peuvent être directement visualisées dans un gonad de ver fixe, ce qui est avantageux pour déterminer si les IPP se produisent à un stade spécifique de développement. L’APL offre une plus grande résolution des IPP par opposition aux essais basés sur la co-localisation, ce qui est idéal pour effectuer des mesures précises. Si elle est utilisée, la microscopie super-résolution a le potentiel de fournir des détails plus fins sur l’emplacement des foyers PLA dans une cellule. Un autre avantage est que les foyers résultant des réactions de l’APL peuvent être comptés par un flux de travail d’analyse basé sur ImageJ, ce qui rend cette technique quantitative.
La famille LC8 de chaînes lumineuses de dynein a d’abord été décrite comme un sous-unité du complexe moteur de dynein16 et a émis l’hypothèse de servir d’adaptateur de cargaison. Depuis sa découverte initiale, LC8 a été trouvé dans de multiples complexes protéiques en plus du complexe moteur de dynein17,18,19,20. Balayage pour les séquences de protéines qui contiennent le motif d’interaction LC819 suggère que LC8 peut avoir de nombreuses interactions avec un large éventail de protéines différentes17,18,19,20,21,22. En conséquence, les protéines de la famille LC8 sont maintenant considérées comme des plaques tournantes qui aident à promouvoir l’assemblage de plus grands complexes protéiques19,22, tels que des assemblages de protéines intrinsèquement désordonnées21.
Une protéine de la famille C. elegans LC8, la chaîne de lumière de la dynein-1 (DLC-1), est largement exprimée sur de nombreux tissus et non enrichie dans des structures souscellulaires spécifiques23,24. Par conséquent, l’identification des partenaires in vivo biologiquement pertinents de DLC-1 dans C. elegans est difficile pour un certain nombre de raisons : 1) la co-immunoprécipitation n’indique pas la source tissulaire où l’interaction se produit; 2) l’expression limitée de partenaires particuliers ou d’interactions transitoires peut entraver la capacité de détecter une interaction par co-immunoprécipitation; et 3) la distribution diffuse du DLC-1 entraîne un chevauchement non spécifique avec les protéines partenaires potentielles par co-immunostaining. Sur la base de ces défis, PLA est une approche idéale pour tester les interactions in vivo avec DLC-1.
Il a été précédemment rapporté que DLC-1 interagit directement avec et sert de cofacteur pour les protéines de liaison ARN (RBPs) FBF-223 et GLD-125. Notre travail prend en charge le modèle de DLC-1 servant de protéine de plaque tournante et suggère que DLC-1 facilite un réseau d’interaction qui s’étend au-delà de la dynein19,22. À l’aide d’un essai de retrait de la TPS, un nouveau RBP d’interaction DLC-1 nommé OMA-1 a été identifié26. OMA-1 est important pour la croissance oocyte et la maturation méiotique27 et fonctionne en conjonction avec un certain nombre de répresseurs translationnels et activateurs28. Alors que FBF-2 et GLD-1 sont exprimés dans les cellules souches et les régions méiotiques pachytene, respectivement, OMA-1 est exprimée diffusement dans la lignée germinale du pachytene méiotique par les oocytes27 (figure 1). Ceci suggère que DLC-1 forme des complexes avec des RBPs dans différentes régions du gonad. Il a également été constaté que l’interaction directe entre DLC-1 et OMA-1 observée in vitro n’est pas récupérée par une ADRESSE in vivo. L’APL a été utilisé avec succès comme une approche alternative pour étudier plus avant cette interaction dans la lignée germinale C. elegans, et les résultats suggèrent que l’APL peut être utilisé pour sonder de nombreux autres IPP dans le ver.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>16% paraformaldehyde solution</td>
			<td>Electron Microscopy services</td>
			<td>15710</td>
			<td>used to make 4% working solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M KH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0662</td>
			<td>Prepare a 1M working stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x M9</td>
			<td>various</td>
			<td>various</td>
			<td>prepared as 10x stock used at 1x; see wormbook.org for protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x PBS</td>
			<td>various</td>
			<td>various</td>
			<td>see wormbook.org for protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26.5 Gauge Needle</td>
			<td>Exel International</td>
			<td>26402</td>
			<td>Needles used for dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Lampire</td>
			<td>7500802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tubes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>05-529C</td>
			<td>50ml Oak ridge centrifuge tube used for synchronization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin Jar</td>
			<td>PolyLab</td>
			<td>62101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip to Freeze Sample</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>1411-10</td>
			<td>22x40mm, No. 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip to Seal Slide</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>1404-15</td>
			<td>22x22mm, No. 1.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI Mounting Medium for Immunofluorescence</td>
			<td>Vector</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ligase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO82029</td>
			<td>Duolink 1x Ligase, Comes as part of the Duolink In Situ Detection Reagents Red kit DUO92008</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplification red buffer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO82011</td>
			<td>Duolink 5x Amplification Red buffer, Comes as part of the Duolink In Situ Detection Reagents Red kit DUO92008</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ligation Buffer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO82009</td>
			<td>Duolink 5x Ligation buffer, Comes as part of the Duolink In Situ Detection Reagents Red kit DUO92008</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody Diluent</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO82008</td>
			<td>Duolink antibody diluent,Comes with DUO92004 and DUO92002, Note: A 1x PBS/1% BSA solution can also be used as a substitute to dilute the antibody.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO82007</td>
			<td>Duolink blocking solution, Comes with DUO92004 and DUO92002</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting Medium for PLA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO82040</td>
			<td>Duolink In Situ mounting medium with DAPI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MINUS Probe</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO92004</td>
			<td>Duolink In Situ Probe Anti-Mouse MINUS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLUS Probe</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO92002</td>
			<td>Duolink In Situ Probe Anti-Rabbit PLUS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash Buffer A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO82046</td>
			<td>Duolink In Situ wash Buffer A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash Buffer B</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO82048</td>
			<td>Duolink In Situ wash Buffer B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polymerase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO82030</td>
			<td>Duolink Polymerase, Comes as part of the Duolink In Situ Detection Reagents Red kit DUO92008</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescent Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>DFC300G camera, DM5500B microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse Alexa 594</td>
			<td>JacksonImmuno</td>
			<td>115-585-146</td>
			<td>Use at 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit Alexa 488</td>
			<td>JacksonImmuno</td>
			<td>111-545-144</td>
			<td>Use at 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Processing Software</td>
			<td>Adobe</td>
			<td></td>
			<td>Adobe Photoshop + Illsutrator CS3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pipette</td>
			<td>Corning</td>
			<td>7095B-5X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Levamisole</td>
			<td>ACROS Organics</td>
			<td>187870100</td>
			<td>Prepare a 250mM working stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-FLAG</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F1804</td>
			<td>Use at 1:1000 for immunofluorescence and PLA, pre-block with normal goat serum recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nailpolish</td>
			<td>L.A. colors</td>
			<td>CNP195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nematode Growth Medium (NGM)</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
			<td>See wormbook.org for protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum</td>
			<td>JacksonImmuno</td>
			<td>005-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene Pasteur Pipette</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>135030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1524</td>
			<td>Prepared as 0.1% stock solution in water, stored at -20C, and diluted 1:100 in water to coat slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dishes</td>
			<td>Tritech</td>
			<td>PD7060</td>
			<td>60 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-GFP</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>G10362</td>
			<td>Use at 1:200 for immunofluorescence, 1:4000 for PLA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slides</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>30-2066A-Brown</td>
			<td>Three-square 14x14mm autoclavable slides with bars are custom-ordered through Fisher Scientific. Poly-L-Lysine added to slides in the lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hypochlorite solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SS290-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>task wipes</td>
			<td>Kimtech</td>
			<td>34120</td>
			<td>4.4x8.4 inch task wipes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trays (242x241x20mm)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>240845</td>
			<td>Used to make humid chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>ACROS Organics</td>
			<td>327372500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure water</td>
			<td>Milli-Q</td>
			<td></td>
			<td>Ultrapure water obtained from Milli-Q Integral Water Purification System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Watchglass</td>
			<td>Carolina Biological</td>
			<td>742300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-20 &#176;C freezer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-80 &#176;C freezer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum Foil</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OP50 strain E. coli</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital Shaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tape</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nematode strains used in this study (both available upon request)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mntSi13[pME4.1] II; unc-119(ed3) III; teIs1 [pRL475]</td>
			<td></td>
			<td>UMT 376</td>
			<td>dlc-1 prom::3xFLAG::dlc-1::dlc-1 3&#39;UTR; oma-1 prom::oma-1::GFP; Reference 24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mntSi13[pME4.1] II; mntSi21[pXW6.22] unc-119(ed3) III</td>
			<td></td>
			<td>UMT 422</td>
			<td>dlc-1 prom::3xFLAG::dlc-1::dlc-1 3&#39;UTR; gld-1 prom::ceGFP::fbf-1 3&#39;UTR + unc-119(+); Reference: this study</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in situ detection of ribonucleoprotein complex assembly in the c. elegans germline using proximity ligation assay

Il est essentiel de comprendre quand et où se produisent les interactions protéines-protéines (IPP) pour comprendre la fonction protéique dans la cellule et comment des processus plus larges tels que le développement sont affectés. La germline d’elegans de Caenorhabditis est un excellent modèle pour étudier les IPP qui sont liées à la régulation des cellules souches, à la méiose et au développement. Il existe une variété de techniques bien développées qui permettent aux protéines d’intérêt d’être étiquetées pour la reconnaissance par des anticorps standard, ce qui rend ce système avantageux pour les réactions d’analyse de ligature de proximité (PLA). En conséquence, l’APL est capable de montrer où les IPP se produisent d’une manière spatiale et temporelle dans les lignées germinales plus efficacement que les approches alternatives. Décrit ici est un protocole pour l’application et la quantification de cette technologie pour sonder les IPP dans la lignée germinale C. elegans.

Co-immunostaining des deux 3xFLAG::DLC-1; GFP et 3xFLAG::DLC-1; OMA-1::GFP germlines avec DES anticorps FLAG et GFP a révélé leurs modèles d’expression dans la lignée germinale (Figure 3Aii-iii,3Bii-iii). Alors que GFP a été exprimée tout au long de la germline (figure 3Aiii), OMA-1::GFP expression a été limitée à la pachytene tardive et les oocytes (figure 3</s...

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In Situ Detection of Ribonucleoprotein Complex Assembly in the C. elegans Germline using Proximity Ligation Assay

Ce protocole démontre l’utilisation de l’essai de ligation de proximité pour sonder pour des interactions protéine-protéine in situ dans la lignée germinale de C. elegans.

In Situ Détection de l’assemblage du complexe Ribonucleoprotéine dans le C. elegans Germline à l’aide de Proximity Ligation Assay

Understanding when and where protein-protein interactions (PPIs) occur is critical to understanding protein function in the cell and how broader processes ...

L’analyse de ligature de proximité permet aux utilisateurs de détecter les interactions protéine-protéine in situ, révélant les modèles spatiaux et temporels des interactions. Cette technique peut aider à répondre à d’importantes questions sur la réglementation du développement de C.elegans. Cette technique offre une sensibilité comparable pour la détection des interactions protéines-protéines sans la complexité d’autres techniques, telles que fret et BiFC.Les individus qui n’ont jamais disséqué les vers pour libérer les 9eds peuvent avoir du mal avec cette étape. Pratiquez la dissection des vers et utilisez-les pour l’immunofluorescence afin de perfectionner les techniques de manipulation et de dissection avant de passer à l’APL. Pour commencer, choisissez de 30 à 40 jeunes vers adultes dans un plat en verre de montre contenant 500 microlitres de 1x M9 et levamisole.Après avoir recueilli les vers, retirer soigneusement et jeter la plupart des médias pour éliminer les bactéries qui sont transférées avec les vers. Ajouter 500 microlitres frais de 1x M9 et levamisole, et utiliser la pipette pour dessiner doucement et distribuer le média pour rincer les vers. Retirez et jetez soigneusement la plupart des supports.Répétez le lavage deux à trois fois. Après les lavages, laissez les vers dans environ 100 microlitres de médias pendant au plus huit minutes. À l’aide d’une pipette en verre ou en polyéthylène, transférer les vers dans une glissade au microscope de 25 millimètres par 75 millimètres recouverte de poly-L-lysine à 001 %.Retirez l’excès de supports de sorte qu’environ 15 microlitres de médias restent sur la diapositive. L’élimination de l’excès de tampon est essentielle pour s’assurer que les vers et les 9eds disséqués adhèrent à la diapositive. Sous un microscope disséquant, avec deux aiguilles de calibre 26 1/2, placez une aiguille sur l’autre de sorte que les extrémités forment une paire de ciseaux.En utilisant les aiguilles orientées de cette façon, couper les vers derrière le pharynx pour libérer les germlines. Disséquez tous les vers en cinq minutes. Une fois que tous les vers sont disséqués, placez doucement un couvercle de 22 millimètres par 40 millimètres sur la glissière de sorte qu’il soit perpendiculaire à la diapositive.Les extrémités du coverslip doivent accrocher la glissière. Congeler les glissières sur un bloc d’aluminium pré-réfrigéré maintenu sur de la glace sèche pendant au moins 20 minutes. Placez délicatement un crayon réfrigéré sur le dessus du coverslip pour empêcher le coverslip de se détacher en raison de l’expansion de la glace.Une fois prêt pour la fixation, feuilletez les coverslips avec un crayon, et trempez immédiatement la glissière dans un bocal contenant du méthanol frais et glacé pendant une minute. Essuyez ensuite délicatement les bords de la lame entourant l’échantillon et appliquez 150 microlitres de fixatif de formaldéhyde à température ambiante pour fixer pendant cinq minutes. Touchez la lame à une serviette en papier à un angle perpendiculaire de 90 degrés pour laisser le fixatif s’enfuir de la glissière et absorber dans la serviette en papier.Bloquez les toboggans deux fois pendant 15 minutes à température ambiante dans un bocal Coplin avec 50 millilitres de PBT/BSA. Bloquez ensuite les glissières avec une solution PBT/BSA contenant 10% de sérum de chèvre normal. Essuyez doucement les bords qui entourent la glissière et appliquez 100 microlitres de la solution sur chaque glissière.Et agitez doucement la lame pour aider à répandre la solution. Incuber pendant une heure à température ambiante dans une chambre humide. Placez la lame sur une serviette en papier pour laisser la solution s’enfuir de la glissière et essuyez doucement les bords.Pour bloquer les glissières, appliquez une goutte du réaccente de blocage sur l’espace de 14 millimètres par 14 millimètres. Incuber les toboggans pendant une heure à 37 degrés Celsius dans une chambre humide. Placez les glissières sur une serviette en papier pour laisser le reagent bloquant s’enfuir de la glissière et essuyez doucement les bords.Utilisez le diluant anticorps pour diluer les anticorps primaires. Appliquez 40 microlitres de la solution d’anticorps primaire diluée par espace de 14 par 14 millimètres sur les glissières. Placez les glissières dans une chambre humide et incubez la nuit à quatre degrés Celsius.Le matin, lavez les glissières deux fois pendant cinq minutes, chacune avec 50 millilitres de tampon de lavage 1x A à température ambiante dans un bocal Coplin. Placez le pot Coplin sur un shaker orbital réglé à 60 rpm. Placez les glissières sur une serviette en papier pour laisser le tampon de lavage s’enfuir de la glissière et essuyez doucement les bords.Préparez une solution de 40 microlitres contenant des sondes plus et moins. Ajoutez la solution à chaque espace de 14 par 14 millimètres. Incuber les toboggans dans une chambre humide pendant une heure à 37 degrés Celsius.Lavez les glissières deux fois pendant cinq minutes chacune avec 50 millilitres de tampon de lavage 1x A à température ambiante dans un bocal Coplin. Placez le pot Coplin sur un shaker orbital réglé à 60 rpm. Diluer le tampon de ligature un à cinq avec de l’eau ultrapure.Utilisez ce tampon pour diluer la ligase un à 40 pour préparer un stock de travail de solution de ligature. Placez la lame sur une serviette en papier pour laisser le tampon de lavage s’enfuir des côtés et essuyez doucement les bords. Ajouter 40 microlitres de la solution de ligature à chaque espace de 14 x 14 millimètres.Incuber les toboggans dans une chambre humide pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius. Après le lavage et le séchage des glissières comme décrit précédemment, ajoutez 40 microlitres de solution d’amplification fraîchement préparée, protégée de la lumière, à chaque espace de 14 par 14 millimètres. Incuber les toboggans dans la chambre humide et sombre pendant une heure et 40 minutes à 37 degrés Celsius.Lavez les glissières deux fois pendant 10 minutes chacune avec 50 millilitres de tampon de lavage 1x B, et lavez les glissières une fois pendant une minute avec 50 millilitres de tampon de lavage 01x B.Après avoir sec le périmètre époxy-enduit de la glissière, ajoutez 10 microlitres de milieu de montage à chaque échantillon, et mentez doucement un coverslip sur le dessus, permettant au milieu de montage de s’étendre. Peindre autour du bord du coverslip avec du vernis à ongles pour sceller le coverslip et glisser. Évitez de déplacer le coverslip.Laisser durcir le vernis à ongles pendant au moins 20 minutes à température ambiante, à l’abri de la lumière. La co-immunostaining des germlines avec des anticorps flag et GFP a indiqué leur modèle d’expression dans la germline. Tandis que GFP a été exprimé tout au long de la germline, l’expression d’OMA-1:GFP a été limitée au pachytene et aux ovocytes tardifs.L’immunostaining flag montre que 3xFLAG:DLC-1 a été exprimé dans toute la lignée germinale dans les deux souches. La région d’intérêt pour la quantification de PLA dans la germline a inclus le pachytene tardif par les ovocytes dans toutes les lignées germinales. C’est la région de l’expression OMA-1.3xFLAG:DLC-1, OMA-1:GFP germlines semblaient avoir une plus grande quantité de foyers PLA dans cette région par rapport à la 3xFLAG:DLC-1, germlines GFP. Assurez-vous qu’il y a suffisamment d’eau pour augmenter l’humidité dans la chambre. Assurez-vous également que les glissières sont à niveau à l’intérieur de la chambre pour éviter le ruissellement des reagents.Après l’essai de ligature de proximité, les 9odes extrudés peuvent être imités sur un microscope confocal et quantifiés à l’aide de Fidji, flux de travail ImageJ. Cette quantification peut aider à déterminer si l’interaction est statistiquement significative. L’APL nous a permis d’évaluer les interactions in situ entre les régulateurs critiques du développement de la germline nématode.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

In Situ Detection of Ribonucleoprotein Complex Assembly in the C. elegans Germline using Proximity Ligation Assay

Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

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