Name: in situ detection of ribonucleoprotein complex assembly in the c. elegans germline using proximity ligation assay
Uploaded: 2020-05-05T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Situ Detection of Ribonucleoprotein Complex Assembly in the C. elegans Germline using Proximity Ligation Assay at JoVE.com

Einige Nematodenstämme, die in dieser Studie verwendet wurden, wurden vom Caenorhabditis Genetics Center bereitgestellt, das von der NIH (P40OD010440) finanziert wurde. Die konfokale Mikroskopie wurde im BioSpectroscopy Core Research Laboratory der University of Montana durchgeführt, das mit Unterstützung der NIH Awards P20GM103546 und S10OD021806 betrieben wurde. Diese Arbeit wurde teilweise durch das NIH-Stipendium GM109053 an E.V., American Heart Association Fellowship 18PRE34070028 an X.W. und Montana Academy of Sciences Award an X.W. unterstützt. Die Geldgeber waren weder an der Studiengestaltung noch am Verfassen des Berichts beteiligt. Wir danken Herrn Ellenbecker für die Diskussion.

HINWEIS: Dieses Protokoll verwendet C. elegans-Stämme, bei denen potenzielle interagierende Partner mit Tags versehen sind. Es wird dringend empfohlen, einen Negativkontrollstamm zu verwenden, bei dem nicht erwartet wird, dass ein markiertes Protein mit einem anderen markierten Kandidaten-Interaktionspartner interagiert. Hier wurde GFP allein als Negativkontrolle verwendet, um den Hintergrund zu bewerten, da nicht erwartet wird, dass DLC-1 mit GFP im Wurm interagiert. ALS experimenteller Stamm wurde MIT GFP-tag...

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Bei der Untersuchung von PPI in der C. elegans Keimbahn ermöglicht die höhere Auflösung, die PLA im Vergleich zur Co-Immunostainierung bietet, die Visualisierung und Quantifizierung von Orten, an denen Wechselwirkungen in der Keimbahn auftreten. Es wurde zuvor berichtet, dass DLC-1 direkt mit OMA-1 interagiert, indem ein in vitro GST Pulldown-Assay26verwendet wird; Diese Wechselwirkung wurde jedoch nicht durch einen In-vivo-Pulldown wiederhergestellt. Die fluoreszierende Co-Im...

Über 80% der Proteine haben schätzungsweise Wechselwirkungen mit anderen Molekülen1, was unterstreicht, wie wichtig PPI für die Ausführung spezifischer biologischer Funktionen in der Zelle2sind. Einige Proteine fungieren als Naben, die die Montage größerer Komplexe erleichtern, die für das Zellüberleben notwendig sind1. Diese Hubs vermitteln mehrere PPIs und helfen, Proteine in einem Netzwerk zu organisieren, das bestimmte Funktionen in einer Zelle3erleichtert. Die Bildung von Proteinkomplexen wird auch durch den biologischen Kontext beeinflusst, wie das Vorhandensein oder Fehlen spezifischer interagierender Partner4, Zellsignalereignisse und Entwicklungsstadium einer Zelle.
C. elegans wird häufig als Modellorganismus für eine Vielzahl von Studien verwendet, einschließlich der Entwicklung. Die einfache Anatomie dieses Tieres besteht aus mehreren Organen, einschließlich der Gonaden, des Darms und der transparenten Nagelhaut, was die Analyse der Wurmentwicklung erleichtert. Die Keimbahn, die sich in der Gonade befindet, ist ein großartiges Werkzeug, um zu untersuchen, wie Keimbahnstammzellen zu Gameten5 reifen, die sich zu Embryonen und schließlich zur nächsten Generation von Nachkommen entwickeln. Der distale Spitzenbereich der Keimbahn enthält einen Pool von sich selbst erneuernden Stammzellen (Abbildung 1). Wenn Stammzellen die Nische verlassen, gelangen sie in das meiotische Pachyten und entwickeln sich schließlich im jungen Erwachsenenstadium zu Eizellen(Abbildung 1). Dieses Entwicklungsprogramm in der Keimbahn wird durch verschiedene Mechanismen streng reguliert, einschließlich eines post-transkriptionspolitischen regulatorischen Netzwerks, das durch RNA-bindende Proteine (RBPs)6erleichtert wird. PPI sind für diese Regulierungstätigkeit wichtig, da RBPs mit anderen Kofaktoren zusammenarbeiten, um ihre Funktionen auszuüben.
Es gibt mehrere Ansätze, die verwendet werden können, um nach PPIs im Wurm zu suchen, aber jeder hat eindeutige Einschränkungen. In vivo Immunpräzipitation (IP) kann verwendet werden, um Protein-Protein-Komplexe aus ganzen Wurmextrakten zu isolieren; Dieser Ansatz gibt jedoch nicht an, wo der PPI im Wurm auftritt. Darüber hinaus können Proteinkomplexe, die vorübergehend sind und sich nur während eines bestimmten Entwicklungsstadiums oder in einer begrenzten Anzahl von Zellen bilden, durch Co-Immunpräzipation nur schwer zu erholen sein. Schließlich müssen IP-Experimente die Bedenken der Proteinkomplex-Neusortierung nach Lyse und unspezifische Retention von Proteinen auf der Affinitätsmatrix ansprechen.
Alternative Ansätze zur In-situ-Detektion von PPI sind Co-Immunostaining, Förster-Resonanzenergietransfer (FRET) und bimolekulare Fluoreszenzkomplementierung (BiFC). Co-Immunostaining beruht auf dem gleichzeitigen Nachweis von zwei Proteinen von Interesse in festem Wurmgewebe und der Messung des Ausmaßes der Signalkolokalisierung. Der Einsatz der hochauflösenden Mikroskopie, die detaillierter als die Standardmikroskopie7bietet, hilft, die Proteinkolokalisierung über die beugungsbegrenzte Barriere von 200-300 nm8hinaus strenger zu testen. Die Ko-Immunostainierung mit konventioneller und superhochauflösender Mikroskopie eignet sich jedoch am besten für Proteine mit genau definierten Lokalisierungsmustern. Im Gegensatz dazu wird es für diffus verteilte interagierende Partner viel weniger informativ. Die Messung der Kolokalisierung von Signalen auf der Grundlage von Überlappungen liefert keine genauen Informationen darüber, ob die Proteine komplex miteinander sind9,10.
Darüber hinaus sind Co-Immunpräzipation und Co-Immunostaining von Protein-Protein-Komplexen nicht quantitativ, was es schwierig macht, festzustellen, ob solche Wechselwirkungen signifikant sind. FRET und BiFC sind beide fluoreszierende Techniken. FRET stützt sich auf die Kennzeichnung von Proteinen von Interesse mit fluoreszierenden Proteinen (FPs), die spektrale Überlappung haben, bei der Energie von einem RP (Spender) an ein anderes RP (Akzeptor) übertragen wird11. Diese nicht-radiotive Energieübertragung führt zu einer Fluoreszenz des Akzeptor-FP, die bei seiner jeweiligen Emissionswellenlänge nachgewiesen werden kann. BiFC basiert auf der Rekonstitution eines fluoreszierenden Proteins in vivo. Es beinhaltet die Aufteilung von GFP in zwei komplementäre Fragmente, wie Helices 1-10 und Helix 1112, die dann zu zwei Proteinen von Interesse verschmolzen werden. Wenn diese beiden Proteine interagieren, werden die komplementären Fragmente von GFP in der Nähe nahe genug, um sich zu falten und zu montieren, wodurch das GFP-Fluorophor wieder vorhanden ist. Rekonstituiertes GFP wird dann direkt als Fluoreszenz beobachtet und gibt an, wo ein PPI aufgetreten ist.
Daher sind sowohl FRET als auch BiFC auf große fluoreszierende Tags angewiesen, die die Funktion des markierten Proteins stören können. Darüber hinaus benötigen FRET und BiFC eine reichliche und vergleichbare Expression der markierten Proteine, um genaue Daten zu erhalten. FRET ist möglicherweise nicht für Experimente geeignet, bei denen ein Partner über dem anderen liegt, was zu einem hohen Hintergrund führen kann13. Auch eine Überexpression in BiFC-Experimenten sollte vermieden werden, da dies zu einer unspezifischen Assembly14 führen kann, die zu einem erhöhten Hintergrund führt. Beide Techniken erfordern eine Optimierung der Expression und der bildgebenden Bedingungen der markierten Proteine, was die Zeit verlängern kann, die für die Abschluss von Experimenten erforderlich ist.
Der Proximity Ligation Assay (PLA) ist ein alternativer Ansatz, der die Grenzen der oben genannten Techniken angehen kann. PLA nutzt primäre Antikörper, die die Proteine von Interesse (oder ihre Tags) erkennen. Diese primären Antikörper werden dann durch sekundäre Antikörper gebunden, die Oligonukleotid-Sonden enthalten, die sich innerhalb eines Abstands von 40 nm (oder kürzer)15miteinander hybridisieren können. Die resultierende hybridisierte DNA wird durch eine PCR-Reaktion verstärkt, die von Sonden nachgewiesen wird, die die DNA ergänzen. Daraus ergeben sich Brennpunkte, die mit einem Mikroskop visualisiert werden. Diese Technologie kann PPI vor Ort in komplexen Geweben (d. h. dem Wurmgonaden) erkennen, der als Fließband organisiert ist, das Zellen in verschiedenen Entwicklungs- und Differenzierungsstadien enthält. Mit PLA können PPIs direkt in einem festen Wurmgonaden visualisiert werden, was vorteilhaft für die Untersuchung ist, ob PPI in einer bestimmten Entwicklungsphase auftreten. PLA bietet eine höhere Auflösung von PPIs im Gegensatz zu co-localization-basierten Assays, die ideal für präzise Messungen sind. Wenn sie verwendet wird, hat die superhochauflösende Mikroskopie das Potenzial, detailliertere Details über die Position von PLA-Brennpunkten innerhalb einer Zelle zu liefern. Ein weiterer Vorteil ist, dass die brennpunkteherreichen PLA-Reaktionen durch einen ImageJ-basierten Analyse-Workflow gezählt werden können, was diese Technik quantitativ macht.
Die LC8-Familie von Dynein-Lichtketten wurde zuerst als Untereinheit des Dynein-Motorkomplexes16 beschrieben und als Frachtadapter vermutet. Seit seiner ersten Entdeckung wurde LC8 in mehreren Proteinkomplexen neben dem Dynein-Motorkomplex17,,18,,19,20gefunden. Das Scannen nach Proteinsequenzen, die das LC8-Interaktionsmotiv19 enthalten, legt nahe, dass LC8 viele Wechselwirkungen mit einer Vielzahl verschiedener Proteine haben kann17,18,19,20,21,22. Als Ergebnis gelten Proteine der LC8-Familie heute als Naben, die die Montage größerer Proteinkomplexe19,22, wie Assemblys von intrinsisch ungeordneten Proteinen21, fördern.
Ein C. elegans LC8-Familie Protein, Dynein light chain-1 (DLC-1), ist weit verbreitet über viele Gewebe und nicht in spezifischen subzellulären Strukturen angereichert23,24. Folglich ist die Identifizierung biologisch relevanter In-vivo-Partner von DLC-1 in C. elegans aus einer Reihe von Gründen eine Herausforderung: 1) Die Co-Immunpräzipation gibt nicht die Gewebequelle an, in der die Wechselwirkung auftritt; 2) eine begrenzte Expression bestimmter Partner oder vorübergehende Wechselwirkungen kann die Fähigkeit behindern, eine Wechselwirkung durch Ko-Immunpräzipation zu erkennen; und 3) die diffuse Verteilung von DLC-1 führt zu unspezifischen Überschneidungen mit potenziellen Partnerproteinen durch Co-Immunostaining. Basierend auf diesen Herausforderungen ist PLA ein idealer Ansatz, um In-vivo-Interaktionen mit DLC-1 zu testen.
Es wurde bereits berichtet, dass DLC-1 direkt mit den RNA-bindenden Proteinen (RBPs) FBF-223 und GLD-125interagiert und als Cofaktor dient. Unsere Arbeit unterstützt das Modell von DLC-1, das als Nabenprotein dient, und schlägt vor, dass DLC-1 ein Interaktionsnetzwerk ermöglicht, das sich über Dynein19,22hinaus erstreckt. Mit einem GST-Pulldown-Assay wurde ein neuer DLC-1-interagierender RBP namens OMA-1 identifiziert26. OMA-1 ist wichtig für Eizellenwachstum und meiotische Reifung27 und funktioniert in Verbindung mit einer Reihe von translationalen Repressoren und Aktivatoren28. Während FBF-2 und GLD-1 in den Stammzellen bzw. meioten Pachytenregionen exprimiert werden, wird OMA-1 in der Keimbahn aus dem meiotischen Pachyten durch die Eizellen27 diffus exprimiert (Abbildung 1). Dies deutet darauf hin, dass DLC-1 komplexe Komplexe mit RBPs in verschiedenen Regionen des Gonaden bildet. Es wurde auch festgestellt, dass die direkte Interaktion zwischen DLC-1 und OMA-1, die in vitro beobachtet wurde, nicht durch ein In-vivo-IP wiederhergestellt wird. Die PLA wurde erfolgreich als alternativer Ansatz verwendet, um diese Wechselwirkung in der C. elegans Keimbahn weiter zu untersuchen, und die Ergebnisse deuten darauf hin, dass PLA verwendet werden kann, um viele andere PPI im Wurm zu untersuchen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>16% paraformaldehyde solution</td>
			<td>Electron Microscopy services</td>
			<td>15710</td>
			<td>used to make 4% working solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M KH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0662</td>
			<td>Prepare a 1M working stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x M9</td>
			<td>various</td>
			<td>various</td>
			<td>prepared as 10x stock used at 1x; see wormbook.org for protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x PBS</td>
			<td>various</td>
			<td>various</td>
			<td>see wormbook.org for protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26.5 Gauge Needle</td>
			<td>Exel International</td>
			<td>26402</td>
			<td>Needles used for dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Lampire</td>
			<td>7500802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tubes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>05-529C</td>
			<td>50ml Oak ridge centrifuge tube used for synchronization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin Jar</td>
			<td>PolyLab</td>
			<td>62101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip to Freeze Sample</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>1411-10</td>
			<td>22x40mm, No. 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip to Seal Slide</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>1404-15</td>
			<td>22x22mm, No. 1.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI Mounting Medium for Immunofluorescence</td>
			<td>Vector</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ligase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO82029</td>
			<td>Duolink 1x Ligase, Comes as part of the Duolink In Situ Detection Reagents Red kit DUO92008</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplification red buffer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO82011</td>
			<td>Duolink 5x Amplification Red buffer, Comes as part of the Duolink In Situ Detection Reagents Red kit DUO92008</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ligation Buffer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO82009</td>
			<td>Duolink 5x Ligation buffer, Comes as part of the Duolink In Situ Detection Reagents Red kit DUO92008</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody Diluent</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO82008</td>
			<td>Duolink antibody diluent,Comes with DUO92004 and DUO92002, Note: A 1x PBS/1% BSA solution can also be used as a substitute to dilute the antibody.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO82007</td>
			<td>Duolink blocking solution, Comes with DUO92004 and DUO92002</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting Medium for PLA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO82040</td>
			<td>Duolink In Situ mounting medium with DAPI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MINUS Probe</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO92004</td>
			<td>Duolink In Situ Probe Anti-Mouse MINUS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLUS Probe</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO92002</td>
			<td>Duolink In Situ Probe Anti-Rabbit PLUS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash Buffer A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO82046</td>
			<td>Duolink In Situ wash Buffer A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash Buffer B</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO82048</td>
			<td>Duolink In Situ wash Buffer B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polymerase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO82030</td>
			<td>Duolink Polymerase, Comes as part of the Duolink In Situ Detection Reagents Red kit DUO92008</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescent Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>DFC300G camera, DM5500B microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse Alexa 594</td>
			<td>JacksonImmuno</td>
			<td>115-585-146</td>
			<td>Use at 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit Alexa 488</td>
			<td>JacksonImmuno</td>
			<td>111-545-144</td>
			<td>Use at 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Processing Software</td>
			<td>Adobe</td>
			<td></td>
			<td>Adobe Photoshop + Illsutrator CS3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pipette</td>
			<td>Corning</td>
			<td>7095B-5X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Levamisole</td>
			<td>ACROS Organics</td>
			<td>187870100</td>
			<td>Prepare a 250mM working stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-FLAG</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F1804</td>
			<td>Use at 1:1000 for immunofluorescence and PLA, pre-block with normal goat serum recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nailpolish</td>
			<td>L.A. colors</td>
			<td>CNP195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nematode Growth Medium (NGM)</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
			<td>See wormbook.org for protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum</td>
			<td>JacksonImmuno</td>
			<td>005-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene Pasteur Pipette</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>135030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1524</td>
			<td>Prepared as 0.1% stock solution in water, stored at -20C, and diluted 1:100 in water to coat slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dishes</td>
			<td>Tritech</td>
			<td>PD7060</td>
			<td>60 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-GFP</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>G10362</td>
			<td>Use at 1:200 for immunofluorescence, 1:4000 for PLA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slides</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>30-2066A-Brown</td>
			<td>Three-square 14x14mm autoclavable slides with bars are custom-ordered through Fisher Scientific. Poly-L-Lysine added to slides in the lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hypochlorite solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SS290-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>task wipes</td>
			<td>Kimtech</td>
			<td>34120</td>
			<td>4.4x8.4 inch task wipes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trays (242x241x20mm)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>240845</td>
			<td>Used to make humid chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>ACROS Organics</td>
			<td>327372500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure water</td>
			<td>Milli-Q</td>
			<td></td>
			<td>Ultrapure water obtained from Milli-Q Integral Water Purification System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Watchglass</td>
			<td>Carolina Biological</td>
			<td>742300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-20 &#176;C freezer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-80 &#176;C freezer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum Foil</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OP50 strain E. coli</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital Shaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tape</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nematode strains used in this study (both available upon request)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mntSi13[pME4.1] II; unc-119(ed3) III; teIs1 [pRL475]</td>
			<td></td>
			<td>UMT 376</td>
			<td>dlc-1 prom::3xFLAG::dlc-1::dlc-1 3&#39;UTR; oma-1 prom::oma-1::GFP; Reference 24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mntSi13[pME4.1] II; mntSi21[pXW6.22] unc-119(ed3) III</td>
			<td></td>
			<td>UMT 422</td>
			<td>dlc-1 prom::3xFLAG::dlc-1::dlc-1 3&#39;UTR; gld-1 prom::ceGFP::fbf-1 3&#39;UTR + unc-119(+); Reference: this study</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in situ detection of ribonucleoprotein complex assembly in the c. elegans germline using proximity ligation assay

Zu verstehen, wann und wo Protein-Protein-Wechselwirkungen (PPIs) auftreten, ist entscheidend für das Verständnis der Proteinfunktion in der Zelle und wie breitere Prozesse wie die Entwicklung beeinflusst werden. Die Caenorhabditis elegans Keimbahn ist ein großartiges Modellsystem zur Untersuchung von PPI, die mit der Regulierung von Stammzellen, Meiose und Entwicklung zusammenhängen. Es gibt eine Vielzahl von gut entwickelten Techniken, die es ermöglichen, Proteine von Interesse für die Erkennung durch Standardantikörper zu kennzeichnen, was dieses System vorteilhaft für Proximity Ligation Assay (PLA) Reaktionen macht. Dadurch kann die PLA zeigen, wo PPI räumlich und zeitlich in Keimlinien auftreten, effektiver als alternative Ansätze. Hier wird ein Protokoll zur Anwendung und Quantifizierung dieser Technologie zur Untersuchung von PPI in der C. elegans Keimbahn beschrieben.

Co-Immunostaining beider 3xFLAG::DLC-1; GFP und 3xFLAG::DLC-1; OMA-1::GFP-Keimbahnen mit FLAG- und GFP-Antikörpern zeigten ihre Expressionsmuster in der Keimbahn (Abbildung 3Aii-iii,3Bii-iii). Während GFP in der gesamten Keimbahn exprimiert wurde (Abbildung 3Aiii), war die OMA-1::GFP-Expression auf die späten Pachyten und Eizellen beschränkt (Abbildung 3B...

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In Situ Detection of Ribonucleoprotein Complex Assembly in the C. elegans Germline using Proximity Ligation Assay

Dieses Protokoll demonstriert die Verwendung des Proximity Ligation Assays zur Sonde für Protein-Protein-Wechselwirkungen in situ in der C. elegans Keimbahn.

In Situ Detektion von Ribonucleoprotein Complex Assembly in der C. elegans Germline mit Proximity Ligation Assay

Understanding when and where protein-protein interactions (PPIs) occur is critical to understanding protein function in the cell and how broader processes ...

Proximity Ligation Assay ermöglicht es Benutzern, Protein-Protein-Wechselwirkungen in situ zu erkennen, und zeigt räumliche und zeitliche Muster der Wechselwirkungen auf. Diese Technik kann helfen, wichtige Fragen zur Regulierung der C.elegans Entwicklung zu beantworten. Diese Technik bietet eine vergleichbare Empfindlichkeit für den Nachweis von Protein-Protein-Wechselwirkungen ohne die Komplexität anderer Techniken wie FRET und BiFC.Personen, die noch nie Würmer seziert haben, um die Gonaden zu befreien, können mit diesem Schritt kämpfen. Üben Sie das Sezieren von Würmern und verwenden Sie sie für die Immunfluoreszenz, um die Handhabungs- und Seziertechniken zu perfektionieren, bevor Sie zu PLA übergehen. Zunächst sollten 30 bis 40 junge würmer in eine Uhrenglasschale mit 500 Mikrolitern 1x M9 und Levamisol gepflücken.Nach dem Sammeln der Würmer, entfernen und entsorgen Sie sorgfältig die meisten Medien, um Bakterien zu entfernen, die zusammen mit den Würmern übertragen werden. Fügen Sie frische 500 Mikroliter 1x M9 und Levamisol hinzu und verwenden Sie die Pipette, um die Medien sanft zu erstellen und zu verteilen, um die Würmer zu spülen. Entfernen und verwerfen Sie die meisten Medien sorgfältig.Wiederholen Sie die Wäsche zwei- bis dreimal. Lassen Sie die Würmer nach dem Einwälten nicht länger als acht Minuten in etwa 100 Mikroliter Medien. Übertragen Sie die Würmer mit einer Glas- oder Polyethylenpipette auf einen 25-Millimeter-x-75-Millimeter-Mikroskopschlitten, der mit 001%poly-L-Lysin beschichtet ist.Entfernen Sie das überschüssige Medium, so dass ca. 15 Mikroliter Medien auf der Folie verbleiben. Das Entfernen des überschüssigen Puffers ist entscheidend, um sicherzustellen, dass die sezierten Würmer und Gonaden an der Folie haften. Unter einem Sezieren des Mikroskops, mit zwei 26 1/2-Spurnadeln, legen Sie eine Nadel über die andere, so dass die Enden eine Schere bilden.Schneiden Sie die Würmer hinter dem Rachen mit den auf diese Weise orientierten Nadeln, um die Keimbahnen freizusetzen. Sezieren Sie alle Würmer innerhalb von fünf Minuten. Nachdem alle Würmer seziert sind, legen Sie vorsichtig einen 22-Millimeter-mal-40-Millimeter-Deckel über den Schlitten, so dass er senkrecht zum Schlitten ist.Die Enden des Coverslips sollten an der Rutsche hängen. Einfrieren Der Rutschen auf einem vorgekühlten Aluminiumblock, der mindestens 20 Minuten auf Trockeneis gehalten wird. Legen Sie vorsichtig einen gekühlten Bleistift auf den Deckelschlupf, um zu verhindern, dass sich der Deckelrutsch durch Eisausdehnung löst.Wenn Sie zur Fixierung bereit sind, streichen Sie die Abdeckungen mit einem Bleistift ab und tauchen Sie das Dia sofort für eine Minute in ein Glas mit frischem, eiskaltem Methanol. Wischen Sie dann vorsichtig die Ränder des Dias um die Probe herum ab und wenden Sie 150 Mikroliter Formaldehyd fixativ bei Raumtemperatur an, um sie fünf Minuten lang zu fixieren. Berühren Sie die Folie auf ein Papiertuch in einem senkrechten 90-Grad-Winkel, um das Fixativ von der Rutsche laufen zu lassen und in das Papiertuch zu absorbieren.Blockieren Sie die Dias zweimal für 15 Minuten bei Raumtemperatur in einem Coplin-Glas mit 50 Milliliter PBT/BSA. Blockieren Sie dann die Dias mit einer PBT/BSA-Lösung, die 10% normales Ziegenserum enthält. Wischen Sie die Kanten, die die Folie umgeben, vorsichtig ab, und tragen Sie 100 Mikroliter der Lösung auf jede Folie auf.Und rühren Sie sanft die Rutsche, um die Lösung zu verbreiten. Eine Stunde bei Raumtemperatur in einer feuchten Kammer inkubieren. Legen Sie die Folie auf ein Papiertuch, damit die Lösung von der Folie abläuft, und wischen Sie die Kanten vorsichtig ab.Um die Dias zu blockieren, wenden Sie einen Tropfen des blockierenden Reagenzes auf den 14-Millimeter-mal-14-Millimeter-Raum an. Inkubieren Sie die Rutschen für eine Stunde bei 37 Grad Celsius in einer feuchten Kammer. Legen Sie die Dias auf ein Papiertuch, damit das blockierende Reagenz von der Folie abläuft, und wischen Sie die Ränder vorsichtig ab.Verwenden Sie das Antikörperverdünnungsmittel, um die primären Antikörper zu verdünnen. Tragen Sie 40 Mikroliter der verdünnten Primärantikörperlösung pro 14 mal 14 Millimeter Raum auf die Dias auf. Die Rutschen in eine feuchte Kammer geben und über Nacht bei vier Grad Celsius bebrüten.Morgens die Dias zweimal für fünf Minuten waschen, jeweils mit 50 Millilitern 1x Waschpuffer A bei Raumtemperatur in einem Coplin-Glas. Stellen Sie das Coplin-Glas auf einen Orbital-Shaker auf 60 Rpm. Legen Sie die Dias auf ein Papiertuch, damit der Waschpuffer von der Folie abläuft, und wischen Sie die Kanten vorsichtig ab.Bereiten Sie eine 40-Mikroliter-Lösung mit Plus- und Minussonden vor. Fügen Sie die Lösung zu jedem 14 mal 14 Millimeter großen Raum hinzu. Inkubieren Sie die Rutschen in einer feuchten Kammer für eine Stunde bei 37 Grad Celsius.Waschen Sie die Dias zweimal für jeweils fünf Minuten mit 50 Millilitern 1x Waschpuffer A bei Raumtemperatur in einem Coplin-Glas. Stellen Sie das Coplin-Glas auf einen Orbital-Shaker auf 60 Rpm. Den Ligationspuffer eins bis fünf mit Reinstwasser verdünnen.Verwenden Sie diesen Puffer, um die Ligase eins bis 40 zu verdünnen, um einen Funktionierenbestand an Ligationslösung vorzubereiten. Legen Sie die Folie auf ein Papiertuch, damit der Waschpuffer von den Seiten abläuft, und wischen Sie die Kanten vorsichtig ab. Fügen Sie 40 Mikroliter der Ligationslösung zu jedem 14-mal-14-Millimeter-Raum hinzu.Inkubieren Sie die Rutschen in einer feuchten Kammer für 30 Minuten bei 37 Grad Celsius. Nach dem Waschen und Trocknen der Dias, wie zuvor beschrieben, 40 Mikroliter frisch zubereitete, lichtgeschützte Verstärkungslösung auf jeden 14 mal 14 Millimeter großen Raum hinzufügen. Inkubieren Sie die Rutschen in der feuchten, dunklen Kammer für eine Stunde und 40 Minuten bei 37 Grad Celsius.Waschen Sie die Dias zweimal für 10 Minuten mit 50 Milliliter 1x 1x Waschpuffer B, und waschen Sie die Dias einmal für eine Minute mit 50 Milliliter 01x Waschpuffer B. Nach dem Trocknen des epoxy-beschichteten Umfangs des Dias, fügen Sie 10 Mikroliter Montagemedium zu jeder Probe hinzu und legen Sie vorsichtig einen Deckelaufschub auf die Oberseite, so dass sich das Montagemedium ausbreiten kann. Malen Sie um den Rand des Coverslip mit Nagellack, um den Deckelschlupf zu versiegeln und zu gleiten. Vermeiden Sie es, den Deckelzuschlag zu verschieben.Lassen Sie den Nagellack mindestens 20 Minuten bei Raumtemperatur aushärten, vor Licht geschützt. Die Ko-Immunostainierung der Keimbahnen mit FLAG- und GFP-Antikörpern zeigte ihr Ausdrucksmuster in der Keimbahn. Während GFP in der gesamten Keimbahn ausgedrückt wurde, war OMA-1:GFP-Expression auf die späten Pachyten und Eizellen beschränkt.DIE FLAG-Immunostainierung zeigt, dass 3xFLAG:DLC-1 in beiden Stämmen in der Keimbahn exprimiert wurde. Das Fürppdummeis für die PLA-Quantifizierung in der Keimbahn interessierte sich um das späte Pachyten durch die Eizellen in allen Keimlinien. Dies ist die Region des OMA-1-Ausdrucks.3xFLAG:DLC-1, OMA-1:GFP Keimbahnen schienen eine größere Menge an PLA-Brennpunkten in dieser Region zu haben als die 3xFLAG:DLC-1, GFP Keimbahnen. Stellen Sie sicher, dass genügend Wasser vorhanden ist, um die Feuchtigkeit in der Kammer zu erhöhen. Stellen Sie außerdem sicher, dass die Dias innerhalb der Kammer eben sind, um den Ablauf von Reagenzien zu verhindern.Nach dem Proximity-Ligationstest können die extrudierten Gonaden auf einem konfokalen Mikroskop abgebildet und mit Demobfiji, ImageJ-Workflow, quantifiziert werden. Diese Quantifizierung kann helfen, festzustellen, ob die Wechselwirkung statistisch signifikant ist. PLA ermöglichte es uns, In-situ-Wechselwirkungen zwischen kritischen Regulatoren der Nematodenkeimbahnentwicklung zu bewerten.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

In Situ Detection of Ribonucleoprotein Complex Assembly in the C. elegans Germline using Proximity Ligation Assay

Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

Das Verständnis frühen Organogenese das vereinfachte<em&gt; In-situ-</em&gt; Hybridisierung Protokoll<em&gt; Xenopus</em

Organogenesis is the study of how organs are specified and then acquire their specific shape and functions during development.  The Xenopuslaevis embryo ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

Umfassende Beurteilung der Keimbahn Chemical Toxicity Mit der Nematode<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Identifying the reproductive toxicity of the thousands of chemicals present in our environment has been one of the most tantalizing challenges in the ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Analyse von Zebrafisch-Larven Skelettmuskel Integrität mit Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

Räumliche und zeitliche Analyse von Active ERK in der<em&gt; C. elegans</em&gt; Germline

The evolutionarily conserved&#160;extracellular signal transducing RTK-RAS-ERK pathway is an important kinase-signaling cascade that controls multiple ...

The Power of Simplicity: Sea Urchin Embryos as in Vivo Developmental Models for Studying Complex Cell-to-cell Signaling Network Interactions

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Die Kraft der Einfachheit: Seeigel Embry als<em&gt; In Vivo</em&gt; Entwicklungsmodelle für komplexe Zell-zu-Zell-Signalnetzwerk Wechselwirkungen Studieren

Remarkably few cell-to-cell signal transduction pathways are necessary during embryonic development to generate the large variety of cell types and ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissektion, Immunofluorescent Färbung der Pilz Körper und Photorezeptor Neuronen im Gehirn Erwachsener Taufliege melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Anwendung von RNAi und Hitze-Schock-induzierte Transkription Faktor Ausdruck zu programmieren Keimzellen Neuronen in C. elegans

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computergestützte Analyse der Keimbahn Caenorhabditis Elegans , die Verteilung der Kerne, Proteine und das Zytoskelett zu studieren

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Visualisierung der Knoten und Notochordal Platte In Gastrulating Maus-Embryonen mittels Rasterelektronenmikroskopie und ganze Mount Immunfluoreszenz

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Cell Cycle Analysis in the C. elegans Germline with the Thymidine Analog EdU

Cell Cycle Analysis in the C. elegans Germline with the Thymidine Analog EdU

Cell Cycle Analysis in C. Elegans Keimbahn mit Thymidin-Analog-EdU

Cell cycle analysis in eukaryotes frequently utilizes chromosome morphology, expression and/or localization of gene products required for various phases ...