Name: in situ detection of ribonucleoprotein complex assembly in the c. elegans germline using proximity ligation assay
Uploaded: 2020-05-05T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Situ Detection of Ribonucleoprotein Complex Assembly in the C. elegans Germline using Proximity Ligation Assay at JoVE.com

Alcuni ceppi di nematodi utilizzati in questo studio sono stati forniti dal Caenorhabditis Genetics Center finanziato dal NIH (P40OD010440). La microscopia confocale è stata eseguita nel Laboratorio di ricerca del nucleo dell'Università del Montana BioSpectroscopia operato con il supporto di NIH Awards P20GM103546 e S10OD021806. Questo lavoro è stato sostenuto in parte dalla sovvenzione NIH GM109053 a E.V., dalla American Heart Association Fellowship 18PRE34070028 a X.W., e dal premio Montana Academy of Sciences a X.W. I finanziatori non sono stati coinvolti nella progettazione dello studio o nella redazione della relazione. Ringraziamo M. Ellenbecker per la discussione.

NOTA: questo protocollo utilizza ceppi C. elegans in cui i potenziali partner interagenti sono entrambi contrassegnati. Si raccomanda vivamente di utilizzare una deformazione di controllo negativo, in cui una proteina con tag non dovrebbe interagire con un altro partner di interazione candidato con tag. Qui, GFP da solo è stato utilizzato come un controllo negativo per valutare lo sfondo, come DLC-1 non dovrebbe interagire con GFP nel worm. OMA-1 con tag GFP è stato usato come ceppo sperimentale, poiché i dat...

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Quando si studiano gli IPP nella germinacina C. elegans, la risoluzione più alta offerta dalla PLA rispetto alla co-immunostaining consente la visualizzazione e la quantificazione dei luoghi in cui si verificano interazioni nella linea germinale. È stato precedentemente riportato che DLC-1 interagisce direttamente con OMA-1 utilizzando un asdetto pulldown GST in vitro 26; tuttavia, questa interazione non è stata recuperata da un pulldown in vivo. La co-immunostaining fluoresce...

Si stima che oltre l'80% delle proteine abbia interazioni con altre molecole1, il che sottolinea quanto siano importanti gli IPP per l'esecuzione di specifiche funzioni biologiche nella cellula2. Alcune proteine funzionano come hub che facilitano l'assemblaggio di complessi più grandi che sono necessari per la sopravvivenza delle cellule1. Questi hub mediano più IPP e aiutano a organizzare le proteine in una rete che facilita funzioni specifiche in una cella3 . La formazione di complessi proteici è influenzata anche dal contesto biologico, come la presenza o l'assenza di specifici partner interagenti4, eventi di segnalazione cellulare e fase di sviluppo di una cellula.
C. elegans è comunemente usato come organismo modello per una varietà di studi, compreso lo sviluppo. La semplice anatomia di questo animale è composta da diversi organi, tra cui la gonad, l'intestino e la cuticola trasparente, che facilita l'analisi dello sviluppo del verme. La germinale che si trova nella gonade è un ottimo strumento per studiare come le cellule staminali germinali maturano in gameti5 che si sviluppano in embrioni e, infine, la prossima generazione di progenie. La regione di punta distale della linea germinale contiene un pool di cellule staminali auto-rinnovanti (Figura 1). Quando le cellule staminali lasciano la nicchia, progrediscono nel pachitene meiotico e alla fine si sviluppano in ovociti nella fase dei giovani adulti(Figura 1). Questo programma di sviluppo nella linea germinale è strettamente regolato attraverso diversi meccanismi, tra cui una rete normativa post-trascrizione facilitata dalle proteine che legano l'RNA (RBP)6. Gli IPP sono importanti per questa attività normativa, in quanto gli RRB si associano ad altri cofattori per esercitare le loro funzioni.
Esistono diversi approcci che possono essere utilizzati per eseguire la ricerca di IPP nel worm, ma ognuno ha limitazioni univoche. L'immunoprecipitazioni in vivo (IP) può essere utilizzata per isolare i complessi proteina-proteina da estratti di vermi interi; tuttavia, questo approccio non indica dove si verifica il PPI nel worm. Inoltre, i complessi proteici che sono transitori e si formano solo durante una fase specifica di sviluppo o in un numero limitato di cellule possono essere difficili da recuperare mediante co-immunoprecipitazioni. Infine, gli esperimenti sulla PI devono affrontare le preoccupazioni del riassortimento complesso proteico dopo la lisi e la ritenzione non specifica delle proteine sulla matrice di affinità.
Gli approcci alternativi per il rilevamento in situ degli IPP sono la co-immunostainizzazione, il trasferimento di energia di risonanza di Fàrster (FRET) e il complemento a fluorescenza bimolecolare (BiFC). La co-immunostaining si basa sul rilevamento simultaneo di due proteine di interesse per il tessuto del verme fisso e sulla misurazione dell'entità della colocalizzazione del segnale. L'uso della microscopia a super-risoluzione, che offre maggiori dettagli rispetto alla microscopia standard7, aiuta a testare più rigorosamente la colocalizzazione delle proteine oltre la barriera limitata alla diffrazione di 200-300 nm8. Tuttavia, la co-immunostaining utilizzando microscopia convenzionale e super-risoluzione funziona meglio per le proteine con modelli di localizzazione ben definiti. Al contrario, diventa molto meno informativo per i partner interagenti diffusamente distribuiti. La misurazione per la co-localizzazione dei segnali basata sulla sovrapposizione non fornisce informazioni accurate sul fatto che le proteine siano in complesso tra loro9,10.
Inoltre, la co-immunoprecipitazioni e la co-immunostaining dei complessi proteina-proteina non sono quantitative, il che rende difficile determinare se tali interazioni sono significative. FRET e BiFC sono entrambe tecniche fluorescenti. FRET si basa sull'etichettatura delle proteine di interesse con proteine fluorescenti (FP) che hanno sovrapposizioni spettrali in cui l'energia di un FP (donatore) viene trasferita a un altro FP (accettatore)11. Questo trasferimento non radiativo di energia provoca fluorescenza dell'arbitro FP che può essere rilevato alla rispettiva lunghezza d'onda dell'emissione. BiFC si basa sulla ricostituzione di una proteina fluorescente in vivo. Si tratta di dividere la GFP in due frammenti complementari, come le eliche 1-10 e l'elica 1112, che vengono poi fuse in due proteine di interesse. Se queste due proteine interagiscono, i frammenti complementari di GFP diventano abbastanza vicini in prossimità di piegare e assemblare, ricostituendo il fluoroforo GFP. La GFP ricostituita viene quindi osservata direttamente come fluorescenza e indica dove si è verificato un PPI.
Come tale, sia FRET che BiFC dipendono da grandi tag fluorescenti che possono interrompere la funzione della proteina marcata. Inoltre, FRET e BiFC richiedono un'espressione abbondante e comparabile delle proteine marcate per ottenere dati accurati. FRET potrebbe non essere adatto per esperimenti in cui un partner è superiore all'altro, il che può portare a un alto background13. Anche la sovraespressione negli esperimenti BiFC dovrebbe essere evitata, in quanto ciò può indurre l'assemblaggio non specifico14 che si traduce in un aumento dello sfondo. Entrambe le tecniche richiedono l'ottimizzazione delle condizioni di espressione e imaging delle proteine marcate, che può prolungare il tempo necessario per completare gli esperimenti.
Il saggio di legatura di prossimità (PLA) è un approccio alternativo che può affrontare i limiti delle tecniche di cui sopra. Il PLA sfrutta gli anticorpi primari che riconoscono le proteine di interesse (o i loro tag). Questi anticorpi primari sono poi legati da anticorpi secondari contenenti sonde oligonucleotidi che possono ibridarsi tra loro quando entro una distanza di 40 nm (o più breve)15. Il DNA ibridato risultante viene amplificato attraverso una reazione PCR, che viene rilevata da sonde che completano il DNA. Questo si traduce in foci che vengono visualizzati da un microscopio. Questa tecnologia è in grado di rilevare i PPI in situ in tessuti complessi (cioè la gonaddel a verme), che è organizzata come una catena di assemblaggio contenente cellule in varie fasi di sviluppo e differenziazione. Con il PLA, gli IPP possono essere visualizzati direttamente in una gonad di verme fissa, che è vantaggiosa per indagare se gli IPP si verificano durante una fase specifica dello sviluppo. PLA offre una maggiore risoluzione degli IPP rispetto ai saggi basati sulla co-localizzazione, ideale per effettuare misurazioni precise. Se utilizzata, la microscopia a super-risoluzione ha il potenziale per fornire dettagli più dettagliati sulla posizione dei focolai PLA all'interno di una cellula. Un altro vantaggio è che i foci derivanti dalle reazioni PLA possono essere conteggiati da un flusso di lavoro di analisi basato su ImageJ, rendendo questa tecnica quantitativa.
La famiglia LC8 di catene di luce dynein è stata descritta per la prima volta come una sottounità del complesso motorio di dineina16 e ipotizzata come un adattatore da carico. Fin dalla sua scoperta iniziale, LC8 è stato trovato in più complessi proteici oltre al complesso motorio della dineina17,18,19,20. La scansione delle sequenze proteiche che contengono il motivo di interazione LC819 suggerisce che LC8 può avere molte interazioni con una vasta gamma di proteine diverse17,18,19,20,21,22. Di conseguenza, le proteine della famiglia LC8 sono ora considerate hub che aiutano a promuovere l'assemblaggio di complessi proteici più grandi19,22, come gli assiemi di proteine intrinsecamente disordinate21.
Una proteina di famiglia C. elegans LC8, dynein light chain-1 (DLC-1), è ampiamente espressa su molti tessuti e non arricchita in specifiche strutture subcellulari23,24. Di conseguenza, l'identificazione dei partner in vivo biologicamente rilevanti del DLC-1 in C. elegans è difficile per una serie di motivi: 1) la co-immunoprecipitazioni non indica la fonte di tessuto in cui si verifica l'interazione; 2) l'espressione limitata di particolari partner o interazioni transitorie può ostacolare la capacità di rilevare un'interazione mediante co-immunoprecipitazioni; e 3) la distribuzione diffusa del DLC-1 porta a sovrapposizioni non specifiche con potenziali proteine partner mediante co-immunostaining. Sulla base di queste sfide, PLA è un approccio ideale per testare le interazioni in vivo con DLC-1.
È stato precedentemente riportato che il DLC-1 interagisce direttamente con e funge da cofattore per le proteine che legano l'RNA (RBP) FBF-222 e GLD-125. Il nostro lavoro supporta il modello di DLC-1 che funge da proteina hub e suggerisce che DLC-1 facilita una rete di interazione che si estende oltre la dineina19,22. Utilizzando un'analizzatore GST, è stato identificato un nuovo RBP interagenti DLC-1 denominato OMA-126. OMA-1 è importante per la crescita degli ovociti e la maturazione meiotica27 e funziona in combinazione con un certo numero di repressori e attivatori traslazionali28. Mentre FBF-2 e GLD-1 sono espressi rispettivamente nelle cellule staminali e nelle regioni di pachitene meiotico, OMA-1 è diffusamente nella germinale del guardatene meiotico attraverso gli ovociti27 (Figura 1). Ciò suggerisce che il DLC-1 forma complessi con RBP in diverse regioni della gonade. È stato anche scoperto che l'interazione diretta tra DLC-1 e OMA-1 osservata in vitro non viene recuperata da un IP in vivo. Il PLA è stato utilizzato con successo come approccio alternativo per studiare ulteriormente questa interazione nella linea germinale di C. elegans, e i risultati suggeriscono che il PLA può essere utilizzato per sondare molti altri IPP nel worm.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>16% paraformaldehyde solution</td>
			<td>Electron Microscopy services</td>
			<td>15710</td>
			<td>used to make 4% working solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M KH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0662</td>
			<td>Prepare a 1M working stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x M9</td>
			<td>various</td>
			<td>various</td>
			<td>prepared as 10x stock used at 1x; see wormbook.org for protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x PBS</td>
			<td>various</td>
			<td>various</td>
			<td>see wormbook.org for protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26.5 Gauge Needle</td>
			<td>Exel International</td>
			<td>26402</td>
			<td>Needles used for dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Lampire</td>
			<td>7500802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tubes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>05-529C</td>
			<td>50ml Oak ridge centrifuge tube used for synchronization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin Jar</td>
			<td>PolyLab</td>
			<td>62101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip to Freeze Sample</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>1411-10</td>
			<td>22x40mm, No. 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip to Seal Slide</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>1404-15</td>
			<td>22x22mm, No. 1.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI Mounting Medium for Immunofluorescence</td>
			<td>Vector</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ligase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO82029</td>
			<td>Duolink 1x Ligase, Comes as part of the Duolink In Situ Detection Reagents Red kit DUO92008</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplification red buffer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO82011</td>
			<td>Duolink 5x Amplification Red buffer, Comes as part of the Duolink In Situ Detection Reagents Red kit DUO92008</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ligation Buffer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO82009</td>
			<td>Duolink 5x Ligation buffer, Comes as part of the Duolink In Situ Detection Reagents Red kit DUO92008</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody Diluent</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO82008</td>
			<td>Duolink antibody diluent,Comes with DUO92004 and DUO92002, Note: A 1x PBS/1% BSA solution can also be used as a substitute to dilute the antibody.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO82007</td>
			<td>Duolink blocking solution, Comes with DUO92004 and DUO92002</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting Medium for PLA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO82040</td>
			<td>Duolink In Situ mounting medium with DAPI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MINUS Probe</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO92004</td>
			<td>Duolink In Situ Probe Anti-Mouse MINUS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLUS Probe</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO92002</td>
			<td>Duolink In Situ Probe Anti-Rabbit PLUS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash Buffer A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO82046</td>
			<td>Duolink In Situ wash Buffer A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash Buffer B</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO82048</td>
			<td>Duolink In Situ wash Buffer B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polymerase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO82030</td>
			<td>Duolink Polymerase, Comes as part of the Duolink In Situ Detection Reagents Red kit DUO92008</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescent Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>DFC300G camera, DM5500B microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse Alexa 594</td>
			<td>JacksonImmuno</td>
			<td>115-585-146</td>
			<td>Use at 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit Alexa 488</td>
			<td>JacksonImmuno</td>
			<td>111-545-144</td>
			<td>Use at 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Processing Software</td>
			<td>Adobe</td>
			<td></td>
			<td>Adobe Photoshop + Illsutrator CS3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pipette</td>
			<td>Corning</td>
			<td>7095B-5X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Levamisole</td>
			<td>ACROS Organics</td>
			<td>187870100</td>
			<td>Prepare a 250mM working stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-FLAG</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F1804</td>
			<td>Use at 1:1000 for immunofluorescence and PLA, pre-block with normal goat serum recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nailpolish</td>
			<td>L.A. colors</td>
			<td>CNP195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nematode Growth Medium (NGM)</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
			<td>See wormbook.org for protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum</td>
			<td>JacksonImmuno</td>
			<td>005-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene Pasteur Pipette</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>135030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1524</td>
			<td>Prepared as 0.1% stock solution in water, stored at -20C, and diluted 1:100 in water to coat slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dishes</td>
			<td>Tritech</td>
			<td>PD7060</td>
			<td>60 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-GFP</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>G10362</td>
			<td>Use at 1:200 for immunofluorescence, 1:4000 for PLA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slides</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>30-2066A-Brown</td>
			<td>Three-square 14x14mm autoclavable slides with bars are custom-ordered through Fisher Scientific. Poly-L-Lysine added to slides in the lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hypochlorite solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SS290-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>task wipes</td>
			<td>Kimtech</td>
			<td>34120</td>
			<td>4.4x8.4 inch task wipes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trays (242x241x20mm)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>240845</td>
			<td>Used to make humid chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>ACROS Organics</td>
			<td>327372500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure water</td>
			<td>Milli-Q</td>
			<td></td>
			<td>Ultrapure water obtained from Milli-Q Integral Water Purification System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Watchglass</td>
			<td>Carolina Biological</td>
			<td>742300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-20 &#176;C freezer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-80 &#176;C freezer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum Foil</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OP50 strain E. coli</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital Shaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tape</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nematode strains used in this study (both available upon request)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mntSi13[pME4.1] II; unc-119(ed3) III; teIs1 [pRL475]</td>
			<td></td>
			<td>UMT 376</td>
			<td>dlc-1 prom::3xFLAG::dlc-1::dlc-1 3&#39;UTR; oma-1 prom::oma-1::GFP; Reference 24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mntSi13[pME4.1] II; mntSi21[pXW6.22] unc-119(ed3) III</td>
			<td></td>
			<td>UMT 422</td>
			<td>dlc-1 prom::3xFLAG::dlc-1::dlc-1 3&#39;UTR; gld-1 prom::ceGFP::fbf-1 3&#39;UTR + unc-119(+); Reference: this study</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in situ detection of ribonucleoprotein complex assembly in the c. elegans germline using proximity ligation assay

Comprendere quando e dove si verificano interazioni proteina-proteina (IPP) è fondamentale per comprendere la funzione delle proteine nella cellula e in che modo processi più ampi come lo sviluppo sono influenzati. La germina Caenorhabditis elegans è un ottimo sistema modello per studiare gli IPP che sono legati alla regolazione delle cellule staminali, della meiosi e dello sviluppo. Ci sono una varietà di tecniche ben sviluppate che consentono alle proteine di interesse di essere etichettate per il riconoscimento da parte di anticorpi standard, rendendo questo sistema vantaggioso per le reazioni di analisi di legatura di prossimità (PLA). Di conseguenza, il PLA è in grado di mostrare dove gli IPP si verificano in modo spaziale e temporale nelle linee germinali in modo più efficace rispetto agli approcci alternativi. Descritto qui è un protocollo per l'applicazione e la quantificazione di questa tecnologia per sondare gli IPP nella linea germinale di C. elegans.

Co-immunostaining di entrambi 3xFLAG::DLC-1; GFP e 3xFLAG::DLC-1; Le germinali OMA-1::GFP con anticorpi FLAG e GFP hanno rivelato i loro modelli di espressione nella linea germinale (Figura 3Aii-iii,3Bii-iii). Mentre GFP è stato espresso in tutta la linea germinale (Figura 3Aiii), l'espressione OMA-1::GFP è stata limitata al tardo pachytene e agli ovociti (Figura 3...

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In Situ Detection of Ribonucleoprotein Complex Assembly in the C. elegans Germline using Proximity Ligation Assay

Questo protocollo dimostra l'uso del saggio di legatura di prossimità per sondare le interazioni proteina-proteina in situ nella germinale C. elegans.

In Situ Detection of Ribonucleoprotein Complex Assembly nella C. elegans Germline utilizzando Proximity Ligation Assay

Understanding when and where protein-protein interactions (PPIs) occur is critical to understanding protein function in the cell and how broader processes ...

Il test di ligation di prossimità consente agli utenti di rilevare interazioni proteina-proteina in situ, rivelando modelli spaziali e temporali delle interazioni. Questa tecnica può aiutare a rispondere a importanti domande sulla regolazione dello sviluppo di C.elegans. Questa tecnica offre una sensibilità comparabile per il rilevamento delle interazioni proteina-proteina senza la complessità di altre tecniche, come FRET e BiFC.Gli individui che non hanno mai sezionato vermi per rilasciare le gonadi possono avere difficoltà con questo passaggio. Esercitati a sezionare i vermi e usale per l'immunofluorescenza per perfezionare le tecniche di manipolazione e dissezione prima di passare al PLA. Per iniziare, scegli da 30 a 40 vermi giovani adulti in un piatto di vetro da orologio contenente 500 microlitri di 1x M9 e levamisolo.Dopo aver raccolto i vermi, rimuovere e scartare con cura la maggior parte dei mezzi per rimuovere i batteri che vengono trasferiti insieme ai vermi. Aggiungere 500 microlitri freschi di 1x M9 e levamisolo e utilizzare la pipetta per disegnare e erogare delicatamente il supporto per risciacquare i vermi. Rimuovere e scartare con cura la maggior parte dei supporti.Ripetere il lavaggio da due a tre volte. Dopo i lavaggi, lasciare i vermi in circa 100 microlitri di supporto per non più di otto minuti. Utilizzando una pipetta in vetro o polietilene, trasferire i vermi in uno scivolo al microscopio da 25 millimetri per 75 millimetri rivestito con poli-L-lisina allo 001%.Rimuovere il supporto in eccesso in modo che circa 15 microlitri di supporti rimangano sulla diapositiva. La rimozione del buffer in eccesso è fondamentale per garantire che i worm e le gonadi sezionati aderiscano alla diapositiva. Al microscopio sezionato, con due aghi calibro 26 1/2, posizionare un ago sopra l'altro in modo che le estremità forno un paio di forbici.Usando gli aghi orientati in questo modo, tagliare i vermi dietro la faringe per rilasciare le linee germinali. Sezionare tutti i vermi entro cinque minuti. Dopo che tutti i vermi sono stati sezionati, posizionare delicatamente un coverslip di 22 millimetri per 40 millimetri sul vetrino in modo che sia perpendicolare allo scivolo.Le estremità del coperchio devono bloccarsi dalla diapositiva. Congelare gli scivoli su un blocco di alluminio pre-refrigerato mantenuto sul ghiaccio secco per almeno 20 minuti. Posizionare delicatamente una matita refrigerata sopra la coverlip per evitare che il coverslip si allente a causa dell'espansione del ghiaccio.Quando sei pronto per la fissazione, scorri le copertine con una matita e immergere immediatamente la diapositiva in un barattolo contenente metanolo fresco e ghiacciato per un minuto. Quindi pulire delicatamente i bordi dello scivolo che circonda il campione e applicare 150 microlitri di formaldeide fissiva a temperatura ambiente da fissare per cinque minuti. Toccare la diapositiva su un tovagliolo di carta con un angolo perpendicolare di 90 gradi per lasciare che il fissatore scorra dal vetrino e assorba nel tovagliolo della carta.Bloccare le diapositive due volte per 15 minuti a temperatura ambiente in un barattolo coplin con 50 millilitri di PBT/BSA. Quindi bloccare le diapositive con una soluzione PBT/BSA contenente il 10% di siero di capra normale. Pulire delicatamente i bordi che circondano lo scivolo e applicare 100 microlitri della soluzione su ogni diapositiva.E agitare delicatamente la diapositiva per aiutare a diffondere la soluzione. Incubare per un'ora a temperatura ambiente in una camera umida. Posizionare la diapositiva su un tovagliolo di carta per lasciare che la soluzione scorazzi dalla diapositiva e pulire delicatamente i bordi.Per bloccare le diapositive, applicare una goccia del reagente di blocco allo spazio di 14 millimetri per 14 millimetri. Incubare gli scivoli per un'ora a 37 gradi Celsius in una camera umida. Posizionare le diapositive su un tovagliolo di carta per lasciare che il reagente bloccante scorra dalla diapositiva e pulire delicatamente i bordi.Utilizzare il diluente anticorpale per diluire gli anticorpi primari. Applicare 40 microlitri della soluzione di anticorpi primari diluiti per uno spazio di 14 per 14 millimetri sulle diapositive. Posizionare gli scivoli in una camera umida e incubare durante la notte a quattro gradi Celsius.Al mattino, lavare gli scivoli due volte per cinque minuti, ciascuno con 50 millilitri di 1x tampone di lavaggio A a temperatura ambiente in un barattolo coplin. Impostare il barattolo Coplin su uno shaker orbitale impostato su 60 giri/min. Posizionare le diapositive su un tovagliolo di carta per lasciare che il tampone di lavaggio scoraggi fuori dalla diapositiva e pulire delicatamente i bordi.Preparare una soluzione da 40 microliter contenente sonde più e meno. Aggiungere la soluzione a ogni spazio di 14 per 14 millimetri. Incubare gli scivoli in una camera umida per un'ora a 37 gradi Celsius.Lavare gli scivoli due volte per cinque minuti ciascuno con 50 millilitri di 1x tampone di lavaggio A a temperatura ambiente in un barattolo coplin. Impostare il barattolo Coplin su uno shaker orbitale impostato su 60 giri/min. Diluire il tampone di legatura da uno a cinque con acqua ultrapura.Utilizzare questo buffer per diluire la ligasi da uno a 40 per preparare uno stock di lavoro di soluzione di legatura. Posizionare lo scivolo su un tovagliolo di carta per lasciare che il tampone di lavaggio scoraggi i lati e pulire delicatamente i bordi. Aggiungere 40 microlitri della soluzione di legatura a ogni spazio di 14 per 14 millimetri.Incubare gli scivoli in una camera umida per 30 minuti a 37 gradi Celsius. Dopo aver lavato e asciugato le diapositive come descritto in precedenza, aggiungere 40 microlitri di soluzione di amplificazione appena preparata, protetti dalla luce, ad ogni spazio di 14 per 14 millimetri. Incubare gli scivoli nella camera umida e buia per un'ora e 40 minuti a 37 gradi Celsius.Lavare gli scivoli due volte per 10 minuti ciascuno con 50 millilitri di 1x tampone di lavaggio B e lavare gli scivoli una volta per un minuto con 50 millilitri di tampone di lavaggio 01x B.Dopo aver asciugato il perimetro rivestito in epossidico dello scivolo, aggiungere 10 microlitri di supporto medio a ciascun campione e posare delicatamente un copripazzo sulla parte superiore, consentendo al mezzo di montaggio di diffondersi. Dipingi intorno al bordo del coverslip con smalto per unghie per sigillare il coverslip e lo scivolo. Evitare di spostare il coverslip.Lasciare indurire lo smalto per almeno 20 minuti a temperatura ambiente, protetto dalla luce. La co-immunosomozione delle linee germinali con gli anticorpi FLAG e GFP ha rivelato il loro modello di espressione nella linea germinale. Mentre la GFP era espressa in tutta la linea germinale, l'espressione OMA-1:GFP era limitata al pachytene tardivo e agli ovociti.L'immunostaining FLAG mostra che 3xFLAG:DLC-1 è stato espresso in tutta la linea germinale in entrambi i ceppi. La regione di interesse per la quantificazione del PLA nella linea germinale comprendeva il pachytene tardivo attraverso gli ovociti in tutte le linee germinali. Questa è l'area dell'espressione OMA-1.3xFLAG:DLC-1, le gerline OMA-1:GFP sembravano avere una maggiore quantità di fuochi PLA all'interno di questa regione rispetto alle germline 3xFLAG:DLC-1, GFP. Assicurarsi che ci sia abbastanza acqua per aumentare l'umidità nella camera. Inoltre, assicurarsi che le diapositive siano livellate all'interno della camera per evitare il deflusso dei reagenti.Seguendo il saggio di legatura di prossimità, le gonadi estruse possono essere immagini su un microscopio confocale e quantificate utilizzando Fiji, flusso di lavoro ImageJ. Questa quantificazione può aiutare a determinare se l'interazione è statisticamente significativa. Il PLA ci ha permesso di valutare le interazioni in situ tra i regolatori critici dello sviluppo della linea germinale del nematode.

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