Name: in situ detection of ribonucleoprotein complex assembly in the c. elegans germline using proximity ligation assay
Uploaded: 2020-05-05T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Situ Detection of Ribonucleoprotein Complex Assembly in the C. elegans Germline using Proximity Ligation Assay at JoVE.com

Algumas cepas de nematoide utilizadas neste estudo foram fornecidas pelo Centro de Genética caenorhabditis financiado pelo NIH (P40OD010440). A microscopia confocal foi realizada no Laboratório de Pesquisa do Núcleo de Biospectroscopia da Universidade de Montana operado com apoio dos Prêmios NIH P20GM103546 e S10OD021806. Este trabalho foi apoiado em parte pelo nihconceder GM109053 à E.V., American Heart Association Fellowship 18PRE34070028 à X.W., e montana academy of sciences award to X.W. Os financiadores não estavam envolvidos na concepção do estudo ou na redação do relatório. Agradecemos ao M. Ellenbecker pela discussão.

NOTA: Este protocolo usa cepas de C. elegans nas quais potenciais parceiros interagindo são marcados. Recomenda-se fortemente que seja usada uma cepa de controle negativa, na qual não se espera que uma proteína marcada interaja com outro parceiro de interação do candidato marcado. Aqui, somente o GFP foi usado como um controle negativo para avaliar o fundo, já que não se espera que o DLC-1 interaja com o GFP no worm. O MA-1 com marca GFP foi usado como cepa experimental, pois dados preliminares sugerem um...

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Ao estudar ppis na germinação C. elegans, a maior resolução oferecida pelo PLA em comparação com a co-imunocoloração permite a visualização e quantificação dos locais onde ocorrem interações na germinação. Foi relatado anteriormente que o DLC-1 interage diretamente com o OMA-1 usando um ensaio de retirada GST in vitro 26; no entanto, essa interação não foi recuperada por um pulldown in vivo. Co-imunocoloração fluorescente de 3xFLAG::DLC-1; OMA-1::Germlines GF...

Estima-se que mais de 80% das proteínas tenham interações com outras moléculas1, o que enfatiza a importância dos IPP para a execução de funções biológicas específicas na célula2. Algumas proteínas funcionam como hubs facilitando a montagem de complexos maiores que são necessários para a sobrevivência celular1. Esses hubs mediam vários PPIs e ajudam a organizar proteínas em uma rede que facilita funções específicas em uma célula3. A formação de complexos proteicos também é afetada pelo contexto biológico, como a presença ou ausência de parceiros de interação específicos4, eventos de sinalização celular e estágio de desenvolvimento de uma célula.
C. elegans é comumente usado como um organismo modelo para uma variedade de estudos, incluindo o desenvolvimento. A simples anatomia deste animal é composta por vários órgãos, incluindo a gonade, intestino e cutícula transparente, o que facilita a análise do desenvolvimento de vermes. A germinação residente na gônada é uma ótima ferramenta para estudar como as células-tronco germinais amadurecem em gametas5 que se desenvolvem em embriões e, eventualmente, na próxima geração de descendentes. A região distal da ponta da germinação contém um pool de células-tronco auto-renovadoras (Figura 1). À medida que as células-tronco saem do nicho, elas avançam para o pacitene meiotico e eventualmente se desenvolvem em oócitos na fase adulta jovem (Figura 1). Este programa de desenvolvimento na germinação é fortemente regulado através de diferentes mecanismos, incluindo uma rede reguladora pós-transcricional facilitada por proteínas de ligação de RNA (RBPs)6. Os PPIs são importantes para essa atividade regulatória, pois os RBPs se associam a outros cofatores para exercer suas funções.
Existem várias abordagens que podem ser usadas para sondar ppis no worm, mas cada uma tem limitações únicas. A imunoprecipitação in vivo (IP) pode ser usada para isolar complexos proteína-proteína de extratos inteiros de vermes; no entanto, essa abordagem não indica onde o PPI ocorre no worm. Além disso, complexos proteicos que são transitórios e só se formam durante um estágio específico de desenvolvimento ou em um número limitado de células podem ser difíceis de recuperar por co-imunoprecipitação. Finalmente, os experimentos de IP precisam abordar as preocupações do resortment complexo de proteínas após a lipose e a retenção não específica de proteínas na matriz de afinidade.
Abordagens alternativas para detecção in situ de PPIs são co-imunocoloração, transferência de energia de ressonância Förster (FRET) e complementação de fluorescência bimolecular (BiFC). A co-imunocoloração depende da detecção simultânea de duas proteínas de interesse no tecido de verme fixo e da medição da extensão da colocalização do sinal. O uso da microscopia de superresolução, que oferece maior detalhe do que a microscopia padrão7,ajuda a testar mais rigorosamente a colocalização de proteínas além da barreira limitada à difração de 200-300 nm8. No entanto, a co-imunocoloração usando microscopia convencional e de superresolução funciona melhor para proteínas com padrões de localização bem definidos. Em contraste, torna-se muito menos informativo para parceiros interagindo difundidos. A medição para co-localização de sinais com base na sobreposição não fornece informações precisas sobre se as proteínas estão em complexo entre si9,10.
Além disso, a co-imunoprecipitação e a co-imunocoloração de complexos proteína-proteína não são quantitativas, tornando desafiador determinar se tais interações são significativas. FRET e BiFC são técnicas baseadas em fluorescentes. Fret baseia-se na marcação de proteínas de interesse com proteínas fluorescentes (FPs) que têm sobreposição espectral na qual a energia de um FP (doador) é transferida para outro FP (aceitador)11. Esta transferência não radiativa de energia resulta em fluorescência do FP aceitador que pode ser detectada em seu respectivo comprimento de onda de emissão. O BiFC baseia-se na reconstituição de uma proteína fluorescente in vivo. Implica a divisão do GFP em dois fragmentos complementares, como helicos 1-10 e hélice 1112, que são então fundidos a duas proteínas de interesse. Se essas duas proteínas interagirem, os fragmentos complementares do GFP ficam próximos o suficiente na proximidade de dobrar e montar, reconstituindo o fluoróforo GFP. O GFP reconstituído é então observado diretamente como fluorescência e indica onde ocorreu um PPI.
Como tal, tanto fret quanto BiFC dependem de grandes marcas fluorescentes que podem interromper a função da proteína marcada. Além disso, FRET e BiFC requerem expressão abundante e comparável das proteínas marcadas para obter dados precisos. Fret pode não ser adequado para experimentos onde um parceiro esteja acima do outro, o que pode levar a um fundo alto13. A superexpressão em experimentos BiFC também deve ser evitada, pois isso pode induzir uma montagem inespecífica14 que resulta em aumento de fundo. Ambas as técnicas requerem otimização das condições de expressão e imagem das proteínas marcadas, o que pode prolongar o tempo necessário para concluir experimentos.
O ensaio de ligadura de proximidade (PLA) é uma abordagem alternativa que pode abordar as limitações das técnicas mencionadas acima. Pla aproveita anticorpos primários que reconhecem as proteínas de interesse (ou suas etiquetas). Estes anticorpos primários são então ligados por anticorpos secundários contendo sondas oligonucleotídeas que podem hibridizar uns com os outros quando dentro de uma distância de 40 nm (ou menor)15. O DNA hibridizado resultante é amplificado através de uma reação pcr, que é detectada por sondas que complementam o DNA. Isso resulta em focos que são visualizados por um microscópio. Esta tecnologia pode detectar PPIs in situ em tecidos complexos (ou seja, a gônada do verme), que é organizado como uma linha de montagem contendo células em vários estágios de desenvolvimento e diferenciação. Com o PLA, os PPIs podem ser visualizados diretamente em uma gonada de worm fixo, o que é vantajoso para investigar se os PPIs ocorrem durante um estágio específico de desenvolvimento. O PLA oferece maior resolução dos PPIs em oposição aos ensaios baseados em co-localização, o que é ideal para fazer medições precisas. Se utilizada, a microscopia de superresolução tem o potencial de fornecer detalhes mais finos sobre a localização de focos de PLA dentro de uma célula. Outra vantagem é que os focos resultantes das reações do PLA podem ser contados por um fluxo de trabalho de análise baseado em ImageJ, tornando essa técnica quantitativa.
A família LC8 de cadeias leves de dynein foi descrita pela primeira vez como uma subunidade do complexo motor dynein16 e hipótese para servir como um adaptador de carga. Desde sua descoberta inicial, lc8 foi encontrado em múltiplos complexos proteicos, além do complexo motor dynein17,18,19,20. A varredura de seqüências proteicas que contenham o motivo de interação LC819 sugere que lc8 pode ter muitas interações com uma ampla gama de proteínas diferentes17,18,,19,,20,21,22. Como resultado, as proteínas familiares LC8 são agora consideradas polos que ajudam a promover a montagem de grandes complexos proteicos19,22, como conjuntos de proteínas intrinsecamente desordenadas21.
Uma proteína c. elegans LC8-family, dynein light chain-1 (DLC-1), é amplamente expressa em muitos tecidos e não enriquecida em estruturas subcelulares específicas23,24. Consequentemente, a identificação de parceiros biologicamente relevantes in vivo de DLC-1 em C. elegans é desafiadora por uma série de razões: 1) co-imunoprecipitação não indica a fonte tecidual onde a interação ocorre; 2) a expressão limitada de parceiros específicos ou interações transitórias pode dificultar a capacidade de detectar uma interação por co-imunoprecipitação; e 3) a distribuição difusa do DLC-1 leva à sobreposição não específica com proteínas potenciais parceiras por co-imunocoloração. Com base nesses desafios, o PLA é uma abordagem ideal para testar interações in vivo com o DLC-1.
Foi relatado anteriormente que o DLC-1 interage diretamente e serve como cofator para as proteínas de ligação de RNA (RBPs) FBF-223 e GLD-125. Nosso trabalho suporta o modelo de DLC-1 servindo como uma proteína hub e sugere que o DLC-1 facilita uma rede de interação que vai além da dynein19,22. Usando um ensaio de retirada GST, um novo RBP de interação DLC-1 chamado OMA-1 foi identificado26. OOMA-1 é importante para o crescimento de oócitos e maturação meiótica27 e funciona em conjunto com uma série de repressores e ativadores translacionais28. Enquanto fbf-2 e GLD-1 são expressos nas células-tronco e regiões de pacitene meiotic, respectivamente, OMA-1 é expressa difusamente na germinação do pacitene meiotico através dos oócitos27 (Figura 1). Isso sugere que o DLC-1 forma complexos com RBPs em diferentes regiões da gônada. Verificou-se também que a interação direta entre DLC-1 e OMA-1 observada in vitro não é recuperada por um IP in vivo. O PLA tem sido usado com sucesso como uma abordagem alternativa para estudar mais essa interação na germinação c. elegans, e os resultados sugerem que o PLA pode ser usado para sondar muitos outros PPIs no worm.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>16% paraformaldehyde solution</td>
			<td>Electron Microscopy services</td>
			<td>15710</td>
			<td>used to make 4% working solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M KH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0662</td>
			<td>Prepare a 1M working stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x M9</td>
			<td>various</td>
			<td>various</td>
			<td>prepared as 10x stock used at 1x; see wormbook.org for protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x PBS</td>
			<td>various</td>
			<td>various</td>
			<td>see wormbook.org for protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26.5 Gauge Needle</td>
			<td>Exel International</td>
			<td>26402</td>
			<td>Needles used for dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Lampire</td>
			<td>7500802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tubes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>05-529C</td>
			<td>50ml Oak ridge centrifuge tube used for synchronization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin Jar</td>
			<td>PolyLab</td>
			<td>62101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip to Freeze Sample</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>1411-10</td>
			<td>22x40mm, No. 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip to Seal Slide</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>1404-15</td>
			<td>22x22mm, No. 1.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI Mounting Medium for Immunofluorescence</td>
			<td>Vector</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ligase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO82029</td>
			<td>Duolink 1x Ligase, Comes as part of the Duolink In Situ Detection Reagents Red kit DUO92008</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplification red buffer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO82011</td>
			<td>Duolink 5x Amplification Red buffer, Comes as part of the Duolink In Situ Detection Reagents Red kit DUO92008</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ligation Buffer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO82009</td>
			<td>Duolink 5x Ligation buffer, Comes as part of the Duolink In Situ Detection Reagents Red kit DUO92008</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody Diluent</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO82008</td>
			<td>Duolink antibody diluent,Comes with DUO92004 and DUO92002, Note: A 1x PBS/1% BSA solution can also be used as a substitute to dilute the antibody.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO82007</td>
			<td>Duolink blocking solution, Comes with DUO92004 and DUO92002</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting Medium for PLA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO82040</td>
			<td>Duolink In Situ mounting medium with DAPI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MINUS Probe</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO92004</td>
			<td>Duolink In Situ Probe Anti-Mouse MINUS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLUS Probe</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO92002</td>
			<td>Duolink In Situ Probe Anti-Rabbit PLUS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash Buffer A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO82046</td>
			<td>Duolink In Situ wash Buffer A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash Buffer B</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO82048</td>
			<td>Duolink In Situ wash Buffer B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polymerase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO82030</td>
			<td>Duolink Polymerase, Comes as part of the Duolink In Situ Detection Reagents Red kit DUO92008</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescent Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>DFC300G camera, DM5500B microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse Alexa 594</td>
			<td>JacksonImmuno</td>
			<td>115-585-146</td>
			<td>Use at 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit Alexa 488</td>
			<td>JacksonImmuno</td>
			<td>111-545-144</td>
			<td>Use at 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Processing Software</td>
			<td>Adobe</td>
			<td></td>
			<td>Adobe Photoshop + Illsutrator CS3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pipette</td>
			<td>Corning</td>
			<td>7095B-5X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Levamisole</td>
			<td>ACROS Organics</td>
			<td>187870100</td>
			<td>Prepare a 250mM working stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-FLAG</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F1804</td>
			<td>Use at 1:1000 for immunofluorescence and PLA, pre-block with normal goat serum recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nailpolish</td>
			<td>L.A. colors</td>
			<td>CNP195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nematode Growth Medium (NGM)</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
			<td>See wormbook.org for protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum</td>
			<td>JacksonImmuno</td>
			<td>005-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene Pasteur Pipette</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>135030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1524</td>
			<td>Prepared as 0.1% stock solution in water, stored at -20C, and diluted 1:100 in water to coat slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dishes</td>
			<td>Tritech</td>
			<td>PD7060</td>
			<td>60 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-GFP</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>G10362</td>
			<td>Use at 1:200 for immunofluorescence, 1:4000 for PLA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slides</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>30-2066A-Brown</td>
			<td>Three-square 14x14mm autoclavable slides with bars are custom-ordered through Fisher Scientific. Poly-L-Lysine added to slides in the lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hypochlorite solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SS290-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>task wipes</td>
			<td>Kimtech</td>
			<td>34120</td>
			<td>4.4x8.4 inch task wipes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trays (242x241x20mm)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>240845</td>
			<td>Used to make humid chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>ACROS Organics</td>
			<td>327372500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure water</td>
			<td>Milli-Q</td>
			<td></td>
			<td>Ultrapure water obtained from Milli-Q Integral Water Purification System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Watchglass</td>
			<td>Carolina Biological</td>
			<td>742300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-20 &#176;C freezer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-80 &#176;C freezer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum Foil</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OP50 strain E. coli</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital Shaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tape</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nematode strains used in this study (both available upon request)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mntSi13[pME4.1] II; unc-119(ed3) III; teIs1 [pRL475]</td>
			<td></td>
			<td>UMT 376</td>
			<td>dlc-1 prom::3xFLAG::dlc-1::dlc-1 3&#39;UTR; oma-1 prom::oma-1::GFP; Reference 24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mntSi13[pME4.1] II; mntSi21[pXW6.22] unc-119(ed3) III</td>
			<td></td>
			<td>UMT 422</td>
			<td>dlc-1 prom::3xFLAG::dlc-1::dlc-1 3&#39;UTR; gld-1 prom::ceGFP::fbf-1 3&#39;UTR + unc-119(+); Reference: this study</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in situ detection of ribonucleoprotein complex assembly in the c. elegans germline using proximity ligation assay

Entender quando e onde ocorrem as interações proteína-proteína (PPIs) é fundamental para entender a função proteica na célula e como processos mais amplos, como o desenvolvimento, são afetados. A linha germinal Caenorhabditis elegans é um ótimo sistema modelo para estudar PPIs que estão relacionados à regulação de células-tronco, meiose e desenvolvimento. Existem uma variedade de técnicas bem desenvolvidas que permitem que proteínas de interesse sejam marcadas para reconhecimento por anticorpos padrão, tornando este sistema vantajoso para reações de ensaio de ligadura de proximidade (PLA). Como resultado, o PLA é capaz de mostrar onde os PPIs ocorrem de forma espacial e temporal em germes de forma mais eficaz do que abordagens alternativas. Descrito aqui é um protocolo para a aplicação e quantificação desta tecnologia para sondar PPIs na linha germinal C. elegans.

Co-imunocoloração de ambos 3xFLAG::DLC-1; GFP e 3xFLAG::DLC-1; OMA-1::GFP germinas com anticorpos FLAG e GFP revelaram seus padrões de expressão na germinação (Figura 3Aii-iii, 3Bii-iii). Enquanto o GFP foi expresso em toda a germinação(Figura 3Aiii), a expressão OMA-1::GFP foi restrita ao pacitene tardio e aos oócitos(Figura 3Biii)<sup cla...

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In Situ Detection of Ribonucleoprotein Complex Assembly in the C. elegans Germline using Proximity Ligation Assay

Este protocolo demonstra o uso do ensaio de ligadura de proximidade para sondar interações proteína-proteína in situ na germinação C. elegans.

In Situ Detection of Ribonucleoprotein Complex Assembly in the C. elegans Germline usando Ensaio de Ligação de Proximidade

Understanding when and where protein-protein interactions (PPIs) occur is critical to understanding protein function in the cell and how broader processes ...

O ensaio de ligadura de proximidade permite que os usuários detectem interações proteína-proteína in situ, revelando padrões espaciais e temporais das interações. Esta técnica pode ajudar a responder a perguntas importantes sobre a regulação do desenvolvimento de C.elegans. Esta técnica oferece sensibilidade comparável para detecção de interações proteína-proteína sem a complexidade de outras técnicas, como FRET e BiFC.Indivíduos que nunca dissecaram vermes para libertar as gônadas podem lutar com este passo. Pratique os vermes de dissecção e use-os para imunofluorescência para aperfeiçoar as técnicas de manuseio e dissecção antes de passar para o PLA. Para começar, escolha de 30 a 40 vermes adultos jovens em um prato de vidro de relógio contendo 500 microliters de 1x M9 e levamisole.Depois de coletar os vermes, remova e descarte cuidadosamente a maioria dos meios de comunicação para remover bactérias que são transferidas junto com os vermes. Adicione 500 microliters frescos de 1x M9 e levamisole, e use a pipeta para elaborar suavemente e dispensar a mídia para enxaguar os vermes. Remova e descarte cuidadosamente a maioria dos meios de comunicação.Repita a lavagem duas a três vezes. Após as lavagens, deixe os vermes em cerca de 100 microliters de mídia por não mais do que oito minutos. Usando uma pipeta de vidro ou polietileno, transfira os vermes para um slide de microscópio de 25 milímetros por 75 milímetros revestido com 001% de poli-L-lysine.Remova o excesso de mídia para que aproximadamente 15 microliters de mídia permaneçam no slide. A remoção do excesso de buffer é fundamental para garantir que os vermes e gônadas dissecados aderam ao slide. Sob um microscópio dissecando, com duas agulhas calibre 26 1/2, coloque uma agulha sobre a outra para que as extremidades formem uma tesoura.Usando as agulhas orientadas desta forma, corte os vermes atrás da faringe para liberar as germinas. Disseca todos os vermes em cinco minutos. Depois que todos os worms forem dissecados, coloque suavemente um deslizamento de cobertura de 22 milímetros por 40 milímetros sobre o slide para que ele seja perpendicular ao slide.As extremidades do deslizamento devem pendurar fora do slide. Congele os slides em um bloco de alumínio pré-refrigerado mantido em gelo seco por pelo menos 20 minutos. Coloque suavemente um lápis refrigerado em cima da tampa para evitar que a mancha de cobertura fique solta devido à expansão do gelo.Quando estiver pronto para fixação, retire as tampas com um lápis e mergulhe imediatamente o slide em um frasco contendo metanol fresco e gelado por um minuto. Em seguida, limpe suavemente as bordas do slide ao redor da amostra e aplique 150 microliters de formaldeído fixativo à temperatura ambiente para fixar por cinco minutos. Toque o slide em uma toalha de papel em um ângulo perpendicular de 90 graus para deixar o fixador sair do slide e absorver a toalha de papel.Bloqueie os slides duas vezes durante 15 minutos em temperatura ambiente em um frasco de Coplin com 50 mililitros de PBT/BSA. Em seguida, bloqueie os slides com uma solução PBT/BSA contendo soro de cabra 10% normal. Limpe suavemente as bordas que circundam o slide e aplique 100 microliters da solução a cada slide.E agitar suavemente o slide para ajudar a espalhar a solução. Incubar por uma hora em temperatura ambiente em uma câmara úmida. Coloque o slide em uma toalha de papel para deixar a solução escorrer e limpe suavemente as bordas.Para bloquear os slides, aplique uma gota do reagente de bloqueio ao espaço de 14 milímetros por 14 milímetros. Incubar os slides por uma hora a 37 graus Celsius em uma câmara úmida. Coloque os slides em uma toalha de papel para deixar o reagente de bloqueio sair do slide e limpar suavemente as bordas.Use o anticorpo diluído para diluir os anticorpos primários. Aplique 40 microliters da solução de anticorpos primários diluídos por espaço de 14 por 14 milímetros nos slides. Coloque os slides em uma câmara úmida e incubar durante a noite a quatro graus Celsius.Pela manhã, lave os slides duas vezes por cinco minutos, cada um com 50 mililitros de 1x tampão de lavagem A à temperatura ambiente em um frasco de Coplin. Coloque o frasco de Coplin em um agitador orbital a 60 rpm. Coloque os slides em uma toalha de papel para deixar o tampão de lavagem sair do slide e limpar suavemente as bordas.Prepare uma solução de 40 microliter contendo sondas mais e menos. Adicione a solução a cada espaço de 14 por 14 milímetros. Incubar os slides em uma câmara úmida por uma hora a 37 graus Celsius.Lave os slides duas vezes por cinco minutos cada um com 50 mililitros de 1x tampão de lavagem A à temperatura ambiente em um frasco de Coplin. Coloque o frasco de Coplin em um agitador orbital a 60 rpm. Diluir o tampão de ligadura de um a cinco com água ultrapura.Use este buffer para diluir o ligase de 1 a 40 para preparar um estoque de trabalho de solução de ligadura. Coloque o slide em uma toalha de papel para deixar o tampão de lavagem correr para fora dos lados e limpe suavemente as bordas. Adicione 40 microliters da solução de ligadura a cada espaço de 14 por 14 milímetros.Incubar os slides em uma câmara úmida por 30 minutos a 37 graus Celsius. Depois de lavar e secar os slides como descrito anteriormente, adicione 40 microliters de solução de amplificação recém-preparada, protegida da luz, a cada espaço de 14 por 14 milímetros. Incubar os slides na câmara úmida e escura por uma hora e 40 minutos a 37 graus Celsius.Lave os slides duas vezes por 10 minutos cada um com 50 mililitros de 1x tampão de lavagem B, e lave os slides uma vez por um minuto com 50 mililitros de tampão de lavagem de 01x B.Depois de secar o perímetro revestido de epóxi do slide, adicione 10 microliters de meio de montagem a cada amostra e coloque suavemente uma tampa de deslizamento na parte superior, permitindo que o meio de montagem se espalhe. Pinte ao redor da borda da tampa com esmalte para selar a mancha e deslizar. Evite mover a tampa.Deixe o esmalte endurecer por pelo menos 20 minutos em temperatura ambiente, protegido da luz. A co-imunossuagem das germes com anticorpos FLAG e GFP revelou seu padrão de expressão na germinal. Enquanto a GFP foi expressa em toda a germina, a expressão OMA-1:GFP foi restrita ao paquiteno tardio e oócitos.A imunostaining flag mostra que 3xFLAG:DLC-1 foi expresso em toda a linha germinal em ambas as cepas. A região de interesse para quantificação pla na germinal englobava o paquiteno tardio através dos oócitos em todas as germinas. Esta é a região da expressão OMA-1.3xFLAG:DLC-1, Germes OMA-1:GFP pareciam ter uma maior quantidade de focos PLA dentro desta região em comparação com as germes 3xFLAG:DLC-1, GFP. Certifique-se de que há água suficiente para aumentar a umidade na câmara. Além disso, certifique-se de que os slides estão nivelados dentro da câmara para evitar o escoamento de reagentes.Seguindo o ensaio de ligadura de proximidade, as gônadas extrudadas podem ser imagens em um microscópio confocal e quantificadas usando Fiji, ImageJ workflow. Essa quantificação pode ajudar a determinar se a interação é estatisticamente significante. O PLA nos permitiu avaliar interações in situ entre reguladores críticos do desenvolvimento de germinas nematoides.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

In Situ Detection of Ribonucleoprotein Complex Assembly in the C. elegans Germline using Proximity Ligation Assay

Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

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Compreender Organogenesis precoce Usando um Simplificado<em&gt; In Situ</em&gt; Protocolo de hibridação em<em&gt; Xenopus</em

Organogenesis is the study of how organs are specified and then acquire their specific shape and functions during development.  The Xenopuslaevis embryo ...

Biologia do Desenvolvimento

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

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Avaliação Compreensiva de Germline Chemical Toxicity Usando o Nemátodo<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Identifying the reproductive toxicity of the thousands of chemicals present in our environment has been one of the most tantalizing challenges in the ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

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The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

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Espaciais e temporais Análise do Active ERK na<em&gt; C. elegans</em&gt; germinativa

The evolutionarily conserved&#160;extracellular signal transducing RTK-RAS-ERK pathway is an important kinase-signaling cascade that controls multiple ...

The Power of Simplicity: Sea Urchin Embryos as in Vivo Developmental Models for Studying Complex Cell-to-cell Signaling Network Interactions

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O Poder da Simplicidade: Sea Urchin embriões Na Vivo Modelos de desenvolvimento para estudar células de células-complexo de sinalização de rede Interações

Remarkably few cell-to-cell signal transduction pathways are necessary during embryonic development to generate the large variety of cell types and ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

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Dissecção e imunofluorescência coloração de cogumelo corpo e fotoreceptor neurônios em cérebros adultos Drosophila melanogaster

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Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

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Análise computacional do Germline Caenorhabditis elegans , para estudar a distribuição de núcleos, as proteínas e o citoesqueleto

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Visualizando o nó e placa Notochordal em Gastrulating embriões de rato usando microscopia eletrônica e imunofluorescência de montagem inteira

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Cell Cycle Analysis in the C. elegans Germline with the Thymidine Analog EdU

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